CN101386644B - 南瓜蛋白2及其制备方法和用途 - Google Patents

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南瓜蛋白2及其制备方法和用途，涉及生物化学领域。本发明公开了从南瓜(Cucurbita moschata)瓜瓤中提取的一种新的核糖体失活蛋白---南瓜蛋白2(2型南瓜核糖体失活蛋白cucurmosin 2)，ESI-MS测定其分子量为27183Da。南瓜蛋白2已在磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液中，以聚乙二醇为沉淀剂长出可供X-射线衍射的单晶体，晶体结构初步分析表明它是类型1核糖体失活蛋白，具有抗肿瘤，抗病毒，特别是抗艾滋病毒作用，为获得药用蛋白质或制备免疫毒素打下物质基础。

Description

南瓜蛋白2及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物化学领域，特别是涉及到生物化学中一种新的核糖体失活蛋白---南瓜蛋白2的分离纯化，晶体生长技术及其应用。
背景技术
从高等植物中提取的核糖体失活蛋白(Ribosome-Inactivating Protein，简称：RIP)，RIP是一类能使真核生物细胞的核糖体失活，从而抑制细胞内蛋白质合成的细胞毒素，其作用机制是具有RNA N-糖苷酶或叫多核苷酸·腺苷糖苷酶[EC3.2.2.22]活性。根据蛋白分子及其基因的结构，RIP可以分为3类，类型1 RIP是具RNA N-糖苷酶活性的单肽链蛋白，例如，来自葫芦科植物栝楼块根的天花粉蛋白(Trichosanthin，简称：TCS)，苦瓜种子的α，β-苦瓜子蛋白(α，β-Momorcharin，简称：α，β-MOM)和丝瓜种子的丝瓜蛋白a，b(Luffina，b)。类型2 RIP是双肽链蛋白，例如，来自大戟科植物蓖麻种子的蓖麻毒素(Ricin)和豆科植物相思树种子的相思子毒素(Abrin)，它是由一条具有RNAN-糖苷酶活性的A链和一条具凝集素活性的B链通过二硫键连接而成的。类型3RIP是一类茉莉酮诱导的蛋白(jasmonate-induced protein)，它是由具有RNAN-糖苷酶功能的N端结构域和一个未知功能的C端结构域组成，例如来自大麦的JIP60。从葫芦科植物中分离出来的类型1 RIP，例如天花粉蛋白、苦瓜子蛋白、丝瓜子蛋白、白泻根蛋白等，均具有抗肿瘤，抗病毒活性，特别是抗艾滋病毒活性。关于类型1 RIP和类型2 RIP已有很多的专利和文献报道。
南瓜(Cucurbita moschata(Duch.)Poiret)，又叫中国南瓜，是葫芦科植物南瓜属的一个种。CN1263107提供了从南瓜瓜瓤中分离出的类型1 RIP——南瓜蛋白，并公开了它的制备方法。SDS-PAGE显示它的分子量为27kDa.CN1603340提供了南瓜蛋白的糖苷酶活性和抗肿瘤活性。中国专利2007100084026提供了南瓜蛋白245个氨基酸顺序。Barbieri等人(Biochimicaet Biophysica Acta 1760(2006)783-792)提供了从南瓜瓜瓤中提取一种新的RIP：C.moschata RIP，它的分子量为30665Da，并测定了它的N端30个氨基酸顺序。Xia等人(Cell Research(2003)13：369-374)从南瓜子中提取出moschatin，它的分子量为29kDa，并测定了它的N端10个氨基酸顺序。关于南瓜果中的其它核糖体失活蛋白，未见报道。
发明内容
本发明的目的是基于上述现有技术基础，寻找一种新的核糖体失活—南瓜蛋白2，探讨其制备技术，以及晶体生长技术，为南瓜蛋白2的结构与功能研究及应用提供物质基础和实验数据。
本发明的技术方案是从南瓜中提取南瓜蛋白的同时分离纯化出新的RIP，通过包括以下四个步骤快速分离纯化得到南瓜蛋白2：
(1).去掉皮和种子的南瓜瓜瓤加pH4.5，10mM醋酸缓冲液进行匀浆。
(2).匀浆液用50％的冰醋酸调pH3.5-4.5，最佳为pH4.0，然后在4℃条件下，16000×g离心30’，收集上清液。
(3).加样到pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡的强阳离子柱上，280nM实时检测，用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗至基线，再用pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液洗至基线，然后用0-0.6M NaCl在pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集第1峰。一般情况下，洗脱出的第2峰就是先前报道的南瓜蛋白。
(4).合并峰1，用50％的冰醋酸调pH4.0，同时加2倍体积的pH4.5，20mM醋酸缓冲液，再加样到用pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡的强阳离子柱上，280nM实时检测，用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗至基线，再用pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液洗至基线，然后用0-1M NaCl在pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液中进行梯度洗脱，收集主要的峰，该峰就是高度纯化的南瓜蛋白2。
本发明所分离纯化的南瓜蛋白2，在SDS-PAGE上呈现一条带，分子量为27kDa，ESI-MS测定其分子量为27183Da。在强阳离子预装柱Mono-S柱(购自Pharmacia公司)表现为单一峰见图1。高纯度的南瓜蛋白2已经用汽相扩散技术包括悬滴法和坐滴法，蛋白质母液配成12-20mg/ml，池液为磷酸盐缓冲液(0.05M-0.2M，pH6.0-pH7.8)、柠檬酸缓冲液(0.05M-0.2M，pH4.2-6.0)，或Tris-HCl缓冲液(0.05M-0.2M，pH7.3-pH8.9)，以聚乙二醇为沉淀剂(10％-40％(W/V))长出可供X-射线衍射用的单晶。该单晶体在同步辐射光源上收集到一套1.8
Figure 2008100013171_0
的衍射数据，该晶体属P212121晶型，晶胞参数为a＝55.853b＝65.507
Figure 2008100013171_2
，c＝91.754
Figure 2008100013171_3
。以天花粉蛋白为结构模版，用分子置换法构建了南瓜蛋白2的结构模型，表明南瓜蛋白2与天花粉蛋白一样具有典型的核糖体失活蛋白折叠(RIP fold)和活性中心，属于类型1 RIP，与天花粉蛋白一样具有抗肿瘤，抗病毒，特别是抗艾滋病毒的功能。用X-ray sequencing的方法根据电子云密度图及残基周围的化学环境，测定出南瓜蛋白2(简写CUS2)的N端顺序为BVSFRLSSATSSSYGTFISNLRFALPKERKLY(B表示N/D)，该顺序与南瓜蛋白(简写CUS)的N端32个氨基酸顺序，C.moschata RIP(简写CmRIP)N端31个氨基酸顺序，moschatin(简写MOS)N端10个氨基酸顺序，pepocin(简写PEP，从西葫芦Cucurbita pepo中提取的RIP)N端20个氨基酸顺序以及天花粉蛋白(简写TCS)的N端32个氨基酸顺序比较如下：
                                             相同性
CmRIP DIALDLSTAT KATYSAFLRQ LRNAFDPTKA T     32％
CUS2  BVSFRLSSAT SSSYGTFISN LRFALPKERK LY    (100％)
TCS   DVSFRLSGAT SSSYGVFISN LRKALPNERK LY    87.5％
CUS   NVRFDLSSAT SSSYKTFIKN LREALPKDGK VT    68.7％
PEP   NVRFDLSGAT SSSYKTFIKN                  85％
MOS   NVRFDLSGAT                             80％
南瓜蛋白2与天花粉蛋白，西葫芦蛋白的N端顺序相同性超过85％，但与C.moschata RIP相同性只有32％，与南瓜蛋白相同性只有68.7％，上述N端顺序比较表明南瓜蛋白2是从南瓜中提取的一种新的RIP。
MTS法测试表明，南瓜蛋白2对人结肠癌细胞株HCT116增殖抑制活性较强，其半数抑制浓度(IC50)为1.48×10-7mol/L。
本发明与现有技术相比，具有以下积极效果：
1.本发明的分离纯化技术，不经硫酸铵分级沉淀等步骤，省却许多人工繁琐操作，可以分离到南瓜蛋白2，同时可以得到南瓜蛋白。
2.本发明优选用于分离纯化的缓冲液浓度、pH值，并选用了强阳离子交换剂，省却透析的繁琐步骤。
3.本发明所得出的南瓜蛋白2的纯度高，在离子交换预装柱表现为一个单峰，并已在磷酸盐缓冲液(0.05M，0.2M，pH6.0-pH7.8)、柠檬酸缓冲液(0.05M-0.2M，pH4.2-6.0)，或Tris-HCl缓冲液(0.05M-0.2M，pH7.3-pH8.9)条件下，以聚乙二醇为沉淀剂(10％-40％(V/V))长出晶体。
4.南瓜蛋白2对人结肠癌细胞株HCT116增殖抑制活性较强。
附图说明
附图为南瓜蛋白2在Mono-S HR5/5柱上洗脱图：
横坐标为洗脱液ml数，纵坐标为mAU，南瓜蛋白2在洗脱液达6.27ml处即在0.16M NaCl(pH7.5 10mM磷酸盐缓冲液)时出峰，图中折线满标为1M NaCl。
具体实施方式
实施例1：南瓜蛋白2的制备技术：
取500g去掉皮和种子的南瓜瓜瓤，加500ml pH4.5，10mM醋酸缓冲液，在匀浆机上匀浆二次，然后用50％的冰醋酸调pH4.0，再在4℃条件下16000×g，离心30’，收集上清液，上清液加样到2.6×13cm的Sp-Sepharose FastFlow柱上(该柱已用pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡)，继续用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗出一个杂峰后，用pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液继续洗柱，又会洗出一个杂峰，然后用0-0.6M NaCl(在pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液中)梯度洗脱，收集第一峰。混合第一峰收集液，用50％冰醋酸调pH4，再加上2倍体积的pH4.5，20mM醋酸缓冲液，混匀后加样到1.6×13cm的Sp-Sepharose Fast Flow柱上(该柱已用pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡)，同样再用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗柱后，用pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液洗柱达到基线后，最后用0-1M NaCl(在pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液中)进行梯度洗脱，收集洗脱尖峰，就是南瓜蛋白2。
实施例2：强阳离子预装柱Mono-S分析：
本发明分离纯化的南瓜蛋白2在Mono-S HR5/5柱上洗脱图(见附图)：A液为pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液，B液为A液+1M NaCl，流速1ml/min，Mono-S柱用A液平衡后，加样，A液洗柱3ml，0-30％B液线性梯度洗脱6ml，然后100％B液洗3ml后，再用A液平衡5ml。南瓜蛋白2在洗脱液达6.27ml即NaCl浓度为0.16M时出峰。
实施例3：南瓜蛋白2的晶体生长：
将本发明提纯的南瓜蛋白2浓缩为14mg/ml，池液用pH5.4，0.1M柠檬酸缓冲液pH 6.0-7.8或0.1M磷酸缓冲液，28％PEG6K为沉淀剂，用悬滴法长出单晶体。该单晶体在同步辐射光源上收集到一套1.8
Figure 2008100013171_4
的衍射数据，该晶体属P212121晶型，晶胞参数为a＝55.853
Figure 2008100013171_5
 b＝65.507，c＝91.754。

Claims (3)

1.一种从南瓜中提取的核糖体失活蛋白一南瓜蛋白2，其特征在于：分子量为27183Da，其N端氨基酸顺序为：BVSFRLSSATSSSYGTFISNLRFALPKERKLY。
2.根据权利要求1的一种南瓜蛋白2的制备方法，包括缓冲液抽提、调酸和强阳离子柱梯度洗脱，其特征在于：通过包括以下四个步骤快速分离纯化得到南瓜蛋白2：
(1)去掉皮和种子的南瓜瓜瓤加pH4.5，10mM醋酸缓冲液进行匀浆；
(2)匀浆液用50％的冰醋酸调pH 3.5-4.5，然后在4℃条件下，16000×g离心30’，收集上清液；
(3)加样到pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡的强阳离子柱上，280nM实时检测，用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗至基线，再用pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液洗至基线，然后用0-0.6M NaCl在pH 6.5，20mM磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集第1峰；
(4)合并峰1，用50％的冰醋酸调pH4.0，同时加2倍体积的pH4.5，20mM醋酸缓冲液，再加样到用pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡的强阳离子柱上，280nM实时检测，用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗至基线，再用pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液洗至基线，然后用0-1M NaCl在pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液中进行梯度洗脱，收集主要的峰，该峰就是高度纯化的南瓜蛋白2。
3.根据权利要求1的一种南瓜蛋白2的用途，其特征在于：该蛋白作为制备治疗结肠癌药物的应用。
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