CN101331233A - 酶促制备香茅醛的方法 - Google Patents

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Abstract

在烯醇还原酶的存在下，通过还原从式(1)的α，β－不饱和醛类制备式(2)的旋光饱和醛类或醇类的方法，所述烯醇还原酶(i)具有多肽序列SEQ ID No.1或2，或(ii)具有与SEQ ID No.1或No.2所示有至少80％序列同一性的多肽序列。

Description

酶促制备香茅醛的方法
本发明涉及从α，β-不饱和醛类制备旋光饱和醛类或醇类的酶促方法，尤其是制备香茅醛的方法。
发明背景
(R)-(+)香茅醛是重要的化学中间体，其例如可用于制备薄荷醇。
化学法制备(R)-(+)香茅醛，始于柠檬醛，需要非常复杂的方法(隔绝氧和水)，这导致工业合成的成本很高。
发明目的
目的是提供通过对应选择性还原柠檬醛制备香茅醛的方法，该方法提供了高化学产率且拥有最大对映体纯度的香茅醛。
发明描述
本发明涉及在烯醇还原酶的存在下通过还原从式(1)的α，β-不饱和醛类制备式(2)的旋光饱和醛类或醇类的过程。所述烯醇还原酶
(i)具有多肽序列SEQ ID No.1或2，或
(ii)具有与SEQ ID No.1或2的序列至少80％同一的多肽序列。
Figure A20068004693700031
其中，R1和R2分别独立地为H、C1-C4-烷基，R3为H、C1-C6-烷基或烯基，以支链和直链形式。
本发明方法可使用式(1)的α，β-不饱和醛类实现，在所述式1中R1和R2分别独立地为H、支链和直链形式的C1-C4-烷基，R3为H、支链和直链形式的C1-C6-烷基或烯基。烷基和烯基可以是单或多取代的。
本发明的方法特别适宜的底物是式(1)的那些α，β-不饱和醛类，其中R1为H，R2为CH3且R3为-CH2-CH2-CH＝(CH3)2(顺式或反式柠檬醛)；以及其中R1为CH3，R2为H且R3为CH3(2-甲基-戊-2-烯-1-醛)的那些。
本发明所采用的烯醇还原酶，偶尔且在某种程度上，也会除了将羰基官能团的α，β位中的双键还原之外，还原所述羰基官能团自身，以在该情况中产生相应的醇。
适用于本发明方法的烯醇还原酶，是能够在NADPH依赖的反应中将2-甲基-戊-2-烯-1-醛还原以提供(S)-2-甲基-戊烷-1-醛的酶。该反应在下文中也被称作模式反应。
此外，本发明方法中适合的烯醇还原酶具有如SEQ ID No.1或No.2的多肽序列，或与SEQ ID No.1或2的序列为至少80％、优选至少90％、特别优选至少95％、以及尤其是至少97％、98％或99％同一的多肽序列。
具有SEQ ID No.1的多肽是来自贝克酵母菌中的QYE2基因(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因座YHR179W)。
具有SEQ ID No.2的多肽是来自贝克酵母菌中的QYE3基因(酿酒酵母基因座YPL171C)。
为了本文描述的目的，序列同一性由威斯康星大学(University ofWisconsin)遗传计算机组(Genetics Computer Group，GCG)的计算机程序“GAP”确定，采用10.3版本和GCG推荐的标准参数。
从SEQ ID No.1或2开始，此类烯醇还原酶可以通过技术人员已知的特定或随机诱变过程得到。但是可选的，也可以就烯醇还原酶筛选微生物，特别是以下属的那些：Alishewanella、交替球菌属(Alterococcus)、Aquamonas、Aranicola、杀雄菌属(Arsenophonus)、Azotivirga、Brenneria、布赫纳氏菌属(Buchnera)(蚜虫P-内共生体)，布戴约维采菌属(Budvicia)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、Candidatus Phlomobacter，西地西菌属(Cedecea)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)，Dickeya，爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，埃希氏菌属(Escherichia)，爱文菌属(Ewingella)，Grimontella，哈夫尼菌属(Hafnia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，克吕沃尔菌属(Kluyvera)，勒克菌属(Leclercia)，勒米诺菌属(Leminorella)、米勒菌属(Moellerella)，摩根菌属(Morganella)，肥杆菌属(Obesumbacterium)，泛菌属(Pantoea)，果胶杆菌属(Pectobacterium)，发光杆菌属(Photorhabdus)，邻单胞菌属(Plesiomonas)，布拉格菌属(Pragia)、变形杆菌属(Proteus)，普罗威登斯菌属(Providencia)，拉恩菌属(Rahnella)、拉乌尔菌属(Raoultella)、沙门菌氏属(Salmonella)、沙门菌属(Samsonia)，沙雷氏菌属(Serratia)，志贺氏菌属(Shigella)、Sodalis、塔特姆菌属(Tatumella)、Trabulsiella、Wigglesworthia、致病杆菌属(Xenorhabdus)，耶尔森氏菌属(Yersinia)和约克菌属(Yokenella)，所述烯醇还原酶催化上述模式反应，且其氨基酸序列已经具有所需的与SEQ No.1或2的序列同一性或其通过诱变过程得到。
所述烯醇还原酶可以以纯化或部分纯化的形式或者另外以微生物本身的形式使用。从微生物中回收和纯化脱氢酶的方法是技术人员充分了解的。
用所述烯醇还原酶的对映选择性还原优选在合适的辅因子(也叫做协同底物)的存在下进行。还原酮常用的辅因子是NADH和/或NADPH。此外，也可以将烯醇还原酶用作天然包含辅因子的细胞系统，或添加可选的氧化还原介体(A.Schmidt，F.Hollmann和B.Bühler″Oxidation ofAlcohols″in K.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysis in OrganicSynthesis 2002，第III卷，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim)。
更加优选在合适还原剂的存在下用所述烯醇还原酶实现对映选择性还原，所述还原剂再生在所述还原过程中被氧化的辅因子。合适还原剂的实例有糖类，特别是己糖，例如葡萄糖、甘露糖、果糖，和/或可被氧化的醇类，特别是乙醇、丙醇或异丙醇，也可以是甲酸盐、亚磷酸盐或氢分子。为了氧化还原剂并与之相关地再生辅酶，可以添加第二种脱氢酶，例如，若使用的还原剂是葡萄糖，那么添加葡萄糖脱氢酶；或者如果使用的还原剂是甲酸盐，那么添加甲酸脱氢酶。所述的第二种脱氢酶可以作为游离或固定化的酶，或者以游离或固定化细胞的形式使用。其制备可以分别进行，也可以通过在(重组)还原酶菌株中共表达来进行。
所述方法的优选实施方案是通过酶促系统再生辅因子，在所述系统中使用第二种脱氢酶，特别优选是葡萄糖脱氢酶。
本发明另外涉及烯醇还原酶用于制备香茅醛的用途。
在此实施方案中使用的优选的辅因子分别是NAD+和NADP+，其可以通过合适的协同底物(氧化剂)再次再生。这里可以使用的优选的协同底物是丙酮，其与已经存在的ADH和/或额外使用的脱氢酶一起，再生辅因子并在该过程中被还原为异丙醇。
为了本发明的目的，“对映选择性”意思是根据下式以已知方式计算的S对映体的对映体过量(enantiomer excess，ee)(以％)：
ee(％)＝S-对映体-R-对映体/(S-对映体-R-对映体)×100
是至少80％，优选至少90％，特别是至少95％以及尤其是至少97％。
根据本发明使用的烯醇还原酶可以游离形式或固定化形式使用。固定化酶表示固定在惰性支持物上的酶。合适的支持材料和在其上固定的酶公开于EP-A-1149849、EP-A-1069183和DE-A 100193773，以及这些专利里引用的参考文献中。在这个问题上，引用的参考文献是其整体引入这些出版物的公开中。合适支持材料的实例包括粘土、粘土矿物例如诸如高岭石、硅藻土、珍珠岩、二氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉、阴离子交换材料，合成聚合物诸如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、酚醛树脂、聚氨基甲酸酯和聚烯烃诸如聚乙烯和聚丙烯。支持材料常常以细分的颗粒形式用于制备受支持的酶，优选提供多孔形式。支持材料的颗粒大小一般不大于5mm，特别是不大于2mm(筛级(sieve grade))。类似地，当使用脱氢酶作为整个细胞催化剂时，可以选用游离或固定化形式。支持材料的实例是藻酸钙和角叉藻聚糖。酶和细胞也可以直接与戊二醛交联(交联以得到CLEA)。例如，相应的和其他固定化方法在J.Lalonde和A.Margolin的“Immobilization of Enzymes”in K.Drauz和H.Waldmann，EnzymeCatalysis in Organic Synthesis 2002，第III卷，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中有描述。
反应可以在水性或非水性反应介质中，或在2相体系中，或在(微)乳剂中进行。水性反应介质优选是缓冲溶液，其通常具有从4到8的pH，优选从5到8。除水之外，水性溶剂也可以包含至少一种醇，例如乙醇或异丙醇或二甲基亚砜。
非水性反应介质指基于反应介质的总质量，包含小于1％(重量)，优选小于0.5％(重量)的水的反应介质。该反应优选在有机溶剂中进行。
适宜溶剂的实例是脂族烃，其优选具有5至8个碳原子，如戊烷，环戊烷，己烷，环己烷，庚烷，辛烷或环辛烷；卤代脂族烃，其优选具有一个或两个碳原子，如二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，二氯乙烷或四氯乙烷；芳烃，如苯，甲苯，二甲苯，氯苯或二氯苯；脂族无环和环的醚类或醇类，其优选具有4至8个碳原子，如乙醚，甲基叔丁基醚，乙基叔丁基醚，二丙醚，二异丙醚，二丁基醚，四氢呋喃；或酯类，如乙酸乙酯或乙酸正丁酯；或酮类，如甲基异丁基酮或二噁烷或其混合物。特别优选是使用上述醚类，尤其是四氢呋喃。
用烯醇还原酶的还原优选在水性-有机，特别是水性，反应介质中进行。
酶促还原中使用的底物(1)优选浓度是从0.1g/l到500g/l，特别优选是从1g/l到50g/l，并且可以随后连续或分批添加。
酶促还原通常在反应温度低于所使用的还原酶的灭活温度并高于-10℃下进行。所述温度特别优选是从0到100℃的范围内，特别是从15到60℃，且尤其是从20到40℃，例如大约30℃。
该步骤可以涉及，例如，最初向底物(1)引入烯醇还原酶、溶剂，以及(根据需要)辅酶；根据需要引入第二种脱氢酶以便再生所述辅酶；和/或还有还原剂并混合混合物，例如通过搅拌或摇晃。但是，也可以将该还原酶固定在反应器中，例如在柱子中并引导包含底物以及根据需要辅酶和/或协同底物的混合物通过反应器。为此目的，混合物可以在反应器中循环，直到达到所需的转化率。
在该过程中，羰基官能团的α，β位双键被还原为单键；偶然地，羰基官能团本身被还原为醇官能团。基于混合物中存在的底物，通常进行还原达到转化率至少为70％，特别优选至少85％，且尤其是至少为95％。反应的过程，也就是，双键的顺序还原，可以通过常规手段进行监控，比如说气相色谱或高压液相色谱。
具体公开的酶的“功能等价物”或类似物为了本发明的目的，是指与之不同且还具有所需生物活性比如底物特异性的多肽。因此，例如，“功能等价物”指这样的酶，其催化模式反应，并具有包含SEQ ID No.1或2所列出的任意氨基酸序列的酶活性的至少20％，优选50％，特别优选75％，非常特别优选90％。此外，功能等价物优选在pH4到10之间稳定，且有利地具有pH最优在5到8之间且温度最优在20℃到80℃的范围内。
根据本发明，“功能等价物”特别还指突变体，其在上述氨基酸序列的至少一个序列位置中具有并非是特定提到的那一个的氨基酸，但是其仍然具有上述生物学活性之一。“功能等价物”因此包含通过一个或多个氨基酸添加、取代、缺失和/或倒位获得的突变体，任何序列位置上发生所述修饰都是可能的，只要它们产生的突变体拥有本发明的性质。如果突变体和未修饰的多肽之间的反应性模式定性地相对应(即例如相同底物以不同的速率反应)，功能等价性也是特别存在的。
合适的氨基酸取代实例可在下表中找到：
  原始残基   取代实例
  AlaArgAsnAsp   SerLysGln；HisGlu
  原始残基   取代实例
  CysGlnGluGlyHisIleLeuLysMetPheSerThrTrpTyrVal   SerAsnAspProAsn；GlnLeu；ValIle；ValArg；Gln；GluLeu；IleMet；Leu；TyrThrSerTyrTrp；PheIle；Leu
上述含义中的“功能等价物”也是所描述多肽的“前体”且也是“功能衍生物”。
在此上下文中，“前体”是多肽的天然或合成的前体，其具有或不具有所需的生物学活性。
本发明中多肽的“功能衍生物“同样可以在已知技术的帮助下，在功能性氨基酸侧基或其N端或其C端上制备。此类衍生物包含，例如羧酸基团的脂族酯，羧酸基团的酰胺，该酰胺通过与氨或与伯胺或仲胺反应得到；游离氨基的N-酰基衍生物，该衍生物通过与酰基反应制备；或游离羟基的O-酰基衍生物，该衍生物通过与酰基反应制备。
在可能的蛋白质糖基化情形中，本发明的“功能等价物”包含上述类型的去糖基化或糖基化形式的蛋白质，也包含通过改变糖基化模式得到的修饰的形式。
“功能等价物”天然还包含从其他生物获得的多肽以及还有天然存在的变体。例如，同源序列区的区域可以通过序列比较确立，而等价酶可以基于本发明特定的指导确定。
“功能等价物”同样包含本发明多肽的片断，优选单个域或序列基序，例如该片段具有所需的生物学功能。
“功能等价物”此外还是融合蛋白质，其包含任何所述多肽序列或由此衍生的功能等价物，以及至少一个另外的异源序列，所述异源序列与之功能不同且是N-末端或C-末端功能性连接的(即，无任何实质的融合蛋白质部分的互相功能损害)。例如，此类异源序列的非限制性实例是信号肽或酶。
本发明中蛋白质的同源物可以通过筛选诸如截短突变体的突变体组合文库鉴别。例如，多种蛋白质变体文库可以通过核酸水平的组合诱变生成，例如通过酶促连接合成的寡核苷酸混合物。有大量的方法可用于从简并的寡核苷酸序列制备潜在同源物文库。简并的基因序列可以在DNA合成仪中化学合成，然后将合成的基因连接到合适的表达载体中。使用简并的基因集合使得在混合物中提供所有的序列成为可能，所述序列编码所需的潜在蛋白质序列集合。合成简并的寡核苷酸的方法已为技术人员所知(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人，(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，(1984)Science 198：1056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11：477).
筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物以及筛选具有所选择性质的基因产物的cDNA文库的多种技术在现有技术中是已知的。可将这些技术修改以用于快速筛选基因文库，所述基因文库是通过本发明同源物的组合诱变生成的。筛选进行高通量分析的大基因文库的最常用技术包括将基因文库克隆进可复制的表达载体，将合适的细胞用得到的载体文库转化并在一定条件下表达组合基因，在所述条件下所需活性的检测促进了编码其产物被检测的基因的载体的分离。循环集团诱变(Recursiveensemble mutagenesis，REM)是增加文库中功能性突变体的频率的技术，可以同筛选测试组合以便鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS89：7811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。
本发明还涉及核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)，其编码具有本发明还原酶活性的酶。优选提供这样的核酸序列，其编码例如根据SEQ ID No.1或2的氨基酸序列或其特征部分序列。
本文提及的所有核酸序列可以本身已知的方式通过化学合成从核苷酸构件制备，例如通过个体重叠、双螺旋的互补核酸构件的片段浓缩。寡核酸可以，例如，使用phosphoamidite方法以已知方式化学合成(Voet，Voet，第2版，Wiley Press New York，第896-897页)。借助于DNA聚合酶克列诺片段和连接反应的合成寡核苷酸的装配和缺口填充以及还有一般的克隆方法在Sambrook等人(1989)的Molecular Cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press有描述。
实施本发明的酶促还原方法的另外的实施方案
烯醇还原酶在本发明的方法中可以用作游离或固定化酶。
本发明的方法有利地在0℃到95℃间，优选是在10℃到85℃之间，特别优选是在15℃到75℃之间的温度下进行。
在本发明方法中，有利保持pH在4到12之间，优选是在pH 4.5到9之间，特别优选在pH 5到8之间。
在本发明方法中，对映纯的或手性产物(2)指的是表现出对映体富集的对映体。在本方法中优选实现至少为70％ee，优选至少为80％ee，特别优选至少90％ee，非常特别优选至少98％ee的对映体纯度。
本发明的方法可以使用生长细胞，该生长细胞包含本发明中的核酸，核酸构建物或载体。也可以使用静息细胞或破裂的细胞。破裂的细胞指，例如，通过用溶剂处理变得可透过的细胞，或者例如通过用酶处理、通过机械处理(例如弗细胞压碎器或超声波处理)或通过其他方法被破裂的细胞。用这种方式获得的粗提取物有利地适于本发明的方法。对于该方法还可以使用纯化的或部分纯化的酶。已经有利地应用于反应的固定化的微生物或酶同样也是合适的。
本发明的方法可以分批、半分批或连续操作。
该方法可以有利地在生物反应器中进行，例如，在Rehm等人编著(1993)的Biotechnology第二版第三卷中，特别是第二章中所描述的。
下述实施例通过举例的方法描述但不限定本发明。在此背景中，参考附图，其中
实验部分
用酿酒酵母的2-甲基-戊-2-烯-1-醛的生物转化
生物转化是在有挡板的500ml的锥形瓶中进行的。所述烧瓶在每种情形中装有126ml的转化溶液。为此，每种情形中加入21g的D-葡萄糖。调节所需的pH(6和8.5之间)。每个烧瓶的底物量是200mg的2-甲基戊-2-烯-1-醛。通过添加21g的贝克酵母起始实验，并且将反应混合物置于培养箱(处于所需温度下(28和37℃之间)(以240rpm摇动))中。于6、12、18、24、36和48小时后取出样品并通过气相色谱分析。
在pH 7.5和pH 8.5之间达到最高转化率(40-70％)。在pH＝8.5且T＝37℃时，光学纯度为ee＝92.1，转化率为66.6％。
用酿酒酵母的柠檬醛的生物转化
生物转化是在有挡板的500ml的锥形瓶中进行的。所述烧瓶在每种情形中装有126ml的转化溶液。为此，在每种情形中添加21g的D-葡萄糖。调节所需的pH(6和8.5之间)。每个烧瓶的底物量是210mg的柠檬醛(柠檬醛为70∶30顺式/反式混合物)。通过添加21g的贝克酵母起始实验，并且将反应混合物置于培养箱(处于所需温度下(28和37℃之间)(以240rpm摇动))中。于6、12、18、24、36和48小时后取出样品并通过气相色谱分析。
除(R)-(+)香茅醛之外，还得到了(R)-(+)-β-香茅醛以及橙花醇和香叶醇。
转化溶液
53.4g的Na2HPO4和21g的D-葡萄糖，以及126ml的蒸馏水(pH调整到6和8.5之间)。
序列表
<110>巴斯夫欧洲公司(BASF Aktiengesellschaft)
<120>酶促制备香茅醛的方法
<130>AE20040629
<160>2
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>400
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>1
Met Pro Phe Val Lys Asp Phe Lys Pro Gln Ala Leu Gly Asp Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Phe Lys Pro Ile Lys Ile Gly Ash Asn Glu Leu Leu His Arg Ala
            20                  25                  30
Val Ile Pro Pro Leu Thr Arg Met Arg Ala Gln His Pro Gly Asn Ile
        35                  40                  45
Pro Asn Arg Asp Trp Ala Val Glu Tyr Tyr Ala Gln Arg Ala Gln Arg
    50                  55                  60
Pro Gly Thr Leu Ile Ile Thr Glu Gly Thr Phe Pro Ser Pro Gln Ser
65                  70                  75                  80
Gly Gly Tyr Asp Asn Ala Pro Gly Ile Trp Ser Glu Glu Gln Ile Lys
                85                  90                  95
lu Trp Thr Lys Ile Phe Lys Ala Ile His Glu Asn Lys Ser Phe Ala
           100                 105                 110
Trp Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Trp Ala Ala Phe Pro Asp Thr Leu
        115                 120                 125
Ala Arg Asp Gly Leu Arg Tyr Asp Ser Ala Ser Asp Asn Val Tyr Met
    130                 135                 140
Asn Ala Glu Gln Glu Glu Lys Ala Lys Lys Ala Asn Asn Pro Gln His
145                 150                 155                 160
Ser Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Gln Tyr Val Lys Glu Tyr Val Gln
                165                 170                 175
Ala Ala Lys Asn Ser Ile Ala Ala Gly Ala Asp Gly Val Glu Ile His
            180                 185                 190
Ser Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro His Ser Asn
        195                 200                 205
Asn Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg Ala Arg Phe
    210                 215                 220
Thr Leu Glu Val Val Asp Ala Val Val Asp Ala Ile Gly Pro Glu Lys
225                 230                 235                 240
Val Gly Leu Arg Leu Ser Pro Tyr Gly Val Phe Asn Ser Met Ser Gly
                245                 250                 255
Gly Ala Glu Thr Gly Ile Val Ala Gln Tyr Ala Tyr Val Leu Gly Glu
            260                 265                 270
Leu Glu Arg Arg Ala Lys Ala Gly Lys Arg Leu Ala Phe Val His Leu
        275                 280                 285
Val Glu Pro Arg Val Thr Asn Pro Phe Leu Thr Glu Gly Glu Gly Glu
    290                 295                 300
Tyr Asn Gly Gly Ser Asn Lys Phe Ala Tyr Ser Ile Trp Lys Gly Pro
305                 310                 315                 320
Ile Ile Arg Ala Gly Asn Phe Ala Leu His Pro Glu Val Val Arg Glu
                325                 330                 335
Glu Val Lys Asp Pro Arg Thr Leu Ile Gly Tyr Gly Arg Phe Phe Ile
            340                 345                 350
Ser Asn Pro Asp Leu Val Asp Arg Leu Glu Lys Gly Leu Pro Leu Asn
        355                 360                 365
Lys Tyr Asp Arg Asp Thr Phe Tyr Lys Met Ser Ala Glu Gly Tyr Ile
    370                 375                 380
Asp Tyr Pro Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Leu Gly Trp Asp Lys Asn
385                 390                 395                 400
<210>2
<211>400
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>2
Met Pro Phe Val Lys Gly Phe Glu Pro Ile Ser Leu Arg Asp Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Phe Glu Pro Ile Lys Ile Gly Asn Thr Gln Leu Ala His Arg Ala
            20                  25                  30
Val Met Pro Pro Leu Thr Arg Met Arg Ala Thr His Pro Gly Asn Ile
        35                  40                  45
Pro Asn Lys Glu Trp Ala Ala Val Tyr Tyr Gly Gln Arg Ala Gln Arg
    50                  55                  60
Pro Gly Thr Met Ile Ile Thr Glu Gly Thr Phe Ile Ser Pro Gln Ala
65                  70                  75                  80
Gly Gly Tyr Asp Asn Ala Pro Gly Ile Trp Ser Asp Glu Gln Val Ala
            85                      90                  95
Glu Trp Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ile His Asp Cys Gln Ser Phe Ala
            100                 105                 110
Trp Val Gln Leu Trp Ser Leu Gly Trp Ala Ser Phe Pro Asp Val Leu
        115                 120                 125
Ala Arg Asp Gly Leu Arg Tyr Asp Cys Ala Ser Asp Arg Val Tyr Met
    130                 135                 140
Asn Ala Thr Leu Gln Glu Lys Ala Lys Asp Ala Asn Asn Leu Glu His
145                 150                 155                 160
Ser Leu Thr Lys Asp Asp Ile Lys Gln Tyr Ile Lys Asp Tyr Ile His
                165                 170                 175
Ala Ala Lys Asn Ser Ile Ala Ala Gly Ala Asp Gly Val Glu Ile His
            180                 185                 190
Ser Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro His Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Thr Ile Glu Asn Arg Ala Arg Phe
    210                 215                 220
Thr Leu Glu Val Val Asp Ala Leu Ile Glu Thr Ile Gly Pro Glu Arg
225                 230                 235                 240
Val Gly Leu Arg Leu Ser Pro Tyr Gly Thr Phe Asn Ser Met Ser Gly
                245                 250                 255
Gly Ala Glu Pro Gly Ile Ile Ala Gln Tyr Ser Tyr Val Leu Gly Glu
            260                 265                 270
Leu Glu Lys Arg Ala Lys Ala Gly Lys Arg Leu Ala Phe Val His Leu
        275                 280                 285
Val Glu Pro Arg Val Thr Asp Pro Ser Leu Val Glu Gly Glu Gly Glu
    290                 295                 300
Tyr Ser Glu Gly Thr Asn Asp Phe Ala Tyr Ser Ile Trp Lys Gly Pro
305                 310                 315                 320
Ile Ile Arg Ala Gly Asn Tyr Ala Leu His Pro Glu Val Val Arg Glu
                325                 330                 335
Gln Val Lys Asp Pro Arg Thr Leu Ile Gly Tyr Gly Arg Phe Phe Ile
            340                 345                 350
Ser Asn Pro Asp Leu Val Tyr Arg Leu Glu Glu Gly Leu Pro Leu Asn
        355                 360                 365
Lys Tyr Asp Arg Ser Thr Phe Tyr Thr Met Ser Ala Glu Gly Tyr Thr
    370                 375                 380
Asp Tyr Pro Thr Tyr Glu Glu Ala Val Asp Leu Gly Trp Asn Lys Asn
385                 390                 395                 400

Claims (7)

1.在烯醇还原酶的存在中通过还原从式(1)的α，β-不饱和醛类制备式(2)的旋光饱和醛类或醇类的方法，所述烯醇还原酶
(i)具有多肽序列SEQ ID No.1或2，或
(ii)具有与SEQ ID No.1或2的序列有至少80％同一的多肽序列，
Figure A2006800469370002C1
其中，R1和R2分别独立地为H、C1-C4-烷基，R3为H、C1-C6-烷基或烯基，以支链和直链形式。
2.根据权利要求1的方法，其中还原使用NADPH作为辅因子进行。
3.根据权利要求1的方法，其中酶促再生所使用的辅因子。
4.根据权利要求1的方法，其中通过葡萄糖脱氢酶再生辅因子。
5.根据权利要求1的方法，其中还原在水性系统中进行。
6.根据权利要求1的方法，其中烯醇还原酶以固定化形式存在。
7.烯醇还原酶在用于从柠檬醛制备(R)-(+)香茅醛的方法中的用途，所述烯醇还原酶
(i)具有多肽序列SEQ ID No.1或2，或
(ii)具有与SEQ ID No.1或2的序列至少80％同一的多肽序列。
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