CN101311266B - 一种全长cDNA均一化消减杂交方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种全长cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括以下顺序步骤：(1)第一链cDNA的合成；(2)双链cDNA的合成；(3)选择性连接和引物延伸；(4)消减杂交；(5)PCR扩增差异表达的cDNA。消减杂交的PCR产物可以直接克隆到载体上，构建差异表达基因富集的cDNA文库，利用这些文库分析基因表达，也可以制备基因芯片，还可以标记为探针，从已有文库中筛选差异表达的基因。此外如果消减效率不够高，还可以把消减杂交的PCR产物重复进行消减杂交，提高均一化和消减效率。本发明所述的全长cDNA均一化消减杂交(FNSH)方法的有益效果主要体现在：对差异基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，高效均一化，并且得到全长cDNA。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种全长cDNA均一化消减杂交(full-length normalizationsubtractive hybridization，FNSH)方法，应用于富集、筛选、克隆和鉴定差异性表达的基因。
(二)背景技术
生物体各种组织或细胞、以及同一种组织或细胞在不同发育时期等所表达的基因在种类及数量上不尽相同，这些表达量或表达时期不同的基因称为差异表达的基因(differentially expressed gene)。差异表达的基因在生物的发育、分化、癌变等过程中起着重要的作用，因此克隆和鉴定这些差异表达的基因能够有力地推动我们研究和揭示这些生命过程的机理。目前筛选差异表达基因的方法主要有：差异显示(differential display，DD)，代表性差异分析(representational difference analysis，RDA)，基因表达系列分析(serialanalysis of gene expression，SAGE)和抑制性消减杂交(suppression subtractivehybridization，SSH)。
上述方法有一个共同的缺点：即所得到的是cDNA的部分片段；要获得全长cDNA序列还需要利用快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNAends，RACE)或者从cDNA文库筛选，但是在基因具有选择性的启动子、剪切和多聚腺苷酸化信号序列时，以及当基因属于多基因家族时，用RACE获得一个正确的全长cDNA序列将十分困难，而构建cDNA文库以及筛选本身又都是耗时费力的事。
此外，上述方法还分别具有一些其他的缺点：DD一次最多只能获得少数几个基因的cDNA部分序列，不能运用于高通量筛选，而且假阳性率较高；RDA不能有效地将非目的分子消减掉，假阳性率也较高，而且更利于表达量高的基因的富集，容易丢失低表达量的基因的信息；SAGE需要大量地测序，分析大量的序列信息，费用较高；SSH虽然高效而且能均一化表达量不同的cDNA的含量，但也有一定的假阳性，并且抑制性PCR的强弱受多种因素控制，对结果影响很大，另外SSH中双链的driver使消减杂交效率无法进一步地提高。
因此，我们需要一种直接富集差异性表达的基因的方法，这种方法不但能够均一化丰度不同的差异性基因，而且可以得到全长cDNA。
(三)发明内容
本发明既是为了提供一种能够均一化丰度不同的差异性基因、得到全长cDNA的直接富集差异性表达的基因的方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是：
一种全长cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括以下顺序步骤：
(1)第一链cDNA的合成：选取含有差异表达基因的两组样品：特有的或差异表达基因表达较高的样品为tester，没有或差异表达基因表达较低的样品为driver(目的是筛选和克隆那些在tester里面有表达或表达量较高而在driver里无表达或表达量较低的基因，筛选到的这些基因将为研究两组样品之间产生区别的分子机制提供基础，FNSH原理及流程参见图1)，抽提样品的总RNA(不需要抽提mRNA)，利用模板转换技术(template-switching)进行逆转录，分别合成tester和driver的第一链eDNA(first-strand cDNA)，使第一链cDNA的两端分别带有一段已知的序列(见图1中白色和灰色长方框)，分别命名为tester1和driver1；
(2)双链cDNA的合成：将tester1分为两组tester1-1、tester1-2，tester1-1利用引物3’AP和5’磷酸化引物PH5’CP，通过PCR扩增合成双链cDNA，得到有义链上5’末端磷酸化的双链cDNA：tester2-1；tester1-2利用引物5’CP和3’磷酸化引物PH 3’AP，通过PCR扩增合成双链cDNA，得到反义链上5’末端磷酸化的双链cDNA：tester2-2；driver1利用引物5’BK和3’BK或者引物5’CP和3’AP，通过PCR扩增合成双链cDNA：driver2，所述引物5’CP和PH5’CP的序列一致且都与步骤(1)中的TSCAP相对应，3’AP和PH3’AP的序列一致且都与步骤(1)中的TSPA相对应，5’BK的3’末端含有与5’CP相同的序列，能够分别和第一链cDNA的两端相配对引物3’BK的3’末端含有与3’AP相同的序列，5’BK和3’BK的5’端序列比第一链cDNA的两端突出，可为后续PCR扩增差异表达基因的cDNA时减少背景提供了帮助，引物5’BK和3’BK也可直接用引物5’CP和3’AP替代，但是最终的消减效率可能会有所下降；
(3)选择性连接和引物延伸：将tester2-1和tester2-2分别用非磷酸化的接头ADP I和ADP II进行连接，得到连接产物tester3-1和tester3-2；driver2分为两组：driver2-1、driver2-2，所述的driver2-1、driver2-2分别采用引物5’BK和3’BK，在PCR条件下进行3～5个循环，分别得到单链cDNA富集的lver3-1和driver3-2；由于tester2-1和tester2-2分别有相对的一端是磷酸化的，所以与非磷酸化的接头(adaptor)连接时，tester2-1和tester2-2分别只有一端能与接头选择性地连接，这里，tester2-1的一端与接头ADP I连接，而tester2-2的相对另一端与接头ADP II连接；driver2分为两组：driver2-1、driver2-2，所述的driver2-1、driver2-2分别采用引物5’BK和3’BK，在PCR条件下进行3～5个循环，分别得到单链cDNA富集的driver3-1和driver3-2；单链富集的driver能够通过减少消减杂交过程中driver cDNA自身相互杂交而维持driver的有效浓度，因此提高了消减杂交的效率。
(4)消减杂交：分别将tester3-1和tester3-2与过量的driver3-1和driver3-2在杂交缓冲液中混合，并加入引物TSCAP2和TSPA，热变性后，65～68℃下放置4～12小时，使tester和driver的cDNA进行充分杂交；由于driver相比tester是过量的，所以第一次杂交过后，tester里面只有差异表达的目的cDNA(target differentiallyexpressed cDNA)还存在单链形式，大多数非差异cDNA与driver的cDNA形成异源杂交子(heterohybrids)，也有少部分自身杂交。此外由于杂交的二级反应动力学的特性(second order kinetics ofhybridizations)，那些单链的差异表达的目的cDNA被均一化了：即本来丰度不同的差异表达基因(差异表达的基因之间存在量的差别)的单链cDNA在第一次杂交之后变得相对相等。将杂交产物混合在一起，65～68℃下继续放置8～16小时，得到含有两端各自为接头ADP I和ADP II的异源杂交子的杂交产物；这些新形成的目的杂交子(差异性的cDNA)具有独一无二的特征，即它们的两端都有接头(adaptor)，其中一端是接头ADP I，另一端是ADP II。利用这一特征，就可以用和ADP I及ADP II相匹配的引物选择性地扩增那些差异表达的目的cDNA。
(5)PCR扩增差异表达的cDNA：将杂交产物补平末端后，利用与ADPI和ADP II相匹配的引物进行选择性的PCR扩增，富集差异表达的cDNA；
所涉及引物序列如下(BstX I酶切位点用方框表示，I-Ppo I的酶切位点用下划线表示，引物5’CP的序列用阴影表示，引物3’AP的序列用阴影和下划线表示，下同)：
5’CP：5’-TGGTTGCCATAAGCGGATCATC-3’
PH5’CP：5’-pTGGTTGCCATAAGCGGATCATC-3’
3’AP：5’-TGGTTGGGACTCGGTTTGGAGG-3’
PH3’AP： 5’-pTGGTTGGACTCGGTTTGGACG-3’
ADP I：5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTAGCGTGAAGACGACAG
AATTCTTAAGGTAGCT-3’
ADP II：5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGCAGGGAACCAATCCTC
TCTTAAGGTAGCT-3’
5’BK：
5’-AATTAACCCTCACTAAAGGGTGGTTGCCATAAGCGGATCATC-3’
3’BK：
5’-AATTAACCCTCACTAAAGGGTGGTTGGACTCGGTTTGGACG-3’
TSCAP2：5’-TGGTTGCCATAAGCGGATCATC
G-3’
TSPA：5’-TGGTTGGACTCGGTTTGGACG 
(T)15VN-3’。
利用差异性的cDNA的特征，就可以用和ADP I及ADP II相匹配的引物选择性地扩增这些差异表达的目的cDNA。只有差异性的cDNA可以指数扩增，因为那些非差异的cDNA由于没有或者只有一端有接头。与接头相匹配的一对巢式引物(nested primer)可以进一步富集差异表达的cDNA。此外，ADP I及ADP II的5’端序列是一致的，在目的cDNA的上形成末端方向重复序列(invert terminal repeats，ITR)，ITR在PCR过程中会产生的PCR抑制效果。研究表明，可以通过控制引物浓度，退火温度等因素来调节PCR抑制效果的强弱，克服PCR对小分子的偏好性，使大分子cDNA优先扩增或达到与小分子cDNA同等效率地扩增。
所述步骤(1)中逆转录按如下方法进行：分别将1～2μg总RNA，1μL10mM的dNTPs，1μL 10μM TSCAP1，及1μL 10μ MTSPA混合，在65℃下放置3分钟后，在冰上冷却后加入2μL5×第一链合成缓冲液，0.25μLRNaseInhibitor以及0.75μL逆转录酶MMLV-RT H-，加灭菌的DEPC处理水补足到10μL总体积后在42℃放置1.5小时使逆转录完成，最后加入0.5μl0.2mMEDTA来螯合Mn2+，并加入70μL无菌去离子水；
所述5×第一链合成缓冲液组成为：250mMTris-Cl pH8.3，375mM KCl，30mM MgCl2，10mM MnCl2，50mM DTT，
所涉及引物序列如下：
TSCAP1：5’-TGGTTGCCATAAGCGGATCAT
G-p-3’
TSPA：5’-TGGTTGGACTCGGTTTGGACG 
(T)15VN-3’。
优选的，所述步骤(4)中杂交缓冲液组成如下：20 mMTris pH 9.2，0.5M NaC1，5mM EDTA，0.1g/mL PEG8000。
具体的，将杂交产物补平末端后，加入与ADP I和ADP II相匹配的巢式引物P1，并加入阻截引物5’BK和3’BK，进行第一步PCR扩增；再以第一步PCR扩增产物为模板，只加入引物P1，进行第二步PCR扩增；第二步PCR扩增产物加入引物P2和AD2P，进行第三步PCR扩增，高效富集差异表达的cDNA；
涉及的引物序列为：
P1：5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’
P2： 5’-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3’
AD2P：5’-CTGCAGGGAACCAATCCTCT-3’。
见图2，在PCR过程中，所有分子在变性(denature)后都形成了单链，小部分非目的cDNA有可能在退火和延伸(annealing and extension)过程中偶然地形成杂交子，这种杂交子一旦形成就会被指数扩增出来，因此会提高背景(图2中左边)；这一问题的解决方案是在第一步PCR反应液中除了引物P1，另外加入一对阻截引物(blocking primer)：5’BK和3’BK。由于高浓度的引物5’BK和3’BK与那些非目的cDNA碰撞并结合的几率远远高于非目的cDNA之间形成异源杂交子，这些引物既对非目的cDNA有竞争抑制，又会改变非目的cDNA的分子结构而使其只能线性扩增(图2中右边)。这样以第一步PCR产物为模板，只用引物P1进行第二步扩增时，就只有差异性的目的cDNA可以指数扩增，再配合内部的巢式引物进行第三步PCR扩增就可以高效地富集差异表达的cDNA。由于本发明方法的独特性，这一步消除背景的技术不能运用到诸如“抑制性消减杂交”(SSH)等方法上。
所述步骤(5)将杂交产物用PCR反应液在75℃放置5min补平末端。
本发明还涉及一对用于全长cDNA均一化消减杂交的非磷酸化接头，其引物序列为：
ADP I：
5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTAGCGTGAAGACGACAG
AATTCTTAAGGTAGCT-3’
ADP II：
5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGCAGGGAACCAATCCTC
TCTTAAGGTAGCT-3’。
为了获得罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbgrgii)雄性生殖系统特异性表达的基因，可以促雄性腺所在的组织及其相邻的部分输精管样品作为tester，卵巢样品作为driver，按照本发明方法进行消减杂交，可筛选出至少40个雄性生殖系统特异性的基因(不在卵巢中表达)，其中37个特异性基因的cDNA是全长的。
消减杂交的PCR产物可以直接克隆到载体上，构建差异表达基因富集的cDNA文库，利用这些文库分析基因表达，也可以制备基因芯片，还可以标记为探针，从已有文库中筛选差异表达的基因。此外如果消减效率不够高，还可以把消减杂交的PCR产物重复进行消减杂交，提高均一化和消减效率。
本发明所述的全长cDNA均一化消减杂交(FNSH)方法的有益效果主要体现在：对差异基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，高效均一化，并且得到全长cDNA。
(四)附图说明
图1为FNSH流程示意图；
图2为PCR扩增消减杂交产物背景的产生及其解决方案示意图；
图3为FNSH与SSH的比较。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
为了获得罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)雄性生殖系统特异性表达的基因，将促雄性腺所在的组织及其相邻的部分输精管样品作为tester，将卵巢样品作为driver，分别用TRIzol(Invitrogen)按产品说明书上的方法提取总RNA进行消减杂交：
所涉及引物或接头序列如下：
5’CP：5’-TGGTTGCCATAAGCGGATCATC-3’
PH5’CP： 5’-pTGGTTGCCATAAGCGGATCATC-3’
3’AP： 5’-TGGTTGGACTCGGTTTGGACG-3’
PH3’AP： 5’-pTGGTTGGACTCGGTTTGGACG-3’
ADP I：
5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTAGCGTGAAGACGACAG
AATTCTTAAGGTAGCT-3’
3’-AGAATTCCATCG-5’
ADP II：
5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGCAGGGAACCAATCCTC
TCTTAAGGTAGCT-3’
3’-AGAATTCCATCG-5’
5’BK：
5’-AATTAACCCTCACTAAAGGGTGGTTGCCATAAGCGGATCATC-3’
3’BK：
5’-AATTAACCCTCACTAAAGGGTGGTTGGACTCGGTTTGGACG-3’
TSCAP1：5’-TGGTTGCCATAAGCGGATCAT
G-p-3’
TSCAP2：5’-TGGTTGCCAIAAGCGGATCAT
G-3’
TSPA：5’-TGGTTGGACTCGGTTTGGACG 
(T)15VN-3’
P1：5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’
P2：5’-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3’
AD2P：5’-CTGCAGGGAACCAATCCTCT-3’。
其中接头ADP I和ADP II分别由相应的两条合成的DNA链在TN缓冲液(10mM Tris，10mM NaCl，pH8.0)中各以10μM的浓度混合后，在70℃两分钟，然后缓慢冷却至室温而形成。
(1)第一链cDNA合成：
分别将1～2μg tester和driver的总RNA，1μL 10mM的dNTPs，1μL10μM TSCAP1，及1μL10μM TSPA混合，在65℃下放置3分钟使RNA的二级结构打开，在冰上冷却后加入2μL 5×第一链合成缓冲液(250mM Tris-ClpH8.3，375mM KCl，30mM MgCl2，10mM MnCl2，50mM DTT)，0.25μL RNaseInhibitor(40U/μL，TaKaRa)以及0.75μL逆转录酶MMLV-RTH-(200U/μL，Promega)或SuperScript II(200U/μL，Invitrogen)，加灭菌的DEPC处理水补足到10μL总体积后在42℃放置1.5小时使逆转录完成，最后加入0.5μL0.2MEDTA来螯合Mn2+，并加入70μL无菌去离子水，得到tester1和driver1。(2)双链cDNA合成：
tester1分两组，一组取6μLtester1作为模板加上6μL引物PH5’CP和6μl引物3’AP混合得到300μLPCR反应液[其他成分是10mM Tris pH9.0，50mMKCl，1.5mM MgCl2，0.1％(w/v)triton X-100，0.2mM dNTPs，7.5 U Taq&Pfu聚合酶(Promega)(Taq:Pfu＝160:1)]，另外一组取6μL tester1作为模板但用6μL引物5’CP和6μL引物PH3’AP混合得到PCR反应液；与此同时取6μL driver1作为模板加上6μL引物5’BK和6μL引物3’BK混合得到PCR反应液；PCR反应液分装成50～100μL每管放置在PCR仪上反应，反应程序如下：先95℃1分钟预变性，接着进行20个循环的95℃30秒，64℃30秒和68℃6分钟；最后在68℃再延伸10分钟。反应产物用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化后分别得到tester2-1、tester2-2和driver2。
(3)选择性连接和引物延伸：
将200ng tester2-1和1μl ADP I(10μM)混合，另外将200ng tester2-2和1μlADP II(10μM)混合，分别加入1μL 10×连接缓冲液(400mM Tris-Cl pH7.8，100mM MgC12，100mM DTT，5mMATP)、1μL 50％(w/v)PEG4000和1μLT4 DNA连接酶(Fermentas)(5U/μL)，加灭菌水补足到10μL后在16℃反应过夜(～16小时)，分别得到tester3-1和tester3-2；将2μg的driver2和1μL的3’BK混合，另外将2μg的driver2和1μL的5’BK混合在25μL的PCR反应液中进行3个循环的反应：95℃30秒，64℃30秒和68℃6分钟。分别得到driver3-1和driver3-2。
(4)均一化消减杂交：
第一步杂交分两管，每管先加入1.25μL4×杂交液(100mM Tris-Cl pH9.2，2M NaCl，20mM EDTA，0.4g/ml PEG8000)，0.25μL TSCAP2/TSPA混合物(各5μM)，然后在其中一管加入1.5μL tester3-1和2μL driver3-1，在另一管中则加入1.5μL tester3-2和2μL driver3-2，着在95℃变性1.5分钟，然后在66℃杂交6小时。第二步杂交是把第一步杂交的产物直接混合到一个管中在66℃继续杂交16小时，然后加入200μL稀释液(20mM Tris pH9.2，50mMNaCl)在68℃放置10分钟。
(5)PCR扩增差异性cDNA：
第一步PCR：取1μL如步骤(4)所述稀释了的消减杂交产物做模板，在PCR反应液中加入引物P1 0.5μL，5’BK和3’BK各0.25μL，加入其它的PCR反应液(除Taq&Pfu外)之后，先让PCR反应液达到75℃，加入0.625U的Taq&Pfu(Promega)在最终体积25μL的反应体系中75℃反应5分钟补平末端，然后进行10个循环的95℃ 30秒，64℃ 30秒和68℃ 6分钟，最后68℃延伸10分钟。
第二步PCR：取1μL第一步PCR产物做模板，加入0.5μL引物P1和其他PCR反应液，进行PCR，反应程序是95℃ 1分钟，接着25循环95℃ 30秒，64℃ 30秒和68℃ 6分钟，最后68℃延伸10分钟。
第三步PCR：取1μL 1/10稀释的第二步PCR产物做模板，加入各0.5μL的引物P2和AD2P以及其他PCR反应液，再进行PCR，反应程序除了循环数是15外，其他与第二步PCR的相同。
(6)消减文库的获得：
将步骤(5)第三步PCR产物连接到2.1载体(Invitrogen)上后，转化到大肠杆菌TOP10(Invitrogen)中得到一个消减文库。
(7)筛选差异表达的cDNA：
从步骤(6)所得的文库中随机挑选了120个克隆，用和
2.1载体(Invitrogen)上的引物M13F和M13R以PCR扩增出插入载体的cDNA片段，把扩增产物点在带正电荷的尼龙膜上，按常规的方法处理后分别与tester和driver的混合探针杂交。Tester和driver的混合探针分别用步骤(2)所得的双链cDNA用Roche公司的地高辛采用随机引物标记法标记，此外也可以用步骤(5)所得的消减杂交的PCR扩增产物代替步骤(2)所得的双链cDNA来标记。杂交的信号如果tester比driver的深则表明可能在tester样品中的表达量高。我们将部分在和tester杂交信号强于driver的克隆测序并用Northernblot的杂交方法验证后，确认从中筛选出至少40个雄性生殖系统特异性的基因(不在卵巢中表达)，这些序列已经递交到GenBank(序列号是EF364516～EF364539和EF364541～EF364556)，其中37个特异性基因的cDNA是全长的。
实施例2：FNSH与SSH的比较
以罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)卵巢的cDNA作为SSH及FNSH的driver，同时也作为SSH及FNSH的tester中的非差异表达的基因。以N74的cDNA(GenBank序列号为EF364538，由实施例1所得并最终确认为雄性生殖系统特异性表达)为tester中的差异表达的cDNA。不同量的N74的cDNA加入到tester分别进行SSH(SSH的tester用PH5’CP和PH3’AP扩增然后与接头连接，driver用5’CP和3’AP扩增后用BstXI酶切，具体步骤参见：Diatchenko L.，Lau Y.-F.C.，Campbell A.P，Chenchik A.，Moqadam F.，Huang B.，Lukyanov S.，Lukyanov K.，Gurskaya N.，Sverdlov E.D.，et al.1996.Suppression subtractive hybridization：A method for generating difierentiallyregulated or tissue-specific cDNA probes and libraries.Proc.Natl.Acad.Sci.96：6025-6030.)和FNSH(方法同实施例1)，最后PCR产物跑电泳、转膜并分别与N74和actin的探针杂交。其中N74探针用来检测富集和均一化效率，持家基因actin探针(见Zhu，X.-J.，Dai，Z.-M.，Liu，J.and Yang，W.-J.(2005)Actingene in prawn，Macrobrachium rosenbergii：characteristics and differential tissueexpression during embryonic development.Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.140：599-605.)用来检测消减效率。电泳结果见图3，30 ng testercDNA中所加N74 cDNA的量分别为30pg(1和5)，3pg(2和6)，0.3pg(3和7)及0.03pg(4和8)，FNSH-1表示第一轮FNSH，FNSH-2表示第二轮FNSH；其中9～12分别是5～8的第二轮FNSH的产物。
结果，SSH只能有效地富集多于0.3pg的差异性基因(在30 ng总testercDNA中占0.001％)；而FNSH可以有效的富集多于0.03pg的差异性基因(在30ng总tester cDNA中占0.0001％，即百万分之一)；而同时FNSH的非差异基因actin的消减效果也优于SSH。第二轮FNSH对低表达量的差异性cDNA更进一步富集的同时也减弱背景。
序列表.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>浙江大学
<120>一种全长cDNA均一化消减杂交方法
<130>
<160>14
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>1
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>2
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>3
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>4
<210>5
<211>57
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>5
<210>6
<211>53
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>6
<210>7
<211>42
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>7
<210>8
<211>41
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>8
<210>9
<211>34
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>9
<210>10
<211>34
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>10
<210>11
<211>36
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc feature
<222>(36)..(36)
<223>nisa，c，g，or t
<400>11
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>12
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<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>13
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<211>20
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>14
Claims (5)
1.一种全长cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括以下顺序步骤：
(1)第一链cDNA的合成：选取含有差异表达基因的两组样品：特有的或差异表达基因表达较高的样品为tester，没有或差异表达基因表达较低的样品为driver，抽提样品的总RNA，分别利用模板转换技术进行逆转录，分别合成tester和driver的第一链cDNA，分别命名为tester1和driver1；
所述逆转录按如下方法进行：分别将1～2μg总RNA，1μL10mM的dNTPs，1μL10μM TSCAP1，及1μL10μM TSPA混合，在65℃下放置3分钟后，在冰上冷却后加入2μL5×第一链合成缓冲液，0.25μL RNaseInhibitor以及0.75μL逆转录酶MMLV-RT H-，加灭菌的DEPC处理水补足到10μL总体积后在42℃放置1.5小时使逆转录完成，最后加入0.5μl0.2mMEDTA来螯合Mn2+，并加入70μL无菌去离子水；
所述5×第一链合成缓冲液组成为：250mM Tris-Cl pH8.3，375mM KCl，30mM MgCl2，10mM MnCl2，50mM DTT；
(2)双链cDNA的合成：将tester1分为两组tester1-1、tester1-2，tester1-1利用引物3’AP和5’磷酸化引物PH5’CP，通过PCR扩增合成双链cDNA，得到有义链上5’末端磷酸化的双链cDNA：tester2-1；tester1-2利用引物5’CP和3’磷酸化引物PH 3’AP，通过PCR扩增合成双链cDNA，得到反义链上5’末端磷酸化的双链cDNA：tester 2-2；driver1利用引物5’BK和3’BK或者引物5’CP和3’AP，通过PCR扩增合成双链cDNA：driver2，所述引物5’CP和PH5’CP的序列一致且都与步骤(1)中的TSCAP1相对应，3’AP和PH3’AP的序列一致且都与步骤(1)中的TSPA相对应，5’BK的3’末端含有与5’CP相同的序列，引物3’BK的3’末端含有与3’AP相同的序列；
(3)选择性连接和引物延伸：将tester2-1和tester2-2分别用非磷酸化的接头ADP I和ADP II进行连接，得到连接产物tester3-1和tester3-2；driver2分为两组：driver2-1、driver2-2，所述的driver2-1、driver2-2分别采用引物5’BK和3’BK，在PCR条件下进行3～5个循环，分别得到单链cDNA富集的driver3-1和driver3-2；
(4)消减杂交：分别将tester3-1和tester3-2与过量的driver3-1和driver3-2在杂交缓冲液中混合，并加入引物TSCAP2和TSPA，热变性后，65～68℃下放置4～12小时，使tester和driver的cDNA进行充分杂交；将杂交产物混合在一起，65～68℃下继续放置8～16小时，得到含有两端各自为接头ADP I和ADP II的异源杂交子的杂交产物；
(5)PCR扩增差异表达的cDNA：将杂交产物补平末端后，利用与ADP I和ADP II相匹配的引物进行选择性的PCR扩增，富集差异表达的cDNA；
所涉及引物序列如下：
5’CP：5’-
-3’
PH5’CP：5’-p
-3’
3’AP：5’-
-3’
PH3’AP：5’-p
-3’
ADP I：5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTAGCGTGAAGACGACAG
AATTCTTAAGGTAGCT-3’
3’-AGAATTCCATCG-5’
ADP II：5’-GTA ATACGACTCACTATAGGGCTGCAGGGAACCAATCCTC
TCTTAAGGTAGCT-3’
3’-AGAATTCCATCG-5’
5’BK：
5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG
-3’3’BK：
5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG
-3’
TSCAP1：5’-G-p-3’
TSCAP2：5’-
G-3’
TSPA：5’-T)15VN-3’。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中杂交缓冲液组成如下：20mM Tris pH 9.2，0.5M NaCl，5mM EDTA，0.1g/mLPEG8000。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)为：将杂交产物补平末端后，加入与ADP I和ADP II相匹配的巢式引物P1，并加入阻截引物5’BK和3’BK，进行第一步PCR扩增；再以第一步PCR扩增产物为模板，只加入引物P1，进行第二步PCR扩增；第二步PCR扩增产物加入引物P2和AD2P，进行第三步PCR扩增，高效富集差异表达的cDNA；
涉及的引物序列为：
P1：5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’
P2：5’-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3’
AD2P：5’-CTGCAGGGAACCAATCCTCT-3’。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)将杂交产物用PCR反应液在75℃放置5min补平末端。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法以罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)促雄性腺所在的组织及其相邻的部分输精管样品作为tester，卵巢样品作为driver。
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