CN101370821A - 新型肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型肽及其用途，具体来说，本发明涉及包含选自SEQID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1氨基酸序列具有至少90％的序列同源性的氨基酸序列的21～41个连续氨基酸的分离的肽，以及涉及促进成纤维细胞增殖和伤口愈合的方法，所述方法包括将有效量的所述肽施用于所需要的受试者。

Description

新型肽及其用途
技术领域
本发明涉及一种新型肽及其用途，具体来说，本发明涉及一种通过刺激成纤维细胞的增殖而具有促进创伤愈合活性的肽。
背景技术
创伤愈合(wound healing)，是指包括皮肤、肌肉、神经组织、骨、软组织、内部器官或血管组织的损伤组织的修复(repair)或复原(replacement)。此类创伤愈合是由一系列反应产生的，如急性及慢性炎症、细胞的迁移、血管发生以及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的积累。发生创伤后，会损伤周围组织的血管，并使创伤处出血。当血凝块中的纤维蛋白原形成纤维蛋白凝胶时，血浆蛋白如纤连蛋白将进入到凝胶中。另外，炎症细胞、成纤维细胞以及新的血管形成细胞等也进入到凝胶中，从而使ECM组分如胶原蛋白、蛋白聚糖等在伤口周围积累。由此，最初存在的纤维蛋白基质被肉芽组织替代，经过一段时间后，在创伤处形成瘢痕。与ECM积累的同时，角质细胞也发生迁移而形成防止水分损失和细菌侵入的上皮膜。这些与创伤愈合相关的一系列过程，是通过损伤组织中的细胞如免疫细胞、炎症细胞以及间叶细胞等与各种细胞因子如转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、上皮生长因子(epidermalgrowth factor，EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)以及成纤维细胞激活因子(fibroblast activation factor，FAF)等以及ECM如胶原蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白(tenascin)以及蛋白聚糖等之间的相互作用而发生的。
最近，开发了包含与上述创伤愈合相关的细胞因子的组合物，作为促进创伤愈合的药物。例如，Jonhshon & Jonhshon公司通过基因工程制造的PDGF，称为贝卡普勒明(Becaplermin)，用于创伤治疗剂。而在欧洲专利第0575484号中公开了包含PDGF和地塞米松(Dexamethasone)的用于哺乳动物组织再生以及修复的药物组合物。在美国专利第5981606号中也公开了包含TGF—β的创伤治疗剂。
特别是，在与上述创伤愈合相关的细胞因子中，已知FGF是通过促进成纤维细胞的增殖而促进创伤愈合，并已有用FGF研发的创伤治疗剂。在美国专利第6800286号中公开了具有促进创伤愈合活性的嵌合FGF，在美国专利第5155214号中则公开了包含FGF的创伤治疗剂。
另一方面，通常，由大量的氨基酸组成的肽具有许多不足，因为体内施用时其发生代谢变化，导致肽腱断裂，并且在配制过程中易于分解。因此，为了用作药物，希望肽的长度尽可能地短，但还必须维持药理活性，因此，探明活性与长链肽相当的最小长度的肽在药物开发中很重要。
发明内容
因此，本发明人以开发新型创伤治疗剂为课题而进行了悉心研究，其结果，发现含有已知蛋白AIMP1的N末端区域氨基酸序列的一部分的肽具有通过刺激成纤维细胞的增殖而促进创伤愈合的活性，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供一种分离的肽及其用途，所述分离的肽包含选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列的21～41个连续氨基酸的肽。
为了实现上述目的，本发明提供一种分离的肽，所述分离的肽包含SEQID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列的21～41个连续氨基酸序列的肽。
另一方面，本发明提供了包含上述肽的组合物。
而且，本发明提供了促进成纤维细胞增殖的方法，该方法包含将有效量的所述肽施用于所需受试者。
进一步，本发明提供一种促进创伤愈合的方法，该方法包含将有效量的所述肽施用于所需受试者。
下文对本发明进行了详细说明。
术语的定义
除非另有说明，本说明书中所用的所有的技术用语及科学用语均与本领域技术人员通常理解的意义相同。
在本发明中所用的术语“创伤”(wound)是指活体受伤状态，其包括病理学状态，在该状态下，构成受试者内部或外部表面的组织，例如，皮肤、肌肉、神经组织、骨、软组织、内部器官或血管组织遭到损坏或破坏。创伤的实例包括但不限于，挫伤(contusion)或瘀伤(bruise)、难愈的外伤性创伤(non-healing traumatic wounds)、因辐射导致的组织破坏、擦伤(abrasion)、坏疽(gangrene)、裂伤(laceration)、撕脱伤(avulsion)、贯通伤(penetrated wound)、枪伤(gun shot wound)、切伤(cutting)、烧伤(burn)、冻伤(frostbite)、皮肤溃疡(skin ulcer)、皮肤干燥(xeroderma)、皮肤角质症(skin keartosis)、破损(breakage)、破裂(rupture)、皮炎(dermatitis)、皮肤真菌引起的剧痛(smart)、手术创伤(surgical wound)、血管疾病创伤、角膜创伤；疮(sores)，如压疮(pressure sores)、褥疮(bed sores)；糖尿性皮肤糜烂等与糖尿病以及循环不良有关的症状；慢性溃疡(chronic ulcers)、整形手术后的缝合部位、脊椎伤害性创伤、妇产科创伤(gynecological wound)、化学创伤以及痤疮。受试者任何损害或损伤的部位均在上述创伤定义的范围内。
本发明中所用的术语“促进创伤愈合”，是指促进受试者损伤组织修复、复原、好转、加速损伤组织的结束或痊愈。
本发明中所用的术语“有效量”，是指体内或体外有效刺激成纤维细胞的增殖或促进伤口愈合的量。
本发明中所用的术语“受试者”，是指哺乳动物，特别是包括人类的动物，或上述动物的皮肤细胞、皮肤组织。上述受试者也可以是需要治疗的患者。皮肤细胞可优选是成纤维细胞。
本发明的肽包含氨酰tRNA合成酶相互作用多功能蛋白1(AminoacyltRNA synthetases(ARS)-interacting multi-functional protein 1，AIMP1)的N末端氨基酸序列的一部分。同时，AIMP1(ARS—interacting multi—functionalprotein 1)以往被称作p43蛋白，本发明人对其进行了重新命名(Sang Gyu Park，etal，.Trends in Biochemical Sciences 30：569-574，2005)。
上述AIMP1是由312个氨基酸构成的蛋白质，其与多种ARS复合体(multi-ARS complex)结合而促进上述多种ARS复合体的催化活性。AIMP1由包括前列腺癌细胞、免疫细胞以及转基因细胞的多种类型的细胞分泌，已知AIMP1可作用于如单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞以及成纤维细胞等的多种靶细胞。已知上述AIMP1的3处单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphisms，SNPs)(参阅NCBI的SNP数据库)。即，下列SNPs是已知的：在全长AIMP1的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)中，第79位的丙氨酸(Ala)被脯氨酸(Pro)取代(SNP登录号：rs133166)、第104位的苏氨酸(Thr)被丙氨酸取代(SNP登录号：rs17036670)、第117位的苏氨酸(Thr)被丙氨酸(Ala)取代(SNP登录号：rs2230255)。
另一方面，本发明人根据上述AIMP1对各种不同的靶细胞分别具有多种复杂的活性的事实，推测该AIMP1为了表达多种活性分别使用了不同的结构基元(motif)或结构域。为了证实这种可能性，本发明人用蛋白酶切割AIMP1，并调查了切断片段是否仍然具有活性(参阅实施例1)。结果发现，当用弹性蛋白酶2(elastase2)切割AIMP1时，其被分成小片段(参阅图1)，虽然由弹性蛋白酶2切割的片段能够维持对内皮细胞的促凋亡活性(pro-apoptoticactivity)(抑制细胞增殖的活性))，但对成纤维细胞的生长刺激活性则会消失(参阅图2)。
因此，为了确定与成纤维细胞的增殖刺激相关的AIMP1的功能域，本发明人鉴定了AIMP1的弹性蛋白酶2切割位点(参阅图3)，基于此，构建了AIMP1的一系列缺失片段(参阅图4以及图5)，并调查了各片段在成纤维细胞增殖中的活性(参阅实施例2)。其结果可推测AIMP1的氨基酸6—46区域为具有刺激成纤维细胞增殖活性的结构域(参阅图6)。
为了证明上述推测，本发明人合成了相当于AIMP16—46区域的肽(参阅实施例3—1)，并测定了该肽刺激成纤维细胞增殖的活性(参阅实施例3—2)。结果发现，AIMP1的氨基酸6—46区域以浓度依赖性方式刺激成纤维细胞增殖(参阅图7)。
本发明人利用体内模型进一步分析了AIMP1的氨基酸6—46区域是否能通过刺激成纤维细胞的增殖而促进创伤愈合。为此，随机切割上述AIMP1的氨基酸6—46区域，以制备由21个氨基酸组成的每个小片段，并同时分析了这些片段在促进创伤愈合中的活性(参阅实施例4)。结果发现，不但AIMP1的氨基酸6—46区域具有促进创伤愈合活性，由它们制备的小片段也具有促进创伤愈合的活性(参阅图8)。
因此，本发明提供了分离的肽，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中21—41个连续氨基酸序列的肽。
NH2-AVLKRLEQKGAEADQIIEYLKQQVSLLKEKAILQATLREEK-COOH(SEQ ID NO：1)
本发明中使用的字母的定义如下：A(丙氨酸)；D(天冬氨酸)；E(谷氨酸)；G(甘氨酸)；I(异亮氨酸)；K(赖氨酸)；L(亮氨酸)；Q(谷酰胺)；R(精氨酸)；S(丝氨酸)；T(苏氨酸)；V(缬氨酸)；Y(酪氨酸)。
本发明的肽优选具有选自由SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：7以及SEQ IDNO：32～SEQ ID NO：37组成的组中的氨基酸序列。上述SEQ ID NO：32～SEQID NO：37的氨基酸序列是上述SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列的公知的SNP。最优选本发明的肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成。
本发明肽的范围还包括与包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中21～41个连续氨基酸序列的肽的功能等同物，优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽的功能等同物以及它们的盐。术语“功能等同物”指与SEQ ID NO：1中提出的氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的氨基酸序列同源性(即同一性)且显示了与SEQ ID NO：1的多肽基本上相同的生理活性的肽。功能等同物包括例如在SEQ ID NO：1中添加、取代或缺失氨基酸而得到的肽。在本文中，序列同一性和同源性被定义为，比对序列和引入空位(如需要，以获得最大百分比的序列同一性)且任何保守性取代都不会作为序列同一性的部分考虑，候补序列中与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相同的氨基酸残基的百分比。SEQ ID NO：1的氨基酸序列的N末端、C末端或者内部延伸、缺失或插入，都不能被解释为对序列同源性或同一性产生了影响。因此，序列同一性可通过通常用于比较两种多肽的氨基酸位置中的相似性的标准方法来测定。如用BLAST或FASTA等计算机程序对两种多肽进行比对，以使其各自的氨基酸达成最佳匹配(根据一个或两个序列的序列全长，或者，根据一个或两个序列的预测部分)。上述程序提供缺省开放罚分(default opening penalty)和缺省空位罚分(default gap penalty)，且得分矩阵如PMA250(标准的得分矩阵；参阅Dayhoff et al.，in Atlas of protein Sequence and Structure，vol 5，supp 3，1978)可与计算机程序一同使用。例如，百分比同一性可按照如下方法计算：相同序列的总数乘100，然后除以对应范围内更长序列的长度与为了比对两个序列而在更长序列内引入的空位数目之和。
本发明所用的术语“基本上相同的生理活性”，是指能在成纤维细胞中产生刺激成纤维细胞的增殖并促进创伤愈合效果的活性。本发明所用的“功能等同物”的范围，包括通过修饰SEQ ID NO：1中列出的肽的化学结构但保留肽的基本骨架和促进成纤维细胞增殖以及促进创伤愈合的活性而获得的衍生物。例如，其中包括用于改变肽的稳定性、贮存性、挥发性或溶解性等的结构修饰物。
本发明的肽可通过基因工程方法利用编码该肽的重组核酸的表达来制备。例如，本发明的肽可通过包括以下步骤的基因工程方法来制备：将编码本发明肽的核酸序列或其片段插入含有一个或多个表达调控序列的重组载体中，所述表达调控序列与所述核酸序列可操作性连接来调控所述核酸序列的表达；用所获得的重组表达载体转化宿主细胞；在适于表达所述核酸序列的培养基和条件下，培养转化的细胞；并从培养基中分离和纯化基本上纯的蛋白。制备肽的基因工程方法在本领域中是已知的(Maniatis et al.，MoleculaCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)；Sambrook et al.，同上；Gene Expression Technology，Method in Enzymology，Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Guthrie & Fink(eds.)，Academic Press，San Diego，Calif.(1991)；Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.，255，12073-12080(1980))。
可选地，本发明的肽可通过本领域中已知的任何技术化学合成(Creighton，Proteins：Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman and Co.，NY(1983))。即，本发明的肽可利用常规液相或固相合成、片段缩合(fragmentcondensation)、F-MOC或T-BOC化学方法来制备(Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins，Williams et al.，Eds.，CRC Press，Boca RatonFlorida，(1997)；A Practical Approach，Atherton & Sheppard，Eds.，IRL Press，Oxford，England，(1989))。
特别优选利用固相合成制备本发明的肽。本发明的肽可根据常规固相方法在被保护的氨基酸之间进行缩合反应来合成，所述缩合反应从C末端开始，根据鉴定的氨基酸序列，由第一个氨基酸、第二个氨基酸、第三个氨基酸等依次进行连接。缩合反应后，可通过如酸解或氨解等公知方法除去保护基以及连接C末端氨基酸的载体。上述肽合成法已详细记载于相关资料中(Grossand Meienhofer′s，The Peptides，vol 2.，Academic Press，1980)。
作为可在本发明肽的合成中使用的固相载体，可采用本领域中通常使用的载体，例如，可以采用具有能够与肽结合的官能团的取代苄基型聚苯乙烯树脂(polystyrene resins of substituted benzyl type)、羟甲基苯乙酰胺型聚苯乙烯树脂、取代的二苯甲基聚苯乙烯树脂、和聚丙烯酰胺树脂等。也可利用常规方法，例如，二环己基碳二亚胺(DDC)、酸酐以及活化酯方法，来进行氨基酸的缩合。
本发明的肽合成中所用的保护基，是指通常在肽的合成中使用的保护基，包括那些容易通过如酸解、还原或氨解等常规方法除去的保护基。氨基保护基的具体实例包括甲酰基、三氟乙酰基、苄氧羰基、(邻-或对-)氯代苄氧羰基以及(邻-或对-)溴代苄氧羰基等被取代的苄氧羰基；叔丁氧羰基以及叔戊氧羰基等的脂肪族氧羰基等。氨基酸的羧基等可通过转化成酯基来加以保护。酯基包括苄基酯、甲氧基苄基酯等的取代的苄基酯；环己酯、环庚酯或叔丁酯等的烷基酯等。胍基虽不需要保护基，但可通过硝基、对甲苯磺酰基、甲氧基苯磺酰基或者均三甲基苯磺酰基等芳磺酰基来加以保护。咪唑的保护基包括对甲苯磺酰基、苄基以及二硝基苯等。色氨酸的吲哚基可由甲酰基来保护，或不进行保护。
脱保护和从载体上分离保护基，可在各种清除剂(scavenger)的存在下通过无水氟化氢进行。清除剂的实例包括在肽的合成中通常采用的清除剂，如苯甲醚、(邻、间、对-)甲酚、二甲硫醚、硫代甲酚、乙二醇以及巯基吡啶。
对由基因工程方法或化学合成制备的重组肽，可根据本领域中已知的方法进行分离和纯化，如可采用萃取法、重结晶法、各种色谱法(凝胶过滤法、离子交换法、沉淀法、吸附法、反相法等)、电泳、逆流分配法。
本发明的肽可以组合物的形式来提供。进一步地，本发明的组合物可含有本发明肽的药学上可接受的盐作为活性成分。药学上可接受的盐的实例，包括与无机碱的盐、与有机碱的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐以及与碱性或酸性氨基酸的盐。与无机碱的盐的实例，包括钠盐、钾盐等的碱金属盐；钙盐、镁盐等的碱土金属盐；铝盐以及铵盐。与有机碱的盐的实例，包括与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己胺以及N，N′-二苄基乙烯二胺的盐。与无机酸的盐的实例，包括与盐酸、硼酸、硝酸、硫酸以及磷酸的盐。与有机酸的盐的实例，包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、邻苯二甲酸、延胡索酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸和对甲苯磺酸的盐。与碱性氨基酸的盐的实例，包括与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸的盐。与酸性氨基酸的盐的实例，包括与天冬氨酸以及谷氨酸的盐。适合使用的盐的名录公开于Remington’sPharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，p1418，1985中，其全部公开的内容以参考的方式并入本文。
另一方面，本发明的组合物还可含有药学上可接受的载体，并利用本领域中公知的方法，以任何形式配制。优选以外用制剂的形式配制。本发明组合物的制剂形式包括但不限于液状涂敷剂(liquid coating)、喷雾剂、洗剂、乳膏、胶凝剂、糊剂(pastes)、油膏(ointments)、气雾剂、粉末剂、经皮递送剂等。
本发明的外用制剂中，作为药学上可接受的载体，根据剂型的不同而不同，包括但不限于凡士林、液体石蜡、烃类胶质(塑料基质)等烃类；中链脂肪酸甘油三酯、猪油、油脂、可可脂等动植物性油脂；鲸蜡醇、硬脂醇、硬脂酸、棕榈酸异丙酯等高级脂肪酸醇、脂肪酸及其酯类；聚乙二醇、1，3-丁二醇、丙三醇、明胶、白糖、糖醇等水溶性基质；甘油脂肪酸酯、硬脂酸聚烃氧酯、蓖麻油聚氧乙烯醚等乳化剂；丙烯酸酯、藻酸钠等的增稠剂；液化石油气、二氧化碳等喷射剂；过氧化苯甲酸酯类等防腐剂等。除了这些载体外，如果需要，本发明的外用制剂还可以含有诸如稳定剂、调味剂、着色剂、pH调节剂、稀释剂、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂等添加剂。本发明的外用制剂优选采用常规方法施加于局部创伤处。
而且，本发明的外用制剂可用于与常规的固体支持体如粘附性绷带的创伤缓解贴(wound release cover)粘附。该粘附可通过用本发明的组合物饱和固体支持体后使所述组合物脱水而实现。优选事先在固体支持体上涂敷粘附剂(adhesive agent)，从而提高本发明的组合物对固体支持体的粘附。粘附剂的实例，包括聚丙烯酸酯以及氰基丙烯酸酯。作为该形式的剂型已有多种市售品，其实例包括具有带孔塑料薄膜形式的非粘附性创伤缓解贴的绷带(Smith &Nephew Ltd)；Johnson & Johnson的薄贴片(thin-strip)、皮肤贴(patch)、喷滴剂(spot)、可塑性贴片形式的创可贴(BAND-AID)；可从Colgate-PalmoliveCo.(Kendall)购买获得的Curity CURAD(Ouchless绷带)；以及可从AmericanWhite Cross Laboratories Inc.购买获得的STIK-TITE(弹性贴片)。可将本发明的肽作为有效成分用于上述形式的制剂中。
进一步地，本发明的组合物也可配制成口服施用的制剂。当为口服施用制剂时，将本发明的肽与合适的载体进行混合，并配制成可吸收型片剂、口含片(buccal tablet)、锭剂(troches)、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆剂及薄片(wafer)等制剂。这些制剂除了有效成分以外，还可以含有稀释剂(例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸)和润滑剂(例如，二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁或钙盐和/或聚乙二醇)。在各种制剂中，特别是片剂，可含有硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮等粘合剂，根据需要，还可以含有淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐等崩解剂、吸收剂、着色剂、调味剂及/或甜味剂。
而且，为了进一步增强本发明肽的活性，本发明的组合物还可以含有本领域中已知的具有促进成纤维细胞增殖以及促进创伤愈合活性的其他活性成分。例如，为了进一步增强本发明肽的活性，本发明的组合物还可以含有四环素、土霉素、庆大霉素、硫酸新霉素、杆菌肽及硫酸多粘菌素B等抗生素；苯海拉明、异丙嗪、扑敏宁、吩噻嗪、氯苯胺、安他宁及泛酸钙等抗组胺药；抗炎药；抗病毒药；抗菌药(anti-fungal agents)；PDGF、PDAF、PDEGF、TGF-β、PF-4、αFGF、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、生长激素(growth hormone，GH)、上皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)以及胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)等生长因子。
另外，本发明提供一种促进成纤维细胞增殖的方法，该方法包括将本发明的肽以有效量施用于所需受试者。
进一步地，本发明提供一种促进创伤愈合的方法，该方法包括将本发明的肽以有效量施用于所需受试者。
既可以将本发明的肽直接施用于受试者，也可以将本发明的肽制备成上述各种剂型后再施用于受试者，优选施用至能够显示所希望的效果为止，即，施用于至能够显示促进成纤维细胞的增殖和/或促进创伤愈合的效果为止。
进一步地，本发明的肽可利用本领域公知的方法，通过多种途径施用。即，可以口服施用或非肠道施用。例如，非肠道施用，包括涂敷在皮肤的局部性施用；或者向口腔、肌肉内、静脉内、皮内、动脉内、骨髓内、膜内、腹腔内、脾腔内、阴道内、直肠内、舌下或皮下的全身性施用，或者可向胃肠管、粘膜、呼吸器官施用。优选将本发明的肽以直接涂敷在皮肤的方法施用。
关于本发明的肽的有效量，本领域技术人员可根据施用途径、治疗次数、需要治疗的受试者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病的重症度、饮食以及排泄率等多种要素，决定合适的有效施用量。优选本发明肽的有效量为1μg～10000μg/kg体重/日，更优选为10μg～1000μg/kg体重/日。
附图说明
图1为用弹性蛋白酶2处理的AIMP1的SDS-PAGE结果。
-：未用弹性蛋白酶2处理
+：已用弹性蛋白酶2处理。
图2为对由弹性蛋白酶2切割的AIMP1片段在多种细胞中细胞增殖活性的分析结果。
图3为通过N末端氨基酸序列对由弹性蛋白酶2切割的AIMP1片段的N末端氨基酸进行测序而获得的结果以及切割位点的鉴定结果。
箭头：切割位点
图4为本发明的AIMP1的缺失突变体的示意图。
图5为用SDS-PAGE分析本发明的重组AIMP1的缺失突变体的结果。
图6为本发明AIMP1的缺失突变体片段的成纤维细胞增殖刺激活性的测量结果。
图7为本发明AIMP1-(6-46)片段的成纤维细胞增殖刺激活性的测量结果。
图8为本发明AIMP1的缺失突变片段的创伤愈合促进活性的体内测量结果。
具体实施方式
下文将通过实施例详细地说明本发明。
下述实施例只是示例本发明，但本发明的内容并不限于此。
实验例1：弹性蛋白酶2切割的AIMP1片段活性的测量
1-1：用弹性蛋白酶2处理
利用本领域公知的Park等的方法(Park S.G.et al.，J.Biol.Chem.，277：45243-45248，2002)，合成由312个氨基酸组成的AIMP1(SEQ ID NO：8)。用弹性蛋白酶2处理上述AIMP1，用切割的AIMP1片段处理各种细胞，以测量所述片段的细胞增殖活性。即，将4μg AIMP1和1单位/ml的弹性蛋白酶2共同在37℃下培养4小时。培养结束后，通过15％ SDS-PAGE对所得到的片段进行分析，并用考马斯亮蓝染色，从而使之可视化。
从实验结果可以确认，弹性蛋白酶2的处理，使AIMP1分离成小片段(参阅图1)。
1-2：由弹性蛋白酶2切割的AIMP1片段的细胞增殖活性
用上述实验例1-1中由弹性蛋白酶2切割的AIMP1片段处理人包皮成纤维细胞(foreskin fibroblast)(从MTT公司得到的MC1232)、U2OS细胞(ATCCHTB-96)以及牛主动脉内皮细胞(Bovine aorta endotheilial cells；下文称为“BAECs”)，并分析上述AIMP1片段等对上述细胞增殖的影响。U2OS细胞为骨肉瘤细胞(Osteosarcoma)，已知其不会因AIMP1而引起细胞增殖，因此用作对照。
从牛的胸降主动脉分离BAECs，并用含有20％胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′smedium，DMEM)，在37℃、5％ CO2的条件下进行培养。包皮成纤维细胞及U2OS细胞则利用含有10％FBS及1％抗生素的DMEM进行培养。对所培养的各细胞系(5×103个细胞)用24孔培养板培养12小时后，进行3小时的血清饥饿培养。然后，向各孔添加100nM的全长AIMP1或用酶切割的AIMP1片段，并培养12小时。对照组则未进行任何处理。培养结束后，将氚[3H]标记的胸苷(luCi/孔)添加到各孔中，在37℃下将细胞再培养4小时。用PBS将所培养的细胞洗涤3次，用5％TCA固定10分钟，随后用PBS洗涤3次。用0.5N NaOH将细胞裂解，用液体闪烁计数器(liquid scintillation counter)对结合的胸苷进行定量。
实验结果表明，由弹性蛋白酶2切割的AIMP1片段与全长AIMP1同样地，能够保持抑制内皮细胞增殖的活性，但其失去了诱导成纤维细胞增殖的活性(参阅图2)。由此可知，AIMP1的多种活性通过存在于AIMP1的不同的区域来表达，可以推测由弹性蛋白酶2切割的AIMP1区域在成纤维细胞的增殖中起重要作用。
实施例1：AIMP1的弹性蛋白酶2切割位点的确定以及AIMP1缺失片段的构建
为了确定弹性蛋白酶2切割的AIMP1区域，将实验例1-1中获得的弹性蛋白酶2切割的AIMP1片段的N末端氨基酸序列，利用Edman降解法以及自动序列分析仪通过N末端氨基酸序列来测定，从而确定了切割区域(参阅图3)。
根据上述确定的序列信息，构建了AIMP1的几个缺失突变体，即
AIMP1-(1-192)、AIMP1-(6-192)、AIMP1-(30-192)、AIMP1-(47-192)、
AIMP1-(54-192)、AIMP1-(101-192)、AIMP1-(114-192)、AIMP1-(1-46)、
AIMP1-(1-53)以及AIMP1-(193-312)片段(图4)。对上述各片段，以AIMP1的cDNA(SEQ ID NO：9)为模板，利用对各片段的特异引物对(primer sets)(表1)，通过PCR进行扩增。PCR扩增的条件如下。即，95℃下2分钟；95℃下30秒、56℃下30秒、72℃下1分钟为一循环，进行30个循环，然后72℃下5分钟。
表1：构建AIMP1缺失突变体所用的引物对
Figure A200680052649D00141
Figure A200680052649D00151
将上述PCR产物用EcoRI及XhoI消化，并连接至经相同酶切割的pGEX4T3载体(Amersham Biosciences)。将E.coli BL21(DE3)用连接产物转化并培养，以诱导肽的表达。将每一个肽表达为GST-标签融合蛋白(GST-tagfusion protein)，并用GSH琼脂糖进行纯化。为了除去脂多糖，将蛋白质溶液在无热源的缓冲液(pyrogen-ffee buffer)(10mM磷酸钾缓冲液，pH6.0，100mMNaCl)中透析。透析后，将蛋白质装入用相同的缓冲液预平衡的多粘菌素树脂(Bio-Rad)中，温育20分钟后洗提。通过SDS-PAGE分析所纯化的各种肽(图5)。
实施例2：具有刺激成纤维细胞增殖活性的AIMP1结构域的鉴定
为了调查在上述实施例1中构建的重组蛋白质的成纤维细胞增殖活性，采用与实验例1-2相同的方法，用各个重组蛋白质处理包皮成纤维细胞，从而调查成纤维细胞的增殖程度。
根据实验结果，发现AIMP1的N末端区域刺激成纤维细胞的增殖。具体来说，AIMP1-(1-312)(SEQ ID NO：8)、AIMP1-(1-192)(SEQ ID NO：5)、AIMP1-(1-46)(SEQ ID NO：2)、AIMP1-(1-53)(SEQ ID NO：3)及AIMP1-(6-192)(SEQ ID NO：4)的诱导成纤维细胞增殖的活性高，但AIMP1-(30-192)、AIMP1-(47-192)、AIMP1-(54-192)、AIMP1-(101-192)、AIMP1-(114-192)以及AIMP1-(193-312)没有显示该活性(参阅图6)。这些结果表明，AIMP1的N末端区域，特别是AIMP1-(6-46)是诱导成纤维细胞增殖的结构域。
实施例3：AIMP1-(6-46)片段的成纤维细胞增殖的刺激活性
为了证明AIMP1-(6-46)为诱导成纤维细胞增殖的结构域的推测，合成AIMP1-(6-46)片段，并分析了其成纤维细胞增殖的刺激活性。
3-1：构建AIMP1-(6-46)片段
合成对应于AIMP1的氨基酸6-46的肽(SEQ ID NO：1)，分析上述肽对成纤维细胞增殖的影响。以AIMP1的cDNA作为模板，利用下述的特异引物对(SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31)，通过PCR，制备AIMP1-(6-46)。PCR扩增的条件如下：95℃下2分钟；以95℃下30秒、56℃下30秒、72℃下1分钟为一个循环，进行30个循环；以及72℃下5分钟。
AIMP1-(6-46)的正义引物(SEQ ID NO：30)
5’-CGG ATT TCG CTG TTC TGA AGA GAC TGG AGC AG-3’
AIMP1-(6-46)的反义引物(SEQ ID NO：31)
5’-GTC TCG AGT TAC TTC TCT TCC CTC AAA GTT GCC TG-3’
用EcoRI及XhoI消化扩增的PCR产物，并与经相同酶切割的pGEX4T3载体(Amercham Biosciences)连接。将E.coli BL21(DE3)用连接产物转化，并对其进行培养，来诱导肽的表达，随后采用与上述实施例1相同的方法进行分离和纯化。
3-2：成纤维细胞增殖的刺激活性
采用与实验例<1-2>相同的方法，分析由上述<3-1>制备的AIMP1-(6-46)片段是否刺激成纤维细胞的增殖。此时，以各种浓度(0，50，100，200nM)使用AIMP1-(6-46)片段处理，并用100nM的全长AIMP1(AIMP1-(1-132))作对照。
实验结果表明，AIMP1-(6-46)片段以剂量依赖性方式诱导成纤维细胞的增殖，具有与相同浓度的全长AIMP1(AIMP1-(1-312))几乎相同的活性(参阅图7)。
实施例4：AIMP1缺失片段的创伤愈合的促进活性
由Peptron公司(httD://peptron.co.kr)用化学合成方法制备比上述实施例3中制备的AIMP1-(6-46)片段更小的小片段，即，分别制造AIMP1-(14-34)(SEQID NO：6)及AIMP1-(26-46)(SEQ ID NO：7)片段，并对其创伤愈合的促进活性进行了体内分析。创伤愈合活性分析是利用8周龄的C57BL/6小鼠进行的。对所述小鼠的腹腔内注射2.5％阿佛丁(Avertin)(100ul/10g)，使小鼠麻醉，随后剃去每一只小鼠背部的毛，并用70％乙醇对背部皮肤进行消毒。在背部皮肤上画直径为0.5cm的圆，用剪刀去掉其皮肤及脂膜肌(panniculus carnosusmuscle)，从而诱发创伤。上述创伤部位未作包扎。对每只小鼠诱发一处创伤，每次分别用200nM的溶解在含有20％丙三醇的磷酸缓冲盐溶液(Phosphate-buffered saline，PBS)中的AIMP1-(14-34)、AIMP1-(26-46)及AIMP1-(6-46)片段，对创伤部位每隔12小时处理一次(一天2次)，并连续处理8天。对照组则采用仅含有20％丙三醇的PBS处理。然后，每天通过图象分析软件(Image-pro Plus software)观察创伤的闭合程度(wound closure)，并计算相对于最初创伤面积的百分比。
根据实验结果，发现A IMP1-(14-34)、AIMP1-(26-46)及AIMP1-(6-46)片段具有促进创伤愈合的活性。另外，这些创伤愈合的促进活性均显示类似的程度(参阅图8)。
工业实用性
如上所述，本发明的肽通过刺激成纤维细胞的增殖而具有促进创伤愈合的活性。
序列表
Figure A200680052649E00182
Figure A200680052649E00191
Figure A200680052649E00211
Figure A200680052649E00241
Figure A200680052649E00251
Figure A200680052649E00261
Figure A200680052649E00271
Figure A200680052649E00281
Figure A200680052649E00291
Figure A200680052649E00301
Figure A200680052649E00311
Figure A200680052649E00321

Claims (8)

1.分离的肽，其包含选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％的序列同源性的氨基酸序列的21～41个连续氨基酸的肽。
2.如权利要求1所述的肽，其中，所述肽具有选自如下组成的组中的氨基酸序列：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：7以及SEQ ID NO：32～SEQ ID NO：37。
3.如权利要求2所述的肽，其中，所述肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
4.组合物，其含有权利要求1所述的肽。
5.如权利要求4所述的组合物，其还含有药学上可接受的载体。
6.促进成纤维细胞增殖的方法，其包括将有效量的权利要求1所述的肽施用于所需要的受试者。
7.促进创伤愈合的方法，其包括将有效量的权利要求1所述的肽施用于所需要的受试者。
8.用作药物的分离的肽，其中，所述肽包含选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有90％序列同源性的氨基酸序列的21～41个连续氨基酸的肽。
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