CN101307300A - 一种用来进行植物蛋白发酵的乳酸杆菌、筛选方法及其在固体发酵中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用来进行植物蛋白发酵的乳酸杆菌、筛选方法及其在固体发酵中应用，用这种方法分离的保藏号为CGMCC No.2426的乳酸杆菌菌株，该菌株既用于脱除植物蛋白中的大豆凝集素、胰蛋白酶抑制因子、棉酚等的抗营养因子，又可以作为益生菌进入动物体内，并长期存活，对动物生长发育起有益作用。

Description

一种用来进行植物蛋白发酵的乳酸杆菌、筛选方法及其在固体发酵中的应用

技术领域

本发明涉及一种用来进行植物蛋白发酵的乳酸杆菌、筛选方法及其固体发酵中的应用，属于微生物发酵领域。

背景技术

我国是世界上最大的养殖生产国之一，同时也是世界上饲料原料特别是蛋白质原料的需求大国。我国饲料工业生产中蛋白质饲料资源的严重不足已成为事实，对国际原料市场强大的依赖性，导致我国配合饲料的生产成本居高不下，价格波动使生产企业处于亏损的边缘，抑制了饲料工业的发展。饲料蛋白作为第一大和第一重要的原料是制约我国畜牧业发展的第一大权重因子，主控权受制于国外，因此饲料蛋白成为我国畜牧业发展的第一大原料供给瓶颈和食物供给安全瓶颈，饲料蛋白资源的开发具有重要的经济意义，更具有重要的国家安全意义。我国饲料工业的发展，对植物性蛋白原料需求不断增加，而我国长江、黄河中下游和新疆地区为棉花主产区，每年可提供约600万吨棉籽，是我国饲料蛋白质重要的来源之一。棉籽(饼)粕是棉籽去油后的一种加工副产品，它是一种常用的高蛋白质饲料，其蛋白质含量可达38％～46％，年产量可达400万吨以上，占我国年产各种饼粕总量的12％左右。棉籽粕中含有棉酚、环丙烯脂肪酸、植酸等抗营养因子，其中棉酚对动物危害性最大，因而最受大家关注。世界上每年的每年棉籽产量在4400万吨左右，而我国的棉籽总量为950～1100万吨，因而对棉籽进行深加工综合开发，不仅可以有效地缓解植物蛋白的供需矛盾，也可使棉籽油、棉酚和棉籽壳在食品、医药、化工等领域被广泛使用，随着开发的深入，其应用前景十分广阔。

我国是全球头号产棉大国，棉籽资源非常丰富。产量约占世界总产量的1/4。我国的主要产棉地有山东、新疆、江苏、湖北、河北、安徽、湖南和河南等省。棉籽是与棉花纤维分开后未加工的、纯的含油种子，棉籽蛋白是从棉籽中提取的一种植物蛋白，主要有棉粕、棉籽饼、棉籽蛋白粉等形式，经压榨处理的棉籽称为棉籽饼，溶剂浸提的称为棉籽粕。棉籽(饼)粕的营养价值随棉花的品种、种植环境、是否去壳及榨油的工艺不同而不同。其蛋白质含量在35％以上，另外棉籽蛋白中含有毒性物质-游离棉酚和环丙烯类脂肪酸等抗营养因子，是限制棉籽(饼)粕利用的主要因素，因此棉籽脱酚是当前研究的热点。

目前常用的脱酚方法为采用有机溶剂对棉籽蛋白进行萃取，如申请号为200610115230的中国专利，采用6号溶剂油和乙醇分别浸出，得到脱酚的棉籽蛋白。但是额外加入的有机溶剂增加了成本。

此外，也可采用微生物发酵的方法将棉粕中的棉酚转化为其他物质，达到脱毒的目的。钟英长(1989)等从自然界霉变棉籽饼中，分离筛选出对棉酚有耐受能力的霉菌，接种在棉籽中发酵，脱毒率达60％～75％，总脱毒率在80％以上，并使棉仁饼和棉籽饼的蛋白质分别提高5.18％和5.75％，氨基酸含量分别提高7.14％和21.9％。在此基础上研制的微生物固态菌种发酵脱毒法，具有脱毒率高，发酵时间短，投资小，成本低，工艺简单，发酵过程能增加生物活性物质，改善营养及适口性等特点。

但是上述方法所采用的微生物如霉菌等脱酚的棉籽蛋白可能对动物有不利的影响。

可见采用微生物发酵的方法对棉籽蛋白进行脱毒的关键在于菌种的选择和发酵工艺的控制。

本发明是以有益乳酸杆菌为发酵菌种，对棉籽蛋白进行发酵，采用符合我国国情的固态发酵法进行规模化生产；不仅提高经济效益，同时也保护生态环境，推动我国畜牧业持续、健康、稳定地发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用来进行植物蛋白发酵的乳酸杆菌，该菌株既可以使用于脱除植物蛋白中的抗营养因子，又可以作为益生菌进入动物体内，并长期存活，对动物生长发育起有益作用。

本发明的另一目的在于提供一种用来进行植物蛋白发酵的乳酸杆菌的筛选方法。

本发明的又一目的在于提供上述乳酸杆菌在固体发酵中的应用。

简单的说，本发明提供了一种用来进行植物蛋白发酵的乳酸杆菌，该乳酸杆菌为2008年4月1日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的乳酸杆菌Lactobacillus sp.，保藏号为CGMCC No.2426。

其中，所述的乳酸杆菌的生物学特性为：

(1)菌株杆状；

(2)菌落乳白色，边缘整齐；

(3)发酵后有乳酸产生；

(4)该乳酸杆菌与大肠杆菌K88、K99或987P混合培养时，其抑制大肠杆菌生长的抑菌直径达到1.2cm；

(5)在pH2.0处理10小时后存活率为73％，当温度为60℃培养15分钟，存活率为56％。

本发明还提供了一种用来进行植物蛋白发酵的乳酸杆菌的筛选方法，包括

(1)出发菌种的初筛

利用Rogosa SL完全选择性培养基对动物消化道不同位置的微生物进行选择行筛选，以获得乳酸杆菌；

(2)菌种耐酸特性的复筛

利用MRS培养基对初筛出的乳酸杆菌进行发酵，以在pH为2.0时进行耐受性筛选，从而获得耐酸性较高的乳酸杆菌；

(3)菌种的益生特性筛选

利用MRS培养基对耐酸性较高的乳酸杆菌进行乳酸产量的筛选以及对致病性大肠杆菌抑制性能的筛选，以获得益生性能较好的乳酸杆菌；

(4)菌种的脱酚能力筛选

首先利用MRS培养基进行益生性能较好的乳酸杆菌发酵18小时后，将发酵液按1％的重量比加入棉籽蛋白中，将固体发酵基质水分含量调至50％，发酵24小时，干燥，即得发酵脱毒的棉籽蛋白产品，测定发酵前后棉籽蛋白中棉酚含量，当脱酚率至少在50％以上时，该乳酸杆菌即为所需的乳酸杆菌。

其中，步骤(1)中所述的动物为猪，优选仔猪，步骤(3)中进行乳酸产量的筛选的标准为接种量为1.0％的条件下，经过20小时培养后，培养基中乳酸的含量达到5-6％以上。对致病性大肠杆菌抑制性能的筛选的标准为所述乳酸杆菌的抑菌直径为1.2cm。

本发明还提供了权利要求1所述的乳酸杆菌在固体发酵中的应用。

其中，所述的固体发酵采用植物蛋白进行发酵，优选大豆蛋白和棉籽蛋白。固体发酵中固液比为1∶0.6-1.5，优选1∶0.8。发酵温度为29-37℃，pH为4.5-5.5，接种量为6-10％，发酵时间为2-4天。优选发酵温度为37℃，pH为5，接种量为10％，发酵时间为3天。

以下是本发明的详细描述。

现有技术采用微生物对棉籽蛋白进行发酵脱酚，为从自然界霉变棉籽饼中，分离筛选出对棉酚有耐受能力的霉菌，接种在棉籽中发酵，以达到脱除棉酚的目的。但是由于霉菌中有害菌种类较多，因此该方法所采用的霉菌脱酚的棉籽蛋白有可能对动物有不利的影响，即使所用的霉菌为有益菌种，但其在动物消化道中也无法长期存活。

乳酸杆菌为一种益生菌，可有效促进动物生长和提高动物对疾病的抵抗力。何明清等(1986)对病、健仔猪肠道菌群的研究发现腹泻仔猪肠道中的乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)数量显著下降，大肠杆菌数显著上升。使用乳酸杆菌益生素可以调整胃肠道微生态平衡(Fuller等，1978)，所以乳酸杆菌是一种很有前途的益生素生产菌种。美国FDA和AAFCO在1989年公布的安全微生物品种共43种，其中乳酸杆菌占12种，中华人民共和国农业部1999年公布允许使用的12种饲用微生物中有3种是乳酸杆菌。在美国，益生素工业上应用的产品57％含有乳酸杆菌属(李玲，1995)。大连医学院康白等开发研制的乳酶生，是一种乳酸杆菌的干燥制剂，保存期间稳定性好，每克产品含活乳酸杆菌约10⁷个，仔猪每日口服3-4克可以有效治疗腹泻。

因此本发明的目标在于分离一种用来进行棉籽蛋白发酵的乳酸杆菌，使得该菌株既可以使棉籽蛋白脱酚，又可以作为益生菌进入动物体内，并长期存活，对动物生长发育起有益作用。

为了达到这个目的，本发明采用了以下方法进行筛选：

1、出发菌种的初筛

利用Rogosa SL完全选择性培养基对动物消化道不同位置的微生物进行选择行筛选，以获得乳酸杆菌。

其中Rogosa SL完全选择性培养基配方为现有技术，具体为：胰蛋白胨：10g，酵母浸粉：5g，葡萄糖：10g，阿拉伯糖：5g，蔗糖：5g，醋酸钠：15g，枸椽酸铵：2g，磷酸二氢钾：6g，七水硫酸镁：0.58g，四水硫酸锰：0.25g，硫酸亚铁：0.03g，吐温-80：1g，琼脂：13g，蒸馏水：1000mL，用醋酸调节pH至5.0。

由于采用的出发菌种为动物消化道不同位置的微生物，如胃中、十二指肠中、空肠中或结肠中，这样所筛选出的有益菌种由于为动物消化道中天然存在的微生物，因而必定可以长期存活，优选采用猪消化道不同位置的微生物，更优选采用仔猪消化道不同位置的微生物。

采用Rogosa SL完全选择性培养基的目的在于排除杂菌，获得乳酸杆菌，，这是由于Rogosa SL完全选择性培养基含有5％的醋酸钠(W/V)，培养基的pH为5.0，在此条件下消化道内的微生物只有乳酸杆菌能够生长，而其它微生物不会生长。

2、菌种耐酸特性的复筛

利用MRS培养基对初筛出的乳酸杆菌进行发酵，以在pH为2.0时进行耐受性筛选，从而获得耐酸性较高的乳酸杆菌；

其中MRS培养基配方为现有技术，具体为：蛋白胨，10g；牛肉浸膏，10g；酵母浸粉，5g；磷酸氢二钾，2g；枸椽酸二铵，2g；葡萄糖，20g；七水硫酸镁，0.58g；四水硫酸锰，0.25g；醋酸钠，5g；吐温-80，1g；蒸馏水，1000mL，用冰醋酸调节pH至2.0。

经过耐酸筛选出的乳酸杆菌，可抵抗胃酸的杀菌作用，降低其在胃中的死亡率。

3、菌种的益生特性筛选

利用MRS培养基对耐酸性较高的乳酸杆菌进行乳酸产量的筛选以及对致病性大肠杆菌抑制性能的筛选，以获得益生性能较好的乳酸杆菌。

其中，乳酸产量筛选的标准是，在接种量为1.0％的条件下，经过20小时培养后，培养基中乳酸的含量要达到5-6％以上。

对治病性大肠杆菌抑制性能的筛选的标准为乳酸杆菌的抑菌直径要达到1.2cm或以上，在抑菌直径的范围内，乳酸杆菌可抑制大肠杆菌的生长，特别是致病性大肠杆菌K88、K99或987P的生长。

4、菌种的脱酚能力筛选

首先利用MRS培养基进行乳酸杆菌发酵18小时后，将固体发酵基质水分含量调至50％，发酵24小时，干燥，即得发酵脱毒的棉籽蛋白产品，测定发酵前后棉籽蛋白中棉酚含量，当脱酚率至少在50％以上时，该乳酸杆菌即为所需的乳酸杆菌。

经过上述步骤的筛选，即可得到既能对棉籽蛋白进行发酵以降低棉酚含量，又能产生较多乳酸同时具有大肠杆菌抑菌性能的乳酸杆菌。

发明人经过上述筛选，即得到了一株性能优异的用来进行棉籽蛋白发酵的乳酸杆菌，该乳酸杆菌为2008年4月1日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的乳酸杆菌Lactobacillus sp.，保藏号为CGMCC No.2426。

该乳酸杆菌的生物学特性为：

(1)菌株杆状；

(2)菌落乳白色，边缘整齐；

(3)发酵后有乳酸产生；

(4)该乳酸杆菌与大肠杆菌K88、K99或987P混合培养时，其抑制大肠杆菌生长的抑菌直径达到1.2cm；

(5)在pH2.0处理10小时后存活率为73％，当温度为60℃培养15min，存活率为56％。

为了更好的利用该菌株，发明人就该菌株在固体发酵中的应用进行了研究。固体发酵与液体发酵相比，基质不溶于水，培养基单纯，发酵原料成本低。

发明人以棉籽蛋白为基质，对该菌株在固体发酵中的应用条件进行了探索，发现固体发酵中固液比以1∶0.6-1.5为宜，优选1∶0.8，其中固体是指棉籽蛋白，液体包括水和菌种液，菌种液取处于对数期和稳定期的乳酸杆菌，其中乳酸菌浓度通常大于10¹⁰/ml。

发酵温度为29-37℃，pH为4.5-5.5，接种量为6-10％，发酵时间为2-4天，优选的发酵温度为37℃，pH为5，接种量为10％，发酵时间为3天。此处接种量为菌种液体积与棉籽蛋白重量的比，其中体积以ml计，重量以g计。

在上述发酵条件下，乳酸杆菌脱除棉酚的能力最高，同时棉籽蛋白发酵后粗蛋白含量有所增加，粗纤维含量有所降低，增加了棉籽蛋白作为饲料的营养价值。

此外，在实验中发现该乳酸杆菌不仅可用来脱除棉酚，还可用来脱除其它植物蛋白中的抗营养因子，如以应用广泛的大豆蛋白为例，其存在形式以豆粕最为普遍。而豆粕中含有多种抗营养因子，如抑制生长的胰蛋白酶抑制因子，抑制胰凝乳蛋白酶和胆碱酶活性的皂苷，降低蛋白质溶解性和酶活性的植酸等，这些都会对饲料的营养价值造成影响。而乳酸杆菌CGMCC No.2426可脱除这些抗营养因子，使之降解为无害的其它物质。以豆粕等其它植物蛋白为基质对对该菌株在固体发酵中的条件进行探索，其适宜条件与棉籽蛋白大体相同。

综上所述，本发明提供了一种用来进行植物蛋白发酵的乳酸杆菌的筛选方法，用这种方法分离的保藏号为CGMCC No.2426的乳酸杆菌菌株，该菌株既可以脱除植物蛋白中的棉酚等抗营养因子，又可以作为益生菌进入动物体内，并长期存活，对动物生长发育起有益作用。

保藏说明

菌株：乳酸杆菌Lactobacillus sp.

保藏日期：2008年4月1日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏编号：CGMCC No.2426。

具体实施方式

实施例1

本实施例所用的胰蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、醋酸钠、枸椽酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、四水硫酸锰、硫酸亚铁、吐温-80、琼脂、蛋白胨、牛肉浸膏、枸椽酸二铵、醋酸钠均购于Sigma公司。

本实施例为保藏号为CGMCC No.2426的乳酸杆菌菌株的筛选过程，具体步骤为

(1)、出发菌种的初筛

利用Rogosa SL完全选择性培养基对仔猪消化道不同位置的微生物进行选择行筛选，以获得乳酸杆菌。

其中Rogosa SL完全选择性培养基配方为现有技术，具体为：胰蛋白胨：10g，酵母浸粉：5g，葡萄糖：10g，阿拉伯糖：5g，蔗糖：5g，醋酸钠：15g，枸椽酸铵：2g，磷酸二氢钾：6g，七水硫酸镁：0.58g，四水硫酸锰：0.25g，硫酸亚铁：0.03g，吐温-80：1g，琼脂：13g，蒸馏水：1000mL，用醋酸调节pH至5.0。

(2)、菌种耐酸特性的复筛

利用MRS培养基对初筛出的乳酸杆菌进行发酵，以在pH为2.0时进行耐受性筛选，从而获得耐酸性较高的乳酸杆菌；

其中MRS培养基配方为现有技术，具体为：蛋白胨，10g；牛肉浸膏，10g；酵母浸粉，5g；磷酸氢二钾，2g；枸椽酸二铵，2g；葡萄糖，20g；七水硫酸镁，0.58g；四水硫酸锰，0.25g；醋酸钠，5g；吐温-80，1g；蒸馏水，1000mL，用冰醋酸调节pH至2.0。

(3)、菌种的益生特性筛选

利用MRS培养基对耐酸性较高的乳酸杆菌进行乳酸产量的筛选以及对致病性大肠杆菌抑制性能的筛选，以获得益生性能较好的乳酸杆菌。

其中，乳酸产量筛选的标准是，在接种量为1.0％的条件下，经过20小时培养后，培养基中乳酸的含量要达到5-6％以上。

对治病性大肠杆菌抑制性能的筛选的标准为乳酸杆菌对致病性大肠杆菌K88、K99或987P的抑菌直径要达到1.2cm或以上。

(4)、菌种的脱酚能力筛选

首先利用MRS培养基进行乳酸杆菌发酵18小时后，将发酵液按体积重量比10％加入棉籽蛋白中，将固体发酵基质水分含量调至50％，发酵24小时，干燥，即得发酵脱毒的棉籽蛋白产品，测定发酵前后棉籽蛋白中棉酚含量，当脱酚率至少在50％以上时，该乳酸杆菌即为所需的乳酸杆菌。

经过筛选，得到一株乳酸杆菌Lactobacillus sp，2008年4月1日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCC No.2426。该菌株杆状；菌落乳白色，边缘整齐；发酵后有乳酸产生；该乳酸杆菌与大肠杆菌K88、K99或987P混合培养时，其抑制大肠杆菌生长的抑菌直径达到1.2cm；在pH2.0处理10小时后存活率为73％，当温度为60℃培养15分钟，存活率为56％。

实施例2

本实施例是实施例1保藏号为CGMCC No.2426的乳酸杆菌对棉籽蛋白脱毒效果和发酵条件的研究。

1材料和方法

1.1菌种和原料：发酵菌种为乳酸杆菌(LA，CGMCC No.2426)，棉籽蛋白购于市场。

1.2分析方法：游离棉酚：苯胺法，按国标GB13086-91“饲料中游离棉酚的测定方法”进行；粗蛋白：凯氏定氮法；粗纤维：按国标GBT6434-94；其它营养成分测定均参考国标进行处理分析。

1.3主要设备：UV-2000紫外可见分光光度计(龙尼柯仪器有限公司)、DHP-9052型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表有限公司)、高速万能粉碎机FW100型(天津市泰斯特仪器有限公司)、DSHL-300多用途水浴恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)、LX-C35Z型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(合肥华泰医疗设备有限公司)，操镜台(苏净集团安泰公司制造)。

1.4主要工艺流程：乳酸杆菌厌氧培养连续传3代作为试验的菌种保藏备用。乳酸杆菌活化后以2％接种在37℃培养箱中培养14h，然后转入37℃种子培养罐培养13h。棉籽蛋白不经过灭菌，加入水和生产好的液体菌种，充分搅拌后进行恒温发酵。

1.5实验设计

1.5.1确定菌种发酵棉籽蛋白的固液比例。根据在一定的培养条件下，观察记录发酵棉籽蛋白的表观性状，以及检测发酵后棉籽蛋白游离棉酚含量，计算脱毒率，干物质中蛋白质的含量和产率等指标，筛选出最佳适宜固态发酵的固液比例。

1.5.2单因素试验。根据微生物的特点，进行单因素试验，主要影响因素为温度、时间、pH和接种量。

1.5.3正交试验。根据筛选出的最佳固液比，按照正交表L9(34)进行正交试验。正交试验因素及水平见表1。根据试验的研究目的，单因素试验及正交试验主要测定指标为游离棉酚的含量，并计算脱毒率。

表1正交试验因素和水平(乳酸发酵)

1.5.4综合试验。按照最佳的脱毒条件，对棉籽蛋白进行扩大试验，取样并测定游离棉酚、粗蛋白、粗纤维、钙、总磷、灰分、盐分等营养指标的含量。

1.6统计分析采用Excel对全部数据进行分析。

2结果与讨论

2.1乳酸杆菌发酵结果

2.1.1固液比对乳酸杆菌固体发酵效果的影响

棉籽蛋白为淡黄色固体粉末，液体包括水和液体菌种，在37℃，自然pH，接种量为8％的条件下固态厌氧发酵4天。从表2可知，在6种不同固液比例水平的乳酸厌氧发酵后，棉籽蛋白中游离棉酚的含量均减少，且以固液比为1∶1.2的游离棉酚含量最低，为216ppm，脱毒率为55.83％。而发酵产物的产率正好相反，干物质中粗蛋白的含量以固液比为1∶0.8的最高，为59.02％。且从各方面的性状来看，气味为酸香味，烘干后味道变淡，颜色稍微加深，呈金黄色。当固液比在1∶1～1∶2之间，液体的含量过多，发酵结束后不容易把产物全部收回，且烘干较慢。另外，固液比在1∶1～1∶1.2时棉籽蛋白不容易搅拌均匀。而固液比在1∶0.8时发酵结果较接近各方面的最优值，游离棉酚的含量为217ppm，且干物质中粗蛋白含量最高，外观呈黄色湿粉状，能保持基质足够的水分并易于发酵操作。所以，乳酸杆菌发酵棉籽蛋白最佳的固液比例选择为1∶0.8。

表2固液比对乳酸杆菌固体发酵结果

2.1.2乳酸杆菌的发酵条件

根据上面试验的结果，以固液比为1∶0.8的比例对乳酸杆菌厌氧发酵棉籽蛋白的条件进行优化。从表3可以看出，对棉籽蛋白脱毒率影响最大的是温度，随之依次是接种量、时间和pH值，即各因素的影响力由主到次为A＞C＞B＞D，B(时间)和D因素(pH)是对脱毒率的影响次要两个因素，当固态厌氧发酵到第三天以后，脱毒率变化不大，所以为了缩短生产周期，发酵三天即可，不同条件下得到两组的脱毒率最高，为55.92％。由于棉籽蛋白不经过灭菌处理，所以接种量选择10％为好。此处接种量为菌种液体积与棉籽蛋白重量的比，其中体积以ml计，重量以g计。

综合它们的主要因素得到的最佳脱毒条件为A3B2C3D2，即在温度为37℃，pH值为5，接种量为10％，发酵时间为3d时，脱毒率为最高。

表3正交试验结果及极差分析(乳酸杆菌发酵)

2.3乳酸发酵方法对棉籽蛋白营养成分的影响

在最佳脱毒工艺条件下，用乳酸杆菌对棉籽蛋白进行固态发酵，然后测定发酵后棉籽蛋白中的游离棉酚、粗蛋白、粗纤维、灰分、盐分、钙和总磷的含量。由表4可知，经过乳酸杆菌发酵后脱毒率分别为56.24％；粗蛋白分别增加了2.51％；粗纤维则分别降低了2.55％，其它营养成分变化不大。

表4发酵前后棉籽蛋白营养成分表

通过以上试验表明，乳酸杆菌能分解棉籽蛋白中有毒成份一游离棉酚，降低粗纤维并提高粗蛋白的含量。

3小结

3.1利用乳酸杆菌在厌氧条件下对棉籽蛋白进行固体发酵的最佳条件为温度37℃，pH值为5，接种量为10％，固液比为1∶0.8时发酵3d的脱毒效果最好。

3.2利用本试验方法棉籽蛋白经过脱毒后，棉酚的含量可以降低56％，达到国家饲料用棉籽饼粕的安全标准为棉酚含量在400ppm以下，同时提高了粗蛋白的含量。

实施例3

本实施例是经过实施例1保藏号为CGMCC No.2426的乳酸杆菌发酵后的棉籽蛋白对仔猪性能的影响。

1、材料与方法

1.1试验动物

试验选取50～55日龄左右的大白和长白仔猪108头，按体重、性别、遗传基础相似的原则随机分为3个处理，每个处理4栏，每栏9头，公母各半。4个处理分别为对照组(不添加棉籽蛋白)、棉籽蛋白组、乳酸杆菌发酵棉籽蛋白组。试验期28d。棉籽蛋白粉购于市场。动物试验设计见表5。

表5试验设计

1.2试验日粮

以总氨基酸为基础，参照NRC(1998)猪营养需要配制基础日粮，仔猪日粮的原料组成及营养水平见表6。试验预混料来自北京九洲大地科技有限公司。

1.3饲养管理

仔猪采用高床饲养，栏内面积247cm2、117cm2，舍内温度保持20～22℃。自由采食和饮水，免疫及消毒程序按猪场常规进行。

1.4检测指标

为检验发酵棉籽蛋白粉在仔猪上的应用效果，试验从仔猪健康水平与生产性能两方面进行考察，分别在试验的第1、14和28d对全部仔猪进行个体称重，统计阶段耗料量，计算平均日增重、平均日采食量和饲料增重比。并记录全期腹泻仔猪头次数。

1.5统计分析

将全部试验数据输入计算机，用Excel和Spss12.0统计软件对数据进行统计分析。

表6仔猪日粮组成及营养成分含量

注：4％预混料含：铁3735mg，铜1250～4980mg 锌3362mg，锰492mg，硒8mg，碘9mg，钙10.4％～22.4％，磷≥2.2％，食盐6.2％～13.4％，VA 237000IU，VD₃ 47300IU，VE 587mg，尼克酸20.0mg，泛酸钙253mg，叶酸12mg，VK₃43.5mg，VB₂ 144mg，VB₁ 36mg，VB₁₂574μg，氯化胆碱9850mg，生物素184mg，VB₆ 62.5mg。

2结果与讨论

2.1发酵棉籽蛋白粉对仔猪生产性能的影响

发酵棉籽蛋白粉对仔猪生产性能的影响结果见表7。在试验前期，乳酸杆菌组仔猪的结束体重、平均日增重、饲料增重比表现最佳。各组的日采食量差异均不显著。其中，未发酵处理棉籽组的饲料增重比最高，为2.14，乳酸组最低，为1.38，在日增重方面，乳酸组最高为497.86g/d，未发酵处理棉籽组最低为321.43g/d。与对照组相比，乳酸组的日增重分别提高37.2％。而饲料增重比则分别降低28.12％。在试验的后期，棉籽组的日增重、饲料增重比差异不显著(P＞0.05)，但是与对照组相比，日增重均高于对照组(459.29g)，饲料增重比均显著低于对照组(2.46)，乳酸组的末重最高为28.96Kg，对照组最低为26.01Kg。

从试验全期来看，试验各组的日采食量均差异不显著(P＞0.05)，但是各组的日增重差异均显著(p＜0.05)，与对照组相比，未发酵处理的棉籽蛋白的饲料增重比差异不显著(P＞0.05)，，乳酸组的饲料增重比极显著低于对照组(p＜0.01)。全期的腹泻率未发酵处理的棉籽蛋白粉和对照组最高为11.43％，乳酸的最低为3.74％。

表7棉籽蛋白粉对仔猪生产性能的影响

注：同行肩注不同表示差异显著(p＜0.05)，只要有相同字母即差异不显著(p＞0.05)，相间字母表示差异极显著(p＜0.01)，SEM表示平均数的标准误差。

Claims (10)

1、一种用来进行植物蛋白发酵的乳酸杆菌，其特征在于，该乳酸杆菌为2008年4月1日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的乳酸杆菌Lactobacillus sp.，保藏号为CGMCC No.2426。

2、根据权利要求1所述的乳酸杆菌，其特征在于，所述的乳酸杆菌的生物学特性为：

(1)菌株杆状；

(2)菌落乳白色，边缘整齐；

(3)发酵后有乳酸产生；

(4)该乳酸杆菌与大肠杆菌K88、K99或987P混合培养时，其抑制大肠杆菌生长的抑菌直径达到1.2cm；

(5)在pH2.0处理10小时后存活率为73％，当温度为60℃培养15min，存活率为56％。

3、一种用来进行植物蛋白发酵的乳酸杆菌的筛选方法，其特征在于，包括

(1)出发菌种的初筛

利用Rogosa SL完全选择性培养基对动物消化道不同位置的微生物进行选择行筛选，以获得乳酸杆菌；

(2)菌种耐酸特性的复筛

利用MRS培养基对初筛出的乳酸杆菌进行发酵，以在pH为2.0时进行耐受性筛选，从而获得耐酸性较高的乳酸杆菌；

(3)菌种的益生特性筛选

利用MRS培养基对耐酸性较高的乳酸杆菌进行乳酸产量的筛选以及对致病性大肠杆菌抑制性能的筛选，以获得益生性能较好的乳酸杆菌；

(4)菌种的脱酚能力筛选

首先利用MRS培养基进行益生性能较好的乳酸杆菌发酵18小时后，将发酵液按体积重量比10％加入棉籽蛋白中，其中体积以ml计，重量以g计，将固体发酵基质水分含量调至50％，发酵24小时，干燥，即得发酵脱毒的棉籽蛋白产品，测定发酵前后棉籽蛋白中棉酚含量，当脱酚率至少在50％以上时，该乳酸杆菌即为所需的乳酸杆菌。

4、根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中所述的动物为猪，优选仔猪，步骤(3)中进行乳酸产量的筛选的标准为接种量为1.0％的条件下，经过20小时培养后，培养基中乳酸的含量达到5-6％以上。

5、根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述的步骤(3)中对致病性大肠杆菌抑制性能的筛选的标准为所述乳酸杆菌的抑菌直径为1.2cm。

6、权利要求1所述的乳酸杆菌在固体发酵中的应用。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的固体发酵采用植物蛋白进行发酵，优选大豆蛋白和棉籽蛋白。

8、根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的固体发酵中固液比为1∶0.6-1.5，优选1∶0.8。

9、根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的固体发酵中发酵温度为29-37℃，pH为4.5-5.5，接种量为6-10％，发酵时间为2-4天。

10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的固体发酵中发酵温度为37℃，pH为5，接种量为10％，发酵时间为3天。