CN108956565A - 一种荧光探针及在检测sirt2酶活性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物分析检测领域，公开了一种荧光探针及在检测SIRT2酶活性中的应用，该探针的结构为：Ac‑Gly‑R1‑R2‑Thr‑NH₂，R1为带荧光基团的长链酰基化赖氨酸，R2为猝灭基团。本发明探针用于检测SIRT2酶活性，反应体系不与任何酶促反应或者化学反应相偶联，只需要一步即SIRT2对底物赖氨酸残基进行去酰基化，赖氨酸侧链上的荧光基团与底物主链上猝灭基团分开，然后通过检测一定激发波长下荧光基团的荧光变化来反应SIRT2的活性，操作简便，成本低，适用于高通量筛选；减小了引入其他物质或者其他反应可能给检测体系带来的误差；且该方法能够连续性检测SIRT2活性并对SIRT2抑制剂进行筛选。

Description

一种荧光探针及在检测SIRT2酶活性中的应用

技术领域

本发明属于生物分析检测领域，涉及一种荧光探针及检测SIRT2酶活性的方法。

背景技术

组蛋白的去乙酰化修饰在基因表达及调控中起重要作用。Sirtuin是一种从细菌到人类高度保守的催化反应依赖于NAD+的去乙酰化酶类，人类Sirtuin家族有7个成员：SIRT1～SIRT7。它们与人体内p53，Ku70，FOXO，PGC-1α等蛋白相互作用，参与调控了细胞应激反应、代谢、衰老以及凋亡等过程。

SIRT2主要存在于细胞质中，具有较强的组蛋白去乙酰化酶活性，无论在体内还是体外都能将α微管蛋白在赖氨酸40位点去乙酰化。除此之外有研究发现，在体外SIRT2能够有效去除赖氨酸上的长链酰基，为体外开发SIRT2检测方法提供了新思路。除了存在于胞浆中，SIRT2在G2/M期能通过去乙酰化组蛋白H4迁移到细胞核调节染色质的凝聚。SIRT2通过催化不同的底物去乙酰化参与了许多生物学过程，比如细胞凋亡、细胞代谢、细胞周期调控、基因沉默等。许多疾病与SIRT2相关，如亨廷顿氏和帕金森等神经退行性疾病以及癌症。有研究发现在神经退行性疾病模型中，SIRT2的抑制能够明显保护神经元细胞，因此，SIRT2有望成为治疗神经退行性疾病的一个重要靶点。

目前常用于SIRT2活性检测的方法有基于液相色谱或液质联用的分析方法，放射标记NAD+或者底物赖氨酸残基上的C、H、P等元素的间接检测方法以及荧光检测法。前两种方法样品处理复杂，操作步骤繁琐，最后一种荧光检测法是现在商品化试剂盒常用方法。但是，现常用的荧光检测法都是与酶促反应相偶联的“两步”检测法，第一步是SIRT2对底物进行去乙酰化修饰，第二步是加入胰酶将去乙酰化修饰的底物断开，使得荧光基团在激发波长下发荧光以此来检测SIRT2活性。

目前未能见到相关文献专利报导能连续的，且不与任何酶促反应或者化学反应相偶联的特异性检测SIRT2酶活性的方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种荧光探针。

本发明的目的之二是提供一种检测SIRT2酶活性的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种荧光探针(ne-K4a)，其结构为：Ac-Gly-R1-R2-Thr-NH₂，

R1为带荧光基团的长链酰基化赖氨酸，

R2为猝灭基团。

优选的，R1为

优选的，R2为3-NO₂-Tyr。

所述荧光探针在检测SIRT2酶活性中的应用。

所述荧光探针在SIRT2抑制剂筛选中的应用，包括如下步骤：

(1)首先在缓冲液中加入荧光探针，辅酶NAD⁺，待测样品，以及SIRT2，混合均匀；

(2)在320nM激发波长，400～430nM发射波长下连续检测至少15min，

通过荧光变化速度判断待测样品对SIRT2有无抑制性。

优选的，步骤(1)中所述缓冲液的配方为：50mM HEPES；100mM KCl；0.001％Tween-20；0.05mg/ml BSA；200mM TCEP；PH:7.4。

优选的，步骤(2)中发射波长为416nM。

优选的，步骤(1)中荧光探针的终浓度为20μM；辅酶NAD+的终浓度为1μM；SIRT2的终浓度为0.3μM。

优选的，步骤(2)中检测的温度为37℃。

步骤(2)中用384黑色孔板进行检测。

本发明的原理：FRET即荧光能量共振转移原理，其概念是发生在两个距离很近的荧光分子间的一种能量转移现象。当荧光分子和猝灭分子相近时，荧光分子发射光谱与猝灭分子吸收光谱重叠，导致荧光分子荧光猝灭。不同于现有的在反应中引入胰蛋白酶的商品化试剂盒，本发明是建立在FRET原理上对荧光探针进行的设计，其荧光探针的多肽底物赖氨酸侧链上含有长链酰基，使得该荧光底物能被SIRT2识别，在辅酶NAD⁺存在下，SIRT2蛋白对该多肽进行去长链酰基修饰。长链酰基未被脱去时，荧光底物上猝灭基团与荧光基团位置靠近，荧光受到抑制，当赖氨酸的长链酰基侧链受到SIRT2作用与多肽断开时，连在长链酰基侧链上的荧光基团与多肽链上的猝灭基团分离，荧光基团在一定的激发波长下发出荧光，从而实现对SIRT2蛋白活性进行特异性连续检测。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明设计的SIRT2活性检测方法是将小分子荧光基团以及猝灭基团连接到SIRT2特异性识别底物上，反应中不需要加入胰酶或者其他物质，只需要一步即SIRT2对底物进行去酰基化，底物上的荧光基团与猝灭基团分开，然后通过检测一定激发波长下荧光基团的荧光变化来检测SIRT2活性，不与任何酶促反应或者化学反应偶联，操作简便，成本低，适用于高通量筛选；减小了引入其他物质或者其他反应可能给检测体系带来的误差；且该方法能够连续性检测SIRT2活性。

附图说明

图1荧光探针检测SIRT2活性原理图。

图2SIRT2蛋白，NAD⁺以及荧光探针相互作用的荧光光谱分析结果图；其中RFU(relative fluorescence units)即相对荧光单位，代表荧光光谱强度，Wavelength/nm表示波长(nm)。

图3荧光探针对SIRT2蛋白的检测灵敏度考察结果；其中FluorescenceEnhancement Velocity即荧光提升速度，表示每秒相对荧光单位提高程度。

图4与SIRT1蛋白,SIRT3蛋白相比，荧光探针对SIRT2蛋白的检测特异性考察结果；其中Fluorescence Enhancement Velocity即荧光提升速度，表示每秒相对荧光单位提高程度。

图5酶SIRT2与荧光底物的酶促反应动力学曲线；其中ne-K4a(μM)表示荧光探针ne-K4a的浓度(μM)，v(μM/min)表示SIRT2蛋白与底物ne-K4a的反应速度，即1min内SIRT2能催化底物ne-K4a(μM)的浓度。

图6SirReal2浓度与其对SIRT2蛋白抑制效应的量效关系图；其中LogConcentration of SirReal2(nM)表示SirReal2浓度(nM)的对数，inhibition rate(％)表示抑制率(％)。

图7AGK2浓度与其对SIRT2蛋白抑制效应的量效关系图；其中Log Concentrationof AGK2(nM)表示AGK2浓度(nM)的对数，inhibition rate(％)表示抑制率(％)。

具体实施方式

以下结合具体实施例及附图对本发明技术方案作进一步地详细的说明，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

验证荧光探针不受SIRT2或者NAD⁺单独作用影响，包括如下步骤：

(1)配置如下四组样品

样品1：向47μl缓冲液(50mM HEPES；100mM KCl；0.001％Tween-20；0.05mg/mlBSA；200mM TCEP；PH:7.4，下同)中加入1μl NAD⁺(50mM，下同)，1μl荧光探针(1mM，下同)，最后加入1ul SIRT2(15μM，下同)；

样品2：向48μl缓冲液加入1μl荧光探针，最后加入1ul sirt2；

样品3：向48μl缓冲液加入1μl NAD⁺，最后加入1ul的sirt2；

样品4：向48μl缓冲液加入1μl荧光探针和1μl NAD⁺；

(2)将四组样品均在37℃下反应一小时，反应结束后用Flex Station3多功能酶标仪检测在320nM激发下，380nM到580nM的荧光光谱。

由图2可见，只有SIRT2,NAD⁺和荧光探针同时加入反应体系时，才有明显的荧光提升现象，而在缺乏SIRT2或者NAD⁺或者荧光探针的体系中，基本没有荧光提升。说明SIRT2或者NAD⁺单独加入体系均不会对荧光探针造成影响，SIRT2需要依赖于辅酶NAD⁺才能发挥SIRT2酶的去酰化能力，脱去荧光探针赖氨酸上的荧光长链酰基，使荧光基团与多肽链上的猝灭基团分开，在320nM的激发波长下发出荧光。

实施例2

检测荧光探针对SIRT2酶的灵敏度考察，包括如下步骤：

向47μl缓冲液中加入1μl荧光探针(1mM)和1μl的NAD⁺(50mM),最后分别加入不同浓度的1μl SIRT2(终浓度为43.75nM，87.5nM，175nM，350nM，425nM，500nM)，采用FlexStation3多功能酶标仪在37℃，激发波长320nM，发射波长416nM连续检测30min，统计30min内的荧光变化速度。

由图3可见，在荧光底物浓度不变的情况下，随着SIRT2蛋白浓度增加，体系的荧光提升速率也随之提高。

实施例3

检测荧光探针对SIRT2酶的特异性考察，包括如下步骤：

(1)配置如下三组样品

样品1：向47μl缓冲液中加入1μl SIRT1(15μM)，1μl NAD+，1μl荧光探针。

样品2：向47μl缓冲液中加入1μl SIRT2(15μM)，1μl NAD+，1μl荧光探针。

样品3：向47μl缓冲液中加入1μl SIRT3(15μM)，1μl NAD+，1μl荧光探针。

(2)三组样品均在37℃下反应，用Flex Station3多功能酶标仪在激发波长320nM，发射波长416nM连续检测30min，统计30min内的荧光变化速度。

由图4可见，相同浓度下，加入SIRT1蛋白与SIRT3蛋白的样品组基本没有荧光信号，而SIRT2样品组有明显的荧光提升，说明荧光探针仅能被SIRT2蛋白特异性识别，并且经过SIRT2蛋白的去酰化修饰后在一定激发波长下发出荧光信号，荧光探针对SIRT2有较强的检测特异性。

实施例4

检测SIRT2连续性反应的酶动力学参数，包括如下步骤：

向47μl缓冲液中加入1μl NAD⁺，分别加入1μl荧光探针(终浓度为24μM，12μM，6μM，3μM，1.5μM，0.75μM，0.75μM，0.375μM)，最后加入1μl SIRT2，用Flex Station3多功能酶标仪在37℃，激发波长320nM，发射波长416nM连续检测30min，用GraphPad Prism统计作图。

由图5可见，SIRT2蛋白浓度不变，在一定范围内，随着荧光探针浓度的增加，体系的荧光提升速度也随之提高，得到酶促反应动力学参数Km＝3.509μM，Kcat＝2.345S^-1。

实施例5

荧光探针在SIRT2抑制剂筛选中的应用，包括如下步骤：

向46μl缓冲液中加入，1μl NAD⁺，1ul ne-K4a，分别加入不同浓度1ul SirReal2(终浓度为0μM，0.2μM，1μM，6μM，30μM，100μM，500μM)，最后加入1μl SIRT2，用FlexStation3多功能酶标仪在37℃，激发波长320nM，发射波长416nM连续检测30min。

由图6可见，随着SirReal2终浓度的提升，SirReal2对SIRT2蛋白的抑制效应也逐渐增加，说明荧光探针构建的SIRT2活性检测体系能较好地反应SIRT2蛋白的抑制，可用于SIRT2抑制剂的筛选。

实施例6

荧光探针在SIRT2抑制剂筛选中的应用，包括如下步骤：

向46μl缓冲液中加入，1μl NAD⁺，1ul ne-K4a，分别加入不同浓度1ul AGK2(终浓度为0μM，0.2μM，1μM，6μM，30μM，100μM，500μM)，最后加入1μl SIRT2，用Flex Station3多功能酶标仪在37℃，激发波长320nM，发射波长416nM连续检测30min。

由图7可见，随着AGK2终浓度的提升，AGK2对SIRT2蛋白的抑制效应也逐渐增加，说明荧光底物ne-K4a构建的SIRT2活性检测体系能较好地反应SIRT2蛋白的抑制，可用于SIRT2抑制剂的筛选。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光探针，其特征在于，该探针的结构为：

Ac-Gly-R1-R2-Thr-NH₂，

R1为带荧光基团的长链酰基化赖氨酸，

R2为猝灭基团。

2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，

R1为

3.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，

R2为3-NO₂-Tyr。

4.权利要求1或2或3所述荧光探针在检测SIRT2酶活性中的应用。

5.权利要求1或2或3所述荧光探针在SIRT2抑制剂筛选中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)首先在缓冲液中加入荧光探针，辅酶NAD⁺，待测样品，以及SIRT2，混合均匀；

(2)在320nM激发波长，400～430nM发射波长下连续检测至少15min，通过荧光变化速度判断待测样品对SIRT2有无抑制性。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中发射波长为416nM。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述缓冲液的配方为：50mMHEPES；100mM KCl；0.001％Tween-20；0.05mg/ml BSA；200mM TCEP；pH:7.4。

9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，步骤(1)中荧光探针的终浓度为20μM；辅酶NAD+的终浓度为1μM；SIRT2的终浓度为0.3μM。

10.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中检测的温度为20～40℃。