CN101392234A

CN101392234A - 缬草环烯醚萜生产方法

Info

Publication number: CN101392234A
Application number: CNA2008101435128A
Authority: CN
Inventors: 黎继烈; 李忠海; 方勤敏; 陈建华; 钟海雁; 彭映辉; 鲁海波; 王卫; 张慧
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Central South University of Forestry and Technology
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2008-11-07
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2028-11-07
Also published as: CN101392234B

Abstract

本发明公开了一种缬草环烯醚萜生产方法，包括以下步骤：(1)缬草愈伤组织诱导培养及处理：将缬草外植体接种在含相应植物生长调节物质的MS固体培养基上进行培养，每15～30天继代一次，选出环烯醚萜高的缬草愈伤组织；(2)细胞悬浮培养：将缬草愈伤组织转移到液体培养基中进行逐步扩大培养，将经过扩大培养的缬草细胞接种于生物反应器的液体培养基中进行规模化缬草细胞悬浮培养，收获缬草细胞；(3)对收获缬草细胞进行提取分离得到环烯醚萜，本发明解决了缬草环烯醚萜生产的原料匮乏的问题，并且产品纯度高，工艺过程容易控制，成本相对较低。

Description

缬草环烯醚萜生产方法

技术领域

本发明涉及一种缬草环烯醚萜的生产方法。

背景技术

缬草为败酱科缬草属(Valeriana L.)多年生草本植物。在我国资源稍多的主要有4种：缬草(Valeriana officinalis L.)、宽叶缬草(Valerianaofficinalis L.var.latifolia Miq.)、黑水缬草(Valeriana amurensisSmir.ex Kom)和蜘蛛香(Valeriana jatamansi Jones)，自东而西主要分布于中南、西南、西北、东北山区及丘陵地带。缬草根茎中主要含环烯醚萜类、倍半萜类、生物碱类、木脂素类、黄酮类等生物活性成分，具有显著的平滑肌解痉、增加冠脉流量、抗心律失常、抗肿瘤、镇静安神等作用，是优良的天然药物资源。我国目前所用缬草基本为野生状态，人工种植才刚开始，野生缬草中环烯醚萜含量要三年左右生的植株才能达到较高的水平，由于三年龄的缬草量少，造成采收时一年、二年、三年生缬草一并采收，这样致使野外资源越来越少，资源短缺现象严重，且缬草环烯醚萜类化合物含量低不稳定。从加工的角度来看目前企业的缬草素提取物的成分复杂，产品纯度不高，有的还存在重金属超标，这样一来就降低了缬草提取物的稳定性和药用价值。比如中国专利CN1396166一种制备总缬草素的新方法，介绍了用石油醚提取总缬草素的方法，得到的是总缬草素总浸膏。中国专利CN1337255一种缬草提取物的制备方法，采用乙醇渗漉后，将渗漉液浓缩干燥即为产品；中国专利CN1370586A北缬草有机溶剂提取物的医药用途，介绍了甲醇提取物为产品；中国专利CN1475490A一种缬草提取物及其制备方法和用途，介绍了用对缬草先用超临界二氧化碳提取挥发油，余渣用乙醇渗漉后浓缩干燥即为缬草素产品。以上几种方法是将提取溶剂浓缩干燥即可，因而所得的缬草素产品纯度不高，并且总产出周期间长。因此如何利用有限的资源快速生产出纯度高性能稳定的缬草素药用产品，是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产品纯度高、性能稳定、产出周期短的缬草环烯醚萜生产方法。

本发明提供的缬草环烯醚萜生产方法包括以下步骤：

(1)缬草愈伤组织诱导培养及处理：将缬草外植体接种在含相应植物生长调节物质的MS固体培养基上进行培养，pH调至5～7，温度25℃±2℃，光照强度1200～2500lx，光照时间每天6～18小时，在固体培养基上每15～30天继代一次，选择生长快、颜色浅、颗粒均匀的细胞作为继代培养，选出环烯醚萜高的缬草愈伤组织；

(2)细胞悬浮培养：将步骤(1)获得缬草愈伤组织转移到液体培养基中，在三角瓶、种子罐中进行逐步扩大培养，将经过扩大培养的缬草细胞接种于生物反应器的液体培养基中进行规模化缬草细胞悬浮培养，培养条件：温度25℃±2℃，pH5～7，光照强度1200～2500lx，光照时间每天6～18小时，搅拌转速为50～150r/min，培养时间8～25天，收获缬草细胞；

(3)环烯醚萜提取分离：将步骤(2)收获的缬草细胞过滤后干燥粉碎得到缬草细胞干粉，将此干粉放入浸提罐中并加入乙醇溶剂，用乙醇溶剂超声波辅助提取，将提取液过滤、除去滤渣，滤液减压浓缩为环烯醚萜浸膏，将所述浸膏用醇水溶液溶解，经大孔吸附树脂初步分离，再经反相C₁₈柱精细分离，浓缩干燥后得到缬草环烯醚萜产品。

由于本发明生产方法通过对缬草细胞大规模培养，将所获得的培养细胞提取分离生产环烯醚萜和其他活性物质，则可使在野外三年才能收获的缬草植株改为10-25天就可收获一次缬草细胞，而且原料的有效成分稳定，提取的产品中缬草环烯醚萜类化合物纯度高，使得环烯醚萜提取分离工艺过程便于控制，生产过程易操作，提取分离的生产成本下降。解决了缬草环烯醚萜生产的原料问题，提高了产品纯度和质量，所用溶剂可回收，相对生产成本低。

具体实施方案

实施例一、这是一个用宽叶缬草(Valeriana officinalis L.var.latifoliaMiq)根作为外植体，培养缬草环烯醚萜细胞，生产环烯醚萜产品的实例，其生产方法按如下步骤进行：

(1)缬草愈伤组织诱导：配制固体培养基组成为MS+2，4-D 2.5mg/L+KT1.8mg/L+6-BA 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L，用酸或碱将该固体培养基的pH值调至5.8，选择宽叶缬草根为外植体，接种于上述配置好的培养基上进行培养，培养温度25℃±1℃，光照强度1200lx，光照时间每天18小时，在固体培养基上每30天继代一次，选择生长快、颜色浅颗粒均匀细胞作为继代培养，选出环烯醚萜高的缬草愈伤组织。

(2)细胞悬浮培养：配制的液体培养基组成为MS+2，4-D 2.5mg/L+KT 1.8mg/L+6-BA 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖40g/L+乙烯利5mg/L，将该液体培养基的pH值调至5.8，将步骤(1)中得到的愈伤组织细胞转移到液体培养基中，在不同容量的三角瓶、种子罐中进行逐步扩大培养，将经过扩大培养的缬草细胞接种于生物反应器的液体培养基中进行规模化缬草细胞悬浮培养，每次接种量为3％。培养条件：温度25℃±2℃，pH为5.8，光照强度1200lx，光照时间每天18小时，转速为50～150r/min，培养时间15天，收获的缬草细胞，细胞增殖倍数为4.8倍。

(3)环烯醚萜提取分离：将收获的缬草细胞离心过滤，低温真空干燥后粉碎得到缬草细胞干粉；用超声波辅乙醇溶剂提取，提取条件是乙醇溶剂的体积浓度为40％，乙醇溶剂与所述缬草细胞干粉的重量比为20∶1，超声波300W，温度30℃，提取时间60min，重复提取1～3次，将所得提取液合并过滤；将提取后的滤液在40～60℃减压浓缩为至浸膏状，用水溶解浸膏后，上大孔树脂柱分离，洗脱溶剂为40％乙醇，分离液浓缩回收乙醇，用V_甲醇∶V_水∶V_甲酸＝18∶82∶0.05的溶剂溶解后作为流动相上C₁₈柱分离，收集不同时间段的分离液，真空浓缩干燥后即为环烯醚萜产品，纯度可达95％以上。

实施例2、这是一个用蜘蛛香(Valeriana jatamansi Jones)叶作为外植体，培养缬草环烯醚萜细胞，生产环烯醚萜产品的实例，其生产方法按如下步骤进行：

(1)缬草愈伤组织诱导：配制固体培养基组成为MS+2，4-D4mg/L+KT3.0mg/L+6-BA 5mg/L+NAA 3.0mg/L，用酸或碱将该固体培养基的pH值调至7，选择蜘蛛香叶为外植体，接种于配置好的培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度2500lx，光照每天6小时，在固体培养基上每15天继代一次，选择生长快、颜色浅颗粒均匀细胞作为继代培养，选出环烯醚萜高的缬草愈伤组织。

(2)细胞悬浮培养：配制的液体培养基组成为MS+2，4-D 4mg/L+KT 3.0mg/L+6-BA 5mg/L+NAA 3.0mg/L+蔗糖60g/L+乙烯利6mg/L，pH调至7，将上述愈伤组织细胞转移到液体培养基中，在不同容量的三角瓶、种子罐中进行逐步扩大培养，将经过扩大培养的缬草细胞接种于生物反应器的液体培养基中进行规模化缬草细胞悬浮培养，每次接种量为7％。培养条件：温度25℃±2℃，pH值为7，光照强度2500lx，光照每天6小时，转速为50～150r/min，培养时间8天，收获的缬草细胞，细胞增殖倍数为2.5倍。

(3)环烯醚萜提取分离：将收获的缬草细胞离心过滤，低温真空干燥后粉碎；用超声波辅乙醇溶剂提取，提取条件是乙醇的浓度为50％，液料比8∶1，超声波200W，温度20℃，提取时间300min，重复提取1～3次，将所得提取液合并过滤；将提取后的滤液在20～50℃减压浓缩为至浸膏状，用20％乙醇溶解浸膏后，上大孔树脂柱分离，洗脱溶剂为40％乙醇，分离液真空浓缩回收乙醇，用V_甲醇∶V_水∶V_甲酸＝10∶90∶0.3的溶剂溶解后作为流动相上C₁₈柱分离，收集不同时间段的分离液，真空浓缩干燥后即为环烯醚萜产品，纯度可达80％以上。

实施例3、选择缬草(Valeriana officinalisL.)根为外植体培养缬草环烯醚萜细胞，生产环烯醚萜产品的实例，其生产方法按如下步骤进行：

(1)缬草愈伤组织诱导：配制固体培养基组成为MS+2，4-D2.5mg/L+KT1.5mg/L+6-BA3.5mg/L+NAA 0.2mg/L，用酸或碱将pH调至6，选择缬草根为外植体，接种于该培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度1500lx，光照每天10小时，在固体培养基上每25天继代一次，选择生长快、颜色浅颗粒均匀细胞作为继代培养，选出环烯醚萜高的缬草愈伤组织。

(2)细胞悬浮培养：配制的液体培养基组成为MS+2，4-D 2.5mg/L+KT 1.5mg/L+6-BA3.5mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖35g/L+乙烯利3.5mg/L，pH调至6，将上述愈伤组织细胞转移到液体培养基中，在不同容量的三角瓶、种子罐中进行逐步扩大培养，将经过扩大培养的缬草细胞接种于生物反应器的液体培养基中进行规模化缬草细胞悬浮培养，每次接种量为10％。培养条件：温度25℃±2℃，pH值为6，光照强度1500lx，光照每天10小时，转速为50～150r/min，培养时间15天，收获的缬草细胞，细胞增殖倍数为4.5倍。

(3)环烯醚萜提取分离：将收获的缬草细胞离心过滤，低温真空干燥后粉碎；用超声波辅乙醇溶剂提取，提取条件是乙醇的浓度为50％，液料比30∶1，超声波250W，温度40℃，提取时间5min，重复提取3次，将所得提取液合并过滤；将提取后的滤液在40～50℃减压浓缩为至浸膏状，用40％乙醇溶解浸膏后，上大孔树脂柱分离，洗脱溶剂为60％乙醇，分离液浓缩回收乙醇，用V_甲醇∶V_水∶V_甲酸＝20∶80∶0.06的溶剂溶解后作为流动相上C₁₈柱分离，收集不同时间段的分离液，真空浓缩干燥后即为环烯醚萜产品，纯度可达95％以上。

实施例4、选择黑水缬草(Valeriana amurensis Smir.ex Kom)茎为外植体培养缬草环烯醚萜细胞，生产环烯醚萜产品的实例，其生产方法按如下步骤进行：

(1)缬草愈伤组织诱导：配制固体培养基组成为MS+2，4-D 0.5mg/L+KT0.1mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA 0.2mg/L，用酸或碱将pH值调至5.2，选择黑水缬草茎为外植体，接种于该培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度1800lx，光照9h/d，在固体培养基上每22天继代一次，选择生长快、颜色浅颗粒均匀细胞作为继代培养，选出环烯醚萜高的缬草愈伤组织。

(2)细胞悬浮培养：配制的液体培养基组成为MS+2，4-D0.5mg/L+KT0.1mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖20g/L+乙烯利0.5mg/L，pH调至5.2，将上述愈伤组织细胞转移到液体培养基中，在不同容量的三角瓶、种子罐中进行逐步扩大培养，将经过扩大培养的缬草细胞接种于生物反应器的液体培养基中进行规模化缬草细胞悬浮培养，每次接种量为5％。培养条件：温度25℃±2℃，pH为5.2，光照强度1800lx，光照9h/d，转速为50～150r/min，培养时间25d，收获的缬草细胞，细胞增殖倍数为2.2倍。

(3)环烯醚萜提取分离：将收获的缬草细胞离心过滤，低温真空干燥后粉碎；用超声波辅乙醇溶剂提取，提取条件是乙醇的浓度为95％，液料比25∶1，超声波500W，温度50℃，提取时间5min，重复提取2次，将所得提取液合并过滤；将提取后的滤液在20～40℃减压浓缩为至浸膏状，用50％乙醇水溶解浸膏后，上大孔树脂柱分离，洗脱溶剂为75％乙醇，分离液浓缩回收乙醇，用V_甲醇∶V_水∶V_甲酸＝20∶80∶0.15的溶剂溶解后作为流动相上C₁₈柱分离，收集不同时间段的分离液，真空浓缩干燥后即为环烯醚萜产品，纯度可达85％以上。

Claims

1、一种缬草环烯醚萜生产方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)缬草愈伤组织诱导培养及处理：将缬草外植体接种在含相应植物生长调节物质的MS固体培养基上进行培养，pH调至5～7，温度25℃±2℃，光照强度1200～25001x，光照时间每天6～18小时，在固体培养基上每15～30天继代一次，选择生长快、颜色浅、颗粒均匀的细胞作为继代培养，选出环烯醚萜高的缬草愈伤组织；

(2)细胞悬浮培养：将步骤(1)获得缬草愈伤组织转移到液体培养基中，在三角瓶、种子罐中进行逐步扩大培养，将经过扩大培养的缬草细胞接种于生物反应器的液体培养基中进行规模化缬草细胞悬浮培养，培养条件：温度25℃±2℃，pH5～7，光照强度1200～25001x，光照时间每天6～18小时，搅拌转速为50～150r/min，培养时间8～25天，收获缬草细胞；

(3)环烯醚萜提取分离：将步骤(2)收获的缬草细胞过滤后干燥粉碎得到缬草细胞干粉，将此干粉放入浸提罐中并加入乙醇溶剂，用超声波辅助提取，将提取液过滤、除去滤渣，滤液减压浓缩为环烯醚萜浸膏，将所述浸膏用醇水溶液溶解，经大孔吸附树脂初步分离，再经反相C₁₈柱精细分离，浓缩干燥后得到缬草环烯醚萜产品。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述缬草外植体为缬草或宽叶缬草或黑水缬草或蜘蛛香的根或茎或叶。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述固体培养基为MS加浓度如下的物质：0.5～4.0mg/L的2，4-D、0.1～3.0mg/L的KT、1.0～5.0mg/L的6-BA、0.2～3.0mg/L的NAA。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述液体培养基为MS加浓度如下的物质：0.5～4.0mg/L的2，4-D、0.1～3.0mg/L的KT、1.0～5.0mg/L的6-BA、0.2～3.0mg/L的NAA、20～60g/L的蔗糖、0.5～6mg/L的乙烯利。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中的缬草环烯醚萜提取条件为：乙醇溶剂的体积比浓度为20％～95％，该乙醇溶剂与所述缬草细胞干粉的重量比为8～30∶1，超声波功率200～500W，温度20～60℃，提取时间5～300min，重复提取1～3次，将所得提取液合并过滤。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述滤液减压浓缩为环烯醚萜浸膏的过程中减压浓缩温度为30～80℃。

7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中溶解浸膏用的醇水溶液为0％～75％体积比浓度的乙醇，在所述初步分离中使用的洗脱溶剂为20％～100％体积比浓度的乙醇，所述大孔树脂柱为苯乙烯类树脂或甲基丙烯酯类树脂。

8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述C₁₈柱中所用填料为C₁₈；流动相体积比V_甲醇∶V_水∶V_甲酸为10～30∶60～90∶0.05～0.3。

9、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述C₁₈柱可为单柱或双柱，采用单柱分离的方式是在一个分离柱中完成分离过程；采用双柱分离的方式是将前一个柱作为粗分离柱，后一个柱作为精分离柱，通过六通进样阀和制备泵完成在线切换。