CN101831054B - 一种鉴别真菌和细菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别真菌和细菌的方法。本发明的方法是检测待测菌是否可以诱导式(I)所示化合物和式(II)所示化合物发生荧光共振能量转移；如果待测菌可以诱导式(I)所示化合物和式(II)所示化合物发生荧光共振能量转移，待测菌为细菌；如果待测菌不能诱导式(I)所示化合物和式(II)所示化合物发生荧光共振能量转移，待测菌为真菌。本发明的方法具有快速、可视、简便等优点。本发明可用于鉴定感染的病原菌类型，指导医生对病人针对性的给药，提高治疗效率，降低因不正确使用抗生素产生抗药性的问题。本发明在食品安全、环境监测等方面也具有应用价值。

Description

一种鉴别真菌和细菌的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别真菌和细菌的方法。

背景技术

病原菌的检测在医疗、食品安全以及环境科学等领域中具有极其重要的意义。由于深部真菌感染具有隐匿性，没有特征的临床表现，因此真菌与细菌的快速区分在临床上对于医师更有针对性的给药具有重要的指导意义。在深部真菌感染中，白色念珠菌是最为常见的病原菌，约占各类真菌的40％；而在由细菌引起的血源性感染中，大肠杆菌则是最为常见的细菌类型，其中E.coli O157：H7在各种细菌感染中占有相当大的比例。

目前，对于病原菌检测的传统方法主要包括微生物培养法，滤膜法，生化检测法等。此外，还包括检测病原菌抗原和抗体的免疫学方法，基于特异性核酸探针的PCR(聚合酶链式反应)和DNA微阵列方法，质谱学方法，生物传感方法以及表面等离子共振方法等。虽然现存的检测方法具有一定的灵敏度和选择性，但高成本、繁杂的制备、长时间的处理过程与对仪器的特殊要求等缺点限制了这些方法的大规模应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别真菌和细菌的方法。

本发明保护一种新化合物，为式(II)所示化合物；

n＝15-20。

式(II)所示化合物具体可采用如下方法制备：

将2，5-二乙烯基-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯、2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯、2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴化三甲胺基-己烷基)苯、醋酸钯、三邻甲苯基膦和三乙胺反应，得到式(II)所示化合物；

所述2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴化三甲胺基-己烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴-己烷基)苯和三甲胺反应得到的；

所述2，5-二乙烯基-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯、三正丁基(乙烯基)锡和四(三苯基膦)钯反应得到的；

所述2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-苯二酚、碳酸钾、二乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯和18-冠醚-6反应得到的；

所述二乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯是将二乙二醇单甲醚、吡啶和对甲苯磺酰氯反应得到的；

所述2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴-己烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-苯二酚、碳酸钾、二(2-溴乙基)醚和18-冠醚-6反应得到的；

所述2，5-二碘-1，4-苯二酚是将2，5-二甲氧基-1，4-二碘苯、三溴化硼反应得到的；

所述2，5-二甲氧基-1，4-二碘苯是将碘酸钾与碘、1，4-二甲氧基苯反应得到的。

式(II)所示化合物具体可采用如下方法制备：

将2，5-二乙烯基-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯、2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯、2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴化三甲胺基-己烷基)苯、醋酸钯、三邻甲苯基膦和三乙胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，氮气气氛下100℃反应24h，得到式(II)所示化合物；

所述2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴化三甲胺基-己烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴-己烷基)苯溶于四氢呋喃中，加入含有三甲胺的甲醇，70℃反应40h得到的；

所述2，5-二乙烯基-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯与三正丁基(乙烯基)锡溶于N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入四(三苯基膦)钯，氮气气氛下100℃反应2.5h得到的；

所述2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-苯二酚与碳酸钾溶于丙酮中，再依次加入二乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯和18-冠醚-6，氮气气氛下70℃反应27h得到的；

所述二乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯是将二乙二醇单甲醚溶于二氯甲烷中，冷却至0℃，加入吡啶，搅拌15分钟，再加入对甲苯磺酰氯，室温反应24小时得到的；

所述2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴-己烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-苯二酚与碳酸钾溶于丙酮中，依次加入二(2-溴乙基)醚和18-冠醚-6，氮气气氛下70℃反应40h得到的；

所述2，5-二碘-1，4-苯二酚是将2，5-二甲氧基-1，4-二碘苯溶于二氯甲烷中冷却至0℃，滴加60ml含三溴化硼的二氯甲烷，然后室温反应6h，然后将反应液倒入氮气饱和的冰水中得到的；

所述2，5-二甲氧基-1，4-二碘苯是将碘酸钾与碘溶于混合溶剂中，加入1，4-二甲氧基苯，加热至回流，反应6h得到的；所述混合溶剂是将100体积份乙酸、5体积份硫酸和1.5体积份水混合得到的。

本发明还保护式(I)所示化合物和任一所述式(II)所示化合物在辅助鉴别真菌和细菌中的应用；

式(I)所示化合物的数均分子量为5000-100000。

所述应用中：式(I)所示化合物的数均分子量具体可为3.5×10⁴。

所述应用中：所述细菌可为大肠杆菌，如JM109、M15、TOP10、BL21、DH5α或TG1等。

所述应用中：所述真菌可为白色念珠菌，如中国普通微生物菌种保藏管理中心编号2.2086的菌株、中国普通微生物菌种保藏管理中心编号2.538的菌株、广东省微生物研究所菌种保藏中心编号GIM2.120的菌株、广东省微生物研究所菌种保藏中心编号GIM2.130的菌株等。

本发明还保护一种辅助鉴别真菌和细菌的方法，是检测待测菌是否可以诱导式(I)所示化合物和式(II)所示化合物发生荧光共振能量转移；如果待测菌可以诱导式(I)所示化合物和式(II)所示化合物发生荧光共振能量转移，待测菌为细菌；如果待测菌不能诱导式(I)所示化合物和式(II)所示化合物发生荧光共振能量转移，待测菌为真菌。

所述的方法中：式(I)所示化合物的数均分子量具体可为3.5×10⁴。

所述方法可为包括如下步骤的方法(A)：在乙醇水溶液中，将式(I)所示化合物、式(II)所示化合物和待测菌菌液混合，在紫外灯下，激发光波长为365nm，观察混合液颜色；如果混合液发出黄绿色荧光待测菌为细菌，如果混合液发出蓝色荧光待测菌为真菌。

所述方法(A)具体可包括如下步骤：在2mL 40％(体积百分含量)乙醇水溶液中加入2μL 1mM式(I)所示化合物的水溶液和5μL 1mM式(II)所示化合物的水溶液，然后加入100μL OD₆₀₀＝1.0的待测菌菌液，在紫外灯下，激发光波长为365nm、强度为4W，观察溶液颜色；如果混合液发出黄绿色荧光待测菌为细菌，如果混合液发出蓝色荧光待测菌为真菌。

所述方法还可为包括如下步骤的方法(B)：

(1)将式(I)所示化合物和式(II)所示化合物溶于乙醇水溶液，得到溶液甲；测定溶液甲的荧光光谱，激发波长为380nm，激发光源为氙灯，得到溶液甲420nm处的荧光强度F₀；

(2)将溶液甲和待测菌菌液混合，得到溶液乙；测定溶液乙的荧光光谱，激发波长为380nm，激发光源为的氙灯，得到溶液乙420nm处的荧光强度F；

(3)根据如下公式淬灭效率(QE)：

$\mathrm{QE}=\frac{(F_0-F)}{F_0}\×100\%$

如果淬灭效率大于50％待测菌为细菌；如果淬灭效率小于40％待测菌为真菌。

所述方法(B)具体可包括如下步骤：

(1)将式(I)所示化合物和式(II)所示化合物溶于40％(体积百分含量)乙醇水溶液，得到溶液甲；测定溶液甲的荧光光谱，激发波长为380nm，激发光源为150W的氙灯，得到溶液甲420nm处的荧光强度F₀；所述溶液甲中，式(I)所示化合物和式(II)所示化合物的终浓度均为1.0×10^-6M；

(2)将1mL溶液甲和10μL OD₆₀₀＝1.0的待测菌菌液混合，得到溶液乙；测定溶液乙的荧光光谱，激发波长为380nm，激发光源为150W的氙灯，得到溶液乙420nm处的荧光强度F；

(3)根据如下公式淬灭效率(QE)：

$\mathrm{QE}=\frac{(F_0-F)}{F_0}\×100\%$

如果淬灭效率大于50％，待测菌为细菌；如果淬灭效率小于40％，待测菌为真菌。

所述方法中：所述细菌可为大肠杆菌，如JM109、M15、TOP10、BL21、DH5α或TG1等。

所述方法中：所述真菌可为白色念珠菌，如中国普通微生物菌种保藏管理中心编号2.2086的菌株、中国普通微生物菌种保藏管理中心编号2.538的菌株、广东省微生物研究所菌种保藏中心编号GIM2.120的菌株、广东省微生物研究所菌种保藏中心编号GIM2.130的菌株等。

细菌和真菌表面通常带有负电荷，而式(I)所示化合物和式(II)所示化合物均带有正电荷，故在细菌和真菌存在的条件下可以通过静电作用诱导两种化合物相互靠近，进而发生能量转移。由于真菌与细菌表面所带的电荷以及表面性质不同，故发生能量转移的程度也不尽相同，最终可以达到区分真菌与细菌的目的。PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺均为水溶性阳离子型共轭聚合物，且二者的光谱重叠积分较大，可以发生较好的能量转移，PFP-NMe₃ ⁺具有荧光量子产率高、对其受体具有显著荧光增幅等特性，而PPV-NMe₃ ⁺的烷氧基侧链可以消除体系中非特异性作用，对不同的表面结构产生不同的响应。本发明利用具有优越荧光性能的PFP-NMe₃ ⁺作为能量供体，使用PPV-NMe₃ ⁺作为其能量受体，加入细菌或真菌后观察二者间的荧光共振能量转移情况，进而对细菌和真菌进行区分。

本发明所提供的鉴别细菌和真菌的方法克服了现有检测技术的种种不足，具有快速、可视、简便等优点。与传统的微生物培养方法相比，本发明处理快速、简便；与各种技术先进的系统(免疫印迹、流式细胞仪、表面等离子共振等)相比，本发明无需复杂的仪器设备，样品处理简单，成本低。在临床上，本方法可以用于快速鉴定感染的病原菌类型，指导医生对病人更有针对性的给药，这样不仅可以提高治疗的效率，同时可以降低由于不正确使用抗生素而产生抗药性的问题。本发明在食品安全、环境监测等方面也具有应用价值。

附图说明

图1为紫外灯下的照片；自左至右依次为：空白、JM109、CA10231。

图2为不同菌种的荧光淬灭效率柱状图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

紫外灯下直接观测：将待测菌菌液加入到PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺的混合溶液中，只有细菌(如大肠杆菌)能诱导两种聚合物发生可视的荧光共振能量转移，即溶液颜色由初始的蓝色变为黄绿色，而真菌(如白色念珠菌)几乎没有可视的荧光共振能量转移可以被观察到。荧光光谱测定：首先测定PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺混合溶液的荧光光谱，而后加入一定体积的待测菌菌液，计算菌液加入前后PFP-NMe₃ ⁺荧光的淬灭效率，淬灭效率低于40％的为真菌(如白色念珠菌)，而淬灭效率大于50％的为细菌(如大肠杆菌)。

实施例1、PFP-NMe₃ ⁺与PPV-NMe₃ ⁺的合成

一、PFP-NMe₃ ⁺的合成

1、1，4-苯二硼酸新戊二酯的合成

100mL单口瓶中加入2.2g 1，4-苯二硼酸、50mL甲苯、5.2g新戊二醇和0.5g对甲苯磺酸，回流24h；蒸除溶剂后硅胶柱分离(洗脱剂：二氯甲烷)后得到4.8g产物。产物的表征：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ(ppm)7.78(s，4H)，3.77(s，8H)，1.02(s，12H)。表征数据表明，产物为1，4-苯二硼酸新戊二酯。

2、2，7-二溴-9，9-二(6-碘己基)芴的合成

50mL单口瓶中加入10mL干燥的四氢呋喃和0.65g 2，7-二溴芴，低温冷却至-78℃后加入2mL含丁基锂的正己烷(丁基锂浓度为2M)，低温搅拌1h，加入0.67g 1，6-二碘己烷于室温反应过夜，结束反应；向反应液加入10mL水和15mL氯仿，分液，有机层经水洗、无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂，硅胶柱分离(石油醚/乙酸乙酯：20/1，体积比)得到0.6g产物。产物的表征：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ(ppm)7.82(d，2H)，7.42(m，4H)，3.29(m，4H)，2.06(m，4H)，1.67(m，4H)，1.22(m，8H)，0.69(m，4H)。表征数据表明，产物为2，7-二溴-9，9-二(6-碘己基)芴。

3、PFP-NMe₃ ⁺的合成

25mL二口瓶中加入5.4mL甲苯和3.6mL 2M碳酸钾水溶液，鼓入氮气30min后，加入325mg 2，7-二溴-9，9-二(6-溴己基)芴、165mg 1，4-苯二硼酸新戊二酯和20mg四(三苯基膦)钯，于氮气下95℃搅拌反应24h，冷却后加入氯仿和水，取氯仿层水洗后用无水硫酸镁干燥、旋蒸浓缩、丙酮沉淀，得到210mg浅黄色固体；将固体溶于20mL二氯甲烷，加入1mL三甲胺于室温搅拌24h后离心，收集沉淀并干燥，得到208mg聚合物产物。产物的表征：M_n＝3.5×10⁴；¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ(ppm)7.3-8.0(m，10H)，2.9-3.2(m，16H)，2.2-2.3(m，4H)，1.5-1.6(m，4H)，0.9-1.2(m，18H)。表征数据表明：得到了式(I)所示的PFP-NMe₃ ⁺。

式(I)所示化合物也可参考文献([a]S.Wang et al.，J.Am.Chem.Soc.2004，126，5446-5451；[b]H.Li et al.，Chem.Eur.J.2003，9，6031-6038)进行合成。

二、PPV-NMe₃ ⁺的合成

1、二乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯的合成

9.04g二乙二醇单甲醚溶解在50ml二氯甲烷中，在冰水浴中冷却至0℃，加入11.9g吡啶，搅拌15分钟，再加入21.5g对甲苯磺酰氯，反应逐渐回暖至室温，继续反应24小时；反应停止后，把反应液倒入80ml水中，用二氯甲烷萃取(50ml×3)，有机相用50ml 1M盐酸水溶液洗涤两次，再依次用饱和的碳酸氢钠溶液和蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩；硅胶柱层析：先用洗脱剂石油醚/乙酸乙酯(7/1，体积比)除去过量的对甲苯磺酰氯，再用洗脱剂石油醚/乙酸乙酯(1/1，体积比)进行洗脱，得到13g产物(546.65)，产率63％。产物的表征：¹H-NMR：(400MHz，CDCl₃，ppm)δ：2.44(s，3H)，3.35(s，3H)，3.48(t，2H)，3.58(t，2H)，3.69(t，2H)，4.17(t，2H)，7.55(d，2H)，7.79(d，2H)。表征数据表明，产物为二乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯。

2、2，5-二甲氧基-1，4-二碘苯的合成

7.75g碘酸钾与19.3g碘溶解在乙酸/硫酸/水(体积比为100/5/1.5)的混合溶剂中，再加入10g 1，4-二甲氧基苯，充分搅拌，混合液缓慢加热至回流，反应6h；反应停止并冷却至室温后，用冰水将混合液冷却，有灰黑色沉淀生成；过滤，收集沉淀，并分别用碳酸氢钠溶液和蒸馏水洗涤，干燥；粗产物溶解在100ml氯仿中，加入活性炭，回流2h，过滤、洗涤、浓缩、干燥；最后用乙醇重结晶，得灰白色固体(产物)17.7g。产物的表征：¹H-NMR：(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)3.91(s，6H)，6.89(s，2H)。表征数据表明：得到了2，5-二甲氧基-1，4-二碘苯。

3、2，5-二碘-1，4-苯二酚的合成

7.8g 2，5-二甲氧基-1，4-二碘苯溶解在100ml二氯甲烷中，把混合液在冰水浴中冷却至0℃，缓慢滴加60ml含三溴化硼的二氯甲烷(三溴化硼在二氯甲烷中的浓度为1M)；滴加完毕后，反应逐渐回暖至室温，继续反应6h；反应停止后，将反应液倒入200ml氮气饱和的冰水中，有大量白色固体产生，搅拌30min，抽滤，洗涤，真空干燥(40℃，12h)，得灰白色固体(产物)5.86g。产物的表征：¹H-NMR：(400MHz，d⁶-DMSO)δ(ppm)7.12(s，2H)，9.23(s，2H)。表征数据表明：得到了2，5-二碘-1，4-苯二酚。

4、2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯的合成

1.99g 2，5-二碘-1，4-苯二酚与3.8g碳酸钾溶解在100ml丙酮中，再依次加入3.32g二乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯和200mg 18-冠醚-6作为相转移催化剂，氮气气氛下反应液升温至70℃，反应27h；反应停止并冷却至室温后，反应液倒入150ml水中，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，用蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩；粗产物用硅胶柱层析分离纯化，展开剂为石油醚/乙酸乙酯(8/1，体积比)，得白色粉末(产物)1.725g。产物的表征：¹H-NMR：(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)3.40(s，6H)，3.58(t，4H)，3.78(t，4H)，3.89(t，4H)，4.12(t，4H)，7.24(s，2H)。表征数据表明：得到了2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯。

5、2，5-二乙烯基-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯的合成

将0.5g 2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯与0.52mL三正丁基(乙烯基)锡溶于10mL无水N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入50mg四(三苯基膦)钯，氮气气氛下反应液升温至100℃，反应2.5h；反应停止并冷却至室温后过滤，反应液倒入20ml水中，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩；粗产物硅胶柱层析分离纯化，展开剂为石油醚/乙酸乙酯(10/1，体积比)，得淡黄色液体(产物)0.2g。产物的表征：¹H-NMR：(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)3.40(s，6H)，3.58(t，4H)，3.72(t，4H)，3.86(t，4H)，4.15(t，4H)，5.24(d，2H)，5.71(d，2H)，7.03(m，4H)。表征数据表明：得到了2，5-二乙烯基-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯。

6、2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴-己烷基)苯的合成

2.16g 2，5-二碘-1，4-苯二酚与4.96g碳酸钾溶解在100ml丙酮中，依次加入5.26g二(2-溴乙基)醚(Alfa Aesar，L11510)和200mg18-冠醚-6；氮气气氛下反应液升温至70℃，反应40h；反应停止并冷却至室温后除去溶剂，反应液倒入80ml水中，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，用蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩；粗产物硅胶柱层析分离纯化，展开剂为石油醚/二氯甲烷(1.5/1，体积比)，得白色粉末(产物)2.1g。产物的表征：¹H-NMR：(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)3.51(t，4H)，3.91(t，4H)，3.96(t，4H)，4.12(t，4H)，7.24(s，2H)。表征数据表明：得到了2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴-己烷基)苯。

7、2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴化三甲胺基-己烷基)苯的合成

0.77g 2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴-己烷基)苯溶于20mL四氢呋喃中，加入27mL含有三甲胺的甲醇(三甲胺在甲醇中的体积百分含量为33％)，反应液升温至70℃反应40h；反应停止并冷却至室温后除去溶剂，加入二氯甲烷洗涤，然后离心，干燥得白色固体(产物)0.9g。产物的表征：¹H-NMR：(400MHz，d⁶-DMSO)δ(ppm)3.13(s，18H)，3.57(t，4H)，3.80(t，4H)，3.95(t，4H)，4.14(t，4H)，7.37(s，2H)。表征数据表明：得到了2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴化三甲胺基-己烷基)苯。

8、PPV-NMe₃ ⁺的合成

37mg 2，5-二乙烯基-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯、34mg 2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯、31mg 2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴化三甲胺基-己烷基)苯、1mg醋酸钯、6mg三邻甲苯基膦以及35μL三乙胺溶于2mL N，N-二甲基甲酰胺中，氮气气氛下100℃反应24h；除去溶剂，双蒸水溶解、过滤后，直接利用截止分子量为3500的透析袋透析(2天换水8次)；除去溶剂，干燥得到41mg深红色固体(产物)。产物的表征：n＝15；¹H-NMR：(400MHz，d⁶-DMSO)δ(ppm)3.0-3.1(m，4.32H)，3.1-3.3(m，3.24H)，3.4-4.2(m，16H)，6.7-7.6(m，4H)。表征数据表明：得到了式(II)所示的PPV-NMe₃ ⁺。

实施例2、PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺在大肠杆菌[JM109]检测中的应用

一、配制待测病原菌溶液

取大肠杆菌JM109菌株(北京博迈德科技发展有限公司；产品目录号：CC0301)加入3mL LB培养基中，37℃培养过夜。取一定体积菌液，4000转离心5min以除去培养液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS，10mM，pH＝7.40)洗3次，最后在磷酸盐缓冲溶液中调节菌液浓度为OD₆₀₀＝1.0。

二、紫外灯下直接观测

将实施例1制备得到的PFP-NMe₃ ⁺溶于双蒸水，得到浓度为1mM的PFP-NMe₃ ⁺溶液。将实施例1制备得到的PPV-NMe₃ ⁺溶于双蒸水，得到浓度为1mM的PPV-NMe₃ ⁺溶液。

在2mL 40％(体积百分含量)乙醇水溶液中依次加入2μL PFP-NMe₃ ⁺溶液和5μLPPV-NMe₃ ⁺溶液，然后加入100μL步骤一的JM109菌液，然后在紫外灯(激发波长为365nm，4W)下观察溶液颜色并拍照。

加入菌液之前溶液发出蓝色荧光，而加入JM109后，溶液发出黄绿色荧光，说明细菌可以诱导聚合物发生可视的荧光共振能量转移。照片见图1。

三、荧光光谱测定

溶剂为40％(体积百分含量)乙醇水溶液。

1、将实施例1制备的PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺溶于溶剂，[PFP-NMe₃ ⁺]＝[PPV-NMe₃ ⁺]＝1.0×10^-6M，测定其荧光光谱，激发波长为380nm，激发光源为150W的氙灯。

2、在1mL步骤1的体系中加入10μL步骤一的JM109菌液，作用3min后，再次测定荧光光谱，激发波长为380nm，激发光源为150W的氙灯。

记录菌液加入前后420nm处的荧光强度变化，计算淬灭效率(QE)，计算公式如下：

$\mathrm{QE}=\frac{(F_0-F)}{F_0}\×100\%$

F₀为加入菌液前420nm处的荧光强度，F为加入菌液后420nm处的荧光强度。

平行测定三次，取平均值。结果见表1。

表1荧光光谱测定结果

JM109(细菌)菌液的淬灭效率为79.1％，大于50％，柱状图见图2。

实施例3、PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺在大肠杆菌[M15]检测中的应用

一、配制待测病原菌溶液

用大肠杆菌M15菌株(北京博迈德科技发展有限公司，CC0901)取代JM109菌株，其它步骤同实施例2的步骤一。

二、荧光光谱测定

用M15菌液取代JM109菌液，其它步骤同实施例2的步骤三。

平行测定三次，取平均值。结果见表2。

表2荧光光谱测定结果

M15(细菌)菌液的淬灭效率为80.5％，大于50％，柱状图见图2。

实施例4、PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺在大肠杆菌[TOP10]检测中的应用

一、配制待测病原菌溶液

用大肠杆菌TOP10(北京博迈德科技发展有限公司，CC0101)取代JM109菌株，其它步骤同实施例2的步骤一。

二、荧光光谱测定

用TOP10菌液取代JM109菌液，其它步骤同实施例2的步骤三。

平行测定三次，取平均值。结果见表3。

表3荧光光谱测定结果

TOP10(细菌)菌液的淬灭效率为78.9％，大于50％，柱状图见图2。

实施例5、PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺在大肠杆菌[BL21]检测中的应用

一、配制待测病原菌溶液

用大肠杆菌BL21(北京博迈德科技发展有限公司，CC0501)取代JM109菌株，其它步骤同实施例2的步骤一。

二、荧光光谱测定

用BL21菌液取代JM109菌液，其它步骤同实施例2的步骤三。

平行测定三次，取平均值。结果见表4。

表4荧光光谱测定结果

BL21(细菌)菌液的淬灭效率为为66.1％，大于50％，柱状图见图2。

实施例6、PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺在大肠杆菌[DH5α]检测中的应用

一、配制待测病原菌溶液

用大肠杆菌DH5α(北京博迈德科技发展有限公司，CC0201)取代JM109菌株，其它步骤同实施例2的步骤一。

二、荧光光谱测定

用DH5α菌液取代JM109菌液，其它步骤同实施例2的步骤三。

平行测定三次，取平均值。结果见表5。

表5荧光光谱测定结果

DH5α(细菌)菌液的淬灭效率为62.3％，大于50％，柱状图见图2。

实施例7、PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺在大肠杆菌[TG1]检测中的应用

一、配制待测病原菌溶液

用大肠杆菌TG1(北京博迈德科技发展有限公司，CC1501)取代JM109菌株，其它步骤同实施例2的步骤一。

二、荧光光谱测定

用TG1菌液取代JM109菌液，其它步骤同实施例2的步骤三。

平行测定三次，取平均值。结果见表6。

表6荧光光谱测定结果

TG1(细菌)菌液的淬灭效率为57.9％，大于50％，柱状图见图2。

实施例8、PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺在白色念珠菌[CA10231]检测中的应用

一、配制待测病原菌溶液

取白色念珠菌CA10231菌株(白假丝酵母(Candida albicans)中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号2.2086)加入3mL YPD培养基中，25℃培养过夜。取一定体积菌液，4000转离心5min以除去培养液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS，10mM，pH＝7.40)洗3次，最后在磷酸盐缓冲溶液中调节菌液浓度为OD₆₀₀＝1.0。

二、紫外灯下直接观测

将实施例1制备得到的PFP-NMe₃ ⁺溶于双蒸水，得到浓度为1mM的PFP-NMe₃ ⁺溶液。将实施例1制备得到的PPV-NMe₃ ⁺溶于双蒸水，得到浓度为1mM的PPV-NMe₃ ⁺溶液。

在2mL 40％(体积百分含量)乙醇水溶液中依次加入2μL PFP-NMe₃ ⁺溶液和5μLPPV-NMe₃ ⁺溶液，然后加入100μL步骤一的CA10231菌液，然后在紫外灯(激发波长为365nm，4W)下观察溶液颜色并拍照。

加入菌液之前溶液发出蓝色荧光，而加入CA10231后，溶液仍发出蓝色荧光，说明真菌不能诱导聚合物发生可视的荧光共振能量转移。照片见图1。

三、荧光光谱测定

溶剂为40％(体积百分含量)乙醇水溶液。

1、将实施例1制备的PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺溶于溶剂，[PFP-NMe₃ ⁺]＝[PPV-NMe₃ ⁺]＝1.0×10^-6M，测定其荧光光谱，激发波长为380nm，激发光源为150W的氙灯。

2、在1mL步骤1的体系中加入10μL步骤一的CA10231菌液，作用3min后，再次测定荧光光谱，激发波长为380nm，激发光源为150W的氙灯。

记录菌液加入前后420nm处的荧光强度变化，计算淬灭效率(QE)，计算公式如下：

$\mathrm{QE}=\frac{(F_0-F)}{F_0}\×100\%$

F₀为加入菌液前420nm处的荧光强度，F为加入菌液后420nm处的荧光强度。

平行测定三次，取平均值。结果见表7。

表7荧光光谱测定结果

CA10231(真菌)菌液的淬灭效率为28.8％，小于40％，柱状图见图2。

实施例9、PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺在白色念珠菌[CA3]检测中的应用

一、配制待测病原菌溶液

用白色念珠菌CA3(白假丝酵母(Candida albicans)，中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号2.538)取代CA10231菌株，其它步骤同实施例8的步骤一。

二、荧光光谱测定

用CA3菌液取代CA10231菌液，其它步骤同实施例8的步骤三。

平行测定三次，取平均值。结果见表8。

表8荧光光谱测定结果

CA3(真菌)菌液的淬灭效率为19.4％，小于40％，柱状图见图2。

实施例10、PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺在白色念珠[CA2]检测中的应用

一、配制待测病原菌溶液

用白色念珠菌CA2(白色假丝酵母(Candida albicans)广东省微生物研究所菌种保藏中心，编号GIM2.120)取代CA10231菌株，其它步骤同实施例8的步骤一。

二、荧光光谱测定

用CA2菌液取代CA10231菌液，其它步骤同实施例8的步骤三。

平行测定三次，取平均值。结果见表9。

表9荧光光谱测定结果

CA2(真菌)菌液的淬灭效率为17.8％，小于40％，柱状图见图2。

实施例11、PFP-NMe₃ ⁺和PPV-NMe₃ ⁺在白色念珠菌[CA1]检测中的应用

一、配制待测病原菌溶液

用白色念珠菌CA1(白色假丝酵母(Candida albicans)广东省微生物研究所菌种保藏中心，编号GIM2.130)取代CA10231菌株，其它步骤同实施例8的步骤一。

二、荧光光谱测定

用CA1菌液取代CA10231菌液，其它步骤同实施例8的步骤三。

平行测定三次，取平均值。结果见表10。

表10荧光光谱测定结果

CA1(真菌)菌液的淬灭效率为17.3％，小于40％，柱状图见图2。

其它聚合度的式(I)所示化合物和式(II)所示化合物可参照实施例1的方法制备，用于鉴别细菌和真菌时，参照实施例2和实施例8的方法即可，均与实施例1制备的两种具体化合物具有同样的效果。

Claims (12)

1.式(II)所示化合物；

n＝15-20。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于：n＝15。

3.如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：

式(II)所示化合物的制备方法如下：将2，5-二乙烯基-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯、2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯、2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴化三甲胺基-己烷基)苯、醋酸钯、三邻甲苯基膦和三乙胺反应，得到式(II)所示化合物；

所述2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴化三甲胺基-己烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴-己烷基)苯和三甲胺反应得到的；

所述2，5-二乙烯基-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯、三正丁基(乙烯基)锡和四(三苯基膦)钯反应得到的；

所述2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-苯二酚、碳酸钾、二乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯和18-冠醚-6反应得到的；

所述二乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯是将二乙二醇单甲醚、吡啶和对甲苯磺酰氯反应得到的；

所述2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴-己烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-苯二酚、碳酸钾、二(2-溴乙基)醚和18-冠醚-6反应得到的；

所述2，5-二碘-1，4-苯二酚是将2，5-二甲氧基-1，4-二碘苯和三溴化硼反应得到的；

所述2，5-二甲氧基-1，4-二碘苯是将碘酸钾与碘和1，4-二甲氧基苯反应得到的。

4.如权利要求3所述的化合物，其特征在于： 

式(II)所示化合物的制备方法如下：将2，5-二乙烯基-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯、2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯、2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴化三甲胺基-己烷基)苯、醋酸钯、三邻甲苯基膦和三乙胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，氮气气氛下100℃反应24h，得到式(II)所示化合物；

所述2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴化三甲胺基-己烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴-己烷基)苯溶于四氢呋喃中，加入含有三甲胺的甲醇，70℃反应40h得到的；

所述2，5-二乙烯基-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯与三正丁基(乙烯基)锡溶于N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入四(三苯基膦)钯，氮气气氛下100℃反应2.5h得到的；

所述2，5-二碘-1，4-二(1，4，7-三氧杂-辛烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-苯二酚与碳酸钾溶于丙酮中，再依次加入二乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯和18-冠醚-6，氮气气氛下70℃反应27h得到的；

所述二乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯是将二乙二醇单甲醚溶于二氯甲烷中，冷却至0℃，加入吡啶，搅拌15分钟，再加入对甲苯磺酰氯，室温反应24小时得到的；

所述2，5-二碘-1，4-二(1，4-二氧杂-6-溴-己烷基)苯是将2，5-二碘-1，4-苯二酚与碳酸钾溶于丙酮中，依次加入二(2-溴乙基)醚和18-冠醚-6，氮气气氛下70℃反应40h得到的；

所述2，5-二碘-1，4-苯二酚是将2，5-二甲氧基-1，4-二碘苯溶于二氯甲烷中冷却至0℃，滴加60ml含三溴化硼的二氯甲烷，然后室温反应6h，然后将反应液倒入氮气饱和的冰水中得到的；

所述2，5-二甲氧基-1，4-二碘苯是将碘酸钾与碘溶于混合溶剂中，加入1，4-二甲氧基苯，加热至回流，反应6h得到的；所述混合溶剂是将100体积份乙酸、5体积份硫酸和1.5体积份水混合得到的。

5.式(I)所示化合物和权利要求1至4中任一所述的式(II)所示化合物在辅助鉴别真菌和细菌中的应用；

式(I)所示化合物的数均分子量为5000-100000。 

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：式(I)所示化合物的数均分子量为3.5×10⁴；所述细菌为大肠杆菌；所述真菌为白色念珠菌。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述大肠杆菌为如下菌株：JM109、M15、TOP10、BL21、DH5α或TG1；

所述白色念珠菌为如下菌株：中国普通微生物菌种保藏管理中心编号2.2086的菌株、中国普通微生物菌种保藏管理中心编号2.538的菌株、广东省微生物研究所菌种保藏中心编号GIM2.120的菌株、广东省微生物研究所菌种保藏中心编号GIM2.130的菌株。

8.辅助鉴别真菌和细菌的方法，是检测待测菌是否可以诱导式(I)所示化合物和权利要求1至4中任一所述的式(II)所示化合物发生荧光共振能量转移；如果待测菌可以诱导式(I)所示化合物和式(II)所示化合物发生荧光共振能量转移，待测菌为候选的细菌；如果待测菌不能诱导式(I)所示化合物和式(II)所示化合物发生荧光共振能量转移，待测菌为候选的真菌。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：

式(I)所示化合物的数均分子量为3.5×10⁴；所述方法为方法(A)或方法(B)；

所述方法(A)包括如下步骤：

在乙醇水溶液中，将式(I)所示化合物、权利要求1至4中任一所述的式(II)所示化合物和待测菌菌液混合，在紫外灯下激发光波长为365nm观察混合液颜色；如果混合液发出黄绿色荧光待测菌为候选的细菌，如果混合液发出蓝色荧光待测菌为候选的真菌；

所述方法(B)包括如下步骤：

(1)将式(I)所示化合物和式(II)所示化合物溶于乙醇水溶液，得到溶液甲；测定溶液甲的荧光光谱，激发波长为380nm，激发光源为氙灯，得到溶液甲420nm处的荧光强度F₀；

(2)将溶液甲和待测菌菌液混合，得到溶液乙；测定溶液乙的荧光光谱，激发波长为380nm，激发光源为氙灯，得到溶液乙420nm处的荧光强度F；

(3)根据如下公式计算淬灭效率QE：

如果淬灭效率大于50％，待测菌为候选的细菌；如果淬灭效率小于40％，待测菌为候选的真菌。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：

所述方法(A)包括如下步骤：在2mL 40％乙醇水溶液中加入2μL 1mM式(I)所示 化合物的水溶液和5μL 1mM所述式(II)所示化合物的水溶液，然后加入100μLOD₆₀₀＝1.0的待测菌菌液，在紫外灯下，激发光波长为365nm、强度为4W，观察溶液颜色；如果混合液发出黄绿色荧光待测菌为候选的细菌，如果混合液发出蓝色荧光待测菌为候选的真菌；所述百分含量为体积百分含量；

所述方法(B)包括如下步骤：

(1)将式(I)所示化合物和所述式(II)所示化合物溶于40％乙醇水溶液，得到溶液甲；测定溶液甲的荧光光谱，激发波长为380nm、激发光源为150W的氙灯，得到溶液甲420nm处的荧光强度F₀；所述溶液甲中，式(I)所示化合物和式(II)所示化合物的终浓度均为1.0×10^-6M；所述百分含量为体积百分含量；

(2)将1mL溶液甲和10μL OD₆₀₀＝1.0的待测菌菌液混合，得到溶液乙；3分钟后测定溶液乙的荧光光谱，激发波长为380nm、激发光源为150W的氙灯，得到溶液乙420nm处的荧光强度F；

(3)根据如下公式计算淬灭效率QE：

如果淬灭效率大于50％待测菌为候选的细菌；如果淬灭效率小于40％待测菌为候选的真菌。

11.如权利要求8至10中任一所述的方法，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌；所述真菌为白色念珠菌。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为如下菌株：JM109、M15、TOP10、BL21、DH5α或TG1；

所述白色念珠菌为如下菌株：中国普通微生物菌种保藏管理中心编号2.2086的菌株、中国普通微生物菌种保藏管理中心编号2.538的菌株、广东省微生物研究所菌种保藏中心编号GIM2.120的菌株、广东省微生物研究所菌种保藏中心编号GIM2.130的菌株。 

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