CN101307302B - 分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺 - Google Patents

Abstract

一种分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺，其取含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA，注射至小白鼠的骨骼肌进行DNA免疫，1～4周后，进行人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫，2～5天后，取免疫小白鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合。进行抗体检测，对抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化，至获得可分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆的杂交瘤细胞株。本发明解决了背景技术中特异性差、免疫周期长以及效率低的技术问题。本发明免疫原性质明确，纯度高，非特异反应少，抗原用量少，全程免疫仅需6～8周。

Description

分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺

技术领域

本发明涉及一种杂交瘤细胞的制备工艺，具体涉及一种可分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺。

背景技术

人天冬酰胺羟化酶(HAAH)为α-酮戊二酸依赖双氧酶，其主要的生物学功能是参与蛋白质合成过程中翻译后的蛋白修饰，可催化多种蛋白中含有表皮生长因子(EGF)样结构域内的天门冬氨酸和天门冬酰胺残基的β-碳原子羟基化。

含有表皮生长因子样结构域的蛋白包括Notch及其配体、凝血因子以及其它具有重要生物学功能的蛋白，其中Notch及其类似分子与细胞分化有关，特别是其胞内区与致瘤性密切相关，因此，人天冬酰胺羟化酶与肿瘤的关系引起了科学家的关注，初步的研究结果显示人天冬酰胺羟化酶可在胆管癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌中高表达，而正常组织不表达或仅仅是弥散性弱表达。人天冬酰胺羟化酶的作用机制目前还不完全清楚，现有的结果显示人天冬酰胺羟化酶是受胰岛素和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)调节的基因，Erk MAPK和AKT/PKB通路均参与对其表达的调节。在肝癌细胞系中表达可传递胰岛素或胰岛素样生长因子-1信号的1型胰岛素受体底物(insulin-receptor substrate，type1，IRS-1)可增强人天冬酰胺羟化酶的表达，增强细胞的迁移性以及侵袭性，而表达羟基末端缺失型的1型胰岛素受体底物或表达人天冬酰胺羟化酶的小干扰RNA(siRNA)均可降低人天冬酰胺羟化酶的表达以及降低细胞的迁移性和侵袭性。胰岛素和胰岛素样生长因子-1可在神经母细胞瘤细胞系SH-Sy5y中也可诱导人天冬酰胺羟化酶表达以及增强细胞的迁移性，Erk MAPK、AKT和CDK-5抑制剂则可抑制胰岛素样生长因子-1诱导的人天冬酰胺羟化酶表达以及抑制胰岛素样生长因子-1诱导的迁移性增强。人天冬酰胺羟化酶在肿瘤细胞表面的表达，使得瘤细胞的运动性和扩散性显著地增加，并通过血管和淋巴高管扩散到临近的正常组织，最终引起肿瘤的恶性转化和肿瘤病灶的形成，并成为恶性肿瘤高特异性的分子标记物。

Lavaissier等在1996年用肝细胞性肝癌(HCC)细胞系FOCUS作为免疫源获得单克隆抗体(mAb)FB-50，单克隆抗体FB-50可与可与原代肝细胞性肝癌、转化细胞系以及肝细胞性肝癌细胞系高度结合，用单克隆抗体FB-50筛选HepG2细胞的cDNA文库获得的cDNA，经检测分析，确认为人天冬酰胺羟化酶基因。Ince等在2000年报道，用人天冬酰胺羟化酶编码基因转染NIN—3T3细胞，发现人天冬酰胺羟化酶在NIH-3T3细胞中过表达，可使细胞表型产生恶性转化，将这种细胞接种到裸鼠体内可形成肿瘤，而接种正常细胞无肿瘤形成。报告中数据显示，人胆管癌细胞人天冬酰胺羟化酶基因表达阳性率达100％，因其他疾病引起的胆管增生细胞中未检测到人天冬酰胺羟化酶基因的表达。Sepe等在2002年报道，人天冬酰胺羟化酶在人原发型恶性神经外胚层瘤，包括成神经管细胞瘤和神经母细胞瘤过表达，而在正常成熟的脑中人天冬酰胺羟化酶低水平表达或不能检出。Palumb等在2002年，对近千例、18种不同恶性肿瘤标本进行检测，其中99％人天冬酰胺羟化酶阳性。使用抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体(mAb)检测胰腺癌细胞，18例/19例阳性，而临近正常胰腺组织均为阴性。Takashi等2003年在NIH基金支持下研究证实，人天冬酰胺羟化酶过度表达会促进肿瘤细胞渗透性生长，特异性的反义寡DNA可显著抑制人天冬酰胺羟化酶表达并抑制胆管癌细胞的活性。2004年Takashi等报道在50例肝内胆管癌(ICCs)标本中46例人天冬酰胺羟化酶表达阳性，占92％；12例正常肝细胞和12例原发性硬化型胆管炎标本人天冬酰胺羟化酶均为阴性。结论为，人天冬酰胺羟化酶是与肿瘤基因表型相关的关键调节蛋白，在调节肝细胞性肝癌细胞的扩散和迁徙中起重要调节作用，人天冬酰胺羟化酶表达水平高，病人预后差。Feldmann等在2006年用实时定量PCR检测了11例胆管癌和5例良性胆管狭窄患者(阴性对照组)标本人天冬酰胺羟化酶及其同源异型框B7(HoxB7)mRNA水平，结果显示：检测敏感性达82％，特异性80％，常规细胞学方法检测特异性虽高达100％，但检测敏感性仅36％。作者认为人天冬酰胺羟化酶和HoxB7mRNA检测为胆管癌的诊断提供了非常有价值的工具。到目前为止，已在在多种肿瘤细胞中检测到人天冬酰胺羟化酶基因的高表达。Suzanne等在2006年研究了人天冬酰胺羟化酶在肝细胞性肝癌细胞系细胞和Hep-G2中的表达调控机理，发现胰岛素和胰岛素样生长因子-1通过MAPK和IP3激酶-Akt途径刺激人天冬酰胺羟化酶mRNA和人天冬酰胺羟化酶蛋白的表达，过表达的人天冬酰胺羟化酶显著增加Hep-G2细胞的运动性和扩散性。用特异性siRNA抑制人天冬酰胺羟化酶基因表达可显著地减小肝细胞性肝癌细胞系细胞的定向运动性，他们认为人天冬酰胺羟化酶是体内调节肿瘤细胞生长的一个重要靶点。Wang等在2007年报道，对130例II期结肠癌患者标本的人天冬酰胺羟化酶和截断的人天冬酰胺羟化酶(Humbug)水平做免疫组化和实时定量RT-PCR检测，结果显示人天冬酰胺羟化酶表达阳性为84％，截断人天冬酰胺羟化酶表达阳性达94％。作者认为，做为结肠癌预后诊断分子标志物，截断人天冬酰胺羟化酶(Humbug)比完整的人天冬酰胺羟化酶特异性更好。

国内外研究进展表明：人天冬酰胺羟化酶做为一种肿瘤相关抗原，与恶性肿瘤细胞的形成具有显著相关性，作为恶性肿瘤标志分子，人天冬酰胺羟化酶的优越性表现在：①与多种肿瘤相关，是一种特殊的广谱性肿瘤相关抗原，已确定至少在18种恶性肿瘤组织细胞中被检出；②人天冬酰胺羟化酶与肿瘤的增生、侵入及转移有着密切的相关性，人天冬酰胺羟化酶检测对肿瘤的诊断具有很高的特异性，具有确诊的意义；③人天冬酰胺羟化酶的表达，出现在细胞癌前病变期，检测疑似肿瘤病理切片标本中人天冬酰胺羟化酶表达情况，不仅有早期诊断的作用，而且可对癌变部位准确定位；④过表达的人天冬酰胺羟化酶可以从细胞膜表面脱落，以可溶性、游离状态存在于人血清和体液中，通过检测血清中人天冬酰胺羟化酶滴度，可对恶性肿瘤做筛查；⑤人天冬酰胺羟化酶是一种酶，抑制其酶活性可以有效地抑制肿瘤细胞的生长，这种抑制效果的强度远远大于对其它肿瘤相关抗原的抑制，并且具有广谱性，因此人天冬酰胺羟化酶有望成为抗肿瘤治疗药物的新靶点。

Lavaissier等在1996年制备抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的主要技术路线如下：收集肝细胞性肝癌(HCC)细胞系(FOCUS)→调节细胞密度为4×10⁶→腹腔接种Balb/c小白鼠→间隔6～10周后做第二次、第三次追加免疫→细胞融合前小鼠尾静脉注射200μl密度为4×10⁶肝细胞性肝癌(HCC)细胞系(FOCUS)的细胞→3天后→取小鼠脾细胞与NS1小鼠骨髓瘤细胞做细胞融合。以什么抗原，如何进行阳性细胞的筛选和克隆化文中未作介绍。结果获得了1株可分泌抗人天冬酰胺羟化酶的杂交瘤细胞株FB—50。该方法存在的不足之处如下：

1.特异性差。在细胞表面有多种膜蛋白，人天冬酰胺羟化酶只是其中的一种，而且丰度不高，以完整细胞做免疫原，免疫血清中特异性抗体的比例和滴度均不高，获得阳性细胞克隆的几率会大大减少，并会大大增加后期阳性细胞筛选和克隆化的工作量。

2.免疫周期长。由于选用细胞为免疫原，完成全程免疫需用18—30周时间。

3.抗原用量大。

4.效率低。历时数月仅获得1株阳性细胞克隆。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺，其解决了背景技术中特异性差、免疫周期长以及效率低的技术问题。

本发明的技术解决方案是：

一种分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺，包括以下实现步骤：

(i)取含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA；

(ii)进行DNA免疫：将含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA注射至小白鼠的骨骼肌，注射剂量为10～200μg/50～200μl/只；

(iii)进行人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫：进行DNA免疫后1～4周，用人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫小白鼠，免疫剂量为10～1000μg/10～1000μg/只；

(iv)进行细胞融合：人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫后2～5天，取免疫小白鼠的脾细胞与免疫或非免疫小白鼠的骨髓瘤细胞进行细胞融合；

(v)进行抗体检测：以重组表达的人天冬酰胺羟化酶为检测抗原，用免疫化学法对细胞融合后的细胞培养上清进行抗体检测；

(vi)对抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化，至获得可分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆的杂交瘤细胞株。

上述人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫1～4周后，可复步骤(iii)进行追加免疫。

上述含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA的纯度以1.6≤OD260nm/OD280nm≤1.8为佳。

上述含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA的载体可采用pCDNA系列、pCMV系列、pCI-S、pMEP4-S或pLXSN-S等。

上述对抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化的次数一般为2次以上。

上述进行DNA免疫的注射剂量以100μg/100μl/只为宜；上述进行人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫以在DNA免疫后2周为宜；上述进行DNA免疫的注射剂量以100μg/100μl/只为宜；上述进行细胞融合以在人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫后3天为宜。

上述进行抗体检测的免疫化学法可采用ELISA间接法、免疫组化染色法或western-blot法等，以采用ELISA间接法为佳。

上述免疫小白鼠可采用Balb/c、X63或NS-等小鼠品系。上述将含人天冬酰胺羟化酶编码基因的重组真核表达质粒DNA注射至小白鼠的骨骼肌，以小白鼠的后肢股四头肌为最佳。上述人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫小白鼠的方法可采用颈背部多点注射法、腹股沟包埋法、脾内注射法或脾内包埋法等。上述追加免疫的注射部位可以是免疫小白鼠的腹腔、颈背部、腹股沟、脾内或尾静脉等。

一种分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺，包括以下实现步骤：

(i)取含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA；

(ii)进行DNA免疫：将含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA注射至小白鼠的骨骼肌，注射剂量为10～200μg/50～200μl/只；

(iii)进行细胞融合：进行DNA免疫后2～5天，取免疫小白鼠的脾细胞与免疫或非免疫小白鼠的骨髓瘤细胞进行细胞融合；

(iv)进行抗体检测：以重组表达的人天冬酰胺羟化酶为检测抗原，用免疫化学法对细胞融合后的细胞培养上清进行抗体检测；

(v)对抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化，至获得可分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆的杂交瘤细胞株。

一种分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺，包括以下实现步骤：

(i)取人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫；

(ii)进行人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫：用人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫小白鼠，免疫剂量为10～1000μg/10～1000μg/只；

(iii)进行细胞融合：人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫后2～5天，取免疫小白鼠的脾细胞与免疫或非免疫小白鼠的骨髓瘤细胞[Sp2/0]进行细胞融合；

(iv)进行抗体检测：以重组表达的人天冬酰胺羟化酶为检测抗原，用免疫化学法对细胞融合后的细胞培养上清进行抗体检测；

(v)对抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化，至获得可分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆的杂交瘤细胞株。

本发明具有以下优点：

1.免疫效果好：使用纯化pCDNA-人天冬酰胺羟化酶重组真核表达质粒和重组人天冬酰胺羟化酶蛋白为免疫原，免疫原性质明确，纯度高，非特异反应少，免疫小鼠后刺激产生的特异血清抗体滴度高达1×10⁵。

2.免疫周期短：完成全程免疫仅需6～8周。

3.抗原用量少：所用免疫原的量为μg级，有利于节约实验成本。

4.效率高：在无阳性参照的情况下，第一次实验就成功的获得了3株可分泌特异性抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

附图说明

图1为本发明实时定量PCR检测结果图。

图2为本发明RT—PCR检测结果图。

图3为本发明乳腺癌患者病理切片的免疫组检测结果图。

图4为本发明肝癌患者病理切片的免疫组检测结果图。

图5为本发明肾癌患者病理切片的免疫组检测结果图。

图6为本发明神经胶质瘤患者病理切片的免疫组检测结果图。

具体实施方式

本发明采用质粒DNA免疫与重组蛋白免疫进行联合免疫效果最佳，具体实现步骤如下：

(i)取含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA。含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA的载体可采用pCDNA系列、pCMV系列、pCI-S、pMEP4-S或pLXSN-S等。含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA的纯度以1.6≤OD260nm/OD280nm≤1.8为佳。

(ii)进行DNA免疫：将含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA注射至小白鼠的骨骼肌，以注射至小白鼠的后肢股四头肌为最佳。注射剂量为10～200μg/50～200μl/只。DNA免疫可采用注射器或基因枪，注射剂量以100μg/100μl/只为佳。免疫小白鼠具体采用Balb/c、X63或NS-1小鼠品系等均可。

(iii)进行人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫：进行DNA免疫后1～4周，一般以2周为宜，用人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫小白鼠，免疫剂量为10～1000μg/10～1000μg/只，免疫剂量以100μg/100μl/只为佳。人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫小白鼠的方法可采用颈背部多点注射法、腹股沟包埋法、脾内注射法或脾内包埋法等。

人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫视免疫小白鼠血清抗体效价的检测结果，1～4周后，可复步骤(iii)进行追加免疫。追加免疫的注射部位可以是免疫小白鼠的腹腔、颈背部、腹股沟、脾内或尾静脉等。

(iv)进行细胞融合：人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫，即末次免疫后2～5天，一般以3天为宜，取免疫小白鼠的脾细胞与免疫或非免疫小白鼠的骨髓瘤细胞进行细胞融合。骨髓瘤细胞如Sp2/0等。

(v)进行抗体检测：以重组表达的人天冬酰胺羟化酶为检测抗原，用免疫化学法对细胞融合后的细胞培养上清进行抗体检测。进行抗体检测的免疫化学法以采用ELISA间接法为佳，也可采用免疫组化染色法或western-blot法等。

(vi)对抗体检测呈阳性的细胞进行2次以上克隆化，至获得可分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆的杂交瘤细胞株。

本发明仅采用质粒DNA免疫，较之采用质粒DNA免疫与重组蛋白免疫进行联合免疫，小白鼠血清特异性抗体滴度较低，小白鼠血清抗体一般为1:80～640。具体实现步骤如下：

(i)取含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA。

(ii)进行DNA免疫：将含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA注射至小白鼠的骨骼肌，注射剂量为10～200μg/50～200μl/只。

(iii)进行细胞融合：进行DNA免疫，即末次免疫后2～5天，取免疫小白鼠的脾细胞与免疫或非免疫小白鼠的骨髓瘤细胞进行细胞融合；

(iv)进行抗体检测：以重组表达的人天冬酰胺羟化酶为检测抗原，用免疫化学法对细胞融合后的细胞培养上清进行抗体检测。

(v)对抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化，至获得可分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆的杂交瘤细胞株。

本发明仅采用人天冬酰胺羟化酶重组蛋白免疫，较之采用质粒DNA免疫与重组蛋白免疫进行联合免疫，在细胞融合中阳性细胞容易丢失。具体实现步骤如下：

(i)取人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫。

(ii)进行人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫：用人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫小白鼠，免疫剂量为10～1000μg/10～1000μg/只；

(iii)进行细胞融合：人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫，即末次免疫后2～5天，取免疫小白鼠的脾细胞与免疫或非免疫小白鼠的骨髓瘤细胞进行细胞融合。

(iv)进行抗体检测：以重组表达的人天冬酰胺羟化酶为检测抗原，用免疫化学法对细胞融合后的细胞培养上清进行抗体检测。

(v)对抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化，至获得可分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆的杂交瘤细胞株。

用本发明所制备的抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体(mAb)，建立免疫组化染色、红外显色蛋白印迹实验以及实时定量PCR实验，从基因、蛋白和细胞三个水平对多种肿瘤组织和癌细胞中的人天冬酰胺羟化酶定性与定量检测，主要实验结果如下：

图1为本发明实时定量PCR检测结果。

Sample                     C(t)

1.人乳腺癌细胞             21.22

2.人肾腺癌细胞             22.62

3.人肾腺癌细胞             27.88

4.人肝癌细胞               30.53

5.小鼠胚胎成骨细胞         31.92

6.对照                     31.38

7.人膀胱癌细胞             35.00

图2为本发明RT—PCR检测结果。样本依次为：人肾腺癌细胞、人乳腺癌细胞、人肾腺癌细胞、人膀胱癌细胞、人肝癌细胞。两个泳道，单数为β-actin扩增产物，双数为人天冬酰胺羟化酶扩增产物。图3～6分别为本发明乳腺癌、肝癌、肾癌、神经胶质瘤患者病理切片的免疫组化检测结果。

Claims (6)

1.一种分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺，包括以下实现步骤：

(i)进行细胞融合：取免疫小白鼠的脾细胞与免疫或非免疫的小白鼠的骨髓瘤细胞进行细胞融合；所述脾细胞取自经以下1)、2)、3)、4)步骤得到的免疫小白鼠：

1)取含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA；

2)进行DNA免疫：将含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA注射至小白鼠的骨骼肌，注射剂量为10～200μg/50～200μl/只；

3)进行人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫：进行DNA免疫后1～4周，用人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫小白鼠，免疫剂量为10～1000μg/10～1000μg/只；

4)人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫后2～5天；

(ii)进行抗体检测：以重组表达的人天冬酰胺羟化酶为检测抗原，用免疫化学法对细胞融合后的细胞培养上清进行抗体检测；

(iii)对抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化，至获得可分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆的杂交瘤细胞株。

2.根据权利要求1所述的分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺，其特征在于：所述的含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA的纯度为1.6≤OD260nm/OD280nm≤1.8。

3.根据权利要求2所述的分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺，其特征在于：所述的含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA的载体包括pCDNA系列、pCMV系列、pCI-S、pMEP4-S或pLXSN-S。

4.根据权利要求3所述的分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺，其特征在于：所述的对抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化的次数为2次以上。

5.一种分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺，包括以下实现步骤：

(i)进行细胞融合：取免疫小白鼠的脾细胞与免疫或非免疫的小白鼠的骨髓瘤细胞进行细胞融合；所述脾细胞取自经以下1)、2)、3)步骤得到的免疫小白鼠：

1)取含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA；

2)进行DNA免疫：将含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA注射至小白鼠的骨骼肌，注射剂量为10～200μg/50～200μl/只；

3)进行DNA免疫后2～5天；

(ii)进行抗体检测：以重组表达的人天冬酰胺羟化酶为检测抗原，用免疫化学法对细胞融合后的细胞培养上清进行抗体检测；

(iii)对抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化，至获得可分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆的杂交瘤细胞株。

6.一种分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺，包括以下实现步骤：

(i)进行细胞融合：取免疫小白鼠的脾细胞与免疫或非免疫的小白鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行细胞融合；所述脾细胞取自经以下1)、2)、3)步骤得到的免疫小白鼠：

1)取人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫；

2)进行人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫：用人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫小白鼠，免疫剂量为10～1000μg/10～1000μg/只；

3)人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫后2～5天；

(ii)进行抗体检测：以重组表达的人天冬酰胺羟化酶为检测抗原，用免疫化学法对细胞融合后的细胞培养上清进行抗体检测；

(iii)对抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化，至获得可分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆的杂交瘤细胞株。

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