CN106929009A - 一种多肽类荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多肽类荧光探针，多肽类荧光探针是通过多肽的氨基与异硫氰酸荧光素的异硫氰酸基键合所得，多肽为四肽DAPD或者二肽，二肽为D、A及P这三种氨基酸中任意两种氨基酸所形成的二肽。多肽类荧光探针的制备方法为：在反应容器中加入异硫氰酸荧光素，然后用甲醇或者水溶解，加入多肽，使异硫氰酸荧光素与多肽的摩尔比为1.2‑1.5:1；恒温20‑40℃条件下，搅拌反应4‑25h后，旋转蒸发除去溶剂得粗产物；粗产物经高效液相色谱分离、纯化和干燥后得到所需纯产物。本发明从仿生的角度出发，制备出的荧光探针能够快速而精确地识别唾液酸，对生物化学、材料学和医学，尤其是一些以唾液酸为重要标示物的重大疾病的早期诊断与治疗具有重要的理论和实际意义。

Description

一种多肽类荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，尤其涉及一种多肽类荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
唾液酸是一类含有羧基的九碳糖化合物酰基衍生物，其广泛存在于细菌、鱼类、哺乳动物等多种生物体内，它参与并调节许多重要的生命活动如细胞识别、生物膜流动和细胞内吞作用等。现如今科学家们发现的唾液酸成员已多达50多个，主要包括N-乙酰基神经氨酸、N-羟乙酰基神经氨酸和脱氨神经氨酸三种核心单体，其余的唾液酸均由这三种体衍生而来。由于唾液酸通常位于细胞膜的糖类部分和分泌的糖复合物(糖脂、糖蛋白和脂多糖)的关键位置，是糖复合物结构和功能多样化的重要物质基础，因此对于血液中唾液酸的分析和检测通常是一些重大疾病早期诊断和治疗的关键。例如多聚脱氨神经氨酸被视为肺癌肿瘤的重要标示物之一。目前唾液酸的检测和分析主要依赖于荧光辅助的高效液相和质谱方法的联用，但是由于唾液酸所处环境中其他糖类的干扰，这一检测方法的准确度并不令人十分满意。另外由于唾液酸种类繁多，且相互之间差异极小，因此对于单一唾液酸的有效检测仍旧是一大难题。综上所述，开发对血液中低浓度的唾液酸具有高灵敏度和高特异性的检测手段，对于进一步研究人体某些重大疾病的致病机理以及相关疾病早期生物标示物的发现具有重要意义。
发明内容
本发明旨在提供一种多肽类荧光探针及其制备方法与应用。该多肽类荧光探针可在类比于血液中低浓度条件下将唾液酸与其他中性单糖区分开来，或者组合利用该荧光探针可以进一步确定唾液酸的种类。
本发明目的采用下述方案来实现：
一种多肽类荧光探针，所述多肽类荧光探针的结构式如下：
所述多肽类荧光探针是通过多肽的氨基与异硫氰酸荧光素的异硫氰酸基键合所得，所述多肽为四肽DAPD或者二肽，所述二肽为D、A、P这三种氨基酸中任意两种氨基酸所形成的二肽。这些肽段均由不同氨基酸通过固相反应合成。
上述方案中，所述二肽为PD、DP、DA、DD、PA或AD。
上述方案中，包括以下步骤：在反应容器中加入异硫氰酸荧光素，然后用甲醇或者水溶解，加入多肽，使异硫氰酸荧光素与多肽的摩尔比为1.2-1.5:1；恒温20-40℃条件下，搅拌反应4-25h后，旋转蒸发除去溶剂得粗产物；粗产物经高效液相色谱分离、纯化和干燥后得到所需纯产物。
所述的多肽类荧光探针在识别唾液酸中的应用。
上述方案中，包括以下步骤：
1)先配置浓度为2.0-20μM的DAPD荧光探针水溶液，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，记录其500-550nm处的荧光强度I0；
2)往该溶液中加入单糖并混合均匀，所述单糖与所述DAPD荧光探针的摩尔比为0.1-10，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，记录其在500-550nm处的荧光强度I1；
3)往步骤2)所得的溶液中继续加入单糖并混合均匀，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，记录其在500-550nm处的荧光强度I2；
4)重复步骤3)n遍，分别得到荧光强度I3,…In；
5)以荧光强度I2,…In分别对应的单糖的摩尔数与DAPD荧光探针的摩尔数之比为横坐标，以I2,…In为纵坐标，得到荧光响应性曲线，若该曲线呈下降趋势，则说明单糖溶液中含有唾液酸。
上述方案中，所述步骤1)中的DAPD荧光探针水溶液中加入Tris-HCl缓冲液调节pH＝5-9。
上述方案中，所述步骤2)中的单糖为唾液酸、半乳糖或葡萄糖。
上述方案中，包括以下步骤：
1)先配置X组浓度为2.0-20μM的pH＝5-9的不同种类的二肽类荧光探针水溶液，所述二肽为D、A、P这三种氨基酸中任意两种氨基酸所形成的二肽，每组二肽类荧光探针水溶液包括Y份相同种类的二肽类荧光探针水溶液，X的数目与二肽的种类数目相同，Y的数目与已知唾液酸的种类数目相同，所述X大于等于3，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，分别记录一系列二肽荧光探针在500-550nm处的荧光强度I0；
2)往其中一种二肽类荧光探针水溶液中加入一种已知种类的唾液酸，使其浓度在10-200μM，并混合均匀，在激发波长470nm条件下，测得加入唾液酸后的二肽荧光探针水溶液的荧光光谱，记录其在500-550nm处的荧光强度I；
3)设定I/I0小于0.4时为“on”状态，I/I0大于0.4时为“off”状态；
4)重复步骤2)和3)，测定X组二肽类荧光探针水溶液中每组的Y份二肽类荧光探针水溶液对于Y种不同种类的已知等量唾液酸得到的不同on和off组合的特定响应规律；
5)以Y种唾液酸为横轴，以X种二肽类荧光探针水溶液为纵轴建立on-off荧光变化正交矩阵；
6)参照步骤1)至步骤3)，测量未知种类唾液酸相对于X种二肽类荧光探针水溶液得到的X个I/I0值，即可以得到X个不同on和off组合的特定响应规律，将所述未知唾液酸的特定响应规律与步骤5)得到的已知唾液酸的正交矩阵进行对比，如果重合即可判断所述未知唾液酸的种类。
上述方案中，所述Y为6，所述6种唾液酸为SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SA-5或SA-6，其结构式如下：
上述方案中，所述X为6，所述6种二肽为PD、DP、DA、DD、PA或AD。
本发明的有益效果为：
1、本发明制备的荧光探针在检测唾液酸时，具有检测精准性高，检测速度快且抗其他中性单糖干扰的优点，非常适用于复杂生物体系中快速检测唾液酸含量变化；
2、本发明制备的荧光探针组合使用时，对不同种类的唾液酸响应性状态不同，因此可以实现不同唾液酸分子的区分；
3、本发明制备的荧光探针设计来源于植物体内的凝集素，其本质是基于糖肽之间氢键的弱相互作用，可扩展性较好。
综上所述，本发明受植物体内凝集素与糖的特异性结合启发，从花生凝集素模型中提取了起关键性作用的核心四肽片段DAPD，并用异硫氰酸荧光素进行修饰，制备了对唾液酸具有特异性识别的荧光探针。另外通过进一步简化肽链结构，制备了一系列基于二肽的荧光探针(PD、DP、DA、DD、PA、AD)，并设计一系列正交实验实现了对其中6种有代表性的唾液酸的精确识别。本发明从仿生的角度出发，制备出的荧光探针能够快速而精确地识别唾液酸，对生物化学、材料学和医学，尤其是一些以唾液酸为重要标示物的重大疾病的早期诊断与治疗具有重要的理论和实际意义。
附图说明
图1为异硫氰酸荧光素化学结构图。
图2为唾液酸分子SA-1～SA-6的化学结构图。
图3为DAPD荧光探针中加入不同摩尔比的SA-1后其荧光光谱的变化趋势，插图为514nm处荧光强度随SA-1分子加入的变化趋势图。
图4为DAPD荧光探针中加入不同摩尔比的葡萄糖后其荧光光谱的变化趋势，插图为514nm处荧光强度随葡萄糖分子加入的变化趋势图。
图5为DAPD荧光探针中加入不同摩尔比的半乳糖后其荧光光谱的变化趋势，插图为514nm处荧光强度随半乳糖分子加入的变化趋势图。
图6为DAPD荧光探针中加入不同摩尔比的各种单糖后其荧光光谱514nm处荧光强度随糖分子加入的变化趋势图。
图7为DAPD荧光探针中加入不同摩尔比的SA-1与葡萄糖的混合物(摩尔比分别为1:10、1:100和1:300)后其荧光光谱514nm处荧光强度随糖分子加入的变化趋势图。
图8为PD荧光探针中分别加入等量SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SA-5和SA-6后荧光光谱对比图。
图9为荧光强度变化幅度与“on-off”状态界定示意图。
图10为荧光强度变化“on-off”状态矩阵图。
具体实施方式
为使本发明的内容、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而本发明不仅限于以下实施例。
实施例中所用原料及设备
各种多肽序列片段由上海强耀生物科技购得，均由固相合成法制得，纯度在98％以上。异硫氰酸荧光素(5g，98％)，Tris试剂(100g，97％)，各种糖类(纯度均高于95％)均由Sigma-Aldrich公司购得。所用甲醇等色谱试剂均由美国天地色谱试剂公司购得，配制缓冲溶液所用盐酸等试剂由国药集团化学试剂有限公司处购得。本发明中所用水均为Milli-Q超纯水仪制备(电阻率为18.2MΩ·cm)。荧光光谱数据由PerkinElmer LS55荧光分光光度计采集而成。
实施例1
异硫氰酸荧光素修饰的多肽类荧光探针的制备方法
在圆底烧瓶中加入异硫氰酸荧光素，然后用25mL甲醇或者水溶解后，加入多肽DAPD、PD、DP、DA、DD、PA或者AD，保证异硫氰酸荧光素与多肽的摩尔比为1.2:1。恒温30℃条件下，搅拌反应12h后，旋转蒸发除去溶剂得粗产物。粗产物经高效液相色谱分离、纯化，真空冷冻干燥后得到所需纯产物，即可用作唾液酸特异性识别的荧光探针。可以理解的是，本发明中的二肽并不局限于PD、DP、DA、DD、PA或者AD，其可以是D、A、P这三种氨基酸中任意两种氨基酸所形成的二肽。
实施例2
基于四肽DAPD的荧光探针应用在唾液酸的特异性识别中，具体步骤如下：
1)先配置浓度为2.0μM的DAPD荧光探针水溶液(加Tris-HCl缓冲，调pH＝7.4)，以其为荧光主体分子，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，记录其在514nm处最高峰强I0；
2)往该溶液中加入DAPD荧光探针的唾液酸(SA-1)作为客体分子，其中加入的SA-1摩尔量是DAPD荧光探针的0.1-5倍，并混合均匀，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，记录其在514nm处最高峰强I1；
3)往步骤2)所得的溶液中继续加入SA-1并混合均匀，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，记录其在500-550nm处的荧光强度I2；
4)重复步骤3)n遍，分别得到荧光强度I3,…In；
5)以荧光强度I2,…In分别对应的SA-1的摩尔数与DAPD荧光探针的摩尔数之比为横坐标，以I2,…In为纵坐标，得到荧光响应性曲线。从图3可以看出，该曲线呈下降趋势，则说明单糖溶液中含有唾液酸。在本实施例中，n为10-40。
实施例3-4
按实施例2所述将步骤2)中客体分子唾液酸(SA-1)分别换成葡萄糖和半乳糖，其他条件不变的情况下测得DAPD荧光探针中加入不同摩尔比的葡萄糖或者半乳糖后其荧光光谱。所得荧光光谱变化趋势如图4和图5所示。
实施例5-8
按实施例2所述将步骤2)中客体分子唾液酸(SA-1)分别换成N-乙酰基葡萄糖胺、N-乙酰基、甘露糖和岩藻糖，其他条件不变的情况下分别测得DAPD荧光探针中加入不同摩尔比的糖类客体分子后其荧光光谱。各荧光图谱中514nm处发射谱峰荧光强度变化趋势如图6所示。
由图3-6可知只有当DAPD荧光探针中加入不同比例唾液酸SA-1时，其荧光强度会随着SA-1的加入而呈现荧光“猝灭”的现象，而当DAPD荧光探针中加入不同比例的其他中性单糖时，其荧光强度则会随着糖分子的加入而呈现荧光增强的现象，由此我们可以有效地将唾液酸从其他中性单糖中区分出来。
实施例9-11
按实施例2所述将步骤1)中主体分子DAPD探针换成PD探针，步骤2)中客体分子唾液酸(SA-1)换成SA-1与葡萄糖的混合物(SA-1与葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:100和1:300)，其他条件不变的情况下分别测得DAPD荧光探针中加入不同摩尔比的糖类客体分子后其荧光光谱。各荧光图谱中514nm处发射谱峰荧光强度变化趋势如图7所示。
由图7可知DAPD荧光探针对SA-1的响应性几乎不受同时加入的葡萄糖分子影响，这充分说明了该类荧光探针抗干扰的能力，有望应用于更加复杂的实际生物样本体系。
实施例12
二肽荧光探针用于区分不同种类的唾液酸，具体步骤如下：
1)先配置X组浓度为2.0-20μM的pH＝5-9的不同种类的二肽类荧光探针水溶液，所述二肽为D、A、P这三种氨基酸中任意两种氨基酸所形成的二肽，每组二肽类荧光探针水溶液包括Y份相同种类的二肽类荧光探针水溶液，X的数目与二肽的种类数目相同，Y的数目与已知唾液酸的种类数目相同，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，分别记录一系列二肽荧光探针在500-550nm处的荧光强度I0；
2)往其中一种二肽类荧光探针水溶液中加入一种已知种类的唾液酸，使其浓度在10-200μM，并混合均匀，在激发波长470nm条件下，测得加入唾液酸后的二肽荧光探针水溶液的荧光光谱，记录其在500-550nm处的荧光强度I；
3)设定I/I0小于0.4时为“on”状态，I/I0大于0.4时为“off”状态；
4)重复步骤2)和3)，测定X组二肽类荧光探针水溶液中每组的Y份二肽类荧光探针水溶液对于Y种不同种类的已知等量唾液酸得到的不同on和off组合的特定响应规律；
5)以Y种唾液酸为横轴，以X种二肽类荧光探针为纵轴建立on-off荧光变化正交矩阵；
6)参照步骤1)至步骤3)，测量未知种类唾液酸相对于X种二肽类荧光探针水溶液得到的X个I/I0值，即可以得到X个不同on和off组合的特定响应规律，将所述未知唾液酸的特定响应规律与步骤5)得到的已知唾液酸的正交矩阵进行对比，如果重合即可判断所述未知唾液酸的种类。
在本实施例中，X为6，Y为6，具体步骤如下：
1)先配置18mL浓度为2μM的PD荧光探针水溶液(加Tris-HCl缓冲，调pH＝7.4)，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，记录其在514nm处荧光强度I0。
2)将PD溶液等分为6份，然后分别往这6份溶液中加等量(300μmol)的唾液酸SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SA-5和SA-6，并分别混合均匀。
3)在激发波长470nm条件下，分别测得这6种混合溶液的荧光光谱，记录其在514nm处荧光强度I。荧光光谱对比如图8所示。
由图8可知，SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SA-5和SA-6的加入均会导致PD溶液呈现荧光“猝灭”的现象，只是荧光强度下降的程度各有不同，依此可初步分辨不同的唾液酸。
实施例13-17
按照实施例12所述方法，将所述步骤1)中PD荧光探针分别换成DP、DA、DD、PA和AD，其他条件不变。规定当I/I0小于0.4时为“on”状态，反之则为“off”状态，如图9所示。以6种唾液酸为横轴、以6种二肽荧光探针为纵轴建立on-off荧光变化正交矩阵，如图10所示(图中深灰色为“off”状态，浅灰色为“on”状态)。
结合图10我们可以清晰地看出，每一种唾液酸均有一个针对于6种二肽荧光探针的特征“on-off”状态转变规律，根据该转变规律图可以很快鉴定出样品属于哪一种唾液酸。进一步观察可以发现，实际上我们仅需要PD、DA和DD三种二肽荧光探针就足以区分这6种唾液酸，这更加展示了我们所设计的多肽类荧光探针在精确识别更多更复杂的唾液酸分子中的潜在应用。
综上所述，本发明仿生的角度出发，制备出的荧光探针能够快速而精确地识别唾液酸，不仅能够区分唾液酸和其他中性单糖，而且对于不同种类的唾液酸亦能加以精确区分。同时与传统的检测方法相比具有检测速度快、成本低廉和抗干扰能力强的优点。因此有望将其应用于复杂生物体系中大规模、高通量、高精度的唾液酸检测和鉴定。另外，本发明制备的荧光探针设计来源于植物体内的凝集素，其本质是基于糖肽之间氢键的弱相互作用，可扩展性较好，对仿生生物传感材料的发展具有一定的启示作用。

Claims (10)

1.一种多肽类荧光探针，其特征在于，所述多肽类荧光探针的结构式如下：
所述多肽类荧光探针是通过多肽的氨基与异硫氰酸荧光素的异硫氰酸基键合所得，所述多肽为四肽DAPD或者二肽，所述二肽为D、A、P这三种氨基酸中任意两种氨基酸所形成的二肽。
2.如权利要求1所述的多肽类荧光探针，其特征在于，所述二肽为PD、DP、DA、DD、PA或AD。
3.如权利要求1所述的多肽类荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在反应容器中加入异硫氰酸荧光素，然后用甲醇或者水溶解，加入多肽，使异硫氰酸荧光素与多肽的摩尔比为1.2-1.5:1；恒温20-40℃条件下，搅拌反应4-25h后，旋转蒸发除去溶剂得粗产物；粗产物经高效液相色谱分离、纯化和干燥后得到所需纯产物。
4.如权利要求1或2所述的多肽类荧光探针在识别唾液酸中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)先配置浓度为2.0-20μM的DAPD荧光探针水溶液，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，记录其500-550nm处的荧光强度I0；
2)往该溶液中加入单糖并混合均匀，所述单糖与所述DAPD荧光探针的摩尔比为0.1-10，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，记录其在500-550nm处的荧光强度I1；
3)往步骤2)所得的溶液中继续加入单糖并混合均匀，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，记录其在500-550nm处的荧光强度I2；
4)重复步骤3)n遍，分别得到荧光强度I3,…In；
5)以荧光强度I2,…In分别对应的单糖的摩尔数与DAPD荧光探针的摩尔数之比为横坐标，以I2,…In为纵坐标，得到荧光响应性曲线，若该曲线呈下降趋势，则说明单糖溶液中含有唾液酸。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤1)中的DAPD荧光探针水溶液中加入Tris-HCl缓冲液调节pH＝5-9。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤2)中的单糖为唾液酸、半乳糖或葡萄糖。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)先配置X组浓度为2.0-20μM的pH＝5-9的不同种类的二肽类荧光探针水溶液，所述二肽为D、A、P这三种氨基酸中任意两种氨基酸所形成的二肽，每组二肽类荧光探针水溶液包括Y份相同种类的二肽类荧光探针水溶液，X的数目与二肽的种类数目相同，Y的数目与已知唾液酸的种类数目相同，所述X大于等于3，在激发波长470nm条件下测其发射的荧光光谱，分别记录一系列二肽荧光探针在500-550nm处的荧光强度I0；
2)往其中一种二肽类荧光探针水溶液中加入一种已知种类的唾液酸，使其浓度在10-200μM，并混合均匀，在激发波长470nm条件下，测得加入唾液酸后的二肽荧光探针水溶液的荧光光谱，记录其在500-550nm处的荧光强度I；
3)设定I/I0小于0.4时为“on”状态，I/I0大于0.4时为“off”状态；
4)重复步骤2)和3)，测定X组二肽类荧光探针水溶液中每组的Y份二肽类荧光探针水溶液对于Y种不同种类的已知等量唾液酸得到的不同on和off组合的特定响应规律；
5)以Y种唾液酸为横轴，以X种二肽类荧光探针为纵轴建立on-off荧光变化正交矩阵；
6)参照步骤1)至步骤3)，测量未知种类唾液酸相对于X种二肽类荧光探针水溶液得到的X个I/I0值，即可以得到X个不同on和off组合的特定响应规律，将所述未知唾液酸的特定响应规律与步骤5)得到的已知唾液酸的正交矩阵进行对比，如果重合即可判断所述未知唾液酸的种类。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述Y为6，所述6种唾液酸为SA-1、SA-2、SA-3、SA-4、SA-5或SA-6，其结构式如下：
10.如权利要求8所述的应用，所述X为6，所述6种二肽为PD、DP、DA、DD、PA或AD。
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