CN101307349B - 一种乳制品中抗生素水解残留物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种残留的抗生素水解产物的检测方法,其特征在于,该方法包括:将待测的乳制品和空白对照无抗奶样品经杀菌、冷却后加入发酵剂,测定其起始的发酵液pH值,然后在40-45℃下保温1小时,测定发酵液的pH值,计算发酵前后pH值的变化与无抗奶对照样变化值的差值,差值大于等于0.3时判定为阳性样品;该发明可以检测出的酶解产物的最低浓度是10ppb,可以灵敏准确地检测乳制品中抗生素酶解残留物。
Description
技术领域
本发明提供了一种检测方法,尤其是指乳制品中牛奶分解剂及抗生素水解残留物的检测,具体为一种市售牛奶抗生素分解剂作用于抗生素后水解残留物的检测方法。
背景技术
由于国标中规定原料奶收购时必须“无抗”,一些不法奶站便人为使用抗生素酶水解乳中残留的抗生素,这类水解酶制剂及酶水解产物没有做过相关的安全性评价,对于消费者存在直接或间接的安全隐患。
奶牛在饲养过程中,用于预防和治疗作用的药物主要是抗生素类药物。但是这类药物在停药后一段时间内,在分泌的牛奶中仍有残留。使用抗生素残留超标的牛奶,不仅会给产品的生产带来影响,产品质量无法保障,而且对消费者的健康存在众多不利影响。国外很多国家都对不同种类抗生素的最大残留量(MRL)做了具体规定,明确要求抗生素残留超标的牛乳严禁收售。国内多数乳品企业对于不同程度抗生素残留超标的牛乳采取降价收购和拒收的原则。出于经济利益的驱动,为谋求经济利益,市场上出现了人为使用一些生物制剂去降解牛乳中残留抗生素的“无抗奶,即生产了“人造”无抗奶。从2005年至今就有数家公司公开出售分解牛乳中残留抗生素的酶制剂。市售的抗生素分解剂是一种黄色液体,其主要成份是青霉素酶,每瓶约4mL左右,在8℃-10℃条件下放置一晚或反应12小时,即可以使3-4吨有抗奶转变为“人造”无抗奶。
针对高浓度的抗生素药品,其分解产物的检测方法一般有高效液相色谱法,分光光度法;残留级的抗生素水解残留物的检测则至今未有相关报道。而且,液相色谱法或分光光度法都不利于在生产企业推广应用,设备成本大,检测费用高,对检测人员的要求也高,不利于在收奶和产品检测中推广应用。
由于残留在原料乳中的抗生素经牛奶分解剂作用后,仅仅是其内部β-内酰胺环的一个N-C键的断开,因而其抑菌特性依然存在。利用这个特性,在这种“人造”无抗乳中添加一定量的发酵剂,在43℃下恒温培养,一定时间后根据酸度的变化大小就可以判断出原料乳是否是“人造”无抗奶或产品。
由于乳制品中青霉素类抗生素酶解残留物的检测方法未见报道,为了确保原奶及其产品的质量和安全,本领域急需一种可以检测乳和乳制品中牛奶分解剂及抗生素水解残留物的方法。
发明内容
为了满足乳品企业及质量监控检测机构的需求,确保乳原料和乳制品的质量安全和消费者的健康,本发明人开发了一种抗生素水解残留物的检测方法,尤其是指乳制品中抗生素酶解残留物的检测方法,该方法能够有效地检测乳制品,尤其是乳中残留的兽药抗生素水解产物残留物。
本发明的目的在于提供一种原料乳及乳制品中抗生素水解残留物的检测方法,该方法采用残留物对发酵的影响来确认样品中是否含有的抗生素水解残留物,可以有效地检测乳和乳制品中残留的抗生素水解残留物,并可根据酸度的相对变化值来定量其浓度范围。
本发明提供了一种残留的抗生素水解产物的检测方法,其过程包括:将待测的乳制品和作为空白对照的无抗奶样品杀菌处理,优选用巴士杀菌法杀菌,冷却后加入发酵剂,测定其起始的发酵液pH值,然后在43℃下保温1小时,测定发酵液的pH值,计算发酵前后pH值的变化与无抗奶对照样变化值的差值,当差值大于等于0.03时,判定该样品为阳性样品,即其中含有抗生素水解残留物,为不合格的“人造”无抗奶。
上述乳制品包括液态乳制品和固态乳制品,液态乳制品包括液态的原奶和还原奶,固态乳制品包括奶粉等,若是固态乳制品则需要先用水还原成液态还原奶。
上述检测方法中采用的发酵剂为含有乳酸菌的发酵剂。
乳酸菌指发酵糖类,产生乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳酸发酵,而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、CO2等物质的称为异型乳酸发酵。乳酸菌从形态上分类主要有球状和杆状两大类,主要包括乳酸链球菌(Streptococceae)和乳酸杆菌(Lactobacilleae)。多数种可发酵乳糖,发酵后可将pH下降至6.0以下。乳酸杆菌中以乳酸杆菌属(Lactobacillus)最为重要。
本发明所用的发酵剂中含有的乳酸菌优选含有乳秆菌属、链球菌属任一或其组合的菌属的乳酸菌,链球菌属的乳酸菌优选嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus),乳秆菌属的乳酸菌优选保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)。
在本发明的优选实施例中,上述的发酵剂为含有嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)任一或其混合的乳酸菌的发酵剂;更优选为含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)的乳酸菌的工业发酵剂。
本发明所述的检测方法中所加入的发酵剂的量为0.2-0.8U/L,以待测的乳制品或作为空白对照样品为基数,即每升待测的样品溶液中加入0.2-0.8U/L,优选0.4-0.7U/L,更优选加入0.6U/L;其中,所述的U为发酵剂中菌的活力单位。
本发明所述的检测方法具体的步骤包括:
(1).样品的处理:
取待测的液态乳制品样品100ml,75℃以上(优选75-98℃)加热10min;
将杀菌后的样品冷却备用;
若样品为奶粉类固体或粉状样品时,称取10-15g固体或者粉末状样品,用去离子水溶解定容至100ml;
同时设置无抗奶为空白对照样品,按同样的上述方法处理待用;
(2).发酵:
在上述制备好的待测液态乳制品样品和空白对照样品中添加发酵剂,该发酵剂为含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)至少一种的乳酸菌的发酵剂,添加量约为0.4-0.7U/L,摇匀,测定发酵前的初始pH值;
然后将样品置入40-45℃恒温培养箱,发酵,取出冷却;
(3).测定pH值:
待测样品发酵结束后的pH值与发酵初始的pH之差,与空白对照样品的发酵结束后的pH值与发酵初始的pH之差,以二者之差是否大于0.03来判定该样品是否为曾经使用过抗生素的乳制品。
在本发明的优选实施例中,通过以下技术方案来实现本发明的目的:
1.样品的处理:
取待测的液态乳制品样品100ml,95℃加热10min;
将杀菌后的样品冷却到40℃-45℃之间备用;
若样品为奶粉类固体或粉状样品时,称取13g固体或者粉末状样品,用去离子水溶解定容至100ml;
同时设置无抗奶为空白对照样品,按同样的上述方法处理待用;
2.发酵:
在上述制备好的待测的液态乳制品样品和空白对照样品中添加发酵剂,例如是经过筛选的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)混合乳酸菌发酵剂YF-1,添加量约为0.6U/L,摇匀,测定发酵前的初始pH值;
然后将样品置入43℃恒温培养箱,发酵,优选0.5-2小时,更优选发酵1小时,取出冷却,终止发酵;
3.测定pH值:
待测样品发酵结束后的pH值与发酵初始的pH之差(pH2),与空白对照样品的发酵结束后的pH值与发酵初始的pH之差(pH1),pH1和pH2二者之差≥0.03时,即可判定该样品为阳性,即为“人造”无抗乳制品,即认为待测样品为人为添加牛奶抗生素分解剂分解抗生素的乳制品,也就是说,其为含有抗生素的原料乳或用含有抗生素的原料乳生产的乳制品。
用计算式表示为:
pH1=pH1-pH01(空白对照样品发酵前后pH值之差)
pH2=pH2-pH02(检测样品发酵前后pH值之差)
当ΔpH1-ΔpH2≥0.03时,判定为阳性样品,即待测乳制品为含有抗生素的乳制品。
上述步骤(2)中采用的发酵剂为含有的乳酸菌的发酵剂,该乳酸菌为含有乳秆菌属、链球菌属任一或其组合的菌属的乳酸菌。
在本发明的检测方法中,用于检测乳中抗生素的酶解产物,所述的抗生素包括β-内酰胺类(青霉素类和头孢类),四环素类(四环素、金霉素、土霉素等),氨基糖苷类(庆大霉素和链霉素等),氯霉素类,大环内酯类(红霉素和螺旋霉素等)。
本发明的方法可以检测的酶解产物的浓度下限为10ppb。
发明方法的原理是基于抗生素及水解残留物对微生物具有抑制作用,并利用乳酸菌对乳的发酵特性,选取特殊的乳酸菌对样品进行发酵处理,跟踪发酵过程,根据其发酵特性来判断样品中有无抗生素的水解残留物。该检测判定方法经济、简便、快捷、准确,适合乳品企业的原料奶质量安全控制和工业原料品质控制及产品安全控制。实用性非常强。
本发明的大量的筛选实验其中较有代表性和说服力的实验数据如下,均以业内普遍使用的青霉素类抗生素类为例:
1.发酵剂产酸能力的比较,选择最佳发酵剂:
选择目前国内、外市场上发酵快、产酸能力强的乳酸菌作为发酵剂,共选择六种不同的市售商品,其区别在于含有不同种类和不同组合的菌属,作为实验用乳酸菌发酵剂,通过对比一定时间内产酸量的多少,选出一定时间内产酸能力强的发酵剂。
方法:
①灭菌乳的制备:
取无抗奶于三角瓶中,114℃灭菌15min。冷却到45℃备用。
②样品的制备:
菌粉的添加方法:
称取0.04g菌粉,溶解于10ml灭菌乳中,充分混匀,取2.5mL接入250mL灭菌奶中。
按上述菌粉的添加方法向六个装有灭菌奶的三角瓶中依次接入所选发酵剂。之后于43℃恒温培养箱中培养。分别于0min、50min、110min、170min测试样品的pH值,从而确定不同发酵剂的产酸能力。
对比后可以看出代号为YF-1和G-061的发酵剂在1小时后表现出最强的和较强的产酸能力;YF-1和G-061均含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)至少一种。
2.产酸能力强的发酵剂对抗生素水解产物的感受性试验:
根据试验目的,应选择产酸能力强、且对抗生素水解产物敏感的发酵剂。即使用上一实验选出的两种产酸最强YF-1与G-061,进行感受性实验。因为本方法发明的意图就是要开发快速的检测方法,所以要选择在最短的时间内表现出最强的产酸性能的发酵剂。
方法:
①灭菌乳的制备:
取无抗奶于三角瓶中,114℃灭菌15min。冷却到45℃备用。
②青霉噻唑酸钾稀释液的配制:
精密称取2.5g青霉素钾于100mL容量瓶中,加入0.5mL(过量)抗生素分解剂后用去离子水定容后摇匀,室温放置4个小时,标记为稀释液①。取10ml稀释液①于100mL容量瓶中,定容后摇匀,标记为稀释液②。取1mL稀释液②于100mL容量瓶中,用去离子水定容后摇匀,标记为稀释液③,其浓度为25mg/L。
③样品的制备:
菌粉的添加方法:
称取0.04g菌粉,溶解于10mL灭菌乳中,充分混匀,取2.5mL接入250mL灭菌奶中。
阴性样品的制备:
将YF-1与G-061及对照(以L-812为代号)三种发酵剂按上述菌粉的添加方法分别接入到灭菌乳中,作为阴性对照。
阳性样品的制备:
将YF-1与G-061及对照(以L-812为代号)三种发酵剂按上述方法分别接入到灭菌乳中,再分别向其中添加1ml稀释液③。三个样品中的青霉噻唑酸钾浓度均为100μg/L。分别标记。由得出的数据曲线可以看出,YF-1对抗生素水解产物的感受性强于G-061和L812。该YF-1为同时含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)的发酵剂。
3.最佳接种量试验:
分别向灭菌奶中添加接种量为标准推荐量(0.2U/L)的1倍、2倍、3倍的YF-1,用对照样与标准推荐量试验组,进行发酵试验(43℃下发酵1小时),以确定最快速发酵的发酵剂使用剂量。
方法:
(1)灭菌乳的制备:
取无抗奶于三角瓶中,114℃灭菌15min。冷却到45℃备用。
(2)青霉噻唑酸钾稀释液的配制:
精密称取1.00g青霉素钾于100mL容量瓶中,加入0.5mL抗生素分解剂后用去离子水定容后摇匀,室温放置4小时后标记为稀释液①。取10mL稀释液①于100mL容量瓶中,定容后摇匀,标记为稀释液②。取1mL稀释液②于100ml容量瓶中,用去离子水定容后摇匀,标记为稀释液③。取1mL稀释液③于10mL容量瓶中,用去离子水定容后摇匀,标记为稀释液④。
精密称取2.50g青霉素钾于100mL容量瓶中,加入0.5mL抗生素分解剂后用去离子水定容后摇匀,室温放置4小时后标记为稀释液⑤。取10mL稀释液⑤于100mL容量瓶中,定容后摇匀,标记为稀释液⑥。取1mL稀释液⑥于100ml容量瓶中,用去离子水定容后摇匀,标记为稀释液⑦,其浓度为25mg/L。
(3)样品的制备:
阴性对照样的制备:
分别称取其他发酵剂0.04g(0.2U)、0.08g(0.4U)、0.12g(0.6U)溶解于10mL灭菌乳中,充分混匀,取2.5mL接入250mL灭菌奶中。由得出的数据曲线可以看出,YF-1发酵剂在0.6U/L的添加量时发酵速度最快。
4.方法有效性的验证:
样品:如下表所示:0-6为自配浓度从10ppm至100ppb的添加抗生素水解残留物样品,B为对照空白组。
样品用95℃,10min杀菌后,接种YF-1发酵剂,测定并记录初始的pH值。置入43℃恒温培养箱发酵60min。起始pH值为6.67。
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | B |
1000ppm | 50ppm | 10ppm | 0ppm | 1ppm | 100ppb | 10ppb | 0 |
6.55 | 6.53 | 6.51 | 6.50 | 6.49 | 6.48 | 6.47 | 6.44 |
实验结果:接菌种量为0.6U/L最佳,本领域技术人员均可以推测并且实验证明(本发明已经有实验数据来证实)0.55-0.65U/L,以及0.4-0.7U/L、甚至0.2-0.8U/L也可以实现本发明。
1)发酵前后pH、值的变化:
6.67-6.55=0.12
6.67-6.53=0.14
6.67-6.51=0.16
6.67-6.50=0.17
6.67-6.49=0.18
6.67-6.48=0.19
6.67-6.47=0.20
B.6.67-6.44=0.23
2)对照样pH变化量与待检样pH变化量的差值:
0)B-0=0.23-0.12=0.11
1)B-1=0.23-0.14=0.09
2)B-2=0.23-0.16=0.07
3)B-3=0.23-0.17=0.06
4)B-4=0.23-0.18=0.04
5)B-5=0.23-0.19=0.04
6)B-6=0.23-0.20=0.03
3)判定结果:0-6号样中均含有抗生素水解残留物且最小检测浓度为10ppb。
上述本发明的检测方法可以定性乳或乳制品中是否含有残留的抗生素酶解残留物,对原料乳和乳制品的品质安全检测提供可靠的依据,对于乳品企业控制原奶质量提供强有力的检测手段和方法,使当前不法奶站对原奶做手脚等现象得到完全控制,对于出口奶粉的安全性检测提供有力的方法支持。该方法具有样品前处理简单、快速、定性准确、重复性好的特点,方法简便,对操作无特殊要求,易于推广。
具体实施方式
以下结合实施例详细说明本发明,但不限定本发明的实施范围。
本发明用于检测乳中抗生素的酶解产物,所述的抗生素包括β-内酰胺类(青霉素类和头孢类),四环素类(四环素、金霉素、土霉素等),氨基糖苷类(庆大霉素和链霉素等),氯霉素类,大环内酯类(红霉素和螺旋霉素等),在本发明的下述实施例中,均以业内普遍使用的青霉素类抗生素类为例。
实施例1:
以牛奶为待测产品。
1.样品的处理:
取待测的牛奶样品100ml,95℃加热10min;
将杀菌后的样品冷却到40℃-45℃之间备用;
同时设置无抗奶为空白对照样品,按同样的上述方法处理待用;
2.发酵:
在上述制备好的待测的液态乳制品样品和空白对照样品中添加0.6U/L的YF-1发酵剂,摇匀,测定发酵前的初始pH值;所述的YF-1发酵剂为含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)的发酵剂,由科汉森(CHR Hansen)公司提供。
然后将样品置入43℃恒温培养箱,发酵1小时,取出冷却,终止发酵;
3.测定pH值:
待测样品发酵结束后的pH值与发酵初始的pH之差(pH2),与空白对照样品的发酵结束后的pH值与发酵初始的pH之差(pH1),pH2和pH1二者之差≥0.03时,即可判定该样品为“人造无抗乳制品”,即认为待测样品为人为添加牛奶抗生素分解剂分解抗生素的乳制品,也就是说,其为曾经使用过抗生素乳制品。
实施例2:
以奶粉为待测产品。
1.样品的处理:
称取13g固体或者粉末状样品,用去离子水溶解定容至100ml(还原乳);
取待测的还原乳样品100ml,95℃加热10min;
将杀菌后的样品冷却到40℃-45℃之间备用;
同时设置无抗奶为空白对照样品,按同样的上述方法处理待用;
2.发酵:
在上述制备好的待测的样品和空白对照样品中添加0.6U/L的含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的发酵剂,摇匀,测定发酵前的初始pH值;
然后将样品置入43℃恒温培养箱,发酵1小时,取出冷却,终止发酵;
3.测定pH值:
待测样品发酵结束后的pH值与发酵初始的pH之差(pH2),与空白对照样品的发酵结束后的pH值与发酵初始的pH之差(pH1),pH2和pH1二者之差≥0.03时,即可判定该样品为人为添加牛奶抗生素分解剂分解抗生素的乳制品,也就是说,其为曾经使用过抗生素乳制品。
实施例3:
以牛奶为待测产品。
1.样品的处理:
取待测的牛奶样品100ml,95℃加热10min;
将杀菌后的样品冷却到40℃-45℃之间备用;
同时设置无抗奶为空白对照样品,按同样的上述方法处理待用;
2.发酵:
在上述制备好的待测的样品和空白对照样品中添加0.6U/L的含有保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)的发酵剂,摇匀,测定发酵前的初始pH值;
然后将样品置入43℃恒温培养箱,发酵1小时,取出冷却,终止发酵;
3.测定pH值:
待测样品发酵结束后的pH值与发酵初始的pH之差(pH2),与空白对照样品的发酵结束后的pH值与发酵初始的pH之差(pH1),pH2和pH1二者之差≥0.03时,即可判定该样品为人为添加牛奶抗生素分解剂分解抗生素的乳制品,也就是说,其为曾经使用过抗生素乳制品。
实施例1的同时含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)的发酵剂对抗生素水解产物的感受性强于实施例2和3所采用的发酵剂。
实验证明,无论是液态奶还是固态奶(例如奶粉、奶酪或者奶片),只要曾经加入过抗生素并且试图用酶解的方式掩盖抗生素的存在,即使酶解产物的量很小(痕量),采用本发明的方法也完全可以检测出乳和乳制品中是否添加过抗生素,从源头上确保了乳和乳制品及其进一步的加工产品的质量安全。
Claims (10)
1. 一种残留的抗生素水解产物的检测方法,其特征在于,该方法包括:将待测的乳制品和作为空白对照的无抗奶样品杀菌、冷却后加发酵剂,加入的量为0.2-0.8U/L,测定其起始的发酵液pH值,然后在40-45℃下恒温培养1小时,测定发酵液的pH值,计算样品发酵前后pH值的变化与无抗奶对照样发酵前后的变化的差值。
2. 如权利要求1所述的检测方法,其中,所述的方法中采用的乳制品包括液态乳制品和固态乳制品。
3. 如权利要求2所述的检测方法,其中,所述的方法中采用的液态乳制品包括液态的原奶和还原奶,固态乳制品包括奶粉。
4. 如权利要求1所述的检测方法,其中,所述的方法中采用的发酵剂为含有乳酸菌的发酵剂。
5. 如权利要求4所述的检测方法,其中,所述的方法中采用的发酵剂中含有的乳酸菌为乳秆菌属、链球菌属任一或其组合的菌属的乳酸菌。
6. 如权利要求4所述的检测方法,其中,所述的链球菌属的乳酸菌为嗜热链球菌,乳秆菌属的乳酸菌为保加利亚乳杆菌。
7. 如权利要求1所述的检测方法,其中,所述的方法中所加入的发酵剂的量为0.4-0.7U/L;该U为菌的活力单位,该L为待测的乳制品或空白对照样品的容积单位。
8. 如权利要求1所述的检测方法,其中,该方法包括:
(1).样品的处理:
取待测的液态乳制品样品100ml,95℃以上加热10min;
将杀菌后的样品冷却到40℃-45℃之间备用;
若样品为奶粉类固体或粉状样品时,称取10-15g固体或者粉末状样品,用去离子水溶解定容至100ml;
同时设置无抗奶为空白对照样品,按同样的上述方法处理待用;
(2).发酵:
在上述制备好的待测的液态乳制品样品和空白对照样品中添加发酵剂,摇匀,测定发酵前的初始pH值;
然后将样品置入43℃恒温培养箱,发酵,取出冷却;
(3).测定pH值:
待测样品发酵结束后的pH值与发酵初始的pH之差,与空白对照样品的发酵结束后的pH值与发酵初始的pH之差,以二者之差是否大于0.03来判定该样品是否为曾经使用过抗生素的乳制品。
9. 如权利要求8所述的检测方法,其中,所述的方法步骤(2)中采用的发酵剂为含有的乳酸菌的发酵剂,该乳酸菌为含有乳秆菌属、乳酸链球菌属任一或其组合的菌属的乳酸菌。
10. 如权利要求1所述的检测方法,其中,该残留的抗生素水解产物包括β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、氯霉素类和/或大环内酯类。
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CN104628164B (zh) * | 2013-11-11 | 2016-05-25 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种杀菌缓蚀剂用组合物及其应用 |
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- 2008-06-24 CN CN2008101318124A patent/CN101307349B/zh active Active
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吕秀芳 等.《微生物法在原料奶验收中的应用》.《中国乳品工业》.2004,第32卷(第7期),全文. |
吕秀芳等.《微生物法在原料奶验收中的应用》.《中国乳品工业》.2004,第32卷(第7期),全文. * |
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CN104628164B (zh) * | 2013-11-11 | 2016-05-25 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种杀菌缓蚀剂用组合物及其应用 |
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