CN101597630B

CN101597630B - 一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法

Info

Publication number: CN101597630B
Application number: CN2009100968810A
Authority: CN
Inventors: 戴忠敏; 杨卫军
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2009-03-19
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2029-03-19
Also published as: CN101597630A

Abstract

本发明提供了一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法，依次包括第一链cDNA的合成、合成双链cDNA、转录RNA、逆转录、均一化和消减杂交、双链特异性DNA酶消化、PCR扩增、克隆差异表达基因及鉴定等步骤。与其它方法相比本发明的有益效果主要体现在：(a)对共同表达基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，同时表达量很低的差异表达基因可以被有效富集；(b)能够得到全长cDNA序列。

Description

一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法

(一)技术领域

本发明涉及一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交(Duplex-specific nuclease-mediated normalization and subtractivehybridization，DNSH)方法。

(二)背景技术

生物体不同组织或细胞间，以及同一组织或细胞在不同发育时期、不同应激条件下会选择性地表达一部分基因，这些表达量或表达时期不同的基因称为差异表达基因(differentially expressed gene)。克隆和鉴定差异表达基因能够有力地推动生物个体的发育、分化、癌变等过程的机理的研究。目前筛选差异表达基因的方法主要有：差异显示(differential display，DD)，代表性差异分析(representational difference analysis，RDA)，基因表达系列分析(serial analysis ofgene expression，SAGE)和抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)。这些方法分别具有一些缺点：DD一次最多只能获得少数几个基因的cDNA部分序列，而且假阳性率较高；RDA不能有效地将非目的分子消减掉，假阳性率也较高，而且更利于表达量高的基因的富集，容易丢失低表达量的基因的信息；SAGE需要大量地测序，分析大量的序列信息，而且获得的序列长度目前最长也只有十几碱基对(bp)，后期的研究仍要大量的工作；SSH相对RDA要高效，而且也能对表达量不同的cDNA的含量有一定均一化作用，但抑制性PCR的强弱受多种因素控制⁵，另外SSH也容易丢失低表达量的基因的信息。此外，上述的这些方法都不能得到全长的cDNA，这样在序列比对时也容易丢失信息；对于需要深入研究的基因，得到全长cDNA也是必需的。因此，需要一种能够富集差异表达基因的方法，这种方法不但能够均一化丰度不同的差异基因，而且可以得到全长cDNA。

(三)发明内容

为有效地筛选生物样品中不同丰度的差异表达基因，并获得基因的全长eDNA序列，本发明提供了一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法。

本发明采用的技术方案是：

一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括如下顺序步骤：

(1)第一链cDNA的合成：选取两组样品tester和driver，其中tester具有差异表达基因，抽提样品的总RNA，分别利用模板转换技术(template-switching)进行逆转录，合成tester和driver的第一链cDNA，使第一链eDNA的两端分别带有已知序列TsOligo-p和Tspa，所述TsOligo-p中包含T7启动子序列，3’端包含3个以上连续G碱基，且3’末端磷酸化，以使合成的cDNA中全长cDNA的比例提高；Tspa包含一段Oligo dT区域和另外一段已知序列)，分别命名为tester1和driver1；样品组tester和driver中既有差异表达基因，也有共同表达(非差异)的基因。目的是筛选和克隆那些在tester里面有表达或表达量较高而在driver里无表达或表达量较低的基因，筛选到的这些基因将为研究两组样品之间产生区别的基因功能和分子机制提供基础。

(2)合成双链cDNA：利用与tester1和driver1的两端已知序列TsOligo-p和Tspa相匹配的引物SP6T7和3’ap，PCR扩增合成tester和driver的双链cDNA，通过PCR扩增可以分别合成大量的tester和driver的双链cDNA，同时使双链cDNA上带有SP6和T7RNA聚合酶的识别序列，分别命名为tester2和driver2；

(3)转录RNA：tester2用SP6RNA聚合酶转录，driver2用T7RNA聚合酶大量转录，分别得到样品RNA，命名为tester3和driver3；

(4)逆转录：tester3逆转录合成cDNA，形成cDNA:RNA复合物，其中cDNA两端加入已知的接头序列；

(5)均一化和消减杂交：将cDNA:RNA复合物与过量driver3在杂交缓冲液中混合，充分杂交；杂交缓冲液终浓度组成如下：0.025M Tris(pH 8.0)，0.5M NaCl，0.01mM EDTA，0.2M海藻糖，20％(v/v)DMSO。其中海藻糖和DMSO都具有降低双链核酸的熔解温度(melting temperature)的作用，使变性和杂交可以在更低的温度下进行，从而减少核酸受热水解等作用，同时增加杂交的特异性，减少核酸因形成稳定的二级结构而被双链特异性核酸酶(duplex-specific nuclease，DSN)酶切降解。具体方法为：反应体系在88℃下热变性90s，然后在55℃下放置16小时使tester的cDNA和driver的RNA进行充分地杂交。由于driver相比tester是过量的，所以杂交过后，tester里面只有差异表达的目的cDNA还存在单链形式，大多数非差异cDNA与driver的RNA形成杂交双链，也有少部分自身杂交。此外由于杂交的二级反应动力学的特性(second order kinetics ofhybridizations)，那些单链的差异表达的目的cDNA被均一化了：即本来丰度不同的差异表达基因(差异表达的基因之间存在量的差别)的单链cDNA在杂交之后变得相对相等。

(6)双链特异性DNA酶消化：在杂交产物中加入DSN酶和DSN酶的缓冲液，进行酶切反应；(1×缓冲液的成分为：50mM Tris，pH 8.0，7mM MgCl₂，1mM DTT，0.2M海藻糖(trehalose))，具体过程：反应体系在65℃反应30分钟。加入1.5μL的100mMEDTA溶液，将反应液升温到68℃并保持10分钟使反应终止。此时所有与RNA杂交的cDNA都已经被DSN酶切成小片段，差异表达基因的cDNA由于没有过量的driver RNA与之杂交，大部分还处于单链状态，因此不能被DSN酶切。

(7)PCR扩增：根据cDNA上的接头序列设计引物，进行PCR扩增，富集差异表达基因；由于步骤(6)中的DSN酶的作用，共同表达基因的cDNA由于被酶切而不能被PCR扩增。PCR扩增中用到了抑制性PCR的作用来调节不同分子量cDNA的扩增效率，同时可以用多至三轮PCR扩增来提高产物量。

(8)克隆差异表达基因及鉴定：将PCR产物直接克隆到T载体上，或者用SaII酶切后接入SaII酶切的载体上，转入大肠杆菌，构建差异表达基因富集的cDNA文库。利用这些文库分析基因表达，也可以制备基因芯片；消减杂交的PCR产物还可以标记为探针，从已有文库中筛选差异表达的基因。可以把文库中或从基因芯片分析结果中挑选的每个基因单独做Northern、半定量逆转录(RT)PCR、或荧光定量RT-PCR等方法鉴定这些基因是不是真正的差异表达基因。

具体的，步骤(1)中已知序列TsOligo-p和Tspa如下：

TsOligo-p：GTAATACGACTCACTATAGGGGG-p；

Tspa：TGGTTGGACTCGGTTTGGACGCCATAGAATTGG TTTTTTTTTTTTTTT VN；

TsOligo-p的3’末端磷酸化，下划线标示部分为T7启动子序列。V表示A、C、G的兼并碱基，N表示A、T、C、G的兼并碱基。因为polyA是一段有几百个碱基的A组成，如果用TTTTTTTTTTTTTTT逆转录的话，它可以结合到polyA的任何位点并开始逆转录，而用TTTTTTTTTTTTTTTVN的的话，可以让它结合到polyA的起始位点，因为兼并碱基V只能跟A之外的其它碱基结合，后面再加一个N会增强这种效果。

步骤(2)中引物SP6T7和3’ap序列如下：

SP6T7：

CATTTAGGTGACACTATAGAGTAATACGACTCACTATAGGG；

3’ap：TGGTTGGACTCGGTTTGGACG；

其中下划线标示部分为T7启动子序列。

步骤(4)中已知的接头序列为T7启动子序列。具体的，步骤(4)方法如下：在逆转录反应体系中，以tester3作为模板，加入引物T7oligodT，进行逆转录反应，然后加入EDTA使反应终止，在70℃加热15分钟使逆转录酶失活，得到cDNA:RNA复合物，其中cDNA两端都加入了T7启动子序列；引物T7oligodT序列如下：GTAATACGACT CACTATAGGG GG(T)15VN，其中下划线标示部分为T7启动子序列。

步骤(5)中杂交缓冲液终浓度组成如下：0.025M Tris(pH 8.0)，0.5M NaCl，0.01mM EDTA，0.2M海藻糖，20％(v/v)DMSO。具体方法为：反应体系在88℃下热变性90s，然后在55℃下放置16小时使tester的cDNA和driver的RNA进行充分地杂交。

PCR扩增中用到了抑制性PCR的作用来调节不同分子量cDNA的扩增效率，同时可以用多至三轮PCR扩增来提高产物量。具体的，步骤(7)方法如下：以DSN酶切过的cDNA为模板，以SOI和PI为引物，进行第一轮PCR；然后以第一轮PCR产物为模板，以PI为引物，进行第二轮PCR；最后以第二轮PCR产物为模板，以SalT7P为引物，进行第三轮PCR；

所用引物序列如下：

SOI：

CTGCAGCGAACCAATCCTCTGTAATACGACTCACTATAGGG；

PI：CTGCAGCGAACCAATCCTCTG；

SalT7P：GATCGTCGACGTAATACGACTCACTATAGGG；

其中下划线标示部分为T7启动子序列。

与其它方法相比本发明的有益效果主要体现在：(a)对共同表达基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，同时表达量很低的差异表达基因可以被有效富集；(b)能够得到全长cDNA序列。

(四)附图说明

图1为双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交实验流程图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：卤虫休眠生殖特异性表达基因的分析

所用引物(10μM)序列见表1：

引物	序列(5’-3’)
		TsOligo-p	GTAATACGACTCACTATAGGGGG-p
T7oligodT	GTAATACGACTCACTATAGGGGGTTTTTTTTTTTTTTTVN
		SOI	CTGCAGCGAACCAATCCTCTGTAATACGACTCACTATAGGG
PI	CTGCAGCGAACCAATCCTCTG
		SalT7P	GATCGTCGACGTAATACGACTCACTATAGGG
SP6T7	CATTTAGGTGACACTATAGAGTAATACGACTCACTATAGGG
		Tspa	TGGTTGGACTCGGTTTGGACGCCATAGAATTGGTTTTTTTTTTTTTTTVN
3’ap	TGGTTGGACTCGGTTTGGACG

注：T7启动子序列用下划线表示，引物TsOligo-p的3’末端磷酸化。

本实验的目的是分离卤虫(Artemia parthenogenetica，尕海湖，中国)休眠生殖特异性表达的基因。

(1)、合成第一链cDNA。

选取两组样品，一组样品为在短光照条件下(光照∶黑暗周期为：4∶20，卤虫以产休眠卵为主要生殖方式)生长的卤虫位于双侧囊的卵母细胞，这组样品作为为tester；另一组样品为在长光照条件下(光照∶黑暗周期为：16∶8，卤虫以产幼虫为主要生殖方式)生长的卤虫位于双侧囊的卵母细胞，这组样品作为driver。

目的是筛选和克隆那些在tester里面有表达或表达量较高而在driver里无表达或表达量较低的基因，筛选到的这些基因将为研究两组样品之间产生区别的基因功能和分子机制提供基础。具体原理参见图1。

利用TriZol抽提tester和driver的总RNA(不需要抽提mRNA)，利用改进的模板转换技术(template-switching)分别合成第一链cDNA，使第一链cDNA的两端分别带有一段已知的序列(图1中TsOligo-p和Tspa的序列)，步骤如下：在冰上分别将1μg tester和driver的总RNA，1μL10mM的dNTPs，1μL 10μM TsOligo-p，及1μL 10μM Tspa混合，2μL5×第一链合成缓冲液(250mM Tris-Cl pH8.3，375mM KCl，25mM MgCl₂，10mM MnCl₂，50mM DTT)，1μL 2M海藻糖(trehalose)，1μL 5M甜菜碱(betaine)，0.25μL RNase Inhibitor(40U/μL，TaKaRa公司)，以及0.75μL逆转录酶MMLV-RT(H^-)(200U/μL，Promega公司)，加灭菌的DEPC处理水补足到10μL总体积后在42℃放置1小时接着在42℃放置30分钟使逆转录完成。最后用AxyPrep PCR Clean-up Kit(Axygen公司)纯化逆转录产物，纯化产物溶于80μL 5mM Tris，pH8.5中。

(2)、合成双链cDNA。

利用与第一链cDNA两端的已知序列相匹配的引物SP6T7和3’ap引物通过PCR扩增可以分别合成大量的tester和driver的双链cDNA。同时可以使新合成的双链cDNA上带有SP6和T7RNA聚合酶的识别列。

每100μL的PCR反应液成分如下：50mM Tris，16mM(NH₄)₂SO₄，1.55mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，4μL纯化的第一链cDNA，SP6T70.2μM，3’ap 0.2μM，Taq+Pfu DNA聚合酶(5U/μL，Sangon公司，其中Taq和Pfu的混合比例是100∶3，以下同)0.8μL。

PCR反应程序如下：94℃1min；24循环的94℃30s，60℃30s，68℃6min。PCR产物用AxyPrep PCR Clean-up Kit(Axygen)纯化，并溶于35μL 5mM Tris，pH8.5中。

(3)、转录RNA。

以步骤(2)中得到的DNA各1μg为模板进行在10μL体系里进行转录。其中tester组样品用SP6 RNA聚合酶(Promega公司)转录，driver组样品用RiboMAX^TM Large Scale RNA Production System-T7(Promega公司)大量转录，转录在37℃进行4小时后用0.5U的DNase I作用20分钟去除其中的DNA。接着用酸性酚以及氯仿的方法纯化RNA。

(4)、从步骤③中得到的tester样品RNA再次逆转录合成cDNA。

步骤如下：在10μL的反应体系中，以0.5μg RNA作为模板，加入2μL M-MLV RT 5×Reaction Buffer(Promega公司)，1μL 10mM dNTPs，1μL T7oligodT，1μL betaine(5M)，1μL trehalose(2M)，0.25μL RNaseInhibitor(40U/μL，TaKaRa公司)，以及0.75μL M-MLV RT(H-)(200U/μL，Promega公司)，在42℃放置1小时接着在42℃放置30分钟使逆转录完成。然后加入1μL 100mM的EDTA使反应终止，在70℃加热15分钟使逆转录酶失活。此合成的cDNA和RNA形成cDNA:RNA复合物，其中cDNA两端都加入了已知的接头序列(T7启动子序列)。

(5)、均一化和消减杂交。

在10μL的反应体系中，将2μL从步骤(4)中得到的cDNA:RNA复合物与15μg(约是tester的150倍)从步骤(3)中得到的RNA在适当的杂交缓冲液中混合。混合后杂交液的成分是：0.025M Tris(pH 8.0)，0.5M NaCl，0.01mM EDTA，0.2M trehalose，20％(v/v)DMSO；在88℃下热变性90s，然后在55℃下放置16小时使tester的cDNA和driver的RNA进行充分地杂交。

由于driver相比tester是过量的，所以杂交过后，tester里面只有差异表达的目的cDNA还存在单链形式，大多数非差异cDNA与driver的RNA形成杂交双链，也有少部分自身杂交。此外由于杂交的二级反应动力学的特性(second order kinetics ofhybridizations)，那些单链的差异表达的目的cDNA被均一化了：即本来丰度不同的差异表达基因(差异表达的基因之间存在量的差别)的单链cDNA在杂交之后变得相对相等。

(6)、双链特异性DNA酶消化。

在上述步骤(5)所得到的杂交产物中加入等体积的DSN酶反应缓冲液(1×缓冲液的成分为：50mM Tris，pH 8.0，7mM MgCl₂，1mM DTT，0.2M trehalose)，在65℃时再加入1μL DSN酶(Evrogen公司)，反应30分钟。加入1.5μL的100mM EDTA溶液，以及20μL灭菌去离子水，将反应液升温到68℃并保持10分钟使反应终止。

此时所有与RNA杂交的cDNA都已经被DSN酶切成小片段，差异表达基因的cDNA由于没有过量的driver RNA与之杂交，大部分还处于单链状态，因此不能被DSN酶切。

(7)、利用PCR扩增来富集差异表达基因。

利用步骤(4)中加入cDNA上的接头序列设计的引物来扩增差异表达基因的cDNA。由于步骤(6)中的DSN酶的作用，共同表达基因的cDNA有于被酶切而不能被PCR扩增。用了三轮PCR来扩增差异表达基因的cDNA。第一轮PCR用2μL经过DSN处理的cDNA为模板，1μL SOI，2μL PI作为引物；第二轮PCR用0.4μL第一轮PCR的产物做模板，用4μL PI作为引物；第三轮PCR用0.4μL第二轮PCR的产物做模板，用1.6μL SalT7P作为引物。PCR的反应体系均为100μL，其他的反应液成分与步骤(2)中PCR缓冲液相同。三轮PCR的循环数分别是30，30，25。第三轮PCR产物用AxyPrep PCR Clean-up Kit(Axygen公司)纯化，并溶于35μL 5mM Tris，pH8.5中。

(8)、克隆差异表达基因及鉴定。

消减杂交的PCR产物用SalI酶切后接入到用SalI酶切的PUC19载体上，转入大肠杆菌，构建差异表达基因富集的cDNA文库。随机挑选了768个大肠杆菌克隆，测序结果显示其中692个含可用的cDNA(在GenBank上的序列号是：GH635209～GH635900)，总共有600种不同的cDNA。挑选了其中的44种cDNA(来源于56个克隆)进行荧光定量RT-PCR方法检测发现，其中11个cDNA(21个克隆)的表达量上调，另外这些基因之间的表达量差异也非常大，最大约3000倍。由此可以证明DNSH的有效性。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江大学

<120>一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法

<130>

<160>8

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

gtaatacgac tcactatagg ggg 23

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)..(40)

<223>n is a，c，g，or t

<400>2

gtaatacgac tcactatagg gggttttttt ttttttttvn 40

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

ctgcagcgaa ccaatcctct gtaatacgac tcactatagg g 41

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>4

ctgcagcgaa ccaatcctct g 21

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>5

gatcgtcgac gtaatacgac tcactatagg g 31

<210>6

<211>41

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>6

catttaggtg acactataga gtaatacgac tcactatagg g 41

<210>7

<211>50

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(50)..(50)

<223>n is a，c，g，or t

<400>7

tggttggact cggtttggac gccatagaat tggttttttt ttttttttvn 50

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>8

tggttggact cggtttggac g 21

Claims

1.一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括如下顺序步骤：

(1)第一链cDNA的合成：选取两组样品tester和driver，其中tester具有差异表达基因，样品组tester和driver中既有差异表达基因，也有共同表达的基因，目的是筛选和克隆那些在tester里面有表达或表达量较高而在driver里无表达或表达量较低的基因，抽提样品的总RNA，分别利用模板转换技术进行逆转录，合成tester和driver的第一链cDNA，使第一链cDNA的两端分别带有已知序列TsOligo-p和Tspa，分别命名为tester1和driver1，所述TsOligo-p中包含T7启动子序列，3’端包含3个以上连续G碱基，且3’末端磷酸化；所述Tspa包含一段Oligo dT区域；所述已知序列TsOligo-p和Tspa如下：

TsOligo-p：GTAATACGACTCACTATAGGGGG-p；

Tspa：TGGTTGGACTCGGTTTGGACGCCATAGAATTGGTTTTTTTTTTTTTTT VN；

TsOligo-p的3’末端磷酸化，下划线标示部分为T7启动子序列；

(2)合成双链cDNA：利用与tester1和driver1的两端已知序列TsOligo-p和Tspa相匹配的引物SP6T7和3’ap，PCR扩增合成tester和driver的双链cDNA，使双链cDNA上带有SP6和T7 RNA聚合酶的识别序列，分别命名为tester2和driver2；所述引物SP6T7和3’ap序列如下：

SP6T7：CATTTAGGTGACACTATAGAGTAATACGACTCACTA TAGGG；

3’ap：TGGTTGGACTCGGTTTGGACG；

其中下划线标示部分为T7启动子序列；

(3)转录RNA：tester2用SP6RNA聚合酶转录，driver2用T7RNA聚合酶转录，分别得到样品RNA，命名为tester3和driver3；

(4)逆转录：tester3逆转录合成cDNA，形成cDNA：RNA复合物，其中cDNA两端加入已知的接头序列；所述已知的接头序列为T7启动子序列

(5)均一化和消减杂交：将cDNA：RNA复合物与过量driver3在杂交缓冲液中混合，充分杂交；

(6)双链特异性DNA酶消化：在杂交产物中加入DSN酶和DSN酶的缓冲液，进行酶切反应；

(7)PCR扩增：根据cDNA上的接头序列设计引物，进行PCR扩增，富集差异表达基因；

(8)克隆差异表达基因及鉴定：将PCR产物直接克隆到T载体上，或者用SaII酶切后接入SaII酶切的载体上，转入大肠杆菌，构建差异表达基因富集的cDNA文库。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)方法如下：在逆转录反应体系中，以tester3作为模板，加入引物T7oligodT，进行逆转录反应，然后加入EDTA使反应终止，在70℃加热15分钟使逆转录酶失活，得到cDNA：RNA复合物，其中cDNA两端都加入了T7启动子序列；引物T7oligodT序列如下：GTAATACGACTCACTATAGGGGGTTTTTTT TTTTTTTT VN，其中下划线标示部分为T7启动子序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中杂交缓冲液终浓度组成如下：0.025M pH 8.0Tris，0.5M NaCl，0.01mM EDTA，0.2M海藻糖，20％v/v DMSO。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(7)方法如下：以DSN酶切过的cDNA为模板，以SOI和PI为引物，进行第一轮PCR；然后以第一轮PCR产物为模板，以PI为引物，进行第二轮PCR；最后以第二轮PCR产物为模板，以SalT7P为引物，进行第三轮PCR；

所用引物序列如下：

SOI：

CTGCAGCGAACCAATCCTCTGTAATACGACTCACTATAGGG；

PI：CTGCAGCGAACCAATCCTCTG；

SalT7P：GATCGTCGACGTAATACGACTCACTATAGGG；

其中下划线标示部分为T7启动子序列。