CN101302425B - 一种测定一氧化氮生成的荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定一氧化氮生成的荧光探针及其应用。该荧光探针是二价铜离子Cu2+与有机配位体2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物形成的铜配合物，具有如下式(I)或(II)的结构。该配合物可简单迅速的进入活细胞，进而特异性的捕获细胞或组织中的活性NO，导致配合物的荧光强度显著增强，进而可以应用于化学体系中NO的检测，生物活细胞或活组织内的NO的分析检测和荧光成像检测，临床医学上病变组织中NO的检测以及生物活体的NO即时检测。本发明的荧光探针具有极高的NO测定灵敏度，其最低检测下限为17nmol/L，对NO有很好的选择性，和NO反应前后荧光变化迅速，荧光稳定，同时该探针具有稳定性好，能够长期保存使用，适用于中性，弱酸性及碱性多种环境。
Description
【技术领域】：
本发明属于生物检测及临床医学检测技术领域，涉及活细胞或者组织中NO的测定，特别是一种可用于活细胞中NO成像测定的铜配合物荧光探针及其应用。
【背景技术】：
NO是一种分子小、结构简单的气体，难溶于水，极易通过细胞膜扩散。由于其分子中有一未配对电子，具自由基结构，极不稳定，容易与氧、超氧化物自由基、过渡金属离子起反应。在组织内的半衰期极短，一般小于1min，但在组织外或有氧气条件下半衰期可延长至4min左右。NO能很快被氧化成硝酸盐或亚硝酸盐，与超氧化离子、血红蛋白以及含血红素蛋白质结合.而失去生物活性。80年代末发现内皮细胞舒张因子(EDRF)就是NO，因此有关NO的研究开始兴起。现已查明NO在细胞内信息传导方面起着重要的作用，它既兼有第二信使和神经递质的性能.又是杀伤肿瘤细胞及寄生虫等效应分子。正是由于NO的生物重要性.研究推测NO可能对某些疾病，如细胞增殖病、新生儿缺氧缺血性疾病及细胞的凋亡、生长及死亡方面影响较大。因此，研究NO的检测技术具有很高的应用价值。
由于NO在生物体内含量低，半衰期短，有氧气存在条件下极易被氧化，这就给其准确测定带来困难。目前主要采用测定NO的稳定代谢终产物硝酸盐，亚硝酸盐间接反映NO含量的方法。硝酸盐可用硝酸盐还原酶或镀铜镉法将其还原为亚硝酸盐再与Griess试剂发生重氮化反应，生成橙红色化合物λmax＝546nm，显色度与亚硝酸盐浓度成正比。
化学发光法根据NO可与臭氧发生化学反应形成激发态二氧化氮，后者在返回基态过程中释放能量，部分能量以光子形式发射，利用敏感的光电倍增管来检测光子的发射强度，以此推算NO含量。此法具有高灵敏度和高特异性的优点，尤其适用于呼出气NO含量的检测，但由于存在金属、玻璃、塑料等固体材料，NH3、烯等气体，以及NO易溶于液体等因素的干扰作用，其临床应用受到一定限制。其它还有高效色谱法、高铁血红素法等，由于需要特殊仪器，操作繁杂，难于在临床推广使用。
由于现在的NO检测技术局限于将NO先氧化成亚硝酸盐或硝酸盐后再测定，无法实现实时直接的测定，使得测定结果的科学性受到质疑。
荧光光谱测定是一种灵敏的化学检测手段，其检测下限一般可达到纳摩尔(10-9摩尔)甚至皮摩尔(10-12摩尔)级。自1995年以来，世界各个实验室致力于开发NO的生物荧光检测试剂，如二氨萘及其衍生物(Diaminonaphthalene，DAN)，二氯荧光素(dichlorofluorescin，DCFH)，二价铁和钴离子的配合物，二氨基荧光素(DAFs)和二氨基罗丹明(DARs)等等，但目前存在的各种荧光检测试剂存在着各种缺陷妨碍其进一步应用，如缺乏NO检测专一性(DAN和DCFH)，检测灵敏度低(二价铁和钴离子的配合物)，需要其他反应物(典型为分子氧)的参与(如DAFs和DARs)等等，使得细胞内或机体内的NO检测进展缓慢。目前应用的最成功的NO荧光检测试剂是DAF和DAR，但由于和NO反应激活荧光时需要O2的参与，尽管其是通过直接和NO反应生成荧光进行检测，但在一定条件下(如无氧环境中的细胞或组织)仍然不能实现NO在细胞内或者机体内的实时三维空间检测。
铜离子和一些荧光基团形成的配合物在近期受到了大家的关注，Cu(II)形成的配合物具有合适的氧化性，在溶液中或生理条件下可以和NO发生反应，形成新的荧光化合物，Cu(II)被还原成Cu(I)，这是一种很灵敏的激发(turn-on)荧光检测法，并且不需要其他任何反应物的参与。苯并咪唑或萘并咪唑类衍生物是一类荧光性质优秀，斯托克斯位移较大，较为稳定的激发态分子内质子转移(Excited-State Intramolecular Proton Transfer，ESIPT)型荧光化合物，它们的最大激发波长在350nm左右，与经典的细胞凋亡检测荧光染料DAPI位于相同的区域，大部分荧光显微镜均配备有相应的激发滤光片，易于进行检测。它们可以和铜离子形成稳定性适中的配合物，在跟NO反应后，激发出荧光。并且由于它们的荧光性质比较稳定独特，在细胞内可以和其他荧光染料结合进行双染色，进一步精细化检测结果。
【发明内容】：
本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种测定一氧化氮生成的荧光探针及其应用。这种荧光探针可以为研究人类的各种炎症、心血管疾病及肿瘤发生过程中的机制、以及为某些重大疾病的早期诊断与预防提供良好的辅助手段。
本发明的技术方案为：
1、测定一氧化氮生成的荧光探针的结构及其合成方法与合成路线：
本发明提供的测定NO生成的荧光探针的结构为式(I)或(II)：
4a-Cu：R1＝R2＝R3＝H；
3a-Cu：R1＝R2＝R3＝R4＝H，R＝H
4b-Cu：R1＝R3＝H R2＝OMe
3b-Cu：R1＝R3＝R4＝H，R2＝OMe，R＝H
4c-Cu：R1＝H，R2＝R3＝OMe
3c-Cu：R1＝R3＝H，R2＝R4＝OMe，R＝H
4d-Cu：R1＝R3＝H R2＝Cl
3d-Cu：R1＝R2＝R4＝H，R3＝Cl，R＝H
4e-Cu：R2＝R3＝H R1＝OMe
3h-Cu：R1＝R2＝R4＝H，R3＝Cl，R＝CH3
4f-Cu：R1＝R3＝H R2＝OH
该荧光探针的合成方法如下步骤：
a.分别将300mmol取代水杨醛(1a～1f)在搅拌下溶于125ml的甲醇中，然后加入150mmol的取代邻苯二胺(2a或2b)用于制备式(I)的铜配合物，或加入150mmol的邻萘二胺(2)用于制备式(II)的铜配合物，室温搅拌1小时，生成相应的沉淀物，过滤收集沉淀物，甲醇洗涤，真空干燥得到配体Aa～Ah(或Da～Df)。
b.分别将13mmol上步得到的配体Aa～Ah(或Da～Df)溶于100ml氯仿中，再加入由2.5g Mn(II)Cl2·4H2O溶于40ml乙醇所制得的溶液，生成褐色溶液，再将此溶液在通入空气的情况下搅拌12小时，得咖啡色溶液，室温搅拌24小时并浓缩，生成咖啡色沉淀，过滤出沉淀物，用DMF洗涤，再用少量乙醇洗涤，真空干燥得到三价锰配合物Ba～Bh(或Ea～Ef)。
c.分别将200mg上步得到的三价锰配合物Ba～Bh(或Ea～Ef)溶于10ml水和5ml甲醇中，加入少量6mol/L NaOH溶液，调节溶液的PH为10，然后室温下搅拌12小时，过滤出沉淀物，滤液中加入少量醋酸，中和至PH＝5，用乙酸乙酯提取溶液，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，得产物，用薄层层析或者柱层析分离，乙酸乙酯/正己烷＝1∶1为展开剂，分离出目的产物，用乙酸或者乙醇重结晶得到2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物3a～3h(或4a～4f)。
d.分别将上步生成的2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物3a～3h(或4a～4f)2mg溶于10ml乙醇，与等体积等摩尔硫酸铜水溶液在室温下形成配合物，常温挥发溶剂，产物以乙醇和去离子水各洗涤三次，即得2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物-铜配合物产物。
具体合成路线如下：
2、本发明提供的测定NO生成的荧光探针的应用：
在各类生物及非生物环境中，利用所述的铜配合物荧光探针捕获体系中的NO，使得探针的荧光强度显著增强，然后通过荧光测定法来确定NO的产生。所述荧光测定法除了常规的荧光测定法外，还包括时间分辨荧光测定法及时间分辨荧光显微镜成像测定法。
本发明的应用具体包括但不限于：
应用于化学体系中NO的检测，生物活细胞或活组织内的NO的分析检测和荧光成像检测，临床医学上病变组织中NO的检测以及生物活体的NO即时检测。
本发明的荧光探针具有如下优点：
1.稳定性好，能够长期保存使用，适用于中性，弱酸性及碱性多种环境。
2.具有极高的NO测定灵敏度，其最低检测下限为17nmol/L(以4b-Cu为例)。
3.对NO有很好的选择性，与其他的含活性氧、活性氮自由基分子作用后荧光信号几乎无变化。
4.和NO反应前后荧光变化迅速，荧光稳定，适合于体系内NO的即时荧光测定。
5.可简单进入活细胞和活组织，特异性捕获细胞或组织中的NO，导致配合物的荧光强度显著增强，进而用于活细胞中NO的时间分辨荧光测定。
6.配合物在体内稳定性强，可以直接用于体内的NO荧光监控，这在生物即时荧光检测应用中优势较为明显。
本发明的荧光探针为研究NO介导的生物信号通路、NO在炎症中的功能、以及NO在肿瘤发生过程中的意义及诊断提供了较好的理论基础和实验方法。
【附图说明】：
图1是化合物3a-Cu，3d-Cu，3h-Cu和4b-Cu与不同反应分子反应后的荧光变化倍数图，用以证明它们与NO反应的选择性。其中，A是3a-Cu、B是3h-Cu、C是3d-Cu、D是4b-Cu；
图2是化合物3a-Cu，3d-Cu，3h-Cu和4b-Cu与NO反应前后的荧光光谱变化图，其中，A是3a-Cu、B是3d-Cu、C是3h-Cu、D是4b-Cu；
图3是化合物4b-Cu对小鼠巨噬细胞(Raw264.7)在LPS刺激前后NO变化的荧光成像；
图4是化合物4b-Cu检测肝急性炎症小鼠中肝脏组织的NO局部变化的冰冻切片荧光成像图；
图5是通过MALDI-TOF和FT-IR测定确定4b-Cu和NO反应的机理，其中，A是4b-Cu的MALDI-TOF测定图、B是4b-Cu与NO反应后产物的MALDI-TOF测定图、C是4b的FT-IR测定图、D是4b-Cu与NO反应后产物的FT-IR测定图。
【具体实施方式】：
实施例中化合物的编号对应于上述方案中的化合物编号。
实施例1：化合物3a-Cu，3b-Cu，3c-Cu，3d-Cu，3h-Cu的共同合成路线
分别将300mmol取代水杨醛(1a～1d)在搅拌下溶于125ml的甲醇中，然后加入150mmol的取代邻苯二胺(2a或2b)，室温搅拌1小时，生成相应的沉淀物，过滤收集沉淀物，甲醇洗涤，真空干燥得到配体Aa～Ah。
分别将13mmol的配体Aa～Ah溶于100ml氯仿中，再加入由2.5g Mn(II)Cl2·4H2O溶于40ml乙醇所制得的溶液，生成褐色溶液，再将此溶液在通入空气的情况下搅拌12小时，得咖啡色溶液，室温搅拌24小时并浓缩，生成咖啡色沉淀，过滤出沉淀物，用DMF洗涤，再用少量乙醇洗涤，真空干燥得到相应的三价锰配合物Ba～Bh。
分别将200mg的三价锰配合物Ba～Bh溶于10ml水和5ml甲醇中，加入少量6mol/LNaOH溶液，调节溶液的PH为10，然后室温下搅拌12小时，过滤出沉淀物，滤液中加入少量醋酸，中和至PH＝5，用乙酸乙酯提取溶液，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，得产物，用薄层层析或者柱层析分离，乙酸乙酯/正己烷＝1∶1为展开剂，分离出目的产物，用乙酸或者乙醇重结晶，得纯品2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类配体化合物3a～3h。
将上步生成的3a，3b，3c，3d，3h配体化合物2mg分别溶于10ml乙醇，与等体积等摩尔硫酸铜水溶液在室温下形成配合物，常温挥发溶剂，产物以乙醇和去离子水各洗涤三次，即得2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物-铜配合物产物，分别称为3a-Cu，3b-Cu，3c-Cu，3d-Cu和3h-Cu。
配体化合物3a的基本数据：
1H NMR(400MHz，deuteriodimethyl sulfoxide)：
(br s，2H，OH and NH)，8.10(dd，1H，arom H，J＝1.6，7.2Hz)，7.76(d，1H，arom H，J＝5.6Hz)，7.65(d，1H，arom H，J＝5.6Hz)，7.44-7.32(m，3H，arom H)，7.10-7.04(m，2H，arom H)；13C nmr(100MHz，deuteriodimethyl sulfoxide)： .＝157.9，151.6，140.7，133.0，131.7，126.2，126.0，123.2，122.3，119.0，117.1，112.5，111.4；EI-MS：m/z(relativeintensity)＝210(100，M+)，182(20)，91(18)，78(14).
配体化合物3b的基本数据：
1H NMR(400MHz，deuteriodimethyl sulfoxide)：δ＝13.35(br s，1H，OH)，13.00(s，1H，NH)，7.95(d，1H，arom H，J＝8.4Hz)，7.62(dd，2H，arom H，J＝3.2，9.2Hz)，7.25(dd，2H，arom H，J＝3.2，9.2Hz)，6.62(dd，1H，arom H，J＝2.4，8.4Hz)，6.58(d，1H，arom H，J＝2.4Hz)，3.80(s，3H，CH3O)；13C nmr(100MHz，deuteriodimethyl sulfoxide) .＝162.2，159.7，151.6，139.9，132.8，127.5，127.3，122.6，122.4，106.5，105.3，101.4，101.3，55.4；EI-MS：m/z(relative intensity)＝240(100，M+)，197(24)，169(7)，143(5)，120(6)，106(7)，65(7).
配体化合物3c的基本数据：
1H NMR(400MHz，deuteriodimethyl sulfoxide)：δ＝14.68(br s，1H，NH)，12.09(br s，1H，OH)，7.64(dd，2H，arom H，J＝3.2，9.2Hz)，7.23(dd，2H，arom H，J＝3.2，9.2Hz)，6.35(s，2H，arom H)，4.01(s，3H，CH3O)，3.80(s，3H，CH3O)；13C nmr(100MHz，deuteriodimethyl sulfoxide)： .＝162.3，161.6，158.8，150.2，139.0，132.4，122.3，122.2，116.8，111.9，95.3，94.3，90.2，55.6，55.1；EI-MS：m/z(relative intensity)＝270(100，M+)，240(16)，193(20)，143(12)，136(20)，121(17)，78(6)，65(5)，58(10).
Anal.Calcd.for C15H14N2O3：C，66.66；H，5.22；N，10.36.Found：C，66.38；H，5.31；N，10.13.
配体化合物3d的基本数据：
1H NMR(400MHz，deuteriodimethyl sulfoxide)：δ＝13.26(br s，2H，OH and NH)，8.15(d，1H，aromH，J＝2.8Hz)，7.80(d，1H，arom H，J＝8.4Hz)，7.69(d，1H，arom H，J＝8.4Hz)，7.47(dd，1H，arom H，J＝2.8，8.8Hz)，7.37(br s，2H，arom H)，7.14(d，1H，arom H，J＝8.8Hz)；13C nmr(100MHz，deuteriodimethyl sulfoxide)： .＝156.5，150.1，133.2，133.1，125.5，125.4，123.1，123.0，122.6，122.5，119.0，118.9，113.9；EI-MS：m/z(relative intensity)＝246(33，M++2)，244(100，M+)，216(8)，181(16)，149(7)，90(11)，57(10).
配体化合物3h的基本数据：
1H nmr(400MHz，deuteriodimethyl sulfoxide)：δ＝13.24(br s，1H，NH)，13.10(br s，1H，OH)，8.14(d，1H，arom H，J＝2.8Hz)，7.59(d，1H，arom H，J＝8.0Hz)，7.45(br s，1H，arom H)，7.39(dd，1H，arom H，J＝2.8，8.8Hz)，7.12(d，1H，arom H，J＝8.0Hz)，7.06(d，1H，arom H，J＝8.8Hz)，2.45(s，3H，CH3)；13C nmr(100MHz，deuteriodimethyl sulfoxide)：δ＝156.4，149.5，133.2，131.1，125.5，125.4，124.7，122.6，122.5，118.9，113.9，113.8，21.3；EI-MS：m/z(relative intensity)＝260(31，M++2)，258(91，M+)，193(97)，136(100)，107(66)，77(33)，58(53).
Anal.Calcd.for C14H11ClN2O：C，65.00；H，4.29；N，10.83.Found：C，64.71；H，4.40；N，10.62.
实施例2：化合物4a，4b，4c，4d，4e，4f的共同合成路线及其铜配合物的合成：
分别将300mmol取代水杨醛(1a～1f)在搅拌下溶于125ml的甲醇中，然后加入150mmol的邻萘二胺(2)，室温搅拌1小时，生成相应的沉淀物，过滤收集沉淀物，甲醇洗涤，真空干燥得到配体Da～Df。
分别将13mmol的配体Da～Df溶于100ml氯仿中，再加入由2.5g Mn(II)Cl2·4H2O溶于40ml乙醇所制得的溶液，生成褐色溶液，再将此溶液在通入空气的情况下搅拌12小时，得咖啡色溶液，室温搅拌24小时并浓缩，生成咖啡色沉淀，过滤出沉淀物，用DMF洗涤，再用少量乙醇洗涤，真空干燥得到三价锰配合物Ea～Ef。
分别将200mg的三价锰配合物Ea～f溶于10ml水和5ml甲醇中，加入少量饱和的NaOH溶液，调节溶液的PH为10，然后室温下搅拌12小时，过滤出沉淀物，滤液中加入少量醋酸，中和至PH＝5，用乙酸乙酯提取溶液，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，得产物，用薄层层析或者柱层析分离，乙酸乙酯/正己烷＝1∶1为展开剂，分离出相应的目的产物，用乙酸或者乙醇重结晶，得纯品4a～4f。
分别将上步生成的4a，4b，4c，4d，4e，4f 2mg溶于10ml乙醇，与等体积等摩尔硫酸铜水溶液在室温下形成配合物，常温挥发溶剂，产物以乙醇和去离子水各洗涤三次，即得2-(2-羟基苯基)萘并咪唑类衍生物-铜配合物产物，分别称为4a-Cu，4b-Cu，4c-Cu，4d-Cu，4e-Cu和4f-Cu。
配体化合物4b的基本数据：
1H nmr(400MHz，deuteriodimethyl sulfoxide)：δ＝13.50(br s，1H，NH)，13.03(br s，1H，OH)，8.18(br s，1H，arom H)，8.05(d，2H，arom H，J＝8.8Hz)，8.04(br s，1H，arom H)，8.02(m，2H，arom H)，7.40(m，2H，arom H)，6.68(dd，1H，arom H，J＝2.8，8.8Hz)，6.63(d，1H，arom H，J＝2.8Hz)，3.84(s，3H，OCH3)；13C nmr(100MHz，deuteriodimethyl sulfoxide)：δ＝162.8，162.6，156.0，141.6，141.5，130.0，127.98，127.94，127.85，127.82，123.56，123.50，113.67，113.62，106.7，105.2，101.4，55.4；EI-MS：m/z(relative intensity)＝290(100，M+)，261(120)，247(23)，219(6)，193(4).Anal.Calcd.for C18H14N2O2：C，74.47；H，4.86；N，9.65.Found：C，74.21；H，4.95；N，9.48.
其它配体化合物的基本数据略
实施例3：配合物对NO的选择性
取3a-Cu，3d-Cu，3h-Cu，4b-Cu，溶于DMSO中，至终浓度为1mmol/L。向96孔板中加入各种铜配合物，分别加入亚硝酸盐，铵根，硝酸盐，过氧化氢，ONOO-，NO，而后向全部样品中补加去离子水，使每个孔得到探针浓度是100μmol/L。亚硝酸盐，铵根，硝酸盐，过氧化氢，ONOO-，NO的摩尔量分别为相应探针的100倍。反应1小时后在酶标仪上测定荧光强度，反应后的荧光强度除以原本铜离子复合物的荧光强度，进行荧光值的归一化(normalized)。结果如图1所示，其中，A是3a-Cu、B是3d-Cu、C是3h-Cu、D是4b-Cu。
由图中可以看出，探针3a-Cu，3d-Cu，3h-Cu，4b-Cu对NO具有很高的选择性和灵敏度。
实施例4：配合物3a，3d，3h，4b-Cu与NO反应的荧光图谱：
将探针3a，3d，3h，4b-Cu溶于DMSO中，至终浓度为100μmol/L，与1000当量的NO反应15分钟后，测定荧光强度变化，激发光分别为3a-Cu：316nm，3d-Cu：326nm，3h-Cu：326nm，4b-Cu：353nm。结果如图2，其中，A是3a-Cu、B是3d-Cu、C是3h-Cu、D是4b-Cu。所有的荧光强度进行归一化(normalized)。
由图中可以得出这些配合物的本底荧光强度在一个很低的本底水平，而跟NO反应后，荧光强度在1分钟内即有很显著的增强。这种荧光增强的快速性和明显性说明这几种探针完全可以用于NO的即时测定。
其他配合物(除3b-Cu和3c-Cu外，这两种化合物跟NO反应后不具有荧光增强性)显示出类似的荧光光谱性质。
实施例5：配合物4b-Cu检测细胞内NO的实验：
取4b-Cu配合物溶于DMSO中，浓度为1mmol/L，加入RAW264.7细胞中，探针的终浓度为10μmol/L。RAW264.7细胞以含有10％小牛血清的Dulbecco’s modified Eagle’s medium培养液进行培养。在1～12小时后照荧光照片作为空白对照；用大肠杆菌脂多糖LPS(500ng/ml)刺激RAW264.7细胞后，同样加入终浓度为10μmol/L的4b-Cu，每隔2小时拍摄荧光照片。为了确认4b-Cu在细胞内的荧光增强对应于NO的生成，我们取一部分Raw264.7细胞，在以LPS刺激细胞之前，加入NO合成酶的抑制剂1400w(N-[3-(aminomethyl)benzyl]acetamidine)，同步进行荧光观测，结果如图3。
从图3中看，探针4b-Cu的检测结果非常明显，在普通的RAW264.7细胞中，它的荧光强度只有微弱的增强，这可能与RAW264.7细胞本底产生的NO量有关，而在LPS刺激后RAW264.7细胞中，4b-铜复合物的荧光强度有了很大的提高，在10～12小时这个区域内荧光强度达到了一个极大值，这与Lim M.H.等人的结果很吻合(Nature Chemical Biology，2，375-380，2006)，而当加入NO合成酶抑制剂1400w后，LPS所诱导的相应荧光强度升高现象消失，证明4b-Cu在细胞内的荧光变化对应于细胞内即时的NO变化，因此很适合作细胞内NO的实时直接检测荧光探针。
实施例6：配合物4b-Cu荧光检测急性肝损伤炎症(Acute Severe Hepatic Injury，ASHI)小鼠肝中NO局部变化(冰冻切片)：
取Balb/c小鼠(雄性，8周左右，18～20g)，腹腔注射300mg/kg的氨基半乳糖和5μg/kg LPS诱导急性肝损伤，6个小时后，进行肝门静脉注射4b-Cu探针(10mg/kg，溶于DMSO∶生理盐水＝1∶1的混合溶液中)，半小时后处死小鼠，取肝于-20℃冰冻，接着肝组织浸润于OCT复合物中1小时(Sakura Finetek公司，Torrance，CA)，于-22℃以Sakura cm-41冰冻切片机切成4μm厚的薄片，4℃丙酮加于薄片进行组织固定，固定后1小时进行荧光显微镜观测。结果显示于图4。从图4可以看出，急性肝损伤小鼠的肝中4b-Cu的荧光强度有了显著的提高，而正常小鼠肝中荧光强度提高不是很明显。为了验证4b-Cu在体内的荧光强度变化也是NO相关的，我们以三氯化钆(GdCl3)(10mg/kg)预先24小时尾静脉注射Balb/c小鼠，去除NO生成细胞：Kupffers细胞，再以GalN+LPS诱导急性肝损伤炎症。诱导后半小时，仍然通过肝门静脉注射4b-Cu探针10mg/kg，由于巨噬细胞的消除，肝冰冻切片中的强荧光消失，证明4b-Cu探针在急性肝损伤中确实检测的是肝中的NO变化，仍参见于图4。在急性肝损伤中，肝脏组织是免疫细胞(尤其是巨噬细胞)的攻击对象，急性的炎症也会伴随着组织中NO浓度的大大升高。这与4b-铜复合物的检测结果是一致的。
实施例7：4b-Cu和NO反应机理的测定：
为了测定和NO反应后物质的结构，我们通过MALDI-TOF(基质辅助的激光解离/离子化飞行质谱，Bruker Autoflex II time-of-flight(TOF)质谱仪(Bruker Daltonics，Billerica，MA)测定了4b-Cu和NO反应前后分子量的变化。激发激光波长为λ＝337nm，α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)作为保护基质，在点样板上的上样量为基质1μl，复合物0.5μl。结果参见图5(A)和(B)。与原化合物对比，对于4b-铜配合物而言，m/z(4b)是289.887，m/z＝351.893代表了[4b+Cu2+-H+]，m/z＝633.962代表[2(4b)+Cu2+-2H+]，and m/z＝319.415代表[4b+NO-H+]。
同时，以Nexus 870FT-IR傅立叶变换红外测定仪测定4b-Cu和NO反应前后的光谱变化。结果参见图5(C)和(D)。与原化合物对比，3347.2cm-1峰的变形，以及1500cm-1，1103.0cm-1处峰的出现，证明了-N-N＝O基团的产生，结合分子量变化的结果，可推测反应后产物结构如下：
Claims (4)
1.一种用于测定一氧化氮生成的荧光探针的合成方法，其特征在于该荧光探针是二价铜离子Cu2+与有机配位体2-(-2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物形成的铜配合物，其结构为式(I)或(II)：
合成方法如下：
a.分别将300mmol取代水杨醛1a-d在搅拌下溶于125ml的甲醇中，然后加入150mmol的取代邻苯二胺2a或2b用于制备式(I)的铜配合物；或分别将300mmol取代水杨醛1a-d，1e，1f在搅拌下溶于125ml的甲醇中，然后加入150mmol的取代邻萘二胺2c用于制备式(II)的铜配合物，室温搅拌1小时，生成相应的沉淀物，过滤收集沉淀物，甲醇洗涤，真空干燥得到配体Aa-h或Da-f；
b.将13mmol的配体Aa-h或Da-f溶于100ml氯仿中，再加入由2.5g Mn(II)Cl2·4H2O溶于40ml乙醇所制得的溶液，生成褐色溶液，再将此溶液在通入空气的情况下搅拌12小时，得咖啡色溶液，室温搅拌24小时并浓缩，生成咖啡色沉淀，过滤出沉淀物，用DMF洗涤，再用少量乙醇洗涤，真空干燥得到三价锰配合物Ba-h或Ea-f；
c.将200mg以上得到的三价锰配合物B溶于10ml水和5ml甲醇中，加入少量6mol/L NaOH溶液，调节溶液的PH为10，然后室温下搅拌12小时，过滤出沉淀物，滤液中加入少量醋酸，中和至PH＝5，用乙酸乙酯提取溶液，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，得产物，用薄层层析或者柱层析分离，乙酸乙酯/正己烷＝1∶1为展开剂，分离出目的产物，用乙酸或者乙醇重结晶得到2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物3a-h或4a-f；
d.分别取上步生成的2-(2-羟基苯基）苯并咪唑类衍生物3a-h或4a-f2mg溶于10ml乙醇，与等体积等摩尔硫酸铜水溶液在室温下形成配合物，常温挥发溶剂，产物以乙醇和去离子水各洗涤三次，即得2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物-铜配合物产物3a-h-Cu或4a-f-Cu；
具体合成路线如下：
2.一种权利要求1所述方法合成的荧光探针的应用，其特征在于：在各类非生物环境中，利用所述的铜配合物荧光探针捕获体系中的NO，使得荧光探针的荧光强度显著增强，然后通过荧光测定法来确定NO的产生。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述荧光测定法除了常规的荧光测定法外，还包括时间分辨荧光测定法及时间分辨荧光显微镜成像测定法。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：应用于化学体系中的NO的检测。
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| 于瑞林等.三价锰存在下2-(1H-苯并咪唑-2-基)-苯酚及其衍生物的合成与其光谱特性.《天津理工大学学报》21 6.2005,21(6),44-47. |
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