KR20060113882A - 프로테아제 효소 활성에 대한 검정법 - Google Patents

프로테아제 효소 활성에 대한 검정법 Download PDF

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코만도오르 아키유탄
크시아오보 쉬
트로이 베르그스테트
프라우케 리닌슬란드
둔칸 맥브란크
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Abstract

β-세크레타제 및 카스파제 효소와 같은 프로테아제 효소의 활성을 검출하기 위한 생체접합체, 키트 및 검정법을 기재하였다. 상기 생체접합체는, 상기 효소를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편 (예를 들어 상기 효소에 의해 절단될 수 있는 절편)을 갖는 테터, 상기 테터상의 제1 위치에 접합된 복수개의 형광 종을 포함하는 형광제, 및 상기 테터상의 제2 위치에 접합된 켄쳐를 포함한다. 프로테아제 효소 (예를 들어 β-세크레타제 또는 카스파제)를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편은 상기 테터 상의 제1 위치와 제2 위치 사이에 존재한다. 상기한 복수개의 형광 종은 서로 결합되어 있어서 켄쳐가 형광제의 수퍼-켄칭을 증폭시킬 수 있다. 상기 검정법은 잠재적인 약물을 β-세크레타제와 같은 프로테아제 효소의 활성을 억제하는 효율에 대하여 평가하는 고처리량 포맷으로 스크리닝하는데 적합하다.
생체접합체, 키트, 검정법, β-세크레타제, 카스파제, 프로테아제 효소, 테터, 켄쳐, 형광제, 켄칭

Description

프로테아제 효소 활성에 대한 검정법 {ASSAYS FOR PROTEASE ENZYME ACTIVITY}
본 출원은 2002년 8월 23일에 출원한 미국 특허 출원 제10/226,300호와 관련이 있으며, 상기 출원은 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
배경기술
기술분야
본 출원은 전체적으로 분자 상호작용의 검출을 검정하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 프로테아제 효소 (예를 들어, β-세크레타제 및 카스파제 효소)의 활성을 검출하는데 사용될 수 있는 생체접합체, 상기 생체접합체를 포함하는 키트, 및 효소 활성을 검출하기 위해 상기 생체접합체를 사용하는 것을 포함하는 검정법에 관한 것이다.
배경기술에 대한 논의
프로테아제 효소는 세포 생물학에서 중요한 역할을 하며, 신규 의약품을 위한 우선적인 표적이 되었다. 단백질분해성 효소 활성의 측정에 대한 관심과 중요성은 연구조사와 약물의 발견 및 개발의 면에서 급속히 증가되고 있다. 아팝토시스(apoptosis)는 발생, 정상 조직 턴오버(turnover)에서 세포 사멸에 관여하는 주목할 만한 과정이며, 또한 세포독성 화합물, 저산소증 또는 바이러스 감염에 대한 노출 후 여러 세포 사멸의 원인이 된다. 여러 암 치료제는 아팝토시스의 개시를 통해 그들의 효과를 발휘한다. 심지어, 발암 과정은 때때로 아팝토시스가 중요하고도 선택적으로 실패하여 돌연변이유발성 DNA 손상이 존속되는 것에 의존하는 것으로 여겨진다. 아팝토시스는 파킨슨병 및 심부전증과 같은 만성 퇴행성 과정에 기여하는 것으로 추측된다. 여러 카스파제 효소는 아팝토시스의 매우 초기 단계를 매개하는 것으로 생각된다. 아마도 카스파제 효소가 아팝토시스에 의한 세포 사멸을 유도하는 생화학적 현상을 촉발하는데 있어서 가장 중요한 이펙터(effector) 분자이기 때문에, 카스파제 활성을 측정하기 위한 검정법은 통상적으로 사용되는 다른 여러 방법보다 조기에 아팝토시스를 검출할 수 있다.
알쯔하이머병은 4 kD 아밀로이드 β-펩티드 (Aβ)로 이루어진 불용성 아밀로이드 플라크의 세포외 침착을 특징으로 한다 (문헌 [Glenner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984,120, pp.885-890]). Aβ는 β 및 γ 세크레타제에 의한 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 단백질분해에 의해 각각 Aβ의 N 및 C-말단을 생성함으로써 유래된다 (문헌 [Kang et al., Nature 1987, 325, 733-736]). 효소 β-세크레타제는 신경 세포가 플라크를 형성하는데 필수적인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Vassar et al., Science 1999, 286, 735-741]).
알쯔하이머병에 대한 가장 최근의 치료적 접근법은 β-세크레타제 효소의 촉매활성 부위를 차단하여 그의 기능을 막는 약물의 발견과 관련이 있다. 따라서, 고처리량 스크리닝에 적합한 신속하고 민감한 검정 플랫폼을 개발하여, 상기 질병에 대항하는 신규 약물의 발견을 용이하게 하는 것이 매우 중요하다.
따라서, β-세크레타제 및 카스파제 효소와 같은 프로테아제 효소의 활성을 높은 민감도로 신속하고 정확하게 검출 및 정량하는 것이 요구되고 있다.
발명의 개요
본 발명의 제1 측면에 따라,
β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편을 포함하는 테터(tether),
복수개의 형광 종을 포함하며 상기 테터상의 제1 위치에 접합된 형광제, 및
상기 테터상의 제2 위치에 접합된 켄쳐(quencher)
를 포함하는 생체접합체가 제공된다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 상기 절편은 상기 테터상의 제1 위치와 제2 위치 사이에 존재한다. 상기한 복수개의 형광 종은 서로 결합되어 있어서 켄쳐가 형광제의 수퍼-켄칭(super-quenching)을 증폭시킬 수 있다. β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편은 펩티드 서열 SEVNLDAEF (서열 1)을 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 측면에 따라,
β-세크레타제 활성을 검정할 샘플을 상기한 생체접합체와 인큐베이션하는 단계, 및
인큐베이션된 상기 샘플의 형광을 측정하는 단계
를 포함하는, 샘플 중에서 β-세크레타제 활성을 검정하는 방법이 제공된다. 인큐베이션된 상기 샘플에서의 형광 측정량은 상기 샘플 중의 β-세크레타제 활성 의 존재 및(또는) 양에 대한 지표이다. 상기 방법은 대조군의 형광을 측정하는 단계, 및 대조군의 형광을 인큐베이션된 상기 샘플의 형광과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이때 대조군 및 인큐베이션된 상기 샘플 사이의 형광차는 상기 샘플 중의 β-세크레타제 활성의 존재 또는 양에 대한 지표이다. 상기 샘플은 β-세크레타제 및 시험 화합물을 포함할 수 있고, 상기 방법은 시험 화합물이 β-세크레타제 활성을 억제하는 능력에 대한 검정법일 수 있다. 형광제는 상기한 복수개의 형광 종과 결합된 고체 지지체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제3 측면에 따라,
β-세크레타제 활성을 검정할 샘플을, 제1 위치와 제2 위치 사이에 β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편을 포함하는 테터상의 상기 제1 위치 및 제2 위치 각각에 접합된 켄쳐 및 리간드를 포함하는 생체접합체와 인큐베이션하는 단계,
인큐베이션된 상기 샘플에, 복수개의 형광 종과 결합된 고체 지지체를 포함하는 형광제를 첨가하여 샘플 혼합물을 형성하는 단계,
생체접합체상의 리간드가 상기 고체 지지체에 결합하도록 하는 단계, 및
이어서, 샘플 혼합물의 형광을 측정하는 단계
를 포함하며, 상기 고체 지지체는 생체접합체의 리간드와 결합할 수 있는 부분을 포함하여 생체접합체가 고체 지지체에 결합될 수 있고, 상기 생체접합체와 고체 지지체가 결합하면 형광제의 수퍼-켄칭이 증폭되는 것인, 샘플 중에서 β-세크레타제 활성을 검정하는 방법이 제공된다. 샘플 혼합물의 형광량은 상기 샘플 중 의 β-세크레타제 활성의 존재 및(또는) 양을 지시한다. 상기 리간드는 바이오틴 부분일 수 있으며, 고체 지지체 상의 상기 부분은 아비딘, 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘 부분일 수 있다. 상기 방법은 생체접합체를 함유하지만 상기 효소와 인큐베이션시키지 않은 제2 샘플에 형광제를 첨가하여 대조군을 형성하는 단계, 대조군의 형광을 측정하는 단계, 및 대조군의 형광을 샘플 혼합물의 형광과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이때 대조군과 샘플 혼합물 사이의 형광차가 상기 샘플 중의 β-세크레타제 활성의 존재 및(또는) 양에 대한 지표이다. 상기 샘플은 β-세크레타제 및 시험 화합물을 포함할 수 있고, 상기 방법은 시험 화합물을 함유하지 않는 제2 샘플을 생체접합체와 인큐베이션하는 단계, 인큐베이션된 상기 제2 샘플에 형광제를 첨가하여 대조군을 형성하는 단계, 대조군의 형광을 측정하는 단계, 및 대조군의 형광을 샘플 혼합물의 형광과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이때 대조군과 샘플 혼합물 사이의 형광차가 시험 화합물이 상기 샘플 중의 β-세크레타제 활성을 억제하는 능력에 대한 지표이다.
본 발명의 제4 측면에 따라,
복수개의 형광 종을 포함하며 고체 지지체에 결합된 형광제; 및
제1 위치와 제2 위치 사이에 β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편을 포함하는 테터상의 상기 제1 위치 및 제2 위치 각각에 접합된 켄쳐 및 리간드를 포함하는 생체접합체
를 포함하는 키트가 제공된다. 상기 고체 지지체는 생체접합체상의 리간드와 결합할 수 있는 부분을 포함하고, 생체접합체의 리간드가 고체 지지체에 결합하 면, 상기한 복수개의 형광 종은 서로 결합되어 있어서 켄쳐가 형광제의 수퍼-켄칭을 증폭시킬 수 있다. 상기 리간드는 바이오틴 부분일 수 있고, 상기 리간드와 결합할 수 있는 부분은 아비딘, 뉴트라비딘 및 스트렙타비딘으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편은 펩티드 서열 SEVNLDAEF (서열 1)일 수 있다.
본 발명의 제5 측면에 따라,
β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편을 포함하는 테터,
복수개의 결합된 형광 종을 포함하는 형광제의 형광을 켄칭할 수 있으며 상기 테터상의 제1 위치에 접합된 켄쳐, 및
상기 켄쳐상의 제2 위치에 접합된 바이오틴 분자
를 포함하고, 표적 생체분자를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 상기 절편은 상기 테터 상의 제1 위치와 제2 위치 사이에 존재하며, 상기한 복수개의 형광 종은 서로 결합되어 있어서 켄쳐가 형광제의 켄칭을 증폭시킬 수 있는 것인 생체접합체가 제공된다. β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편은 펩티드 서열 SEVNLDAEF (서열 1)을 포함할 수 있다.
본 발명의 제6 측면에 따라,
표적 효소 활성을 검정할 샘플을, 표적 효소에 의해 절단될 수 있는 절편을 포함하는 테터에 접합된 켄쳐를 포함하는 생체접합체와 인큐베이션하는 단계,
인큐베이션된 상기 샘플에 형광제를 첨가하여 샘플 혼합물을 형성하는 단계,
표적 효소가 테터를 절단하도록 하고, 이때 테터가 절단되면 생체접합체보다 는 형광제와 결합하는 경향이 더 큰 켄쳐 함유 단편이 생성되는 단계, 및
이어서, 샘플 혼합물의 형광을 측정하는 단계
를 포함하며, 이때 상기 형광제는 서로 결합된 복수개의 형광 종을 포함하여 형광제와 리간드가 결합하면 형광제의 수퍼-켄칭이 증폭되는 것인, 샘플 중에서 표적 효소 활성을 검정하는 방법이 제공된다. 샘플 혼합물의 형광량은 상기 샘플 중의 표적 효소 활성의 존재 및(또는) 양을 지시한다. 켄쳐와 형광제의 결합은 쿨롱 인력, 수소 결합력, 반데르발스력 또는 공유 결합 형성의 결과일 수 있다. 예를 들어, 형광제 및 생체접합체 각각은 전체적으로 음전하를 가질 수 있으며, 켄쳐 함유 단편은 알짜 양전하를 가질 수 있다. 형광제는 음이온성 접합된 중합체일 수 있고, 켄쳐는 양이온성 전자 또는 에너지 전달 켄쳐일 수 있다. 한 실시양태에 따라, 상기 생체접합체는 D-E-V-D-QSY7' (서열 7)로 표시된다. 추가의 실시양태에 따라, 상기 형광제는 공여자 시아닌 염료들의 응집체를 포함하는 실질적인(virtual) 중합체이고, 상기 켄쳐는 수용자 시아닌 염료로서, 테터에 접합되면 공여자 시아닌 염료들과의 응집체를 형성할 수 없다. 생체접합체가 공여자 시아닌 염료들과의 응집체를 형성할 수 없는 것은, 전하의 영향 때문이거나 입체적인 영향 때문일 수 있다. 수용자 시아닌 염료는 형광성 분자 또는 비-형광성 분자일 수 있다. 수용자 시아닌 염료가 형광성 분자인 경우에는 수용자의 형광을 측정할 수 있다. 별법으로, 공여자의 형광을 측정할 수 있다. 상기 검정법은 세포내 검정일 수도 있고 또는 세포외 검정일 수도 있다.
본 발명의 제7 측면에 따라,
표적 효소 활성을 검정할 샘플을, 테터에 접합된 형광 염료를 포함하는 생체접합체와 인큐베이션하는 단계 (이때, 이 테터는 표적 효소에 의해 절단되어 형광 염료 함유 단편을 형성할 수 있는 절편을 포함하고, 이 형광 염료 함유 단편은 생체접합체와는 상이한 흡수 스펙트럼을 갖는 염료 응집체를 형성할 수 있음),
표적 효소가 생체접합체를 절단하도록 하는 단계, 및
염료 응집체가 생체접합체보다 더 높은 정도로 흡수하는 파장에서 샘플을 여기시켜서, 샘플 혼합물의 형광을 측정하는 단계
를 포함하는, 샘플 중에서 표적 효소 활성을 검정하는 방법이 제공된다. 샘플 혼합물의 형광량은 상기 샘플 중의 표적 효소 활성의 존재 및(또는) 양을 지시한다. 형광 염료는 시아닌 분자일 수 있다. 효소 절단에 의해 생체접합체로부터 방출된 형광 염료 함유 단편은 J-응집체를 형성할 수 있다. 표적 효소는 카스파제 효소일 수 있다. 예를 들어, 표적 효소는 카스파제-3일 수 있고, 생체접합체는 D-E-V-D-시아닌 (서열 8)로 표시되는 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 제8 측면에 따라,
복수개의 형광 종을 포함하는 형광제, 및
카스파제 효소에 의해 절단될 수 있는 절편을 포함하는 테터에 접합된 켄쳐를 포함하는 생체접합체
를 포함하는 키트가 제공된다. 본 발명의 이 실시양태에 따라, 테터가 절단되면 생체접합체보다는 형광제와 결합하는 경향이 더 큰, 켄쳐 함유 생체접합체 단편이 생성되고, 형광제와 켄쳐가 결합하면 형광제의 수퍼-켄칭이 증폭된다. 상기 한 복수개의 결합된 형광 종은 고체 지지체에 결합할 수 있다. 표적 카스파제 효소는 카스파제-3일 수 있고, 카스파제 효소에 의해 절단될 수 있는 절편은 펩티드 서열 DEVD (서열 9)일 수 있다. 켄쳐 함유 생체접합체 단편은 쿨롱 인력, 수소 결합력, 반데르발스력 또는 공유 결합 형성을 통해 형광제와 결합할 수 있다. 예를 들어, 형광제 및 생체접합체 각각은 전체적으로 음전하를 가질 수 있으며, 켄쳐 함유 생체접합체 단편은 알짜 양전하를 가질 수 있다.
또한, 형광제는 공여자 시아닌 염료들의 응집체를 포함하는 실질적인 중합체이고, 켄쳐는 수용자 시아닌 염료로서, 수용자는 테터에 접합되면 공여자 시아닌 염료들과의 응집체를 형성할 수 없는, 상기한 바와 같은 키트가 제공된다. 생체접합체가 공여자와의 응집체를 형성할 수 없는 것은, 전하의 영향 때문이거나 입체적인 영향 때문일 수 있다. 수용자 시아닌 염료는 형광성 분자 또는 비-형광성 분자일 수 있다.
본 발명의 제9 측면에 따라,
카스파제 효소에 의해 절단될 수 있는 절편을 포함하는 테터, 및
테터에 접합된 켄쳐
를 포함하는 생체접합체가 제공된다. 상기 카스파제 효소는 카스파제-3일 수 있고, 카스파제 효소에 의해 절단될 수 있는 절편은 펩티드 서열 DEVD (서열 9)일 수 있다. 상기 켄쳐는 양이온성 전자 또는 에너지 전달 켄쳐일 수 있다.
본 발명의 제10 측면에 따라, 표적 효소에 의해 절단되면 형광 염료 함유 단편을 생성할 수 있는 절편을 포함하는 테터에 접합된 형광 염료를 포함하는 생체접 합체가 제공된다. 상기한 형광 염료 함유 단편은 생체접합체와는 상이한 흡수 스펙트럼을 갖는 염료 응집체를 형성할 수 있다. 상기 표적 효소는 카스파제 효소, 예컨대 카스파제-3일 수 있다. 상기 형광 염료는 시아닌 염료일 수 있다. 추가의 실시양태에 따라, 절편을 함유하는 형광 염료는 J-응집체를 형성할 수 있다. 표적 효소에 의해 절단될 수 있는 절편은 펩티드 서열 DEVD (서열 9)일 수 있다.
도 1은 프로테아제 (예를 들어, β-세크레타제) 효소 활성에 대한 검정을 수행하는 2가지 일반적 반응식을 예시한다.
도 2는 카스파제-3 효소 활성에 대한 켄쳐-테터 (QT) 검정법을 예시한다.
도 3은 카스파제-3 활성에 대한 J-응집체 검정 포맷을 예시한다.
바이오센싱에 대한 켄쳐-테터-리간드 (QTL) 접근법은 전자 전달 및 에너지 전달 켄쳐에 의한 형광성 고분자전해질과 같은 형광제의 수퍼-켄칭을 이용한다. 한 포맷에서, 형광제 (예를 들어 형광성 중합체) P는 중합체 미소구와 같은 고체 지지체의 표면 상에 특이적 분석물에 대한 수용체와 함께 존재한다. 수용체는 예를 들어 공유 연결 또는 바이오틴-바이오틴 결합 단백질 (BBP) 결합에 의해 고체 지지체 (예를 들어 비드 지지체)에 부착될 수 있다. 검정은 분석물과 합성 QTL 접합체 사이의 수용체에 대한 경쟁에 기재한다. 중합체-수용체 조합의 형광은 분석물의 결합에 의해서는 영향받지 않지만, 이는 QTL이 결합될 때 켄칭된다. 작은 분자 및 단백질에 대한 정량적 검정법은 상기 기술을 사용하여 설명되어 왔다 (문헌 [Chen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 1999, 96, 12287-12292]).
2002년 8월 23일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/226,300호에는 형광제 (예를 들어 형광성 중합체) P와 켄쳐 Q를 연결시키는 반응성 테터를 포함하는 프로테아제 효소에 대한 센서가 개시되어 있다. QTL 접근법의 이러한 변형법은 "QTP"로 지칭되며, 여기서 QTP 조합은 표적 효소에 의해 인식되고 절단된 펩티드 테터를 통해 형광제 P에 연결된 켄쳐 Q를 포함한다. 효소 또는 다른 표적 분자와 QTP 분자의 특이적 결합 또는 반응의 부재하에서, P의 형광은 Q의 상대적 근접에 의해 감쇄되거나 완벽하게 켄칭된다. 테터 T가 표적에 의해 인식되고 절단될 경우, Q 및 P성분이 분리되어 P의 형광이 켜진다. T의 효소-유도된 절단이 촉매활성이기 때문에, 검출 사건의 증폭이 일어나며 따라서 매우 낮은 수준에서의 효소 검출이 가능하다.
다른 포맷에서, QTB 분자 (여기서, "B"는 바이오틴기를 지칭함)가 사용된다. 부가된 바이오틴은 센서에서 중합체와 함께 존재하는 바이오틴 결합 단백질 (BBP)에 결합하며, 켄쳐에 의한 중합체의 효율적인 켄칭을 용이하게 한다. 펩티드가 표적 효소에 의해 절단되면, 켄쳐와 바이오틴기는 서로 분리되기 때문에 중합체 형광이 켄칭되지 않는다.
프로테아제 검정을 수행하는 2가지 일반 반응식이 도 1에 예시되어 있다. 도 1 중 화살표 (17 및 34)로 표시하여 나타낸 제1 반응식에서, 켄쳐 (16), 바이오틴 부분 (12) 및 켄쳐 (16)와 바이오틴 부분 (12)을 연결시키는 테터 (11)를 포함하는 생체접합체 (10)를 프로테아제 (예를 들어 β-세크레타제) 효소 (18)와 인큐베이션한다 (17). 테터는 β-세크레타제 효소 (18)에 의해 인식될 수 있는 (예를 들어 절단될 수 있는) 인식 서열 (14)을 포함한다. 이어서, 인큐베이션된 생체접합체를 바이오틴 결합 단백질을 포함하는 형광제 (23)와 접촉시킨다 (34). 도 1에서는 형광성 중합체로 코팅되어 있으며 표면에 스트렙타비딘기 (25)를 갖는 미소구 (26)를 형광제 (23)로 나타내었다. 절단되지 않은 생체접합체 (10)의 바이오틴 부분 (12)이 형광성 중합체로 코팅된 미소구 (26)상의 스트렙타비딘 부분 (25)과 반응하면, 켄칭된 생체접합체 (28)로 나타낸 바와 같이 형광제 (23)로부터의 형광이 켄칭된다. 그러나, 프로테아제 검정을 위한 제1 반응식에 나타낸 바와 같이, 효소 (18)에 의해 테터가 절단되어 생성된 바이오틴 함유 단편 (32)의 바이오틴 부분이 미소구 (26)상의 스트렙타비딘 부분 (25)과 반응하면, 형광제 (23)로부터의 형광은 켄칭되지 않는다. 따라서, 형광을 이용하여 β-세크레타제 효소 활성의 존재 및(또는) 양을 결정할 수 있다.
도 1 중 화살표 (24 및 30)로 표시하여 나타낸 프로테아제 검정법의 제2 반응식에서, 켄쳐 (16), 바이오틴 부분 (12) 및 켄쳐 (16)와 바이오틴 부분 (12)을 연결시키는 테터 (11)를 포함하는 생체접합체 (10)를 먼저 바이오틴 결합 단백질을 포함하는 형광제 (23)와 접촉시킨다 (24). 테터 (11)는 β-세크레타제 효소 (18)에 의해 인식될 수 있는 (예를 들어 절단될 수 있는) 인식 서열 (14)을 포함한다. 절단되지 않은 생체접합체 (10)의 바이오틴 부분 (12)이 형광성 중합체로 코팅된 미소구 (26) 상의 스트렙타비딘 부분 (25)과 반응하면, 켄칭된 생체접합체 (28)로 나타낸 바와 같이 형광제 (23)로부터의 형광이 켄칭된다. 이어서, 생성된 켄칭된 생체접합체 (28)를 프로테아제 (예를 들어 β-세크레타제) 효소 (18)와 인큐베이션한다 (30). 효소 (18)에 의해 테터가 절단되어 켄쳐 함유 단편 (22)이 형광제 함유 단편 (32)으로부터 분리된다. 결과적으로, 형광제로부터의 형광은 증가된다 (즉, 형광제의 켄칭량은 감소된다).
QTB 검정법에 사용되는 펩티드 기질은 표적 효소에 의해 인식되고 절단될 수 있는 중간의 펩티드 서열, QTB가 중합체-수용체 조합에 결합하는 것을 용이하게 하는 한쪽 말단 상의 바이오틴 관능기 및 중합체에 근접할 때 중합체 형광을 효율적으로 켄칭하는 켄쳐를 포함하는 3관능성이다.
β-세크레타제 효소는 하기 펩티드 서열을 인식하여 결합하는 것으로 나타났다.
SEVNLDAEF (서열 1).
문헌 [Cai et al., Science 1993, 259, 514-516]. 결합 후, 상기 효소는 루이신과 아스파르트산 사이의 펩티드 결합을 절단한다. 본 발명의 한 실시양태에 따라, β-세크레타제에 대한 QTB 펩티드 기질은 한쪽 말단에는 바이오틴에 의해 플랭킹(flanking)된 상기 서열 및 다른 말단에는 켄쳐를 포함한다.
β-세크레타제에 대한 검정법에 사용될 수 있는 예시적인 펩티드 기질의 구조는 하기에 열거되어 있다.
(QSY-7)-TEEISEVNLDAEFK-(Nε-바이오틴) (서열 2),
(QSY-7)-TEEISEVNLDAEFK-(Nε-PEG-바이오틴) (서열 3),
(AZO)-TEEISEVNLDAEFK-(Nε-바이오틴) (서열 4), 및
(AZO)-TKKISEVNLDAEFRK-(Nε-바이오틴) (서열 5)
(여기서, QSY-7, AZO, 바이오틴 및 PEG-바이오틴은
Figure 112006003797927-PCT00001
[이때, "*"는 각 부분이 폴리펩티드에 부착되는 지점을 나타냄]
의 구조를 갖는 부분을 나타내고,
"Nε"은 바이오틴 부분이 리신 잔기의 ε-아미노기 (K)를 통해 폴리펩티드 테터의 리신 잔기에 연결되는 것을 나타냄).
상기 나타낸 바와 같이 QSY-7 및 아조 부분은 폴리펩티드의 N-말단 트레오닌 잔기의 아미노기를 통해 폴리펩티드에 부착된다.
따라서, β-세크레타제가 펩티드 테터를 절단하면 바이오틴은 생성된 단편의 하나에 남아 있을 것인 반면, 켄쳐는 이로부터 물리적으로 분리되어 다른 단편상에 남는다. 따라서, 켄쳐는 형광제-수용체 조합을 결합시키는 것을 보조하는 바이오틴 부분이 없어진다. 결과적으로, 절단된 기질의 바이오틴 함유 단편은 조합의 형광을 켄칭하지 않아야 한다.
바이오틴은 구체적으로 중합체-BBP 조합의 BBP에 결합함으로써 중합체 및 켄쳐를 함께 가져오는 QTB 생체접합체에 포함된다. 바이오틴과 BBP 사이의 상호작용이 상기와 같이 개시되어 있지만, 바이오틴-BBP 상호작용은 형광제와 켄쳐를 유니팅(uniting)할 수 있는 임의의 시스템으로 용이하게 대체될 수 있다. 예를 들어 유니팅 상호작용은 임의의 생물학적 항원-수용체 배합 또는 금속-리간드 결합, 또는 2종 이상의 반응 종 사이의 화학 반응일 수 있다. 상호작용의 예로는 수소 결합, 쿨롱 인력 또는 공유 결합을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
켄쳐 Q는 여기된 중합체로부터 방사성 에너지를 흡수하여 형광을 켄칭하도록 설계된다. 예시적인 켄쳐로는 중성으로 대전되거나 양으로 대전되거나 음으로 대전된 또는 양쪽-이온성, 비-형광성 또는 형광성, 유기, 무기, 유기금속성, 생물학적 또는 중합체성 또는 에너지 또는 전자-전달 종 등의 종을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 한 실시양태에 따라, 켄쳐는 QSY-7 또는 아조 염료와 같은 비-형광성 작은 분자 염료이다. 한 실시양태에 따라, 켄쳐는 형광제의 상기한 복수개의 형광 종을 증폭-켄칭 또는 수퍼-켄칭할 수 있다. 추가의 실시양태에 따라, 켄쳐는 형광제로부터 흡수된 방사성 에너지를 형광으로 재방출할 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따라, 생체접합체의 테터는 하기 펩티드 서열을 포함할 것이다.
SEVNLDAEF (서열 1).
상기 서열은 보다 많은 아미노산 또는 다른 화학적 및 생물학적 인자에 의해 어느 측면 상에도 플랭킹될 수 있다. QTB 테터의 길이는 검정에 중요하지 않다. 본 발명의 실시양태에 따라, QTB가 중합체-수용체 조합에 결합하면 켄쳐는 중합체와 대략 100 Å 내의 간격을 이룬다. 상기 간격은 매우 긴 QTB 테터에 대해서도 달성될 수 있는데, 이는 이들이 통상적으로, 켄쳐를 중합체에 가까이 가져가기 쉬운 어떤 2차 폴딩된 배위로 존재하기 때문이다.
형광제 (F)는 복수개의 형광 종을 포함한다. 예시적인 실시양태에 따라, 형광제는 중성으로 대전되거나 양으로 대전되거나 음으로 대전된 또는 양쪽-이온성일 수 있는 접합된 중합체이다. 형광제 (F)는 또한 J형 응집 거동을 나타내는 팬던트 형광 염료를 갖는 비-접합된 주쇄를 포함하는 측쇄 중합체일 수 있다. 형광제는 또한 고체 표면 상에 응집되어 "실질적인" 중합체를 형성하는 복수개의 독립적인 작은 분자 형광성 발색단을 포함한다.
예시적인 형광성 중합체 (1) 및 (2)의 구조는 하기와 같다.
Figure 112006003797927-PCT00002
본 발명의 한 실시양태에 따라, 형광성 중합체는 용액 중의 또는 고체 지지체에 고착된 바이오틴 결합 단백질 (BBP)과 함께 존재한다. 한 실시양태에서, 상기 화학식 (1)에 기재된 바와 같은 양으로 대전된 PPE 중합체는 직경이 0.6 ㎛인 뉴트라비딘-관능화된 음이온성 카르복실산-결합된 라텍스 미소구 상에 흡수적으로 코팅된다 (중합체 조합 A). 또다른 실시양태에서, 상기 화학식 (2)로 표시되는 바이오티닐화된 음이온성 PPE 중합체는 아비딘과 복합체를 형성하여 용액 센서 조합을 형성한다 (중합체 조합 B). 중합체는 바이오틴-아비딘 상호작용을 통해 아비딘에 결합하여 QTB 생체접합체에 이용가능한 유리 바이오틴 결합 부위를 포함하는 가교된 상위-분자 조합을 형성한다. 이들의 켄칭 거동은 혼합물 중 중합체 (2) 및 BBP의 비율을 변화시킴으로써 최적화할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 중합체 포맷의 각각은 바이오티닐화된 R-피코에리트린 (BRPE)을 첨가함으로써 개선될 수 있다. 생성된 포맷은 중합체 조합 C 및 D로 표시된다. BRPE 도판트의 존재하에서, 여기된 중합체 발색단은 그 에너지를 가까운 BRPE 분자에 전달한 후, 그 에너지를 보다 효율적으로 재방출하여 샤프한 적색-쉬프팅된 형광성 신호를 제공한다. 이어서, BRPE의 형광은 QTB가 결합할 때 켄칭된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 형광성 중합체는 피코에리트린 또는 피코빌리솜을 포함하는 생물학적 조합이다. 에너지를 수확하고 온건하게 보호된 방출 부위에서 이를 수집하는 약 34개 발색단을 함유하는 중합체성 조합으로 이루어진 상기 단백질은, 공지된 가장 형광성인 인자의 일부이며, 바이오틴 결합 단백질에 접합되면 β-세크레타제 및 다른 프로테아제에 대한 QTP 검정법에서 우수한 센서로서 기능한다 (중합체 조합 E). 예를 들어, 1:1 공유스트렙타비딘-B-피코에리트린 접합체 (SAv-BPE)는 스테른-볼머(Stern-Volmer) 켄칭 상수가 형광성 접합제의 2.5 nM 용액에 대해 약 1 x 108 M-1인 것으로서 증명되듯이, 서열 2로 표시되는 β-세크레타제 펩티드 기질의 존재하에서 수퍼-켄칭을 나타낸다.
β-세크레타제에 대한 QTP 검정법은 본 명세서에 기재한 다양한 중합체 포맷 및 펩티드 기질을 사용하여 최적화되었다. 중합체 광 수확 특성에 의해 제공된 검출 민감도의 증폭은 켄쳐의 수퍼-켄칭 효율과 조합되어 QTP 검정법을 다른 형광 기재 검정법보다 상당히 더 민감하게 한다.
센서의 한 실시양태에서, QTB를 중합체-수용체 조합과 인큐베이션하여 QTP 단위를 형성한다. 이어서, QTP에 대한 효소를 함유하는 샘플을 QTP에 노출시킨 후, 연속적인 모니터링 포맷으로 형광을 "회수"함으로써 β-세크레타제에 대한 검정을 수행한다. QTP 단위는 켄쳐가 중합체에 근접할 때는 형광이 거의 없거나 전혀 없다. 샘플에 존재하는 효소의 활성에 따라, 펩티드 기질의 절단이 일어나 켄칭 반응의 감소, 즉 샘플 중의 효과가 증가된 형광을 초래한다. 센서의 또다른 실시양태에서, QTB 전체를 β-세크레타제 효소-함유 샘플에 노출시킨 후 CRT에서 단시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 중합체-수용체 조합을 샘플에 첨가하고, 최종 혼합물의 형광 강도를 측정한다. 이렇게 측정된 형광을 효소가 없는 동일량의 QTB 및 중합체를 함유하는 샘플과 비교함으로써, 효소 활성에 단독으로 기여하는 형광 증가를 수득한다. 효소 및 기질의 인큐베이션은 QTB 기질에 대한 효소 활성이 최대가 되도록 최적화된 완충 용액 (검정 완충액)에서 수행한다. 중합체는 통상적으로 반응 혼합물에 첨가시 반응을 중단시키고 중합체-QTB 상호작용으로부터 켄칭 반응을 최대로 제공하는 2중 작업을 수행하도록 최적화된 완충 용액 (중합체 완충액)에서 이루어진다. 센서의 본 실시양태에서, QTL 검정법은 30분에 1 nM 미만 농도의 용액 중의 β-세크레타제 활성을 검출할 수 있다.
또다른 실시양태에서, QTL 검정법은 미지의 샘플 중의 β-세크레타제 활성 억제를 검출할 수 있다. 반응 혼합물 중 임의의 억제성 물질의 부재하에서는 효소는 존재하는 반응성 테터의 대부분을 절단할 것이지만, 효과적인 억제제의 존재하에서는 효소는 그의 활성을 대부분 소실할 것이다. QTL 검정법은 이러한 샘플 중의 "형광 회수"를 감소시키거나 완전히 소실시킴으로써 효소 활성의 부분적 또는 전체적 억제의 증거를 제공한다.
예시적인 형광제로는 복수개의 형광성 반복 단위 또는 복수개의 형광 종과 결합된 고체 지지체를 포함하는 중합체 또는 올리고머를 들 수 있다. 고체 지지체가 사용될 경우, 1개 이상의 켄쳐는 각각, 반응성 테터를 통해 고체 지지체에 연결될 수 있다. 예시적인 고체 지지체로는 스트렙타비딘으로 코팅된 구, 중합체 미소구, 실리카 미소구, 유기 나노입자, 무기 나노입자, 자성 비드, 자성 입자, 반도체 나노입자, 양자 도트, 막, 슬라이드, 플레이트, 및 시험관을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 형광제는 접합된 고분자전해질, 바이오티닐화된 접합된 고분자전해질, 관능화된 접합된 올리고머, 대전된 접합된 중합체, 대전되지 않은 접합된 중합체, 접합된 중합체 블렌드, 및 조립된 단량체 또는 올리고머를 포함하는 J-응집된 중합체 조립체로 구성된 군에서 선택된다. 예를 들어, 형광제는 시아닌 펜던트기를 갖는 폴리(L-리신) 중합체 또는 올리고머일 수 있다. 형광제는 또한 실질적인 중합체일 수 있다. 별법으로, 형광제는 올리고당류로부터 제조될 수 있다.
형광성 중합체 또는 올리고머는 고체 지지체로의 공유 부착, 고체 지지체 표면상으로의 흡착, 또는 형광성 중합체 또는 올리고머상의 바이오틴 부분과 고체 지지체 표면상의 아비딘, 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘 부분 사이의 상호작용에 의해 고체 지지체에 결합될 수 있다.
형광제는 단백질 분자를 통해 테터에 접합될 수 있다. 예시적인 단백질 분자는 아비딘, 뉴트라비딘 및 스트렙타비딘을 포함한다.
한 실험에서, STA-200이라 불리는 β-세크레타제의 잘 알려진 스타틴-유래의 펩티드 억제제는, 샘플을 단지 15분 동안 인큐베이션했을 때, 나노몰 농도 범위의 IC50 값을 제공하는 것으로 나타났다. β-세크레타제의 스타틴-유래의 펩티드 억제제의 구조는 하기 식으로 제시된다:
KTEISEVN-(Sta)-VAEF-OH (서열 6)
상기 식에서, "Sta"는 스타틴 잔기를 나타낸다. 본 발명의 현 실시양태에서, 96-웰 또는 384-웰 플레이트와 같은 마이크로웰 플레이트의 웰에서 검정을 수행한다. 따라서, 검정은 대부분의 약물 스크리닝 실험실에서 이용가능한 통상의 마이크로플레이트 판독기에서 수행하는 것이 편리하다. 이러한 검정은 β-세크레타제 효소 활성을 균일하고, 민감하며, 신속하게 검출한다. 본 발명의 현 실시양태에서, β-세크레타제에 대한 QTL 검정은 반응 혼합물 중의 DMSO의 존재에 대해 최대 10％ 정도까지 관용성이다. 이 검정은 반응 혼합물 중의 메탄올 및 아세토니트릴의 존재에 대해 최대 10％까지 관용성이다. 따라서, 검정은 펩티드 기질에 대한 β-세크레타제의 활성을 억제하는 효율에 대하여 잠재적인 약물을 평가하는, 고-처리량 포맷의 잠재적인 약물 스크리닝에 적합하다. 본 발명의 현 실시양태에서, 검정은 매우 우수하며, 펩티드 기질의 대략 10％의 전환에서 0.6 이상의 Z'-값을 제공한다.
본 발명의 추가의 실시양태에 따라,
표적 효소 활성을 검정할 샘플을, 표적 효소를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편을 포함하는 테터에 접합된 켄쳐를 포함하는 생체접합체와 인큐베이션하는 단계,
인큐베이션된 상기 샘플에 형광제를 첨가하여 샘플 혼합물을 형성하는 단계,
표적 효소가 생체접합체를 절단하도록 하여, 켄쳐가 방출되도록 하는 단계, 및
이어서, 샘플 혼합물의 형광을 측정하는 단계
를 포함하며, 이때 상기 형광제는 서로 결합된 복수개의 형광 종을 포함하여 형광제와 켄쳐가 결합하면 형광제의 수퍼-켄칭이 증폭되는, 샘플 중에서 표적 효소 활성을 검정하는 방법이 제공된다. 샘플 혼합물의 형광량은 상기 샘플 중의 표적 효소 활성의 존재 및(또는) 양을 지시한다.
상기 검정은 첨가된 형광제와 상호작용하여 그의 형광을 켄칭할 수 없는 켄쳐-테터 (QT) 생체접합체를 이용한다. 표적 효소에 의한 절단시, 켄쳐는 생체접합체로부터 방출되며, 따라서 형광제와 상호작용하여 형광 켄칭 반응을 유발한다. 켄쳐와 형광제 사이의 상호작용은 쿨롱 인력, 수소 결합력, 반데르발스력 또는 공유 결합 형성의 결과일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에 따라, 형광제는 음이온성 접합된 중합체이고, 켄쳐는 양이온성 전자 또는 에너지 전달 켄쳐이다. 이러한 실시양태에 따라, 켄쳐-테터 생체접합체는 전체적으로 음전하를 갖기 때문에, 형광제와 상호작용하지 않으며 형광제를 켄칭하지 않는다. 그러나, 표적 효소에 의한 생체접합체의 절단시, 양이온성 켄쳐가 방출되며, 이로써 형광제를 켄칭할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 형광제는 공여자 시아닌 염료들의 응집체를 포함하는 "실질적인 중합체"이고, 켄쳐는 수용자 시아닌 염료이다. 이러한 실시양태에 따라, 수용자가 테터에 접합되면 공여자 시아닌 염료들과의 응집체에 포함될 수 없어서 공여자 형광을 켄칭하지 않는다. 생체접합체가 공여자와의 응집체를 형성할 수 없는 것은, 전하로 인한 영향이거나, 입체적인 영향이거나, 또는 이들의 조합 때문일 수 있다. 그러나, 테터가 표적 효소에 의해 절단되는 경우, 켄쳐 함유 생체접합체 단편은 공여자 시아닌 염료들과의 응집체에 포함될 수 있으며, 그 결과로서 공여자 형광을 켄칭한다. 수용자 시아닌 염료는 형광성 분자 또는 비-형광성 분자일 수 있다. 수용자 시아닌이 그 자체로 형광성인 경우에는 이것이 공여자 시아닌과의 응집체에 포함됨으로써 수용자로부터의 형광을 감작할 수 있게 된다. 따라서, 공여자의 형광 강도 감소 또는 수용자의 신호 강도 증가에 따라 샘플을 효소 활성에 대하여 모니터링할 수 있다. 이러한 실시양태에 따른 검정은 세포내 및 세포외 검정 포맷 둘 다로 효소 활성을 결정할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에 따라,
표적 효소 활성을 검정할 세포내 또는 세포외 샘플을, 테터에 접합된 형광 염료를 포함하는 생체접합체와 인큐베이션하는 단계,
효소가 생체접합체를 절단하여 염료가 방출되도록 하는 단계, 및
이어서, 샘플을 염료 응집체는 흡수하지만 염료로 표지된 생체접합체는 흡수하지 않는 파장에서 여기시켜서, 샘플 혼합물의 형광을 측정하는 단계
를 포함하며, 형광 염료가 효소에 의해 생체접합체로부터 절단되는 경우에 J형 응집체와 같은 응집체를 형성할 수 있고, 테터는 상기 효소를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편을 포함하는, 세포내 또는 세포외 샘플에서 표적 효소 활성을 검정하는 벙법이 제공된다. 샘플 혼합물의 형광량은 상기 샘플 중의 표적 효소 활성의 존재 및(또는) 양을 지시한다.
본 발명의 이러한 실시양태에 따라, 형광 염료는 테터에 접합되는 경우에 단량체로서 존재하며 넓은 흡수 및 방출 스펙트럼을 갖는 시아닌 분자일 수 있다. 표적 효소에 의한 테터의 절단시, 형광 염료 함유 단편이 생체접합체로부터 방출되며, 단량체에 비해 더 긴 파장 및 훨씬 더 좁은 스펙트럼에 대해 흡수 및 방출 최대값의 큰 이동(shift)을 나타내는, J-응집체와 같은 약하게 결합된 응집체를 형성할 수 있다. 따라서, 샘플을 응집체에 대한 흡수 최대값에서 여기시킴으로써 샘플로부터의 방출을 모니터링하면 생체접합체 자체로부터 신호가 적게 생성되거나 전혀 생성되지 않을 것이다. 생체접합체의 효소 절단시 얻어진 유리 염료 분자에 의해 형성된 염료 응집체의 존재하에, 샘플은 효소 활성을 지시하는 강도를 갖는 신호를 제공할 것이다.
문헌 [Lu et al., "Surface Enhanced Superquenching of Cyanine Dyes as J-Aggregates on Laponite Clay Nanoparticles", Langmuir, Vol. 18, No. 20, pp. 7706-7713 (2002)]은 J-응집체를 형성시킬 수 있는 시아닌 염료를 개시한다. 또한, 이 문헌은 J-응집된 공여자 시아닌 염료들의 형광을 켄칭할 수 있는 수용자 시아닌 염료를 개시한다. 문헌 [Lu et al., "Superquenching in Cyanine Pendant Poly(L-lysine) Dyes: Dependence on Molecular Weight, Solvent, and Aggregation", J. Am. Chem. Soc., Vol. 124, No. 3 (2002)]은 J-응집체 중합체를 개시한다.
실험
β- 세크레타제 활성의 결정을 위한 일반적인 검정 절차
384-웰 플레이트에서, 적정 농도의 β-세크레타제 펩티드 기질 용액 5 mL를 소정량의 β-세크레타제 효소와 함께 10 mL의 총 부피로 검정 완충액 중에 혼합하였다. 동일 플레이트에서, 검정 완충액 중에 동일량의 펩티드를 넣지만 효소는 첨가하지 않는 대조군 실험을 또한 설정하였다. 이 실험은 일반적으로 샘플 및 대조군 둘 다에 대해 3벌 세트로 수행하였다. CRT에서 소정의 기간 동안 인큐베이션한 후, 중합체 완충액 중의 형광성 중합체를 샘플 및 대조군 웰에 첨가하였다. 플레이트 판독기 내부의 웰 플레이트를 진탕하고, 샘플의 형광 강도를 측정하였다. 샘플 및 대조군 웰 사이의 상대적 형광 유닛의 차이는 효소 활성에 대한 측정치이다.
상기 예에서, 중합체는 이하의 것들 중 어떤 것을 포함할 수 있다:
A. 접합된 중합체 1로 코팅된 바이오틴 결합 단백질 (BBP) 관능화된 폴리스티렌 라텍스 카르복실산 미소구,
B. BBP 및 바이오티닐화 중합체 2의 용액 복합체,
C. 피코에리트린 또는 바이오틴에 접합된 관련 형광성 단백질을 소량으로 도핑한 A에서와 같은 미소구,
D. 피코에리트린 또는 바이오틴에 접합된 관련 형광성 단백질을 소량으로 도핑한 B에서와 같은 용액 센서, 및
E. 피코에리트린 또는 또다른 형광성 단백질 및 BBP의 공유 접합체.
상기 실험에서의 펩티드 기질은 상기 나열된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 이들 펩티드는 모두 β-세크레타제 효소에 의해 인식 및 절단되는 아미노산 서열을 함유한다. 또한, 각각의 기질에서 한쪽 말단에는 바이오티닐기로, 다른쪽 말단에는 켄쳐 분자로 태그가 부착될 수 있다.
하기 실시예는 다양한 중합체 포맷 및 다양한 펩티드를 이용하여 샘플 중 β-세크레타제의 활성을 결정함으로써, β-세크레타제의 공지된 억제제의 존재하에 효소 활성의 억제를 입증하고, 다양한 잠재적인 방해물질(interferent), 예를 들어 유기 용매, 착색된 화합물, 형광성 화합물, 통상적으로 발견되는 단백질, 계면활성제, 및 양으로 대전된 이온 및 음으로 대전된 이온이 이들의 생리학적 농도로 존재하는 경우에 검정의 우수성을 증명하는, QTP 검정의 능력을 예시한다.
실시예 1
384-웰 플레이트의 웰에서 검정 완충액 중 400 nM BSEC-1 용액 5 ㎕에 검정 완충액 5 ㎕ 중의 β-세크레타제 효소 20 ng을 첨가하였다. 대조군 웰에서는 400 nM BSEC-1 용액 5 ㎕를 아무런 효소 없이 검정 완충액 5 ㎕과만 혼합하였다. 상기 혼합물을 CRT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간이 끝났을 때, 1 ×107개 미소구를 함유하는 중합체 A의 현탁액 18.5 ㎕를 각 웰에 가하였다. 상기 플레이트를 마이크로플레이트 판독기 내에서 60초 동안 진탕시킨 후에 상기 샘플을 420 nm에서 여기시켜서 샘플을 530 nm에서의 방출에 대해 프로빙(probing)하였다. 475 nm 컷오프(cut-off) 필터를 사용하여 측정하였다. 샘플 및 대조군의 측정은 각각 3벌로 수행하였고, 결과를 평균내어 신뢰성높은 데이타를 얻었다. 대조군에 대하여 얻은 상대적 형광 유닛 (RFU, Relative Fluorescence Unit)은 5529±286이었지만, 샘플의 RFU는 9045±109였다. 대조군에 대한 샘플 RFU의 상승치 (델타라고도 불림)는 상기 샘플 중의 β-세크레타제 활성에 직접 비례한다.
실시예 2
아조 염료 켄쳐를 함유하는 BSEC-2 펩티드를 실험에 사용하면, 검정 성능이 향상되는 것으로 나타났다. BSEC-3의 400 nM 용액 5 ㎕에 β-세크레타제 (60 ng)의 5 ㎕ 용액을 가하였다. 이때, 대조군 웰은 실시예 1에서와 같이 설정하였다. 효소 및 대조군 웰을 단지 10분 동안만 CRT에서 인큐베이션한 다음, 중합체를 첨가하였다. 각 웰에 가해진 중합체 현탁액은 20 ㎕ 중 1×107 미소구를 함유하였다. 샘플을 440 nm에서 여기시키고 475 nm 컷오프 필터를 사용하여, 샘플을 530 nm에서 형광 강도에 대하여 프로빙하였다. 대조군에 대해 얻어진 RFU는 8111±707이었으며, 샘플에 대해서는 10996±424의 RFU가 얻어졌다.
실시예 3
중합체 미소구 샘플 A를 소량의 바이오틴-R-피코에리트린 (바이오틴-R-PE) 접합체으로 도핑하여 검정 성능을 추가로 개선시켰다. 한 실험에서, BSEC-1, BSEC-3 (a,b) (여러 제조자에 의해 합성된 동일한 펩티드 기질) 및 BSEC-4를 모두 동일한 조건하에 β-세크레타제 효소에 노출시켜 검정에서 이들의 효율을 비교하였다. 실험 시작 직전에 중합체 A와 바이오틴-R-PE를 10 ㎕의 부피 중에 바이오틴-R-PE 100 fmol/웰로 도핑된 5×106개 미소구가 제공되도록 고안된 비율로 한데 혼합하여 중합체 샘플 C를 새로 제조하였다.
별개의 웰에서 검정 완충액 중 각 펩티드 기질의 300 nM 용액 5 ㎕에 검정 완충액 5 ㎕ 중 β-세크레타제 효소 10 ng을 첨가하여 반응을 개시하였다. 각 반응을 3벌로 수행하였다. 대조군은 효소 없이 각 펩티드에 대하여 4벌로 수행하였다. 샘플을 CRT에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간이 끝났을 때, 바이오틴-R-PE 도핑된 중합체 C를 각 웰에 가하였다. 플레이트를 플레이트 판독기에서 60초 동안 진탕한 다음, 440 nm에서 여기시키고 475 nm 컷오프 필터를 사용함으로써 576 nm에서의 방출에 대하여 프로빙하였다. BSEC-1은 대조군에 대하여 6270±196의 RFU 값을 제공하였으며, 샘플에 대해서는 9645±152의 RFU 값을 제공하였다. BSEC-3a는 대조군에 대하여 7656±20 및 샘플에 대하여 15022±743의 RFU를 제공한 반면, BSEC-3b는 대조군 및 샘플에 대하여 각각 6054±41 및 12265±913의 RFU를 제공하였다. 비교로서, BSEC-4는 대조군 및 샘플에 대하여 각각 9207±364 및 9732±319의 값을 제공하였다.
실시예 4
아비딘 (바이오틴 결합 단백질, BBP) 56.5 nmol 및 바이오티닐화 PPE 중합체 2 848 nmol을 11.3 ㎕의 총 부피로 한데 혼합하여 중합체 용액 센서 B를 제조하고, 24시간 동안 CRT에서 인큐베이션하였다. 중합체 및 BBP는 바이오틴-아비딘 상호작용을 통해 서로 복합체를 이루어 안정한 인자를 형성시킨다. 이와 같이 제조된 용액 센서를 각 실험의 초기에 중합체 완충액으로 적절히 희석시켰다.
실시예 5
384 웰 플레이트에서 검정 완충액 중 400 nM BSEC-1 용액 5 ㎕에 검정 완충액 5 ㎕ 중에 용해된 β-세크레타제 30 ng을 첨가하였다. 혼합물을 3벌로 만들고, CRT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 대조군 웰은 펩티드만을 함유하였으며, 효소는 함유하지 않았다. 인큐베이션 후, 상기 용액 센서를 100배 희석하여 각 웰에 20 ㎕로 가하였다. 플레이트를 마이크로플레이트 판독기 내에서 진탕하고, 440 nm에서 중합체를 여기시키고 530 nm에서의 방출 강도를 측정하여 웰을 프로빙하였다. 대조군 웰은 5400±200의 평균 RFU 값을 제공하였으며, 효소를 함유하는 샘플 웰은 8350±200의 RFU를 제공하였다.
실시예 6
용액 센서 중합체 B를 소량의 바이오틴-R-PE로 도핑하여 검정 성능을 훨씬 개선시켰다. 중합체 B의 마스터 스톡(master stock)을 바이오틴-R-PE로 200배 희석한 (혼합물 40 ㎕ 중 후자를 250 fmol 제공하는 비율로 희석함) 희석물을 인큐베이션함으로써 각 실험의 초기에 중합체 센서 D를 제조하였다. 검정 완충액 중 BSEC-3의 300 nM 용액 5 ㎕에 검정 완충액 5 ㎕ 중 β-세크레타제 효소 30 ng을 첨 가하였다. 대조군 및 샘플 혼합물을 30분 동안 CRT에서 인큐베이션한 다음, 도핑된 용액 센서 D 40 ㎕를 각 웰에 가하였다. 상기 플레이트를 플레이트 판독기 내에서 60초 동안 진탕하고, 중합체를 440 nm에서 여기시키고, 475 nm 컷오프 필터를 사용하여 576 nm에서 방출을 측정함으로써 웰을 형광 강도에 대하여 프로빙하였다. 대조군 웰은 5200±100의 평균 RFU 값을 제공하였으며, 샘플 웰은 14500±200의 상응하는 값을 제공하였다.
실시예 7
피코에리트린과 같은 다수의 발색단을 함유하는 고형광성 단백질을 β-세크레타제에 대한 QTL 검정에서 독립적으로 사용할 수 있었다. 검정 완충액 중의 300 nM BSEC-1 용액 5 ㎕에 검정 완충액 5 ㎕ 중의 β-세크레타제 20 ng을 첨가하였다. 대조군 웰은 BSEC-1만을 함유하고 효소를 함유하지 않았다. 혼합물을 30분 동안 인큐베이션한 후, 스트렙타비딘-B-피코에리트린 접합체 (SAv-BPE, 중합체 E)의 5 nM (50 fmol) 용액 10 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 플레이트 판독기 내에서 진탕하고, 490 nm에서 여기시키고 515 nm 컷오프 필터를 사용하여 샘플 및 대조군 웰의 형광 강도를 576 nm에서 측정하였다. 대조군 웰은 7671±286의 평균 RFU을 수득한 반면, 효소 웰은 11828±556의 대응값을 수득하였다.
BSEC-1 대신에 BSEC-3으로 동일한 조건하에서 검정을 수행한 경우, 델타 RFU는 보다 양호하였다: 대조군의 RFU는 11639±335이었고, 샘플의 RFU는 18032±228이었다.
실시예 8
STA-200는 β-세크레타제 활성의 억제제로서 익히 공지되어 있다. 검정 완충액 중의 800 nM BSEC-1 용액 2.5 ㎕에 β-세크레타제 30 ng을 첨가하고, 검정 완충액으로 부피가 총 10 ㎕가 되게 하였다. 또다른 웰에서는, 800 nM BSEC-1 용액 2.5 ㎕를 STA-200 용액 2.5 ㎕와 β-세크레타제 30 ng을 미리 혼합시킨 용액과 인큐베이션하여, 최종 부피는 역시 10 ㎕이었다. 또한, 2개의 대조군 반응물을 한쪽은 검정 완충액 중에 오직 펩티드만을 함유하고 다른 쪽은 검정 완충액 중에서 인큐베이션한 펩티드 및 억제제를 함유하는 별개의 웰에 넣었다. 모든 샘플을 CRT에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 중합체 완충액 중의 중합체 A 현탁액 (1 x 107개의 미소구) 19.2 ㎕의 각각에 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 440 nm에서 여기시키고 475 nm 컷오프 필터를 사용하여 530 nm에서의 방출에 대해 프로빙하였다. 펩티드와 효소 단독의 혼합물은 4468±85의 대조군-초과-델타(delta-over-control) RFU를 나타내었다. 이에 비해, 펩티드, 효소 및 60 nM STA-200 (600 fmol)의 혼합물은 2746±241의 대조군-초과-델타 RFU를 나타내었고, 반면에 250 nM STA-200 (2.5 pmol)을 함유하는 혼합물은 오직 865±178의 대응값을 나타내었다.
다른 프로테아제 효소에 대한 펩티드 기질, 키트 및 검정
β-세크레타제에 대한 펩티드 기질, 키트 및 검정을 상기 개시하였다. 이하에서는 카스파제 효소와 같은 다른 프로테아제 효소에 대한 검정에 사용할 수 있는 예시적인 펩티드 기질에 대해 논의한다. 카스파제-3 효소 활성에 대한 특이적 기질도 또한 하기 기재한다.
특히, 샘플에서의 표적 효소 활성에 대한 검정 방법을 제공하며, 상기 방법은 표적 효소 활성을 검정할 샘플을, 표적 효소에 의해 절단될 수 있는 절편을 포함하는 테터에 접합된 켄쳐를 포함하는 생체접합체와 인큐베이션하는 단계, 인큐베이션된 상기 샘플에 형광제를 첨가하여 샘플 혼합물을 형성하는 단계 (이때 상기 형광제는 서로 결합된 복수개의 형광 종을 포함하여 형광제와 켄쳐가 결합하면 형광제의 수퍼-켄칭이 증폭됨), 및 표적 효소가 테터를 절단하도록 하고, 이때 테터가 절단되면 생체접합체보다는 형광제와 결합하는 경향이 더 큰 켄쳐 함유 생체접합체 단편이 생성되는 단계, 및 이어서, 샘플 혼합물의 형광을 측정하는 단계를 포함한다. 샘플 혼합물의 형광량은 상기 샘플 중의 표적 효소 활성의 존재 및(또는) 양을 지시한다. 켄쳐와 형광제 사이의 결합은 쿨롱 인력, 수소 결합력, 반데르발스력 또는 공유 결합 형성의 결과일 수 있다. 예를 들어, 형광제 및 생체접합체 각각은 전체적으로 음전하를 가질 수 있으며, 켄쳐 함유 단편은 알짜 양전하를 가질 수 있다. 형광제는 음이온성 접합된 중합체일 수 있고, 켄쳐는 양이온성 전자 또는 에너지 전달 켄쳐일 수 있다.
생체접합체는 하기 화학식으로 표시될 수 있다:
D-E-V-D-QSY7' (서열 7)
(여기서, "QSY7'"는
Figure 112006003797927-PCT00003
[이때, "*"는 켄쳐 부분이 테터에 부착되는 지점을 나타냄]
로 표시되는 켄쳐 부분을 나타냄).
서열 7로 표시되는 펩티드 기질에서, 켄쳐 부분은 켄쳐상의 아미노기를 통해 C-말단 아스파르트산 잔기의 α-카르복실산기에 부착된다.
폴리펩티드 테터는 켄쳐상의 아민기를 통해 켄쳐에 접합될 수 있다. 아민기를 통해 켄쳐에 접합될 수 있는 예시적인 켄쳐를 하기 나타낸다:
Figure 112006003797927-PCT00004
1급 아민기를 통해 폴리펩티드 테터에 접합되는 경우, 이 켄쳐는 QSY7' 켄쳐 부분을 형성한다. 아민기를 갖는 다른 켄쳐도 사용할 수 있다. 상기 켄쳐들은 공지된 화학 합성 기술을 이용하여 합성할 수 있다.
서열 7로 표시되는 QT 생체접합체의 전체 전하는 -2이다 (D 및 E = -1이고, QSY7' = +1). 그러므로, 생체접합체는 알짜 음전하를 갖는 형광제와 결합하지 않는 경향이 있을 것이다. 그러나, 테터가 효소에 의해 절단되면, 전체적으로 양전하 (+1)를 갖는 켄쳐 함유 단편이 생성된다. 따라서, 상기 켄쳐 함유 단편은 알짜 음전하를 갖는 형광제와 결합하는 경향이 있을 것이다.
본 발명의 추가의 실시양태에 따라, 형광제는 공여자 시아닌 염료들의 응집체를 포함하는 실질적인 중합체이고, 켄쳐는 수용자 시아닌 염료로서, 테터에 접합되면 공여자 시아닌 염료들과의 응집체를 형성할 수 없다. 생체접합체가 공여자 시아닌 염료들과의 응집체를 형성할 수 없는 것은, 전하의 영향 때문이거나 입체적인 영향 때문일 수 있다. 수용자 시아닌 염료는 형광성 분자 또는 비-형광성 분자일 수 있다. 수용자 시아닌 염료가 형광성 분자인 경우에는 수용자의 형광을 측정할 수 있다. 별법으로, 공여자의 형광을 측정할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에 따른 상기 검정법은 세포내 검정일 수도 있고 또는 세포외 검정일 수도 있다.
본 발명의 추가의 실시양태에 따라, 샘플에서의 표적 효소 활성에 대한 검정 방법은 표적 효소 활성을 검정할 샘플을, 테터에 접합된 형광 염료를 포함하는 생체접합체와 인큐베이션하는 단계 (이때, 이 테터는 표적 효소에 의해 절단되어 형광 염료 함유 단편을 형성할 수 있는 절편을 포함하고, 이 형광 염료 함유 단편은 생체접합체와는 상이한 흡수 스펙트럼을 갖는 염료 응집체를 형성할 수 있음), 표적 효소가 생체접합체를 절단하도록 하는 단계, 및 염료 응집체가 생체접합체보다 더 높은 정도로 흡수하는 파장에서 샘플을 여기시켜서, 샘플 혼합물의 형광을 측정하는 단계를 포함한다. 샘플 혼합물의 형광량은 상기 샘플 중의 표적 효소 활성의 존재 및(또는) 양을 지시한다. 형광 염료는 시아닌 분자일 수 있다. 효소 절단에 의해 생체접합체로부터 방출된 형광 염료 함유 단편은 J-응집체를 형성할 수 있다. 표적 효소는 카스파제 효소일 수 있다. 예를 들어, 표적 효소는 카스파제-3일 수 있고, 생체접합체는 하기 화학식으로 표시되는 구조를 가질 수 있다:
D-E-V-D-시아닌 (서열 8)
(여기서, "시아닌"은 시아닌 염료 부분을 나타냄).
예시적인 시아닌 염료 부분으로는 하기 부분이 포함되나 이에 제한되지 않는다:
Figure 112006003797927-PCT00005
통상적인 합성 화학 절차를 사용하여 시아닌 염료를 펩티드 테터에 접합시킬 수 있다. 한 실시양태에 따라, 테터는 염료의 측쇄상의 관능기를 통해 염료에 접합될 수 있다. 예를 들어, 시아닌 염료는 테터상의 기 (즉, 아미노기 및 카르복실 산기)에 반응성인 관능기를 갖는 측면 기와 합성될 수 있다. 염료상에서 합성될 수 있는 예시적인 반응성 기는 아미노기 및 카르복실산기이다. 한 실시양태에 따라, 시아닌 염료에서의 알킬측 기는 이후에 테터상의 카르복실산기와의 접합을 위해 사용할 수 있는 아미노기 또는 카르복실산기와 합성될 수 있다.
J-응집체 포맷인 프로테아제 검정에 사용할 수 있는 펩티드 기질의 예를 하기에 나타낸다:
Figure 112006003797927-PCT00006
(여기서, "테터"는 프로테아제 효소에 의해 절단될 수 있는 폴리펩티드를 나타냄).
카스파제-3 효소 검정의 경우, 테터는 하기 펩티드 서열을 포함할 수 있다:
D-E-V-D (서열 9)
(여기서, 테터는 C 말단 아스파르트산 잔기의 α-카르복실산기를 통해 염료 부분에 부착됨).
상기에서는 카스파제-3 효소 검정에 대하여 하기 서열을 포함하는 폴리펩티드 테터를 개시하지만, 카스파제-3 효소에 의해 절단될 수 있는 다른 서열도 사용할 수 있다:
D-E-V-D (서열 9).
추가로, 상기 기술은 다른 프로테아제 효소에 대한 검정에 사용할 수 있고, 이때 테터는 관심 프로테아제 효소에 의해 절단될 수 있는 펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태에 따라, 효소에 의한 테터의 절단에 의해 J-응집체를 형성할 수 있는 염료 함유 단편이 생성된다. 응집체에 대한 흡수 최대점에서 샘플을 여기시켜 샘플로부터 방출되는 것에 대한 모니터링을 이용하여 신호가 제공되며, 이 신호의 강도는 효소 활성의 지시자이다.
상기 기재된 바와 같은 생체접합체 뿐만 아니라 상기 생체접합체를 포함하는 키트도 또한 본 발명의 추가의 실시양태에 따라 제공된다. 본 발명의 추가의 실시양태에 따라, 복수개의 형광 종을 포함하는 형광제, 및 카스파제 효소에 의해 절단될 수 있는 절편을 포함하는 테터에 접합된 켄쳐를 포함하는 생체접합체를 포함하는 키트가 제공된다. 본 발명의 이러한 실시양태에 따라, 테터가 절단됨으로써, 생체접합체보다는 형광제와 결합하는 경향이 더 큰 켄쳐 함유 생체접합체 단편이 생성된다. 추가로, 형광제와 켄쳐와의 결합은 형광제의 수퍼-켄칭의 증폭을 야기한다. 상기한 복수개의 결합된 형광 종은 고체 지지체에 결합될 수 있다. 표적 카스파제 효소는 카스파제-3일 수 있고, 카스파제 효소에 의해 절단될 수 있는 절편은 하기 펩티드 서열일 수 있다:
DEVD (서열 9).
켄쳐 함유 생체접합체 단편은 쿨롱 인력, 수소 결합력, 반데르발스력 또는 공유 결합 형성을 통해 형광제와 결합할 수 있다. 예를 들어, 형광제 및 생체접합 체 각각은 전체적으로 음전하를 가질 수 있으며, 켄쳐 함유 생체접합체 단편은 알짜 양전하를 가질 수 있다. 형광제는 음이온성 접합체 중합체일 수 있고, 켄쳐는 양이온성 전자 또는 에너지 전달 켄쳐일 수 있다. 생체접합체는 하기 화학식으로 표시되는 생체접합체일 수 있다:
D-E-V-D-QSY7' (서열 7)
(여기서, "QSY7'"는
Figure 112006003797927-PCT00007
[이때, "*"는 켄쳐 부분이 테터에 부착되는 지점을 나타냄]
인 켄쳐 부분을 나타내고,
상기 켄쳐 부분은 테터의 c-말단 아스파르트산 잔기의 α-카르복실산을 통해 테터에 접합됨).
켄쳐는 2가 연결기를 통해 테터에 접합될 수 있다. 예를 들어, QSY7과 같은 카르복실산기를 가진 켄쳐는 디아민을 이용하여 폴리펩티드 테터의 카르복실산기에 접합될 수 있다. 그러므로, 2가 연결기 부분은 디아민의 잔기일 수 있다. 예시적인 디아민으로는 디아미노 알칸, 예를 들어 1,2-디아미노에탄이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
또한 추가의 실시양태에 따라, 상기 기재된 바와 같은 키트가 제공되는데, 여기서 형광제는 공여자 시아닌 염료들의 응집체를 포함하는 실질적인 중합체이고, 켄쳐는 수용자 시아닌 염료로서, 수용자가 테터에 접합되면 공여자 시아닌 염료들과의 응집체를 형성할 수 없다. 생체접합체가 공여자와의 응집체를 형성할 수 없는 것은, 전하의 영향 때문이거나 입체적인 영향 때문일 수 있다. 수용자 시아닌 염료는 형광성 분자 또는 비-형광성 분자일 수 있다.
본 발명의 추가의 실시양태에 따라, 카스파제 효소에 의해 절단될 수 있는 절편을 포함하는 테터 및 테터에 접합된 켄쳐를 포함하는 생체접합체가 제공된다. 카스파제 효소는 카스파제-3일 수 있고, 카스파제 효소에 의해 절단될 수 있는 절편은 하기 펩티드 서열일 수 있다:
DEVD (서열 9).
켄쳐는 양이온성 전자 또는 에너지 전달 켄쳐일 수 있다.
생체접합체는 하기 화학식으로 표시되는 생체접합체일 수 있다:
D-E-V-D-QSY7' (서열 7)
(여기서, "QSY7'"는
Figure 112006003797927-PCT00008
[이때, "*"는 켄쳐 부분이 테터에 부착되는 지점을 나타냄]
의 구조로 표시되는 켄쳐 부분을 나타내고,
상기 켄쳐 부분은 테터의 c-말단 아스파르트산 잔기의 α-카르복실산을 통해 테터에 접합됨).
켄쳐는 2가 연결기를 통해 테터에 접합될 수 있다. 예를 들어, QSY7과 같은 카르복실산기를 가진 켄쳐는 디아민을 이용하여 폴리펩티드 테터의 카르복실산기에 접합될 수 있다. 그러므로, 2가 연결기 부분은 디아민의 잔기일 수 있다. 예시적인 디아민으로는 디아미노 알칸, 예를 들어 1,2-디아미노에탄이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 추가의 실시양태에 따라, 테터에 접합된 형광 염료를 포함하는 생체접합체가 제공되며, 여기서 테터는 표적 효소에 의해 절단되어 형광 염료 함유 단편을 생성할 수 있는 절편을 포함한다. 형광 염료 함유 단편은 생체접합체와는 상이한 흡수 스펙트럼을 갖는 염료 응집체를 형성할 수 있다. 형광 염료는 시아닌 염료일 수 있다. 형광 염료 함유 단편은 J-응집체를 형성할 수 있다. 표적 효소는 카스파제-3과 같은 카스파제 효소일 수 있다. 표적 효소에 의해 절단될 수 있는 절편은 하기 펩티드 서열일 수 있다:
DEVD (서열 9).
예시적인 생체접합체는 하기 화학식으로 표시되는 구조를 갖는다:
D-E-V-D-시아닌 (서열 8)
(여기서, "시아닌"은 시아닌 염료 부분을 나타내고,
시아닌 염료 부분은 테터의 C-말단 아스파르트산 잔기의 α-카르복실산기에 접합되어 있음). 예를 들어, 생체접합체는 하기 화학식으로 표시되는 구조를 가질 수 있다:
Figure 112006003797927-PCT00009
하기 예언적 실시예 (실시예 9 및 10)는 카스파제-3 효소 활성에 대한 검정에 관한 것이다.
실시예 9 - QT 검정 포맷
본 실시예에서는 카스파제-3 효소에 대한 검정에서 켄쳐-테터 접합체의 사용을 기재한다. 384-웰 플레이트의 웰에서 검정 완충액 중 서열 7로 표시되는 펩티드 기질의 알고 있는 양에 카스파제-3 효소를 함유하는 샘플을 첨가하였다. 혼합물을 CRT에서 수분 동안 인큐베이션하였다. 전체적으로 음으로 대전된 펩티드 기질을 효소로 절단하여 음으로 대전된 펩티드와 양으로 대전된 켄쳐를 분리하였다. 인큐베이션 후, 상기 화학식 2로 표시되는 음으로 대전된 중합체를 웰에 첨가하고, 혼합물로부터의 형광을 측정하고, 펩티드 및 중합체를 함유하지만 효소는 함유하지 않는 대조군 혼합물과 비교하였다. 샘플과 대조군의 형광 차이는 샘플에서의 효소 활성의 척도이다. 이러한 유형의 검정을 도 2에 나타내었다.
실시예 10 - 응집체 형성 검정
384-웰 플레이트의 한 웰에서, 검정 완충액 중 서열 8로 표시되는 펩티드 기질의 알고 있는 양에 카스파제-3 효소의 샘플 용액을 첨가하였다. 또다른 웰에는, 펩티드 기질을 효소 없이 넣었다. 플레이트를 CRT에서 인큐베이션하고, 샘플 및 대조군 웰을 다양한 시간적 기간에서 형광 강도에 대해 측정하였다. 시간이 흐름에 따라 대조군은 변화 없이 유지되는 반면, 샘플은 형광 증가가 나타났고, 이는 효소 활성의 척도였다. 이러한 유형의 검정을 도 3에 나타내었다.
전술한 기재는 단지 예시하기 위한 것이며 제한하려는 것은 아니다. 본원에서는 구체적인 실시양태를 예시 목적으로 기술하였으나, 발명의 실시 없이도 이들 실시양태에 여러가지 변형이 가해질 수 있다. 이러한 모든 변형은 첨부하는 청구 범위의 사상과 범위 내에 속한다.

Claims (91)

  1. β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편을 포함하는 테터(tether),
    복수개의 형광 종을 포함하며 상기 테터상의 제1 위치에 접합된 형광제, 및
    상기 테터상의 제2 위치에 접합된 켄쳐(quencher)
    를 포함하고, 표적 생체분자를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 상기 절편은 상기 테터 상의 제1 위치와 제2 위치 사이에 존재하며, 상기한 복수개의 형광 종은 서로 결합되어 있어서 켄쳐가 형광제의 수퍼-켄칭(super-quenching)을 증폭시킬 수 있는 생체접합체.
  2. 제1항에 있어서, β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편이 하기 펩티드 서열을 포함하는 생체접합체:
    SEVNLDAEF (서열 1).
  3. 제1항에 있어서, 형광제가 복수개의 형광성 반복 단위를 포함하는 중합체 또는 올리고머를 포함하는 생체접합체.
  4. 제1항에 있어서, 형광제가 복수개의 형광 종과 결합된 고체 지지체를 포함하는 생체접합체.
  5. 제4항에 있어서, 1개 이상의 켄쳐가 각각, 반응성 테터를 통해 고체 지지체에 연결된 생체접합체.
  6. 제4항에 있어서, 고체 지지체가 스트렙타비딘으로 코팅된 구, 중합체 미소구, 실리카 미소구, 유기 나노입자, 무기 나노입자, 자성 비드, 자성 입자, 반도체 나노입자, 양자 도트, 막, 슬라이드, 플레이트 및 시험관으로 구성된 군에서 선택된 생체접합체.
  7. 제1항에 있어서, 형광제가 접합된 고분자전해질, 형광성 단백질, 바이오티닐화된 접합된 고분자전해질, 관능화된 접합된 올리고머, 대전된 접합된 중합체, 대전되지 않은 접합된 중합체, 접합된 중합체 블렌드, 및 조립된 단량체 또는 올리고머를 포함하는 J-응집된 중합체 조립체로 구성된 군에서 선택된 생체접합체.
  8. 제1항에 있어서, 형광제가 실질적인(virtual) 중합체인 생체접합체.
  9. 제1항에 있어서, 형광제가 시아닌 펜던트기를 갖는 폴리(L-리신) 중합체 또는 올리고머인 생체접합체.
  10. 제1항에 있어서, 형광제가 올리고당류로부터 제조된 것인 생체접합체.
  11. 제4항에 있어서, 형광제가 형광성 중합체 또는 올리고머를 포함하는 생체접합체.
  12. 제11항에 있어서, 형광성 중합체 또는 올리고머가 고체 지지체로의 공유 부착, 고체 지지체 표면상으로의 흡착, 또는 형광성 중합체 또는 올리고머상의 바이오틴 부분과 고체 지지체 표면상의 아비딘, 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘 부분 사이의 상호작용에 의해 고체 지지체에 결합된 생체접합체.
  13. 제1항에 있어서, 형광제가 단백질 분자를 통해 테터에 접합된 생체접합체.
  14. 제13항에 있어서, 단백질 분자가 아비딘, 뉴트라비딘 및 스트렙타비딘으로 구성된 군에서 선택된 생체접합체.
  15. 제1항에 있어서, 켄쳐가 비-형광성인 생체접합체.
  16. 제1항에 있어서, 켄쳐가 형광성이고 형광제로부터 흡수된 에너지를 재방출할 수 있는 것인 생체접합체.
  17. β-세크레타제 활성을 검정할 샘플을, 제1 위치와 제2 위치 사이에 β-세크 레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편을 포함하는 테터상의 상기 제1 위치 및 제2 위치 각각에 접합된 켄쳐 및 리간드를 포함하는 생체접합체와 인큐베이션하는 단계,
    인큐베이션된 상기 샘플에, 복수개의 형광 종을 포함하며 생체접합체의 리간드와 결합할 수 있는 부분을 포함하여 생체접합체가 결합할 수 있는 형광제를 첨가하여 샘플 혼합물을 형성하는 단계,
    생체접합체상의 리간드가 형광제에 결합하도록 하는 단계, 및
    이어서, 샘플 혼합물의 형광을 측정하는 단계
    를 포함하며, 형광제와 리간드가 결합하면 형광제의 수퍼-켄칭이 증폭되고, 샘플 혼합물의 형광량이 상기 샘플 중의 β-세크레타제 활성의 존재 및(또는) 양을 지시하는 것인, 샘플 중에서 β-세크레타제 활성을 검정하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 복수개의 결합된 형광 종이 고체 지지체에 결합된 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    생체접합체를 함유하지만 상기 효소와 인큐베이션시키지 않은 제2 샘플에 형광제를 첨가하여 대조군을 형성하는 단계,
    대조군의 형광을 측정하는 단계, 및
    대조군의 형광을 샘플 혼합물의 형광과 비교하는 단계
    를 추가로 포함하며, 대조군과 샘플 혼합물 사이의 형광차가 상기 샘플 중의 β-세크레타제 활성의 존재 및(또는) 양에 대한 지표인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 샘플이 β-세크레타제 및 시험 화합물을 포함하고,
    시험 화합물을 함유하지 않는 제2 샘플을 생체접합체와 인큐베이션하는 단계,
    인큐베이션된 상기 제2 샘플에 형광제를 첨가하여 대조군을 형성하는 단계,
    대조군의 형광을 측정하는 단계, 및
    대조군의 형광을 샘플 혼합물의 형광과 비교하는 단계
    를 추가로 포함하며, 대조군과 샘플 혼합물 사이의 형광차가 시험 화합물이 상기 샘플 중의 β-세크레타제 활성을 억제하는 능력에 대한 지표인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 리간드가 바이오틴 부분이며, 형광제상의 부분이 아비딘, 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘 부분인 방법.
  22. β-세크레타제 활성을 검정할 샘플을 제1항 기재의 생체접합체와 인큐베이션하는 단계, 및
    인큐베이션된 상기 샘플의 형광을 측정하는 단계
    를 포함하며, 인큐베이션된 상기 샘플에서의 형광 측정량이 상기 샘플 중의 β-세크레타제 활성의 존재 및(또는) 양에 대한 지표인, 샘플 중에서 β-세크레타 제 활성을 검정하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    대조군의 형광을 측정하는 단계, 및
    대조군의 형광을 인큐베이션된 상기 샘플의 형광과 비교하는 단계
    를 추가로 포함하며, 대조군 및 인큐베이션된 상기 샘플 사이의 형광차가 상기 샘플 중의 β-세크레타제 활성의 존재 또는 양에 대한 지표인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 샘플이 β-세크레타제 및 시험 화합물을 포함하며, 시험 화합물이 β-세크레타제 활성을 억제하는 능력을 검정하는 것인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 형광제가 고체 지지체를 포함하며, 상기한 복수개의 형광 종이 고체 지지체에 결합된 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 1개 이상의 켄쳐가 각각, 반응성 테터를 통해 고체 지지체에 연결된 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 고체 지지체가 스트렙타비딘으로 코팅된 구, 중합체 미소구, 실리카 미소구, 유기 나노입자, 무기 나노입자, 자성 비드, 자성 입자, 반도체 나노입자, 양자 도트, 막, 슬라이드, 플레이트 및 시험관으로 구성된 군에서 선택 된 것인 방법.
  28. 복수개의 형광 종을 포함하는 형광제, 및
    제1 위치와 제2 위치 사이에 β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편을 포함하는 테터상의 상기 제1 위치 및 제2 위치 각각에 접합된 켄쳐 및 리간드를 포함하는 생체접합체
    를 포함하며, 상기한 형광제는 생체접합체상의 리간드와 결합할 수 있는 부분을 포함하고 상기한 복수개의 형광 종은 서로 결합되어 있어서 리간드가 형광제에 결합하면 켄쳐가 형광제의 수퍼-켄칭을 증폭시킬 수 있는 키트.
  29. 제28항에 있어서, 복수개의 결합된 형광 종이 고체 지지체에 결합된 키트.
  30. 제28항에 있어서, 리간드가 바이오틴 부분인 키트.
  31. 제28항에 있어서, 리간드와 결합할 수 있는 부분이 아비딘, 뉴트라비딘 및 스트렙타비딘으로 구성된 군에서 선택된 키트.
  32. 제28항에 있어서, β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편이 하기 펩티드 서열을 포함하는 키트:
    SEVNLDAEF (서열 1).
  33. β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 절편을 포함하는 테터,
    복수개의 결합된 형광 종을 포함하는 형광제의 형광을 켄칭할 수 있으며 상기 테터상의 제1 위치에 접합된 켄쳐, 및
    상기 켄쳐상의 제2 위치에 접합된 바이오틴 분자
    를 포함하고, 표적 생체분자를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 상기 절편은 상기 테터 상의 제1 위치와 제2 위치 사이에 존재하며, 상기한 복수개의 형광 종은 서로 결합되어 있어서 켄쳐가 형광제의 켄칭을 증폭시킬 수 있는 생체접합체.
  34. 제33항에 있어서, β-세크레타제를 인식하고 그와 상호작용할 수 있는 상기 절편이 하기 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 생체접합체:
    SEVNLDAEF (서열 1).
  35. 제34항에 있어서,
    (QSY-7)-TEEISEVNLDAEFK-(Nε-바이오틴) (서열 2),
    (QSY-7)-TEEISEVNLDAEFK-(Nε-PEG-바이오틴) (서열 3),
    (AZO)-TEEISEVNLDAEFK-(Nε-바이오틴) (서열 4) 또는
    (AZO)-TKKISEVNLDAEFRK-(Nε-바이오틴) (서열 5)
    (여기서, QSY-7, AZO, 바이오틴 및 PEG-바이오틴은
    Figure 112006003797927-PCT00010
    [이때, "*"는 각 부분이 폴리펩티드에 부착되는 지점을 나타냄]
    의 구조를 갖는 부분을 나타내고,
    "Nε"은 바이오틴 부분 또는 PEG-바이오틴 부분이 폴리펩티드의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기를 통해 리신 잔기에 연결되는 것을 나타내며,
    QSY-7 및 AZO 부분은 폴리펩티드의 N-말단 트레오닌 잔기의 아미노기를 통해 폴리펩티드에 부착됨)
    로 표시되는 구조를 갖는 생체접합체.
  36. 표적 효소 활성을 검정할 샘플을, 표적 효소에 의해 절단될 수 있는 절편을 포함하는 테터에 접합된 켄쳐를 포함하는 생체접합체와 인큐베이션하는 단계,
    인큐베이션된 상기 샘플에 형광제를 첨가하여 샘플 혼합물을 형성하는 단계,
    표적 효소가 테터를 절단하도록 하고, 이때 테터가 절단되면 생체접합체보다 는 형광제와 결합하는 경향이 더 큰 켄쳐 함유 생체접합체 단편이 생성되는 단계, 및
    이어서, 샘플 혼합물의 형광을 측정하는 단계
    를 포함하며, 이때 상기 형광제는 서로 결합된 복수개의 형광 종을 포함하여 형광제와 켄쳐가 결합하면 형광제의 수퍼-켄칭이 증폭되고, 샘플 혼합물의 형광량이 상기 샘플 중의 표적 효소 활성의 존재 및(또는) 양을 지시하는 것인, 샘플 중에서 표적 효소 활성을 검정하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 표적 효소가 카스파제 효소인 방법.
  38. 제36항에 있어서, 표적 효소가 카스파제-3인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 표적 효소에 의해 절단될 수 있는 절편이 하기 펩티드 서열인 방법:
    DEVD (서열 9).
  40. 제36항에 있어서, 켄쳐 함유 생체접합체 단편과 형광제 사이의 결합이 쿨롱 인력, 수소 결합력, 반데르발스력 또는 공유 결합 형성을 포함하는 것인 방법.
  41. 제36항에 있어서, 형광제 및 생체접합체 각각이 전체적으로 음전하를 가지 며, 켄쳐 함유 생체접합체 단편이 알짜 양전하를 갖는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 형광제가 음이온성 접합체 중합체인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 켄쳐가 양이온성 전자 또는 에너지 전달 켄쳐인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 생체접합체가 하기 화학식으로 표시되는 것인 방법:
    D-E-V-D-QSY7' (서열 7)
    (여기서, "QSY7'"는
    Figure 112006003797927-PCT00011
    [이때, "*"는 켄쳐 부분이 테터에 부착되는 지점을 나타냄]
    의 구조로 표시되는 켄쳐 부분을 나타내고,
    상기 켄쳐 부분은 C-말단 아스파르트산 잔기의 α-카르복실산을 통해 테터에 접합됨).
  45. 제36항에 있어서, 켄쳐가 2가 연결기를 통해 테터에 접합된 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 2가 연결기가 디아민인 방법.
  47. 제36항에 있어서, 형광제는 공여자 시아닌 염료들의 응집체를 포함하는 실질적인 중합체이고, 켄쳐는 수용자 시아닌 염료로서, 수용자가 테터에 접합되면 공여자 시아닌 염료들과의 응집체를 형성할 수 없는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 생체접합체가 공여자와의 응집체를 형성할 수 없는 것이 전하의 영향 때문이거나 입체적인 영향 때문인 방법.
  49. 제47항에 있어서, 수용자 시아닌 염료가 형광성인 방법.
  50. 제47항에 있어서, 수용자 시아닌 염료가 형광성이고, 수용자의 형광을 측정하는 것인 방법.
  51. 제47항에 있어서, 공여자 시아닌 염료의 형광을 측정하는 것인 방법.
  52. 제47항에 있어서, 상기 검정이 세포내 검정 또는 세포외 검정인 방법.
  53. 표적 효소 활성을 검정할 샘플을, 테터에 접합된 형광 염료를 포함하는 생체 접합체와 인큐베이션하는 단계 (이때, 이 테터는 표적 효소에 의해 절단되어 형광 염료 함유 단편을 형성할 수 있는 절편을 포함하고, 이 형광 염료 함유 단편은 생체접합체와는 상이한 흡수 스펙트럼을 갖는 염료 응집체를 형성할 수 있음),
    표적 효소가 생체접합체를 절단하도록 하는 단계, 및
    염료 응집체가 생체접합체보다 더 높은 정도로 흡수하는 파장에서 샘플을 여기시켜서 샘플 혼합물의 형광을 측정하는 단계
    를 포함하며, 샘플 혼합물의 형광량이 상기 샘플 중의 표적 효소 활성의 존재 및(또는) 양을 지시하는 것인, 샘플 중에서 표적 효소 활성을 검정하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 형광 염료가 시아닌 염료인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 형광 염료 함유 단편이 J-응집체를 형성할 수 있는 것인 방법.
  56. 제53항에 있어서, 표적 효소가 카스파제 효소인 방법.
  57. 제53항에 있어서, 표적 효소가 카스파제-3인 방법.
  58. 제53항에 있어서, 표적 효소에 의해 절단될 수 있는 절편이 하기 펩티드 서열인 방법:
    DEVD (서열 9).
  59. 제58항에 있어서, 생체접합체가 하기 화학식으로 표시되는 구조를 갖는 것인 방법:
    D-E-V-D-시아닌 (서열 8)
    (여기서, "시아닌"은 시아닌 염료 부분을 나타내고,
    시아닌 염료 부분은 C-말단 아스파르트산 잔기의 α-카르복실산기에 접합됨).
  60. 제59항에 있어서, 생체접합체가 하기 화학식으로 표시되는 구조를 갖는 것인 방법:
    Figure 112006003797927-PCT00012
    .
  61. 복수개의 형광 종을 포함하는 형광제, 및
    카스파제 효소에 의해 절단될 수 있는 절편을 포함하는 테터에 접합된 켄쳐를 포함하는 생체접합체
    를 포함하며, 테터가 절단되면 생체접합체보다는 형광제와 결합하는 경향이 더 큰 켄쳐 함유 생체접합체 단편이 생성되고, 형광제와 켄쳐가 결합하면 형광제의 수퍼-켄칭이 증폭되는 키트.
  62. 제61항에 있어서, 복수개의 결합된 형광 종이 고체 지지체에 결합된 키트.
  63. 제61항에 있어서, 카스파제 효소가 카스파제-3인 키트.
  64. 제63항에 있어서, 카스파제 효소에 의해 절단될 수 있는 절편이 하기 펩티드 서열인 키트:
    DEVD (서열 9).
  65. 제61항에 있어서, 켄쳐 함유 생체접합체 단편이 쿨롱 인력, 수소 결합력, 반데르발스력 또는 공유 결합 형성을 통해 형광제와 결합하는 키트.
  66. 제61항에 있어서, 형광제 및 생체접합체 각각이 전체적으로 음전하를 가지며, 켄쳐 함유 생체접합체 단편이 알짜 양전하를 갖는 키트.
  67. 제66항에 있어서, 형광제가 음이온성 접합체 중합체인 키트.
  68. 제66항에 있어서, 켄쳐가 양이온성 전자 또는 에너지 전달 켄쳐인 키트.
  69. 제61항에 있어서, 생체접합체가 하기 화학식으로 표시되는 키트:
    D-E-V-D-QSY7' (서열 7)
    (여기서, "QSY7'"는
    Figure 112006003797927-PCT00013
    [이때, "*"는 켄쳐 부분이 테터에 부착되는 지점을 나타냄]
    의 구조로 표시되는 켄쳐 부분을 나타내고,
    상기 켄쳐 부분은 테터의 C-말단 아스파르트산 잔기의 α-카르복실산을 통해 테터에 접합됨).
  70. 제61항에 있어서, 켄쳐가 2가 연결기를 통해 테터에 접합된 키트.
  71. 제70항에 있어서, 2가 연결기가 디아민인 키트.
  72. 제61항에 있어서, 형광제는 공여자 시아닌 염료들의 응집체를 포함하는 실질적인 중합체이고, 켄쳐는 수용자 시아닌 염료로서, 수용자가 테터에 접합되면 공여 자 시아닌 염료들과의 응집체를 형성할 수 없는 키트.
  73. 제72항에 있어서, 생체접합체가 공여자와의 응집체를 형성할 수 없는 것이 전하의 영향 때문이거나 입체적인 영향 때문인 키트.
  74. 제72항에 있어서, 수용자 시아닌 염료가 비-형광성 분자이거나, 또는 형광제로부터 흡수된 에너지를 재방출할 수 있는 형광성 분자인 키트.
  75. 카스파제 효소에 의해 절단될 수 있는 절편을 포함하는 테터, 및
    테터에 접합된 켄쳐
    를 포함하는 생체접합체.
  76. 제75항에 있어서, 카스파제 효소가 카스파제-3인 생체접합체.
  77. 제76항에 있어서, 카스파제 효소에 의해 절단될 수 있는 절편이 하기 펩티드 서열인 생체접합체:
    DEVD (서열 9).
  78. 제75항에 있어서, 켄쳐가 양이온성 전자 또는 에너지 전달 켄쳐인 생체접합체.
  79. 제75항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 생체접합체:
    D-E-V-D-QSY7' (서열 7)
    (여기서, "QSY7'"는
    Figure 112006003797927-PCT00014
    [이때, "*"는 켄쳐 부분이 테터에 부착되는 지점을 나타냄]
    의 구조로 표시되는 켄쳐 부분을 나타내고,
    상기 켄쳐 부분은 테터의 C-말단 아스파르트산 잔기의 α-카르복실산을 통해 테터에 접합됨).
  80. 제75항에 있어서, 켄쳐 부분이 2가 연결기를 통해 테터에 접합된 생체접합체.
  81. 제80항에 있어서, 2가 연결기가 디아민인 생체접합체.
  82. 제75항에 있어서, 켄쳐가 수용자 시아닌 염료인 생체접합체.
  83. 제82항에 있어서, 수용자 시아닌 염료가 형광성인 생체접합체.
  84. 테터에 접합된 형광 염료를 포함하며, 이 테터는 표적 효소에 의해 절단되어 형광 염료 함유 단편을 형성할 수 있는 절편을 포함하고, 이 형광 염료 함유 단편은 생체접합체와는 상이한 흡수 스펙트럼을 갖는 염료 응집체를 형성할 수 있는 생체접합체.
  85. 제84항에 있어서, 형광 염료가 시아닌 염료인 생체접합체.
  86. 제84항에 있어서, 형광 염료 함유 단편이 J-응집체를 형성할 수 있는 생체접합체.
  87. 제84항에 있어서, 표적 효소가 카스파제 효소인 생체접합체.
  88. 제84항에 있어서, 표적 효소가 카스파제-3인 생체접합체.
  89. 제88항에 있어서, 표적 효소에 의해 절단될 수 있는 절편이 하기 펩티드 서열인 생체접합체:
    DEVD (서열 9).
  90. 제89항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 구조를 갖는 생체접합체:
    D-E-V-D-시아닌 (서열 8)
    (여기서, "시아닌"은 시아닌 염료 부분을 나타내고,
    시아닌 염료 부분은 테터의 C-말단 아스파르트산 잔기의 α-카르복실산기에 접합됨).
  91. 제90항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 구조를 갖는 생체접합체:
    Figure 112006003797927-PCT00015
    .
KR1020067001229A 2003-07-18 2004-07-19 프로테아제 효소 활성에 대한 검정법 KR20060113882A (ko)

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US10/621,311 2003-07-18

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