CN101375850A

CN101375850A - 去甲异波尔定在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN101375850A
Application number: CNA2008101562123A
Authority: CN
Inventors: 戴岳; 夏玉凤; 刘美; 侴桂新; 王峥涛
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2008-10-07
Filing date: 2008-10-07
Publication date: 2009-03-04
Anticipated expiration: 2028-10-07
Also published as: CN101375850B

Abstract

本发明涉及医药领域，具体涉及去甲异波尔定的医药用途。其特征是去甲异波尔定可用于制备治疗自身免疫性疾病药物的应用。所述自身免疫性疾病如：类风湿关节炎、多发性硬化症、系统红斑狼疮、多发性硬化症、I型糖尿病、银屑病、溃疡性结肠炎、Sjogren综合征、硬皮病、多肌炎、慢性活动性肝炎、混合性结缔组织病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性溶血性贫血等疾病。

Description

去甲异波尔定在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及去甲异波尔定的医药用途。

背景技术

自身免疫性疾病是一类临床常见的由免疫应答异常所致的疾病，包括类风湿性关节炎、系统红斑狼疮、多发性硬化症、I型糖尿病、银屑病、溃疡性结肠炎等多种疾病。其中，类风湿关节炎是以周围对称性的多关节非化脓性炎症为主的疾病，常常伴有关节腔滑膜炎症，滑膜组织增生，肉芽肿形成，软骨及骨组织破坏，最后关节形变，功能缺失。而多发性硬化是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘病变为特征的自身免疫疾病。治疗类风湿关节炎的药物主要有非甾体抗炎药(双氯灭痛，阿司匹林等)，皮质激素和免疫抑制剂(6-巯基嘌呤等)，治疗多发性硬化的药物主要有皮质激素和免疫抑制剂。但这些药物均存在明显的不良反应。非甾体抗炎药易造成胃肠道粘膜损伤而导致消化性溃疡；皮质激素类药物虽可有效地改善症状，但长期应用易引起许多副作用如液体及电解质不平衡、肠胃、内分泌、骨质及代谢的损害，且停药后易出现“反跳”现象；免疫抑制剂选择性差，易于诱发感染。因此，有必要研制新型的高效、安全的治疗类风湿关节炎和多发性硬化的药物。

中药乌药为樟科山胡椒属植物乌药Lindera aggregata(Sims)Kosterm.(L.strychnifolia Vill)干燥块根。去甲异波尔定(norisoboldine)是乌药所含的一种异喹啉类生物碱，分子式为C₁₈H₁₉O₄N，该化合物在原药材中含量较高。迄今为止，除体外抗氧化作用〔药学学报200641(10):956-962〕外，未见有关去甲异波尔定生物活性或临床应用方面的报道。

发明内容

本发明公开了去甲异波尔定的医药新用途，即其可用于制备治疗自身免疫性疾病药物的应用。所述自身免疫性疾病如：类风湿关节炎、多发性硬化症、系统红斑狼疮、多发性硬化症、I型糖尿病、银屑病、溃疡性结肠炎、Sjogren综合征、硬皮病、多肌炎、慢性活动性肝炎、混合性结缔组织病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性溶血性贫血、桥本甲状腺炎、Addisons病、白斑、Graves病、重症肌无力、强直性脊柱炎、变应性骨关节炎、变应性血管炎、自身免疫性噬中性白细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、狼疮性肾炎、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性不育、子宫内膜异位症、pasture病、天疱疮、盘状狼疮或致密沉积物等疾病。

优选治疗类风湿关节炎，还优选治疗多发性硬化症。

去甲异波尔定可按照文献制得，可以从乌药中提取得到，也可以化学合成得到，还可在市场购得，或用下列方法制备：干燥的乌药块根粉末，用95％乙醇回流提取，减压浓缩得浸膏，加入2％盐酸溶解，过滤。滤液经强酸性阳离子交换树脂柱层析，水洗柱，氨水调pH至8.5后，将交换树脂转入索氏提取器中，乙醚回流提取。挥去乙醚，得黑棕色提取物。提取物经反复硅胶柱色谱分离得到去甲异波尔定粗品，经过多次重结晶，得到去甲异波尔定纯品。

附图说明

图1是对胶原关节炎小鼠体重增长的影响(与模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01)

图2是对小鼠胶原关节炎临床积分的影响(与模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01)

图3是对小鼠血清中抗-II型胶原抗体的影响(与模型组比较，^**p<0.01)

图4是对II型胶原诱导的小鼠耳廓迟发型超敏反应的影响(与模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01)

图5是对II型胶原诱导的小鼠淋巴细胞增殖的影响(与模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01)

图6是对II型胶原关节炎小鼠关节组织学变化的影响(A：正常组；B：模型组；C：去甲异波尔定40mg/kg组；D：地塞米松1mg/kg组)

图7是对II型胶原关节炎小鼠关节组织学病变积分的影响(与模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01)

具体实施方式

实施例1

去甲异波尔定的制备：干燥的乌药块根粉末3kg，用95％乙醇回流提取3次，每次2h，减压浓缩得浸膏，加入2％盐酸溶解，过滤。滤液经强酸性阳离子交换树脂柱层析，水洗柱，氨水调pH至8.5后，将交换树脂转入索氏提取器中，乙醚回流提取。挥去乙醚，得黑棕色提取物4.8g。提取物经反复硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇(7：3)反复洗脱得到化合物I粗品，经过多次重结晶，得到棕色粉末化合物I 0.76g。与对照品共硅胶薄层层析，R_f值一致，混和熔点不下降，故鉴定化合物I为去甲异波尔定。经HPLC检测，化合物I的纯度为98％。

实施例2

去甲异波尔定对II型胶原致小鼠关节炎的影响

1 去甲异波尔定对胶原关节炎小鼠体重的影响

将鸡II型胶原加入0.1M的醋酸中，4℃搅拌至充分溶解，使其浓度为2mg/ml，4℃过夜，在冰浴中与等体积完全弗氏佐剂(含2mg/ml的热灭活结核分支杆菌)混合，充分乳化，得II型胶原乳剂。雄性ICR小鼠尾根部皮内注射II型胶原乳剂100μl致敏，注射当天记为d 0。第21天再次在相同部位注射II型胶原乳剂100μl攻击，将小鼠随机分为6组(n＝7—8)：1)正常组；2)模型组；3)去甲异波尔定(10mg/kg)；4)去甲异波尔定(20mg/kg)；5)去甲异波尔定(40mg/kg)；6)地塞米松(DEX，1mg/kg)。每日灌胃给药，正常组和模型组小鼠给予等量溶剂，连续20天。在此过程中，记录小鼠体重变化。

结果见图1，图1显示：II型胶原攻击后模型组和地塞米松组小鼠的体重明显减轻，去甲异波尔定(10，20，40mg/kg)能够有效缓解胶原关节炎小鼠的体重减轻。

2 胶原关节炎临床积分评价

第21天起，每隔4天观察一次小鼠关节及足红肿状况，一直观察至第40天。小鼠足的关节炎轻重程度采用双盲法并依据以下标准进行评价：0分＝无变化；1分＝脚趾上出现肿胀和红斑；2分＝足部出现轻微的肿胀和红斑；3分＝脚趾上出现明显的肿胀和红斑；4分＝足部出现严重的肿胀或强直变形。四足的临床积分之和作为每个小鼠关节炎评分，每只小鼠最高积分为16分。

由图2可见，去甲异波尔定(20，40mg/kg)和地塞米松(1mg/kg)明显减轻胶原关节炎小鼠关节的肿胀和红斑，降低关节炎临床积分。

3 血清中抗-II型胶原抗体的检测

致敏后第36天，小鼠眼眶采血，制备血清，采用酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清中抗-II型胶原抗体的滴度。

图3显示，胶原关节炎小鼠血清中IgG滴度明显高于正常小鼠。去甲异波尔定(20，40mg/kg)显著降低小鼠血清中抗II型胶原IgG抗体水平。

4 去甲异波尔定对II型胶原诱导的迟发型超敏反应的影响

致敏后第40天，小鼠右耳皮内注射0.2％II型胶原溶液(溶于0.1M冰乙酸)20μl，左耳注射等量溶媒。24小时后，用螺旋测微仪检测两耳廓厚度，用两耳廓厚度差作为表示迟发型超敏反应强度。

由图4可见，去甲异波尔定(20，40mg/kg)明显抑制II型胶原诱发的小鼠耳迟发型超敏反应。

5 去甲异波尔定对II型胶原诱导淋巴细胞增殖的影响

致敏后第41天，将模型组小鼠断头放血处死，在无菌条件下取出腹股沟处淋巴结，经碾磨和过滤，分散成单个淋巴细胞悬液。将细胞悬浮于含10％ NCS RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度为5×10⁶个/ml。将细胞悬液加入96孔板中，100μl/孔，分别加入II型胶原(终浓度50μg/ml)50μl，以及不同浓度的药物50μl，在37℃，5％ CO₂条件下培养68小时。每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，继续培养4小时。培养结束后，离心(2000rpm，20分钟)，吸弃上清液，每孔加入DMSO 200μl，振荡10分钟。在波长540nm处测量吸光度。按下式计算淋巴细胞增殖指数：增殖指数＝加II型胶原组OD值/空白组OD值。

由图5可见，去甲异波尔定(20，40mg/kg)和地塞米松(1mg/kg)显著抑制II型胶原诱导的淋巴细胞增殖。

6 关节组织学检查：

小鼠处死后，取后足固定于4.5％甲醛溶液。在4℃条件下，10％ EDTA中钙化14天，石蜡包埋、切片(5μm)，苏木精和伊红(H&E)染色。跗关节组织病理学变化根据下列评分系统进行评价：0分＝正常；1分＝炎性细胞浸润；2分＝滑膜增生；3分＝血管翳形成；4分＝骨质侵蚀；5分＝骨质破坏。每只小鼠关节病变的最高积分为15分。

图6中B显示，胶原关节炎模型组小鼠出现关节滑膜增生、血管翳形成、关节腔炎细胞浸润、骨和软骨侵蚀等病变。去甲异波尔定(40mg/kg)组小鼠没有发现骨质的侵蚀和降解，炎细胞浸润和滑膜增生较模型组小鼠轻(图6C)。地塞米松(1mg/kg)亦阻止关节的破坏(图6D)。各组小鼠关节病理学改变的积分见图7。

实施例3

去甲异波尔定对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的影响

无菌条件下取豚鼠脊髓，制成50％匀浆，与等量的完全福氏佐剂充分混合，制成免疫原。大鼠两后足垫内各注射免疫原乳剂0.1mL，同时尾根皮下注射百日咳疫苗(5.5×10¹⁰mL^-1)0.2mL。对照组免疫原中的豚鼠脊髓匀浆以等量生理盐水替代，给药组自免疫当日开始给药，连续18天。

免疫接种后每日称大鼠体重，观察病情并进行神经功能障碍评分。神经功能障碍评分标准采用5分评分法：0分，无明显异常；1分，大鼠尾部无力麻痹；2分，尾部无力+后肢无力；3分，后肢轻度麻痹；4分，后肢严重麻痹伴前肢无力，被动翻身不能复原；5分，全身瘫痪或濒死。

EAE模型组大鼠在致敏后7～10天，陆续出现活动减少，体重减轻，尾部麻痹，双后肢瘫痪，严重者四肢瘫痪，伴大小便失禁，甚至出现濒死状态。整个病程持续8～10天，发病率100％。去甲异波尔定(10，20mg/kg)灌胃给药组的发病率分别为50％和30％，临床症状明显减轻(表1)。

表1 去甲异波尔定对EAE大鼠临床神经功能障碍的影响

与模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01。

各组大鼠于免疫接种后第12天(相当于EAE发病高峰期)，取血制备血清，ELISA法检测IL-2和IFN-γ水平。与对照组比较，EAE模型组大鼠血清IL-2和IFN-γ水平明显升高。去甲异波尔定(10，20mg/kg)组血清IL-2和IFN-γ明显降低(表2)。

表2 去甲异波尔定对EAE大鼠血清IL-2和IFN-γ水平的影响

与模型组比较，^**p<0.01。

Claims

1、去甲异波尔定在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。

2、权利要求1的应用，其中自身免疫性疾病是类风湿关节炎。

3、权利要求1的应用，其中自身免疫性疾病是多发性硬化症。

4、权利要求1的应用，其中自身免疫性疾病是系统红斑狼疮、多发性硬化症、I型糖尿病、银屑病、溃疡性结肠炎、Sjogren综合征、硬皮病、多肌炎、慢性活动性肝炎、混合性结缔组织病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性溶血性贫血、桥本甲状腺炎、Addisons病、白斑、Graves病、重症肌无力、强直性脊柱炎、变应性骨关节炎、变应性血管炎、自身免疫性噬中性白细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、狼疮性肾炎、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性不育、子宫内膜异位症、pasture病、天疱疮、盘状狼疮或致密沉积物疾病。