CN101302425B - 一种测定一氧化氮生成的荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定一氧化氮生成的荧光探针及其应用。该荧光探针是二价铜离子Cu2+与有机配位体2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物形成的铜配合物,具有如下式(I)或(II)的结构。该配合物可简单迅速的进入活细胞,进而特异性的捕获细胞或组织中的活性NO,导致配合物的荧光强度显著增强,进而可以应用于化学体系中NO的检测,生物活细胞或活组织内的NO的分析检测和荧光成像检测,临床医学上病变组织中NO的检测以及生物活体的NO即时检测。本发明的荧光探针具有极高的NO测定灵敏度,其最低检测下限为17nmol/L,对NO有很好的选择性,和NO反应前后荧光变化迅速,荧光稳定,同时该探针具有稳定性好,能够长期保存使用,适用于中性,弱酸性及碱性多种环境。
Description
【技术领域】:
本发明属于生物检测及临床医学检测技术领域,涉及活细胞或者组织中NO的测定,特别是一种可用于活细胞中NO成像测定的铜配合物荧光探针及其应用。
【背景技术】:
NO是一种分子小、结构简单的气体,难溶于水,极易通过细胞膜扩散。由于其分子中有一未配对电子,具自由基结构,极不稳定,容易与氧、超氧化物自由基、过渡金属离子起反应。在组织内的半衰期极短,一般小于1min,但在组织外或有氧气条件下半衰期可延长至4min左右。NO能很快被氧化成硝酸盐或亚硝酸盐,与超氧化离子、血红蛋白以及含血红素蛋白质结合.而失去生物活性。80年代末发现内皮细胞舒张因子(EDRF)就是NO,因此有关NO的研究开始兴起。现已查明NO在细胞内信息传导方面起着重要的作用,它既兼有第二信使和神经递质的性能.又是杀伤肿瘤细胞及寄生虫等效应分子。正是由于NO的生物重要性.研究推测NO可能对某些疾病,如细胞增殖病、新生儿缺氧缺血性疾病及细胞的凋亡、生长及死亡方面影响较大。因此,研究NO的检测技术具有很高的应用价值。
由于NO在生物体内含量低,半衰期短,有氧气存在条件下极易被氧化,这就给其准确测定带来困难。目前主要采用测定NO的稳定代谢终产物硝酸盐,亚硝酸盐间接反映NO含量的方法。硝酸盐可用硝酸盐还原酶或镀铜镉法将其还原为亚硝酸盐再与Griess试剂发生重氮化反应,生成橙红色化合物λmax=546nm,显色度与亚硝酸盐浓度成正比。
化学发光法根据NO可与臭氧发生化学反应形成激发态二氧化氮,后者在返回基态过程中释放能量,部分能量以光子形式发射,利用敏感的光电倍增管来检测光子的发射强度,以此推算NO含量。此法具有高灵敏度和高特异性的优点,尤其适用于呼出气NO含量的检测,但由于存在金属、玻璃、塑料等固体材料,NH3、烯等气体,以及NO易溶于液体等因素的干扰作用,其临床应用受到一定限制。其它还有高效色谱法、高铁血红素法等,由于需要特殊仪器,操作繁杂,难于在临床推广使用。
由于现在的NO检测技术局限于将NO先氧化成亚硝酸盐或硝酸盐后再测定,无法实现实时直接的测定,使得测定结果的科学性受到质疑。
荧光光谱测定是一种灵敏的化学检测手段,其检测下限一般可达到纳摩尔(10-9摩尔)甚至皮摩尔(10-12摩尔)级。自1995年以来,世界各个实验室致力于开发NO的生物荧光检测试剂,如二氨萘及其衍生物(Diaminonaphthalene,DAN),二氯荧光素(dichlorofluorescin,DCFH),二价铁和钴离子的配合物,二氨基荧光素(DAFs)和二氨基罗丹明(DARs)等等,但目前存在的各种荧光检测试剂存在着各种缺陷妨碍其进一步应用,如缺乏NO检测专一性(DAN和DCFH),检测灵敏度低(二价铁和钴离子的配合物),需要其他反应物(典型为分子氧)的参与(如DAFs和DARs)等等,使得细胞内或机体内的NO检测进展缓慢。目前应用的最成功的NO荧光检测试剂是DAF和DAR,但由于和NO反应激活荧光时需要O2的参与,尽管其是通过直接和NO反应生成荧光进行检测,但在一定条件下(如无氧环境中的细胞或组织)仍然不能实现NO在细胞内或者机体内的实时三维空间检测。
铜离子和一些荧光基团形成的配合物在近期受到了大家的关注,Cu(II)形成的配合物具有合适的氧化性,在溶液中或生理条件下可以和NO发生反应,形成新的荧光化合物,Cu(II)被还原成Cu(I),这是一种很灵敏的激发(turn-on)荧光检测法,并且不需要其他任何反应物的参与。苯并咪唑或萘并咪唑类衍生物是一类荧光性质优秀,斯托克斯位移较大,较为稳定的激发态分子内质子转移(Excited-State Intramolecular Proton Transfer,ESIPT)型荧光化合物,它们的最大激发波长在350nm左右,与经典的细胞凋亡检测荧光染料DAPI位于相同的区域,大部分荧光显微镜均配备有相应的激发滤光片,易于进行检测。它们可以和铜离子形成稳定性适中的配合物,在跟NO反应后,激发出荧光。并且由于它们的荧光性质比较稳定独特,在细胞内可以和其他荧光染料结合进行双染色,进一步精细化检测结果。
【发明内容】:
本发明目的是克服现有技术存在的上述不足,提供一种测定一氧化氮生成的荧光探针及其应用。这种荧光探针可以为研究人类的各种炎症、心血管疾病及肿瘤发生过程中的机制、以及为某些重大疾病的早期诊断与预防提供良好的辅助手段。
本发明的技术方案为:
1、测定一氧化氮生成的荧光探针的结构及其合成方法与合成路线:
本发明提供的测定NO生成的荧光探针的结构为式(I)或(II):
4a-Cu:R1=R2=R3=H;
3a-Cu:R1=R2=R3=R4=H,R=H
4b-Cu:R1=R3=H R2=OMe
3b-Cu:R1=R3=R4=H,R2=OMe,R=H
4c-Cu:R1=H,R2=R3=OMe
3c-Cu:R1=R3=H,R2=R4=OMe,R=H
4d-Cu:R1=R3=H R2=Cl
3d-Cu:R1=R2=R4=H,R3=Cl,R=H
4e-Cu:R2=R3=H R1=OMe
3h-Cu:R1=R2=R4=H,R3=Cl,R=CH3
4f-Cu:R1=R3=H R2=OH
该荧光探针的合成方法如下步骤:
a.分别将300mmol取代水杨醛(1a~1f)在搅拌下溶于125ml的甲醇中,然后加入150mmol的取代邻苯二胺(2a或2b)用于制备式(I)的铜配合物,或加入150mmol的邻萘二胺(2)用于制备式(II)的铜配合物,室温搅拌1小时,生成相应的沉淀物,过滤收集沉淀物,甲醇洗涤,真空干燥得到配体Aa~Ah(或Da~Df)。
b.分别将13mmol上步得到的配体Aa~Ah(或Da~Df)溶于100ml氯仿中,再加入由2.5g Mn(II)Cl2·4H2O溶于40ml乙醇所制得的溶液,生成褐色溶液,再将此溶液在通入空气的情况下搅拌12小时,得咖啡色溶液,室温搅拌24小时并浓缩,生成咖啡色沉淀,过滤出沉淀物,用DMF洗涤,再用少量乙醇洗涤,真空干燥得到三价锰配合物Ba~Bh(或Ea~Ef)。
c.分别将200mg上步得到的三价锰配合物Ba~Bh(或Ea~Ef)溶于10ml水和5ml甲醇中,加入少量6mol/L NaOH溶液,调节溶液的PH为10,然后室温下搅拌12小时,过滤出沉淀物,滤液中加入少量醋酸,中和至PH=5,用乙酸乙酯提取溶液,有机相用无水硫酸钠干燥,浓缩,得产物,用薄层层析或者柱层析分离,乙酸乙酯/正己烷=1∶1为展开剂,分离出目的产物,用乙酸或者乙醇重结晶得到2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物3a~3h(或4a~4f)。
d.分别将上步生成的2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物3a~3h(或4a~4f)2mg溶于10ml乙醇,与等体积等摩尔硫酸铜水溶液在室温下形成配合物,常温挥发溶剂,产物以乙醇和去离子水各洗涤三次,即得2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物-铜配合物产物。
具体合成路线如下:
2、本发明提供的测定NO生成的荧光探针的应用:
在各类生物及非生物环境中,利用所述的铜配合物荧光探针捕获体系中的NO,使得探针的荧光强度显著增强,然后通过荧光测定法来确定NO的产生。所述荧光测定法除了常规的荧光测定法外,还包括时间分辨荧光测定法及时间分辨荧光显微镜成像测定法。
本发明的应用具体包括但不限于:
应用于化学体系中NO的检测,生物活细胞或活组织内的NO的分析检测和荧光成像检测,临床医学上病变组织中NO的检测以及生物活体的NO即时检测。
本发明的荧光探针具有如下优点:
1.稳定性好,能够长期保存使用,适用于中性,弱酸性及碱性多种环境。
2.具有极高的NO测定灵敏度,其最低检测下限为17nmol/L(以4b-Cu为例)。
3.对NO有很好的选择性,与其他的含活性氧、活性氮自由基分子作用后荧光信号几乎无变化。
4.和NO反应前后荧光变化迅速,荧光稳定,适合于体系内NO的即时荧光测定。
5.可简单进入活细胞和活组织,特异性捕获细胞或组织中的NO,导致配合物的荧光强度显著增强,进而用于活细胞中NO的时间分辨荧光测定。
6.配合物在体内稳定性强,可以直接用于体内的NO荧光监控,这在生物即时荧光检测应用中优势较为明显。
本发明的荧光探针为研究NO介导的生物信号通路、NO在炎症中的功能、以及NO在肿瘤发生过程中的意义及诊断提供了较好的理论基础和实验方法。
【附图说明】:
图1是化合物3a-Cu,3d-Cu,3h-Cu和4b-Cu与不同反应分子反应后的荧光变化倍数图,用以证明它们与NO反应的选择性。其中,A是3a-Cu、B是3h-Cu、C是3d-Cu、D是4b-Cu;
图2是化合物3a-Cu,3d-Cu,3h-Cu和4b-Cu与NO反应前后的荧光光谱变化图,其中,A是3a-Cu、B是3d-Cu、C是3h-Cu、D是4b-Cu;
图3是化合物4b-Cu对小鼠巨噬细胞(Raw264.7)在LPS刺激前后NO变化的荧光成像;
图4是化合物4b-Cu检测肝急性炎症小鼠中肝脏组织的NO局部变化的冰冻切片荧光成像图;
图5是通过MALDI-TOF和FT-IR测定确定4b-Cu和NO反应的机理,其中,A是4b-Cu的MALDI-TOF测定图、B是4b-Cu与NO反应后产物的MALDI-TOF测定图、C是4b的FT-IR测定图、D是4b-Cu与NO反应后产物的FT-IR测定图。
【具体实施方式】:
实施例中化合物的编号对应于上述方案中的化合物编号。
实施例1:化合物3a-Cu,3b-Cu,3c-Cu,3d-Cu,3h-Cu的共同合成路线
分别将300mmol取代水杨醛(1a~1d)在搅拌下溶于125ml的甲醇中,然后加入150mmol的取代邻苯二胺(2a或2b),室温搅拌1小时,生成相应的沉淀物,过滤收集沉淀物,甲醇洗涤,真空干燥得到配体Aa~Ah。
分别将13mmol的配体Aa~Ah溶于100ml氯仿中,再加入由2.5g Mn(II)Cl2·4H2O溶于40ml乙醇所制得的溶液,生成褐色溶液,再将此溶液在通入空气的情况下搅拌12小时,得咖啡色溶液,室温搅拌24小时并浓缩,生成咖啡色沉淀,过滤出沉淀物,用DMF洗涤,再用少量乙醇洗涤,真空干燥得到相应的三价锰配合物Ba~Bh。
分别将200mg的三价锰配合物Ba~Bh溶于10ml水和5ml甲醇中,加入少量6mol/LNaOH溶液,调节溶液的PH为10,然后室温下搅拌12小时,过滤出沉淀物,滤液中加入少量醋酸,中和至PH=5,用乙酸乙酯提取溶液,有机相用无水硫酸钠干燥,浓缩,得产物,用薄层层析或者柱层析分离,乙酸乙酯/正己烷=1∶1为展开剂,分离出目的产物,用乙酸或者乙醇重结晶,得纯品2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类配体化合物3a~3h。
将上步生成的3a,3b,3c,3d,3h配体化合物2mg分别溶于10ml乙醇,与等体积等摩尔硫酸铜水溶液在室温下形成配合物,常温挥发溶剂,产物以乙醇和去离子水各洗涤三次,即得2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物-铜配合物产物,分别称为3a-Cu,3b-Cu,3c-Cu,3d-Cu和3h-Cu。
配体化合物3a的基本数据:
1H NMR(400MHz,deuteriodimethyl sulfoxide):(br s,2H,OH and NH),8.10(dd,1H,arom H,J=1.6,7.2Hz),7.76(d,1H,arom H,J=5.6Hz),7.65(d,1H,arom H,J=5.6Hz),7.44-7.32(m,3H,arom H),7.10-7.04(m,2H,arom H);13C nmr(100MHz,deuteriodimethyl sulfoxide): .=157.9,151.6,140.7,133.0,131.7,126.2,126.0,123.2,122.3,119.0,117.1,112.5,111.4;EI-MS:m/z(relativeintensity)=210(100,M+),182(20),91(18),78(14).
配体化合物3b的基本数据:
1H NMR(400MHz,deuteriodimethyl sulfoxide):δ=13.35(br s,1H,OH),13.00(s,1H,NH),7.95(d,1H,arom H,J=8.4Hz),7.62(dd,2H,arom H,J=3.2,9.2Hz),7.25(dd,2H,arom H,J=3.2,9.2Hz),6.62(dd,1H,arom H,J=2.4,8.4Hz),6.58(d,1H,arom H,J=2.4Hz),3.80(s,3H,CH3O);13C nmr(100MHz,deuteriodimethyl sulfoxide) .=162.2,159.7,151.6,139.9,132.8,127.5,127.3,122.6,122.4,106.5,105.3,101.4,101.3,55.4;EI-MS:m/z(relative intensity)=240(100,M+),197(24),169(7),143(5),120(6),106(7),65(7).
配体化合物3c的基本数据:
1H NMR(400MHz,deuteriodimethyl sulfoxide):δ=14.68(br s,1H,NH),12.09(br s,1H,OH),7.64(dd,2H,arom H,J=3.2,9.2Hz),7.23(dd,2H,arom H,J=3.2,9.2Hz),6.35(s,2H,arom H),4.01(s,3H,CH3O),3.80(s,3H,CH3O);13C nmr(100MHz,deuteriodimethyl sulfoxide): .=162.3,161.6,158.8,150.2,139.0,132.4,122.3,122.2,116.8,111.9,95.3,94.3,90.2,55.6,55.1;EI-MS:m/z(relative intensity)=270(100,M+),240(16),193(20),143(12),136(20),121(17),78(6),65(5),58(10).
Anal.Calcd.for C15H14N2O3:C,66.66;H,5.22;N,10.36.Found:C,66.38;H,5.31;N,10.13.
配体化合物3d的基本数据:
1H NMR(400MHz,deuteriodimethyl sulfoxide):δ=13.26(br s,2H,OH and NH),8.15(d,1H,aromH,J=2.8Hz),7.80(d,1H,arom H,J=8.4Hz),7.69(d,1H,arom H,J=8.4Hz),7.47(dd,1H,arom H,J=2.8,8.8Hz),7.37(br s,2H,arom H),7.14(d,1H,arom H,J=8.8Hz);13C nmr(100MHz,deuteriodimethyl sulfoxide): .=156.5,150.1,133.2,133.1,125.5,125.4,123.1,123.0,122.6,122.5,119.0,118.9,113.9;EI-MS:m/z(relative intensity)=246(33,M++2),244(100,M+),216(8),181(16),149(7),90(11),57(10).
配体化合物3h的基本数据:
1H nmr(400MHz,deuteriodimethyl sulfoxide):δ=13.24(br s,1H,NH),13.10(br s,1H,OH),8.14(d,1H,arom H,J=2.8Hz),7.59(d,1H,arom H,J=8.0Hz),7.45(br s,1H,arom H),7.39(dd,1H,arom H,J=2.8,8.8Hz),7.12(d,1H,arom H,J=8.0Hz),7.06(d,1H,arom H,J=8.8Hz),2.45(s,3H,CH3);13C nmr(100MHz,deuteriodimethyl sulfoxide):δ=156.4,149.5,133.2,131.1,125.5,125.4,124.7,122.6,122.5,118.9,113.9,113.8,21.3;EI-MS:m/z(relative intensity)=260(31,M++2),258(91,M+),193(97),136(100),107(66),77(33),58(53).
Anal.Calcd.for C14H11ClN2O:C,65.00;H,4.29;N,10.83.Found:C,64.71;H,4.40;N,10.62.
实施例2:化合物4a,4b,4c,4d,4e,4f的共同合成路线及其铜配合物的合成:
分别将300mmol取代水杨醛(1a~1f)在搅拌下溶于125ml的甲醇中,然后加入150mmol的邻萘二胺(2),室温搅拌1小时,生成相应的沉淀物,过滤收集沉淀物,甲醇洗涤,真空干燥得到配体Da~Df。
分别将13mmol的配体Da~Df溶于100ml氯仿中,再加入由2.5g Mn(II)Cl2·4H2O溶于40ml乙醇所制得的溶液,生成褐色溶液,再将此溶液在通入空气的情况下搅拌12小时,得咖啡色溶液,室温搅拌24小时并浓缩,生成咖啡色沉淀,过滤出沉淀物,用DMF洗涤,再用少量乙醇洗涤,真空干燥得到三价锰配合物Ea~Ef。
分别将200mg的三价锰配合物Ea~f溶于10ml水和5ml甲醇中,加入少量饱和的NaOH溶液,调节溶液的PH为10,然后室温下搅拌12小时,过滤出沉淀物,滤液中加入少量醋酸,中和至PH=5,用乙酸乙酯提取溶液,有机相用无水硫酸钠干燥,浓缩,得产物,用薄层层析或者柱层析分离,乙酸乙酯/正己烷=1∶1为展开剂,分离出相应的目的产物,用乙酸或者乙醇重结晶,得纯品4a~4f。
分别将上步生成的4a,4b,4c,4d,4e,4f 2mg溶于10ml乙醇,与等体积等摩尔硫酸铜水溶液在室温下形成配合物,常温挥发溶剂,产物以乙醇和去离子水各洗涤三次,即得2-(2-羟基苯基)萘并咪唑类衍生物-铜配合物产物,分别称为4a-Cu,4b-Cu,4c-Cu,4d-Cu,4e-Cu和4f-Cu。
配体化合物4b的基本数据:
1H nmr(400MHz,deuteriodimethyl sulfoxide):δ=13.50(br s,1H,NH),13.03(br s,1H,OH),8.18(br s,1H,arom H),8.05(d,2H,arom H,J=8.8Hz),8.04(br s,1H,arom H),8.02(m,2H,arom H),7.40(m,2H,arom H),6.68(dd,1H,arom H,J=2.8,8.8Hz),6.63(d,1H,arom H,J=2.8Hz),3.84(s,3H,OCH3);13C nmr(100MHz,deuteriodimethyl sulfoxide):δ=162.8,162.6,156.0,141.6,141.5,130.0,127.98,127.94,127.85,127.82,123.56,123.50,113.67,113.62,106.7,105.2,101.4,55.4;EI-MS:m/z(relative intensity)=290(100,M+),261(120),247(23),219(6),193(4).Anal.Calcd.for C18H14N2O2:C,74.47;H,4.86;N,9.65.Found:C,74.21;H,4.95;N,9.48.
其它配体化合物的基本数据略
实施例3:配合物对NO的选择性
取3a-Cu,3d-Cu,3h-Cu,4b-Cu,溶于DMSO中,至终浓度为1mmol/L。向96孔板中加入各种铜配合物,分别加入亚硝酸盐,铵根,硝酸盐,过氧化氢,ONOO-,NO,而后向全部样品中补加去离子水,使每个孔得到探针浓度是100μmol/L。亚硝酸盐,铵根,硝酸盐,过氧化氢,ONOO-,NO的摩尔量分别为相应探针的100倍。反应1小时后在酶标仪上测定荧光强度,反应后的荧光强度除以原本铜离子复合物的荧光强度,进行荧光值的归一化(normalized)。结果如图1所示,其中,A是3a-Cu、B是3d-Cu、C是3h-Cu、D是4b-Cu。
由图中可以看出,探针3a-Cu,3d-Cu,3h-Cu,4b-Cu对NO具有很高的选择性和灵敏度。
实施例4:配合物3a,3d,3h,4b-Cu与NO反应的荧光图谱:
将探针3a,3d,3h,4b-Cu溶于DMSO中,至终浓度为100μmol/L,与1000当量的NO反应15分钟后,测定荧光强度变化,激发光分别为3a-Cu:316nm,3d-Cu:326nm,3h-Cu:326nm,4b-Cu:353nm。结果如图2,其中,A是3a-Cu、B是3d-Cu、C是3h-Cu、D是4b-Cu。所有的荧光强度进行归一化(normalized)。
由图中可以得出这些配合物的本底荧光强度在一个很低的本底水平,而跟NO反应后,荧光强度在1分钟内即有很显著的增强。这种荧光增强的快速性和明显性说明这几种探针完全可以用于NO的即时测定。
其他配合物(除3b-Cu和3c-Cu外,这两种化合物跟NO反应后不具有荧光增强性)显示出类似的荧光光谱性质。
实施例5:配合物4b-Cu检测细胞内NO的实验:
取4b-Cu配合物溶于DMSO中,浓度为1mmol/L,加入RAW264.7细胞中,探针的终浓度为10μmol/L。RAW264.7细胞以含有10%小牛血清的Dulbecco’s modified Eagle’s medium培养液进行培养。在1~12小时后照荧光照片作为空白对照;用大肠杆菌脂多糖LPS(500ng/ml)刺激RAW264.7细胞后,同样加入终浓度为10μmol/L的4b-Cu,每隔2小时拍摄荧光照片。为了确认4b-Cu在细胞内的荧光增强对应于NO的生成,我们取一部分Raw264.7细胞,在以LPS刺激细胞之前,加入NO合成酶的抑制剂1400w(N-[3-(aminomethyl)benzyl]acetamidine),同步进行荧光观测,结果如图3。
从图3中看,探针4b-Cu的检测结果非常明显,在普通的RAW264.7细胞中,它的荧光强度只有微弱的增强,这可能与RAW264.7细胞本底产生的NO量有关,而在LPS刺激后RAW264.7细胞中,4b-铜复合物的荧光强度有了很大的提高,在10~12小时这个区域内荧光强度达到了一个极大值,这与Lim M.H.等人的结果很吻合(Nature Chemical Biology,2,375-380,2006),而当加入NO合成酶抑制剂1400w后,LPS所诱导的相应荧光强度升高现象消失,证明4b-Cu在细胞内的荧光变化对应于细胞内即时的NO变化,因此很适合作细胞内NO的实时直接检测荧光探针。
实施例6:配合物4b-Cu荧光检测急性肝损伤炎症(Acute Severe Hepatic Injury,ASHI)小鼠肝中NO局部变化(冰冻切片):
取Balb/c小鼠(雄性,8周左右,18~20g),腹腔注射300mg/kg的氨基半乳糖和5μg/kg LPS诱导急性肝损伤,6个小时后,进行肝门静脉注射4b-Cu探针(10mg/kg,溶于DMSO∶生理盐水=1∶1的混合溶液中),半小时后处死小鼠,取肝于-20℃冰冻,接着肝组织浸润于OCT复合物中1小时(Sakura Finetek公司,Torrance,CA),于-22℃以Sakura cm-41冰冻切片机切成4μm厚的薄片,4℃丙酮加于薄片进行组织固定,固定后1小时进行荧光显微镜观测。结果显示于图4。从图4可以看出,急性肝损伤小鼠的肝中4b-Cu的荧光强度有了显著的提高,而正常小鼠肝中荧光强度提高不是很明显。为了验证4b-Cu在体内的荧光强度变化也是NO相关的,我们以三氯化钆(GdCl3)(10mg/kg)预先24小时尾静脉注射Balb/c小鼠,去除NO生成细胞:Kupffers细胞,再以GalN+LPS诱导急性肝损伤炎症。诱导后半小时,仍然通过肝门静脉注射4b-Cu探针10mg/kg,由于巨噬细胞的消除,肝冰冻切片中的强荧光消失,证明4b-Cu探针在急性肝损伤中确实检测的是肝中的NO变化,仍参见于图4。在急性肝损伤中,肝脏组织是免疫细胞(尤其是巨噬细胞)的攻击对象,急性的炎症也会伴随着组织中NO浓度的大大升高。这与4b-铜复合物的检测结果是一致的。
实施例7:4b-Cu和NO反应机理的测定:
为了测定和NO反应后物质的结构,我们通过MALDI-TOF(基质辅助的激光解离/离子化飞行质谱,Bruker Autoflex II time-of-flight(TOF)质谱仪(Bruker Daltonics,Billerica,MA)测定了4b-Cu和NO反应前后分子量的变化。激发激光波长为λ=337nm,α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)作为保护基质,在点样板上的上样量为基质1μl,复合物0.5μl。结果参见图5(A)和(B)。与原化合物对比,对于4b-铜配合物而言,m/z(4b)是289.887,m/z=351.893代表了[4b+Cu2+-H+],m/z=633.962代表[2(4b)+Cu2+-2H+],and m/z=319.415代表[4b+NO-H+]。
同时,以Nexus 870FT-IR傅立叶变换红外测定仪测定4b-Cu和NO反应前后的光谱变化。结果参见图5(C)和(D)。与原化合物对比,3347.2cm-1峰的变形,以及1500cm-1,1103.0cm-1处峰的出现,证明了-N-N=O基团的产生,结合分子量变化的结果,可推测反应后产物结构如下:
Claims (4)
1.一种用于测定一氧化氮生成的荧光探针的合成方法,其特征在于该荧光探针是二价铜离子Cu2+与有机配位体2-(-2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物形成的铜配合物,其结构为式(I)或(II):
合成方法如下:
a.分别将300mmol取代水杨醛1a-d在搅拌下溶于125ml的甲醇中,然后加入150mmol的取代邻苯二胺2a或2b用于制备式(I)的铜配合物;或分别将300mmol取代水杨醛1a-d,1e,1f在搅拌下溶于125ml的甲醇中,然后加入150mmol的取代邻萘二胺2c用于制备式(II)的铜配合物,室温搅拌1小时,生成相应的沉淀物,过滤收集沉淀物,甲醇洗涤,真空干燥得到配体Aa-h或Da-f;
b.将13mmol的配体Aa-h或Da-f溶于100ml氯仿中,再加入由2.5g Mn(II)Cl2·4H2O溶于40ml乙醇所制得的溶液,生成褐色溶液,再将此溶液在通入空气的情况下搅拌12小时,得咖啡色溶液,室温搅拌24小时并浓缩,生成咖啡色沉淀,过滤出沉淀物,用DMF洗涤,再用少量乙醇洗涤,真空干燥得到三价锰配合物Ba-h或Ea-f;
c.将200mg以上得到的三价锰配合物B溶于10ml水和5ml甲醇中,加入少量6mol/L NaOH溶液,调节溶液的PH为10,然后室温下搅拌12小时,过滤出沉淀物,滤液中加入少量醋酸,中和至PH=5,用乙酸乙酯提取溶液,有机相用无水硫酸钠干燥,浓缩,得产物,用薄层层析或者柱层析分离,乙酸乙酯/正己烷=1∶1为展开剂,分离出目的产物,用乙酸或者乙醇重结晶得到2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物3a-h或4a-f;
d.分别取上步生成的2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物3a-h或4a-f2mg溶于10ml乙醇,与等体积等摩尔硫酸铜水溶液在室温下形成配合物,常温挥发溶剂,产物以乙醇和去离子水各洗涤三次,即得2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物-铜配合物产物3a-h-Cu或4a-f-Cu;
具体合成路线如下:
2.一种权利要求1所述方法合成的荧光探针的应用,其特征在于:在各类非生物环境中,利用所述的铜配合物荧光探针捕获体系中的NO,使得荧光探针的荧光强度显著增强,然后通过荧光测定法来确定NO的产生。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述荧光测定法除了常规的荧光测定法外,还包括时间分辨荧光测定法及时间分辨荧光显微镜成像测定法。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:应用于化学体系中的NO的检测。
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于瑞林等.三价锰存在下2-(1H-苯并咪唑-2-基)-苯酚及其衍生物的合成与其光谱特性.《天津理工大学学报》21 6.2005,21(6),44-47. * |
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