CN108193284A - 一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，包括如下步骤：将mDNA在PCR引物以及寡核苷酸引物的引导下，通过逆转录酶逆转录，能够合成第一链cDNA，将纯化时的第一链cDNA需要结束时，将第一链cDNA放到冰上终止反应，然后将第一链cDNA置于试管内，然后放置在预热的PCR仪上，将第一链cDNA再次利用PCR引物以及锚定引物，利用改进后的Cap‑trapper法在PCR仪合成并扩增第二链cDNA，并在14‑20摄氏度的条件下进行过夜，分别对第二链cDNA做λ噬菌体包装反应，未扩增的第二链cDNA文库在1‑4摄氏度的条件下保存12‑18天。该方法在构建细菌cDNA文库时能够利用特性进行反转录提供理论基础，重组率高，符合现在生物发展的需求。
Description
技术领域
本发明涉及cDNA文库构建技术领域，尤其涉及一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法。
背景技术
全长cDNA文库不仅能大大提高基因测序和生物信息学分析的进程，还利于后期蛋白质表达及功能分析，也是高效、大规模获得基因序列信息的一条有效途径，尤其是对基因组庞大，近期内尚不能进行全基因组测序的生物来说更是进行功能基因组研究的一条重要途径。即使在模式生物，如拟南芥、水稻、秀丽线虫等全基因组测序完成后，分子生物学家们仍旧构建了相应生物的全长cDNA文库，并进行了大规模的全长cDNA测序，以深入了解基因的功能。如：拟南芥(A.thaliana)，小鼠(M.musculus)，果蝇(D.melanoga ster)，水稻(O.sati2va)等等，产生了大量有价值的数据，由此科学家们也取得了很多全新的研究成果，极大地促进了功能基因组学研究，推动了医学、农业和环保生物技术产品的开发。
此外，要想获得高质量有价值的全长cDNA文库，mRNA的均一化处理非常关键。全长cDNA文库在一定程度上解决了大规模获得全长cDNA的问题，但如果想通过大规模测序来发掘新基因，还有一个无法回避的现实问题就是：冗余序列。为了提高发掘稀有表达新基因的效率，还需要对全长cDNA文库进行差减/均一化。现有构建全长cDNA文库的方法各具特色，也都存在一定的缺陷，它们有的涉及PCR扩增，极易改变文库中克隆的代表性，并影响难扩增基因的克隆；有的以质粒为载体，不利于大片段基因的克隆；有的实验流程长，步骤繁琐；有的成本高，效率底等。而且目前已有的构建方法均没有包含均一化这个关键技术步骤，而需单独进行均一化处理，这样大大增加了操作的难度、时间成本和工作量，存在较大的技术缺陷。为此，我们提出了一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法。
发明内容
本发明提出了一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明提出了一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，包括如下步骤：
S1：选取mDNA，并将mDNA作为合成cDNA第一链的模板，然后将mDNA储存在8-14摄氏度的无菌环境下，且储存时间为45-60min，完成后备用；
S2：将S1中处理后的mDNA在PCR引物以及寡核苷酸引物的引导下，通过逆转录酶逆转录，从而能够合成第一链cDNA，并将第一链cDNA在纯化酶的作用下进行纯化处理，以保证第一链cDNA在使用时的质量；
S3：将纯化时的第一链cDNA需要结束时，将第一链cDNA放到冰上终止反应，然后将第一链cDNA置于试管内，轻弹试管混匀,稍离心甩到管底，然后放置在预热的PCR仪上；
S4：将S3中处理后的第一链cDNA再次利用PCR引物以及锚定引物，利用改进后的Cap-trapper法在PCR仪合成并扩增第二链cDNA，在反应结束后，取适量第二链cDNA在琼脂糖电泳上检测第二链cDNA的合成效果；
S5：取3-6支0.5ml试管，标号后按下表加样，温和地混合第二链cDNA，且需避免产生气泡，稍离心使样品都沉到管底，并在14-20摄氏度的条件下进行过夜；
S6：在S5中的第二链cDNA处理完成后，分别对第二链cDNA做λ噬菌体包装反应，然后测定每个包装后文库的滴度，从上面三个连接重组反应将获得2*106-5*106单克隆，未扩增的第二链cDNA文库在1-4摄氏度的条件下保存12-18天，即构建完成均一化全长cDNA文库。
优选的，在S4中的在合成第二链cDNA时，需要进行三次的利用PCR仪合成并扩增第二链cDNA，以保证第二链cDNA的准确度。
优选的，在S6中，如果获得的克隆数少于2*106，重复上面的连接操作，并检查样品的浓度体积以及cDNA的用量。
优选的，所述的PCR引物具体为：
引物序列P1：ACACGATGCAATGACATATG,
引物序列P2：ACTGATACGGAGACGATAGA。
优选的，所述的寡核苷酸引物具体为：
引物序列P1：ACGTATGCACTGACATATA,
引物序列P2：AGTCTACGCTGACGATAGG。
优选的，所述的锚定引物具体为：
引物序列P1：ACGTACGTACCGACTGATC,
引物序列P2：AGTCTCGGCTAACGATACG，
引物序列P3：AGCTCTAGCTCGAGTAGAG。
本发明提出的一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，有益效果在于：该高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法的操作简单、灵活，检测通量高、检测成本低，产生的文库测序质量高，该方法在构建细菌cDNA文库时能够利用特性进行反转录提供一定的理论基础，且还方法的滴度高，重组率高，符合现在生物发展的需求。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明提出了一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，包括如下步骤：
S1：选取mDNA，并将mDNA作为合成cDNA第一链的模板，然后将mDNA储存在8摄氏度的无菌环境下，且储存时间为45min，完成后备用；
S2：将S1中处理后的mDNA在PCR引物以及寡核苷酸引物的引导下，通过逆转录酶逆转录，从而能够合成第一链cDNA，并将第一链cDNA在纯化酶的作用下进行纯化处理，以保证第一链cDNA在使用时的质量；
S3：将纯化时的第一链cDNA需要结束时，将第一链cDNA放到冰上终止反应，然后将第一链cDNA置于试管内，轻弹试管混匀,稍离心甩到管底，然后放置在预热的PCR仪上；
S4：将S3中处理后的第一链cDNA再次利用PCR引物以及锚定引物，利用改进后的Cap-trapper法在PCR仪合成并扩增第二链cDNA，在反应结束后，取适量第二链cDNA在琼脂糖电泳上检测第二链cDNA的合成效果；
S5：取3支0.5ml试管，标号后按下表加样，温和地混合第二链cDNA，且需避免产生气泡，稍离心使样品都沉到管底，并在14摄氏度的条件下进行过夜；
S6：在S5中的第二链cDNA处理完成后，分别对第二链cDNA做λ噬菌体包装反应，然后测定每个包装后文库的滴度，从上面三个连接重组反应将获得2*106单克隆，未扩增的第二链cDNA文库在1摄氏度的条件下保存12天，即构建完成均一化全长cDNA文库。
在S4中的在合成第二链cDNA时，需要进行三次的利用PCR仪合成并扩增第二链cDNA，以保证第二链cDNA的准确度。
在S6中，如果获得的克隆数少于2*106，重复上面的连接操作，并检查样品的浓度体积以及cDNA的用量。
所述的PCR引物具体为：
引物序列P1：ACACGATGCAATGACATATG,
引物序列P2：ACTGATACGGAGACGATAGA。
所述的寡核苷酸引物具体为：
引物序列P1：ACGTATGCACTGACATATA,
引物序列P2：AGTCTACGCTGACGATAGG。
所述的锚定引物具体为：
引物序列P1：ACGTACGTACCGACTGATC,
引物序列P2：AGTCTCGGCTAACGATACG，
引物序列P3：AGCTCTAGCTCGAGTAGAG。
实施例2
本发明提出了一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，包括如下步骤：
S1：选取mDNA，并将mDNA作为合成cDNA第一链的模板，然后将mDNA储存在10摄氏度的无菌环境下，且储存时间为50min，完成后备用；
S2：将S1中处理后的mDNA在PCR引物以及寡核苷酸引物的引导下，通过逆转录酶逆转录，从而能够合成第一链cDNA，并将第一链cDNA在纯化酶的作用下进行纯化处理，以保证第一链cDNA在使用时的质量；
S3：将纯化时的第一链cDNA需要结束时，将第一链cDNA放到冰上终止反应，然后将第一链cDNA置于试管内，轻弹试管混匀,稍离心甩到管底，然后放置在预热的PCR仪上；
S4：将S3中处理后的第一链cDNA再次利用PCR引物以及锚定引物，利用改进后的Cap-trapper法在PCR仪合成并扩增第二链cDNA，在反应结束后，取适量第二链cDNA在琼脂糖电泳上检测第二链cDNA的合成效果；
S5：取4支0.5ml试管，标号后按下表加样，温和地混合第二链cDNA，且需避免产生气泡，稍离心使样品都沉到管底，并在16摄氏度的条件下进行过夜；
S6：在S5中的第二链cDNA处理完成后，分别对第二链cDNA做λ噬菌体包装反应，然后测定每个包装后文库的滴度，从上面三个连接重组反应将获得3*106单克隆，未扩增的第二链cDNA文库在2摄氏度的条件下保存14天，即构建完成均一化全长cDNA文库。
在S4中的在合成第二链cDNA时，需要进行三次的利用PCR仪合成并扩增第二链cDNA，以保证第二链cDNA的准确度。
在S6中，如果获得的克隆数少于2*106，重复上面的连接操作，并检查样品的浓度体积以及cDNA的用量。
所述的PCR引物具体为：
引物序列P1：ACACGATGCAATGACATATG,
引物序列P2：ACTGATACGGAGACGATAGA。
所述的寡核苷酸引物具体为：
引物序列P1：ACGTATGCACTGACATATA,
引物序列P2：AGTCTACGCTGACGATAGG。
所述的锚定引物具体为：
引物序列P1：ACGTACGTACCGACTGATC,
引物序列P2：AGTCTCGGCTAACGATACG，
引物序列P3：AGCTCTAGCTCGAGTAGAG。
实施例3
本发明提出了一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，包括如下步骤：
S1：选取mDNA，并将mDNA作为合成cDNA第一链的模板，然后将mDNA储存在12摄氏度的无菌环境下，且储存时间为55min，完成后备用；
S2：将S1中处理后的mDNA在PCR引物以及寡核苷酸引物的引导下，通过逆转录酶逆转录，从而能够合成第一链cDNA，并将第一链cDNA在纯化酶的作用下进行纯化处理，以保证第一链cDNA在使用时的质量；
S3：将纯化时的第一链cDNA需要结束时，将第一链cDNA放到冰上终止反应，然后将第一链cDNA置于试管内，轻弹试管混匀,稍离心甩到管底，然后放置在预热的PCR仪上；
S4：将S3中处理后的第一链cDNA再次利用PCR引物以及锚定引物，利用改进后的Cap-trapper法在PCR仪合成并扩增第二链cDNA，在反应结束后，取适量第二链cDNA在琼脂糖电泳上检测第二链cDNA的合成效果；
S5：取5支0.5ml试管，标号后按下表加样，温和地混合第二链cDNA，且需避免产生气泡，稍离心使样品都沉到管底，并在18摄氏度的条件下进行过夜；
S6：在S5中的第二链cDNA处理完成后，分别对第二链cDNA做λ噬菌体包装反应，然后测定每个包装后文库的滴度，从上面三个连接重组反应将获得4*106单克隆，未扩增的第二链cDNA文库在3摄氏度的条件下保存16天，即构建完成均一化全长cDNA文库。
在S4中的在合成第二链cDNA时，需要进行三次的利用PCR仪合成并扩增第二链cDNA，以保证第二链cDNA的准确度。
在S6中，如果获得的克隆数少于2*106，重复上面的连接操作，并检查样品的浓度体积以及cDNA的用量。
所述的PCR引物具体为：
引物序列P1：ACACGATGCAATGACATATG,
引物序列P2：ACTGATACGGAGACGATAGA。
所述的寡核苷酸引物具体为：
引物序列P1：ACGTATGCACTGACATATA,
引物序列P2：AGTCTACGCTGACGATAGG。
所述的锚定引物具体为：
引物序列P1：ACGTACGTACCGACTGATC,
引物序列P2：AGTCTCGGCTAACGATACG，
引物序列P3：AGCTCTAGCTCGAGTAGAG。
实施例4
本发明提出了一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，包括如下步骤：
S1：选取mDNA，并将mDNA作为合成cDNA第一链的模板，然后将mDNA储存在14摄氏度的无菌环境下，且储存时间为60min，完成后备用；
S2：将S1中处理后的mDNA在PCR引物以及寡核苷酸引物的引导下，通过逆转录酶逆转录，从而能够合成第一链cDNA，并将第一链cDNA在纯化酶的作用下进行纯化处理，以保证第一链cDNA在使用时的质量；
S3：将纯化时的第一链cDNA需要结束时，将第一链cDNA放到冰上终止反应，然后将第一链cDNA置于试管内，轻弹试管混匀,稍离心甩到管底，然后放置在预热的PCR仪上；
S4：将S3中处理后的第一链cDNA再次利用PCR引物以及锚定引物，利用改进后的Cap-trapper法在PCR仪合成并扩增第二链cDNA，在反应结束后，取适量第二链cDNA在琼脂糖电泳上检测第二链cDNA的合成效果；
S5：取6支0.5ml试管，标号后按下表加样，温和地混合第二链cDNA，且需避免产生气泡，稍离心使样品都沉到管底，并在20摄氏度的条件下进行过夜；
S6：在S5中的第二链cDNA处理完成后，分别对第二链cDNA做λ噬菌体包装反应，然后测定每个包装后文库的滴度，从上面三个连接重组反应将获得5*106单克隆，未扩增的第二链cDNA文库在4摄氏度的条件下保存18天，即构建完成均一化全长cDNA文库。
在S4中的在合成第二链cDNA时，需要进行三次的利用PCR仪合成并扩增第二链cDNA，以保证第二链cDNA的准确度。
在S6中，如果获得的克隆数少于2*106，重复上面的连接操作，并检查样品的浓度体积以及cDNA的用量。
所述的PCR引物具体为：
引物序列P1：ACACGATGCAATGACATATG,
引物序列P2：ACTGATACGGAGACGATAGA。
所述的寡核苷酸引物具体为：
引物序列P1：ACGTATGCACTGACATATA,
引物序列P2：AGTCTACGCTGACGATAGG。
所述的锚定引物具体为：
引物序列P1：ACGTACGTACCGACTGATC,
引物序列P2：AGTCTCGGCTAACGATACG，
引物序列P3：AGCTCTAGCTCGAGTAGAG。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：选取mDNA，并将mDNA作为合成cDNA第一链的模板，然后将mDNA储存在8-14摄氏度的无菌环境下，且储存时间为45-60min，完成后备用；
S2：将S1中处理后的mDNA在PCR引物以及寡核苷酸引物的引导下，通过逆转录酶逆转录，从而能够合成第一链cDNA，并将第一链cDNA在纯化酶的作用下进行纯化处理，以保证第一链cDNA在使用时的质量；
S3：将纯化时的第一链cDNA需要结束时，将第一链cDNA放到冰上终止反应，然后将第一链cDNA置于试管内，轻弹试管混匀,稍离心甩到管底，然后放置在预热的PCR仪上；
S4：将S3中处理后的第一链cDNA再次利用PCR引物以及锚定引物，利用改进后的Cap-trapper法在PCR仪合成并扩增第二链cDNA，在反应结束后，取适量第二链cDNA在琼脂糖电泳上检测第二链cDNA的合成效果；
S5：取3-6支0.5ml试管，标号后按下表加样，温和地混合第二链cDNA，且需避免产生气泡，稍离心使样品都沉到管底，并在14-20摄氏度的条件下进行过夜；
S6：在S5中的第二链cDNA处理完成后，分别对第二链cDNA做λ噬菌体包装反应，然后测定每个包装后文库的滴度，从上面三个连接重组反应将获得2*106-5*106单克隆，未扩增的第二链cDNA文库在1-4摄氏度的条件下保存12-18天，即构建完成均一化全长cDNA文库。
2.根据权利要求1所述的一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，其特征在于：在S4中的在合成第二链cDNA时，需要进行三次的利用PCR仪合成并扩增第二链cDNA，以保证第二链cDNA的准确度。
3.根据权利要求1所述的一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，其特征在于：在S6中，如果获得的克隆数少于2*106，重复上面的连接操作，并检查样品的浓度体积以及cDNA的用量。
4.根据权利要求1所述的一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，其特征在于：所述的PCR引物具体为：
引物序列P1：ACACGATGCAATGACATATG,
引物序列P2：ACTGATACGGAGACGATAGA。
5.根据权利要求1所述的一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，其特征在于：所述的寡核苷酸引物具体为：
引物序列P1：ACGTATGCACTGACATATA,
引物序列P2：AGTCTACGCTGACGATAGG。
6.根据权利要求1所述的一种高效快速的均一化全长cDNA文库构建方法，其特征在于：所述的锚定引物具体为：
引物序列P1：ACGTACGTACCGACTGATC,
引物序列P2：AGTCTCGGCTAACGATACG，
引物序列P3：AGCTCTAGCTCGAGTAGAG。
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