CN101381687A

CN101381687A - 一种DDTs降解菌及其应用

Info

Publication number: CN101381687A
Application number: CNA2008101207418A
Authority: CN
Inventors: 方华; 高春明; 虞云龙
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2008-09-10
Filing date: 2008-09-10
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2028-09-10
Also published as: CN101381687B

Abstract

本发明公开了一种降解DDTs的鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)DDT－6，其保藏号为CCTCC M 208116。本发明DDTs降解菌可快速、高效地降解水体和土壤中的残留DDTs，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，生产成本低廉，使用也非常方便，具有广阔的应用前景。

Description

一种DDTs降解菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种细菌，尤其涉及一种DDTs降解菌及其应用。

背景技术

滴滴涕(DDT)是一种曾广泛应用于我国农业生产的有机氯杀虫剂，是环境中典型的持久性有机污染物(Persistent organic pollutants，POPs)和环境内分泌干扰物(Endocrine disrupters，EDs)。它通常包括p，p′-DDT，o，p′-DDT，p，p′-DDE和p，p′-DDD(统称为DDTs)。我国曾是DDT的生产和使用大国，20世纪60～80年代初我国累计使用量高达40多万t，占全世界总用量的20％。鉴于它在环境中的持久性、生物富集性和生态毒性，我国已从1983年开始禁用DDT。近年来，在我国也出现新的DDT污染源。例如，一些不合法的生产和使用，以DDT为原料的三氯杀螨醇仍在生产并用于白蚁防治。

由于DDTs在环境中降解缓慢，至今在土壤、水体、大气、沉积物和农产品等环境介质中均有较高的检出率，甚至在人体内也有检出。研究发现DDTs主要影响动物特别是鸟类和哺乳动物的神经系统、生殖系统、免疫系统和内分泌系统，具有典型的三致毒性：致癌、致畸、致突变。DDTs能通过环境介质或食物链，最终会在人体内蓄积，严重影响人的身体健康。土壤中以结合残留态形式存在的DDTs，当环境条件改变时，在根际微环境中仍可表现较高的生物活性，对农产品安全仍构成潜在威胁。因此，如何高效、安全和快速地去除环境中DDTs残留已引起政府部门和公众的广泛关注，也是当前研究的热点。

DDTs化学性质稳定，在常温下不易分解。DDTs在水中溶解度很低，在水体中较稳定，它在土壤中也有很长的持久性，其半衰期长达15～20年，甚至更长。研究表明生物降解尤其是微生物降解是污染环境中DDTs残留去除的主要途径。因此，分离筛选DDTs降解菌对于治理DDTs环境污染、保障蔬菜的安全生产具有重要的现实意义，利用降解菌剂去除环境中DDTs残留是一种高效安全的方法，生产和使用成本较低。

发明内容

本发明提供了一种降解效率高、速度快的DDTs降解菌。

一种DDTs降解菌，经鉴定命名为鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)DDT-6，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2008年8月5日，保藏号为CCTCC M 208116。

该菌株主要形态及生物学特征为：革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，单端多根鞭毛，无芽孢，大小约为(0.5μm～1.0μm)×(1.5μm～3.0μm)，菌落呈乳黄色、圆形、边缘整齐、光滑湿润、在生理盐水中易分散，接触酶阳性，氧化酶阳性，好氧，能利用葡萄糖、酵母膏、吐温40、吐温80、甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为EU927288。

一种含有上述DDTs降解菌的菌剂，该菌剂可通过将上述DDTs降解菌与常规的附加剂混合后制成水剂得到。

上述DDTs降解菌剂以适当剂量通过直接投加的方式应用于水体中或通过兑水喷雾的方式应用于土壤中，可安全有效去除水体和土壤中残留的DDTs。

本发明DDTs降解菌可快速、高效地降解水体和土壤中的残留DDTs，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，生产成本低廉，使用也非常方便，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明DDTs降解菌的电镜图；

图2为本发明DDTs降解菌在纯培养条件下对不同浓度DDTs的降解曲线；

图3为本发明DDTs降解菌在不同碳源存在条件下对DDTs的降解曲线；

图4为本发明DDTs降解菌在不同pH值条件下对DDTs的降解曲线；

图5为本发明DDTs降解菌在不同温度条件下对DDTs的降解曲线。

具体实施方式

培养基

无机盐培养基：MgSO₄·7H₂O 0.4g、FeS0₄·7H₂O 0.02g、K₂HPO₄ 0.2g、(NH₄)₂SO₄ 0.2g、CaSO₄ 0.08g、蒸馏水补足1000mL，混合后搅拌均匀，调节pH值至7.0，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得。

肉汤培养基：牛肉膏10g、蛋白胨5.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水补足至1000mL，混合后搅拌均匀，调节pH值至7.0，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏10g、蛋白胨5.0g、氯化钠5.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL，混合后搅拌均匀，调节pH值至7.0，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得。

下述实施例所添加的DDTs中p，p′-DDT，o，p′-DDT，p，p′-DDE和p，p′-DDD的浓度比均为1:1:1:1，如此分配比例只是为了计算方便，DDTs中各组分的比例对本发明的菌株降解DDTs没有限制。

菌株分离纯化

污染土壤样品采自浙江省慈溪市菜地污染土壤，取1g土壤置于100mL三角瓶中，加入20mL无机盐培养基，添加DDTs浓度至10mg/L，黑暗振荡培养(30℃、160rpm)1周，取上层浊液1mL接种于含20mg/LDDTs的无机盐培养基中，黑暗振荡培养(30℃、160rpm)1周，重复上述培养过程2次(培养基中DDTs的浓度分别为30mg/L和50mg/L)，每次培养的接种物均取自上次培养所得的培养液。

蘸取少量最后一次培养获得的培养液，在含50mg/L DDTs的牛肉膏蛋白胨平板上进行划线分离，于生化培养箱(30℃)中培养，待平板上出现单菌落后，挑取单菌落转接至牛肉膏蛋白胨试管斜面培养基上，连续接种，传代5次，挑取仍能在含有DDTs的培养基上生长的菌株，接种保藏于牛肉膏蛋白胨试管斜面培养基上。

菌株鉴定

将上述挑取的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图1所示。该菌株主要形态及生物学特征为:革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，单端多根鞭毛，无芽胞，大小约为(0.5μm～1.0μm)×(1.5μm～3.0μm)，菌落呈乳黄色、圆形、边缘整齐、光滑湿润、在生理盐水中易分散，接触酶阳性，氧化酶阳性，好氧，能利用葡萄糖、酵母膏、吐温40、吐温80、甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。该菌最适生长pH值为7.0，最适生长温度为30℃，能以DDTs作为唯一碳源和能源生长。该菌株经16SrDNA序列分析鉴定为鞘氨醇杆菌属的一个未知种，命名为鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)DDT-6。

菌剂制备

1.将保藏在试管斜面上的菌种接种于20mL无机盐培养基中活化培养7天。

2.将活化好的菌种接种于200mL含10mg/L DDTs的肉汤培养基中，振荡培养至对数生长期。

3.将上述对数生长期的菌种离心(8000×g)10min，倒掉上清液，菌体分别用30mL pH 7.0的0.2mol/L磷酸缓冲液洗涤3次。

4.将步骤(3)得到的菌种悬浮于pH 7.0的磷酸缓冲液中，制成OD₄₁₅为2.0的菌悬液，即为菌剂。

pH 7.0的0.2mol/L磷酸缓冲液配方为:取0.2mol/L磷酸氢二钠61mL和0.2mol/L磷酸二氢钠39mL，加蒸馏水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得。

无机盐培养基中DDTs的检测

将20mL含DDTs的无机盐培养液转入250mL分液漏斗中，分别用50mL正己烷萃取3次，下层有机相经过无水硫酸钠层合并于250mL平底烧瓶中，在旋转蒸发器上减压浓缩至1mL左右，然后用氮气流吹干，用正己烷定容至10mL供气相色谱分析。

气相色谱仪:Agilent GC 6890N；检测器:μ-ECD；毛细管柱：DB-1701，30m×0.32mm×0.25μm；进样口温度：230℃；柱温：160℃(0min)→10℃/min→220℃→5℃/min→240℃(5min)；检测器温度：280℃；载气(N₂)：60mL/min。

DDTs残留量计算公式如下：

X = \frac{A_{x} \times V_{0}}{A_{0} \times Vx} \times Cs

其中：X为待测样品中DDTs的浓度(mg/L)；A_x为样品中DDTs的峰面积；A₀为DDTs标准样品峰面积；V_x为样品体积(mL)；V₀为最后定容体积(mL)；C_s为DDTs标准样品的浓度(mg/L)。

DDTs降解率计算公式如下：

P (%) = (1 - \frac{Cx}{C_{0}}) \times 100 %

其中：P为待测样品中DDTs的降解率(％)；C_x为样品中DDTs残留浓度(mg/L)；C₀为样品中DDTs初始浓度(mg/L)。

DDTs添加回收率试验

在无机盐培养基中分别添加0.01、0.1、1、10和100mg/L的DDTs，然后根据上述方法提取无机盐培养基中的DDTs，利用气相色谱检测DDTs含量，每个浓度重复3次，同时做空白试验。

无机盐培养基中DDTs的添加回收率和变异系数见表1。

表1 无机盐培养基中DDTs的添加回收率和变异系数

DDTs	浓度(mg/L)	样品量(mL)	平均回收率(％)	变异系数(％)
DDTs	浓度(mg/L)	样品量(mL)	平均回收率(％)	变异系数(％)	p，p′-DDE	0.01	20	100.6	4.0
o，p′-DDT	0.01	20	91.2	5.8	p，p′-DDE	0.01	20	100.6	4.0
o，p′-DDT	0.01	20	91.2	5.8	p，p′-DDD	0.01	20	99.9	6.9
p，p′-DDT	0.01	20	102.9	4.6	p，p′-DDD	0.01	20	99.9	6.9
p，p′-DDT	0.01	20	102.9	4.6	p，p′-DDE	0.1	20	98.2	3.1
o，p′-DDT	0.1	20	96.0	5.9	p，p′-DDE	0.1	20	98.2	3.1
o，p′-DDT	0.1	20	96.0	5.9	p，p′-DDD	0.1	20	103.8	5.5
p，p′-DDT	0.1	20	101.1	3.4	p，p′-DDD	0.1	20	103.8	5.5
p，p′-DDT	0.1	20	101.1	3.4	p，p′-DDE	1	20	97.6	3.9
o，p′-DDT	1	20	90.7	1.7	p，p′-DDE	1	20	97.6	3.9
o，p′-DDT	1	20	90.7	1.7	p，p′-DDD	1	20	100.3	2.3
p，p′-DDT	1	20	94.3	2.8	p，p′-DDD	1	20	100.3	2.3
p，p′-DDT	1	20	94.3	2.8	p，p′-DDE	50	20	95.5	2.7
o，p′-DDT	50	20	93.9	1.9	p，p′-DDE	50	20	95.5	2.7
o，p′-DDT	50	20	93.9	1.9	p，p′-DDD	50	20	99.0	1.5
p，p′-DDT	50	20	98.2	2.0	p，p′-DDD	50	20	99.0	1.5

从表1可知，在0.01、0.1、1和50mg/L的添加浓度下，p，p′-DDE在无机盐培养基中的平均回收率是95.5％～100.6％，变异系数2.7％～4.0％；o，p′-DDT相应的平均回收率是90.7％～96.0％，变异系数1.7％～5.9％；p，p′-DDD相应的平均回收率是99.0％～103.8％，变异系数1.5％～6.9％；p，p′-DDT相应的平均回收率是94.3％～102.9％，变异系数2.0％～4.6％。这些数据表明无机盐培养基中p，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD、p，p′-DDT的提取方法符合农药残留分析的要求。

农药浓度对DDTs降解的影响

为了研究DDTs浓度对其自身微生物降解的影响，分别向三个100mL灭菌的三角瓶中加入20mL pH 7.0无机盐培养基(含50mg/L葡萄糖)，然后每个瓶分别添加p，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT浓度至1、10和50mg/L，将适量的上述制备好的DDTs降解菌菌剂接种于无机盐培养基中，使吸光度值(OD₄₁₅)达到0.4，然后置于摇床(30℃、160rpm)中黑暗振荡培养，相应地配置3个不含该菌剂的空白对照，对照组同样在上述条件下进行培养。

在培养时间为0、3、7、14和21d定时取样，根据上述方法检测DDTs残留量。试验组与对照组各为三个重复。本发明菌株在纯培养条件下对不同浓度DDTs的降解曲线如图2所示。

观察图2发现，培养21d后，本发明DDTs降解菌对1mg/Lp，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT的降解率分别为78.8％、82.4％、77.5％和88.2％，相应的降解速率分别为0.037、0.040、0.038和0.043mg/day·L；10mg/Lp，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT的降解率分别为73.6％、69.7％、62.2％和75.1％，相应的降解速率分别为0.351、0.330、0.300和0.362mg/day·L；50mg/L p，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT的降解率分别为60.7％、61.5％、59.5％和69.9％，相应的降解速率分别为1.443、1.461、1.417和1.665mg/day·L。p，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT的降解速率和其浓度分别成较好的线性关系(R²分别为0.9983、0.9996、0.9999和0.9998)，表明它们的降解符合一级动力学特征。1mg/L p，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT的降解半衰期分别是10.97d、9.75d、10.22d和7.26d；10mg/Lp，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT的降解半衰期分别是11.81d、13.15d、15.57d和10.63d；50mg/Lp，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT的降解半衰期分别是15.86d、16.86d、17.07d和11.99d。在不加菌的对照中，DDTs的水解率均小于5％。结果表明该菌剂对DDTs有很强的降解能力，并且随着DDTs浓度的逐渐增大，其降解半衰期逐渐延长。

不同碳源对DDTs降解的影响

为了研究不同碳源对DDTs微生物降解的影响，分别向四个100mL灭菌的三角瓶中加入20mL pH 7.0无机盐培养基(含50mg/L葡萄糖)，然后每个瓶分别添加1mg/Lp，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT，然后四个瓶中分别添加50mg/L酵母膏、果糖、葡萄糖和蔗糖。将适量的上述制备好的DDTs降解菌菌剂接种于无机盐培养基中，使吸光度值(OD₄₁₅)达到0.4，然后置于摇床(30℃、160rpm)中黑暗振荡培养，同时做不加菌剂的空白对照，对照组同样在上述条件下进行培养。

在培养时间为0、3、7、14和21d定时取样检测DDTs残留量。试验组与对照组各为三个重复。本发明菌株在不同碳源存在条件下对DDTs的降解曲线如图3所示。

观察图3发现，培养21d后，本发明DDTs降解菌在酵母膏存在的条件下对1mg/L p，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT的降解率分别是57.4％、50.0％、46.5％和58.4％，相应的降解半衰期分别是18.05d、23.02d、25.67d和18.99d；在果糖存在的条件下，相应的降解率分别是49.5％、43.4％、33.3％和41.4％，相应的降解半衰期分别是22.28d、28.52d、38.72d和30.94d；在葡萄糖存在的条件下，相应的降解率分别是67.3％、67.3％、55.1％和66.3％，相应的降解半衰期分别是13.78d、14.78d、20.26d和14.38d；在蔗糖存在的条件下，相应的降解率分别是53.5％、45.9％、43.6％和46.5％，相应的降解半衰期分别是19.97d、25.86d、26.55d和25.86d。在不加菌的对照中，DDTs的水解率均小于5％。上述数据表明，DDTs在葡萄糖存在条件下的降解半衰期明显低于其在酵母膏、蔗糖和果糖存在条件下的降解半衰期(P≤0.05)。p，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT在果糖存在条件下的降解半衰期分别是其在葡萄糖存在条件下的1.62、1.93、1.91和2.15倍。降解菌DDT-6在不同碳源存在条件下对DDTs的降解效果为葡萄糖>酵母膏>蔗糖>果糖。结果表明降解菌DDT-6在葡萄糖存在的条件下对DDTs的降解效果最好。

pH值对DDTs微生物降解的影响

为了研究不同pH值对DDT微生物降解的影响，分别向三个100ml灭菌的三角瓶中加入20mL pH 5.0、7.0和9.0缓冲液(含50mg/L葡萄糖)，然后每个瓶分别添加1mg/Lp，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT。将适量的上述制备好的DDT降解菌菌剂接种于培养基中，使吸光度值(OD₄₁₅)达到0.4，然后置于摇床(30℃、160rpm)中黑暗振荡培养，同时做不加菌剂的空白对照，对照组同样在上述条件下进行培养。

在培养时间为0、3、7、14和21d定时取样检测DDTs残留量。试验组与对照组各为三个重复。本发明菌株在不同pH值条件下对DDTs的降解曲线如图4所示。

观察图4所示，在pH 5.0、7.0和9.0的条件下，p，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT的微生物降解均符合一级动力学特征。培养21d后，在pH5.0的条件下1mg/Lp，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT的降解率分别是61.4％、66.3％、48.0％和66.7％，相应的降解半衰期分别是16.86d、13.83d、21.86d和13.10d；在pH 7.0的条件下，相应的降解率分别是83.8％、84.0％、75.8％和84.8％，相应的降解半衰期分别是8.84d、8.34d、10.85d和7.99d；在pH 9.0的条件下，相应的降解率是78.6％、81.8％、59.6％和77.8％，相应的降解半衰期分别是10.39d、8.94d、17.33d和9.48d。在不加菌的对照中，DDTs在pH 5.0和7.0的条件下的水解率均小于5％，而在pH 9.0的条件下的水解率高达12.8％。显著性分析表明DDTs在pH 7.0的条件下的降解半衰期显著小于其在pH 5.0和9.0的条件下的降解半衰期(P≤0.05)。DDTs在pH 7.0的条件下的降解半衰期分别是其在pH5.0的条件下的1.91、1.66、2.01和1.64倍。DDTs在不同pH条件下的降解效果为pH 7.0>pH 9.0>pH 5.0。结果表明降解菌DDT-6在中性条件下对DDTs的降解效果最好。

温度对DDTs微生物降解的影响

为了研究不同温度对DDTs微生物降解的影响，分别向三个100ml灭菌的三角瓶中加入20mL pH 7.0的无机盐培养基(含50mg/L葡萄糖)，然后每个瓶分别添加1mg/L p，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT。将适量的上述制备好的DDT降解菌菌剂接种于无机盐培养基中，使吸光度值(OD₄₁₅)达到0.4，然后分别置于20、30和40℃的摇床(160rpm)中黑暗振荡培养，同时做不加菌剂的空白对照，对照组同样在上述条件下进行培养。

在培养时间为0、3、7、14和21d定时取样检测DDT残留量。试验组与对照组各为三个重复。本发明菌株在不同温度条件下对DDTs的降解曲线如图5所示。

观察图5所示，在20、30和40℃的条件下，p，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT的微生物降解均符合一级动力学特征。培养21d后，在20℃的条件下1mg/L p，p′-DDE、o，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDT的降解率分别是61.8％、55.1％、49.5％和53.5％，降解半衰期分别是15.43d、17.59d、22.65d和19.69d；在30℃的条件下，相应的降解率分别是76.2％、61.4％、54.5％和64.6％，相应的降解半衰期分别是10.37d、15.68d、20.50d和14.50d；在40℃的条件下，相应的降解率分别是82.2％、70.3％、59.2％和68.4％，相应的降解半衰期分别是8.83d、12.86d、17.91d和13.13d。在不加菌的对照中，DDTs在20、30和40℃的条件下的水解率均小于5％。显著性分析表明DDTs在40℃的条件下的降解半衰期显著小于其在20℃的条件下的降解半衰期(P≤0.05)。DDTs在20℃的条件下的降解半衰期分别是其在40℃的条件下的降解半衰期的1.75、1.37、1.26和1.50倍。本发明菌株在不同温度条件下对DDTs的降解效果为40℃>30℃>20℃。结果表明随着培养温度的上升，DDTs的降解速率变大。

从上述试验可得，本发明DDTs降解菌在中性和葡萄糖存在的条件下对DDTs的降解率最大，并且随着培养温度的逐步升高，其降解率逐渐变大。该菌能利用DDTs作为唯一碳源和能源生长，属矿化作用，是一种较为理想的作用方式。因此，本发明DDTs降解菌对污染环境中DDTs残留的降解具有积极的意义。

Claims

1.一种降解DDTs的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)DDT-6，其保藏号为CCTCC M 208116。

2.一种含有权利要求1所述的鞘氨醇杆菌DDT-6的菌剂。

3.如权利要求1所述的鞘氨醇杆菌DDT-6在去除水体和土壤中残留DDTs中的应用。