CN102827209B - Hdppz配体的钌配合物作为单线态氧荧光探针的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Hdppz配体的钌配合物作为单线态氧荧光探针的应用。该配合物以过渡金属钌为中心离子，以6-羟基-二吡啶并(3，2-a：2′，3′-c)吩嗪(Hdppz)为配体，通过其羟基与单线态氧作用，使配合物的荧光强度发生很大的变化，进而进行单线态氧的荧光测定。该钌配合物用于检测单线态氧具有可见光激发，选择性好，灵敏度高，检测手段简单等优点，适宜中性和碱性体系中单线态氧的测定。
Description
技术领域
本发明涉及水溶液中单线态氧(1O2)的测定，具体涉及一种吩嗪衍生物配体的钌金属配合物单线态氧荧光探针的制备及其应用。
背景技术
单线态氧是氧分子处于高能激发态的一种不稳定的存在形式，其化学性质很活泼，较基态氧更不稳定，是通常所说的活性氧物种之一。活性氧物种在正常的人体细胞中含量很少，在健康的人体中处于平衡状态，而且这些体内产生的活性氧对生命活动具有重要的作用，它们在体内参与多种多样的生理活动，如信号的传导，神经传递，肌肉紧张的调节、蠕动，血小板的聚合以及血压高低的调节，免疫系统的控制，学习记忆，能量的产生，细胞规律的分裂生长等。但是一旦这一平衡被打破，它们就可能对人体产生伤害作用，导致膜脂过氧化或脱脂化，造成膜差别透性丧失、离子大量外渗、代谢紊乱等一系列生理变化，严重时导致细胞死亡。单线态氧作为有机化学中一种珍贵试剂，在许多光化学和光生物反应，如光降解、污染物的光转化、化学发光、生物体氧化老化、甚至是光致癌作用等过程中，都扮演着十分重要的角色。在有机合成中，单线态氧使得在高度立体专一的有机化合物中引入氧变得极为容易。在生物体系中，单线态氧对生命体系有着重大的影响。单线态的生理学氧化作用越来越受到研究者的关注。单线态氧在细胞损伤和凋亡中起着重要的作用，它对机体可能造成强氧化性损伤，从而引起机体脂质过氧化作用的发生，导致生物膜、小动脉、DNA、蛋白质和中枢神经系统的损伤，加快机体的衰老和死亡，因此被认为是体内重要的毒性物种，能引发与氧化损伤有关的疾病，如白内障、肺水肿、糖尿病、肌肉萎缩、营养缺乏、精神病和肿瘤萌生等[(a)K.Briviba，L.O.Klotz，H.Sies，Toxic and signalingeffects of photochemically or chemically generated singlet oxygen in biological systems，Biol.Chem.，1997，378，1259.b)J.R.Wagner，P.A.Motchnik，R.Stocker，H.Sies，B.N.Ames，Theoxidation of blood plasma and low density lipoprotein components by chemically generatedsinglet oxygen，J.Biol.Chem.，1993，268，18502.c)A.Gomes，E.Fernandes，JoséL.F.C.Lima，Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species，J.Biochem.Biophys.Methods.，2005，65，45.]。单线态氧在细胞的增生、分化、凋亡等调控中也起重要作用，被认为是一种新的第二信使[(a)R.W.Redmond，I.E.Kochevar，Spatially resolved cellular responses tosinglet oxygen，Photochem.Photobiol.，2006，82(5)，1178-1186.(b)N.L.Oleinick，R.L.Morris，I.Belichenko，The role of apoptosis in response to photodynamic therapy：what，where，why，and how，Photochem.Photobiol.Sci.，2002，1，1-21.]。相反，也可以利用单线态氧的强氧化性来杀死体内的病毒细胞。科学家已经利用单线态氧这种强氧化性来治疗肿瘤，实验表明恶性细胞获取并结合单线态氧的敏化剂药物的能力显著地大于正常组织分子，这样通过光照后，药物分子产生的单线态氧就能选择性地杀死肿瘤细胞，这种光动力学治疗技术在肿瘤的诊断和治疗中具有广泛的应用前景，目前已应用于下生殖道癌前病变、原位癌和晚期恶性肿瘤，如外阴癌和卵巢癌等许多部位的诊断和治疗[a)D.G.J.E.J.D.Dolmans，R.K.J.Fukumura，timeline：Photodynamic therapy for cancer，Nat.Rev.Cancer，2003，3，380.b)A.P.Castano，P.M.Mroz，R.Hamblin，Photodynamic therapy and anti-tumour immunity.Nat.Rev.Cancer，2006，6，535.c)N.Nishiyama，W.D.Jang，K.Kazunori，Supramolecular nanocarriersintegrated with dendrimers encapsulating photosensitizers for effective photodynamic therapy andphotochemical gene delivery.New J.Chem.，2007，31，1074.d)T.Oba，Photosensitizernanoparticles for photodynamic therapy.Curr.Bioact.Comp.，2007，3，239.]。医学上，用亚甲基蓝(methylene blue，MB)光敏化法产生的1O2来对血浆消毒和肿瘤的光动力学诊断[L.C.Harber，A.S.Fleischer，R.L.Baer，Erythropoietic protoporphyria and photohemolysis.J.Am.Med.Assoc.，1964，189，191.]。这种光动力学治疗技术在肿瘤的诊断和治疗中具有广泛的应用前景。单线态氧与人类健康和疾病密切相关，是当前生命科学和化学科学交叉研究的热点。
由于单线态氧在光化学和光生物过程中具有如此重要的地位，1O2检测倍受关注，特别是生物体系中1O2的检测越来越引起科研工作者的关注。研发高灵敏度和选择性好的单线态氧的小分子荧光探针具有重要意义，它能实时地给出单线态氧靶向细胞体系内生物大分子的重要空间分布信息，能够适时准确地检测体内单线态氧的含量，对于某些疾病的预防、诊断以及病理的研究都有十分重要的指导意义[K.Tanaka，T.Miura，N.Umezawa，Y.Urano，K.Kikuchi，T.Higuchi，T.Nagano，Rational design of fluorescein-based fluorescence probes，Mechanism-based design of a maximum fluorescence probe for singlet oxygen，J.Am.Chem.Soc.，2001，123(11)，2530.]。目前已报道的用于检测单线态氧的方法主要有以下几种：
(1)磷光光度法。磷光光度法的原理是：处于激发态氧分子的单线态氧，其能量高于基态氧分子，电子由激发态跃迁回基态时，以光的形式释放能量而发出磷光。它利用单线态氧自身淬灭在1268nm处产生的近红外磷光进行检测，此法最直接，对生物体无侵害，选择性高，被认为是检测单线态氧的标准方法。但灵敏度低、检出信号弱、无法用于很低浓度1O2的检测[K.Andersen，Z.Cao，P.R.Ogilby，L.Poulsen，I.Zebger，J.Phys.Chem.A.2002，106，8488.]。
(2)化学捕获吸光光度法。此方法是利用9，10-二苯基蒽(DPA)与1O2的特征性反应生成稳定的内过氧化物引起DPA吸收光谱的变化，通过检测DPA吸收光谱的变化来测量1O2，此法选择性好，灵敏度比1268nm磷光探测高[M.J.Steinbeck，A.U.Khan，M.J.Karnovsky，Extracellular production of singlet oxygen by stimulated macrophages quantifiedusing 9，10-diphenylanthracene and perylene in a polystyrene film，J.Biol.Chem.，1993，268(21)，15649.]。该方法已被用于测定刺激性吞噬细胞中的单线态氧的含量[a)M.J.Steinbeck，A.U.Khan，M.J.Karnovsky，Intracellular singlet oxygen generation by phagocytosing neutrophils inresponse to particles coated with a chemical trap.J.Biol.Chem.，1992，267，13425.b)M.J.Steinbeck，A.U.Khan，M.J.Karnovsky，Extracellular production of singlet oxygen by stimulatedmacrophages quantified using 9，10-diphenylanthracene and perylene in a polystyrene film.J.Biol.Chem.，1993，268，15649.]。但是，此法是基于吸收光谱，所以灵敏度仍然较低。
(3)有机荧光探针法。典型的有机荧光探针9，10-Dimethylanthracene(DMA)，DMA是一种荧光化合物(λex/λem＝375/436)，能选择性地与单线态氧反应生成其内过氧化物，本身荧光消失。近年来，利用荧光信号为检出手段的有机荧光探针法包括两类：(a)利用1O2与带有蒽环的荧光素类探针分子专一性反应，使得探针由原来的非荧光性分子变为强荧光性分子，从而用于1O2的检测[N.Umezawa，K.Tanaka，Y.Urano，K.Kikuchi，T.Higuchi，T.Nagano，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1999，38，2899；K.Tanaka，T.Miura，N.Umezawa，Y.Urano，K.Kikuchi，T.Higuchi，T.Nagano，J.Am.Chem.Soc.2001，123，2530.]。该方法检测时间短，灵敏度高，但不适用于低pH值环境和实时检测。(b)利用荧光探针分子间的能量传递，激发探针分子发出强的迟滞荧光，进而用于检测1O2[A.A.Krasnovskii，C.Schweitzer，H.Leismann，C.Tanielian，E.A.Luk’yanets，Quantum Electron.，2000，30，445；A.A.Krasnovskii，M.E.Bashtanov，N.N.Drozdova，O.A.Yuzhakova，E.A.Luk’yanets，Quantum Electron.，2002，32，83.]。这类探针主要有酞菁染料和紫菜嗪衍生物等，当接收到单线态氧的能量后能在700nm附近发出荧光用于检测。
(4)化学发光探针法。这是一类基于光诱导电子转移机理的单线态氧荧光探针[X.H.Li，G.X.Zhang，H.M.Ma，D.Q.Zhang，J.Li，D.B.Zhu，J.Am.Chem.Soc.2004，126，11543.]，这类探针检测速度快且具有很高的灵敏度和很好的选择性，但水溶性差，不利于生物体系中1O2的测定。
(5)稀土荧光探针。袁景利小组基于稀土荧光配合物的长寿命荧光特征，制备了一系列稀土荧光探针，利用时间分辨荧光检测技术测定单线态氧已取得较好的效果[袁景利，宋波，王桂兰，谭明乾，一种基于铕配合物的单线态氧荧光探针及其应用，中国发明专利，申请号200510130851.9；袁景利，宋波，王桂兰，一种单线态氧铕配合物荧光探针及其应用，中国发明专利，申请号：200510045768.1；袁景利，宋波，王桂兰，一种铽配合物单线态氧荧光探针及其应用，中国发明专利，申请号200510045767.7]，这类配合物的激发波长处于紫外区，测定1O2时，对生物体系有损伤[B.Song.G.L.Wang.M.Q.Tan.J.L.Yuan.NewJ.Chem.2005，29，1431.]。
我们最近报道了一个铼(I)配合物的单线态氧荧光探针[Y.J.Liu，K.Z.Wang，Eur.J.Inorg.Chem.，2008，5214.]和一个中国发明专利申请[王科志，刘艳菊，陈春辉，钌和铱金属配合物单线态氧荧光探针的制备及其应用，中国发明专利，申请号200810240591.4]。这些配合物虽可在可见光激发下检测单线态氧，但无单线态氧存在时该配合物表现出较大的背景荧光，且水溶性、单线态氧的检测灵敏度与选择性仍需进一步改进。因此进一步制备具有水溶性好、灵敏度高、选择性好，适用范围广，可见光激发的单线态氧荧光探针具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是开发荧光增强倍数大和1O2检测限低的新型1O2荧光探针。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
将含有Hdppz配体的钌配合物作为单线态氧荧光探针，对物质体系中的单线态氧进行定性和定量分析。所述钌配合物的结构通式为[RuAmLn]Xk，其中：X为抗衡离子；L为6-羟基-二吡啶并(3，2-a：2′，3′-c)吩嗪(6-Hydroxy-dipyrido[3，2-a：2′，3′-c]phenazine，简称Hdppz)，其结构如式I所示；A为N^N辅助配体；m＝0或2，n＝1或3，且m+n＝3；k＝1或2。
上述A为辅助配体，常用的N^N辅助配体例如联吡啶(bpy)和邻菲咯啉(phen)，但并不限于这两种配体。
上述抗衡离子X多为负一价的阴离子，例如Cl-，PF6 -，ClO4 -，NO3 -，BF4 -，CF3SO3 -。当X为负一价阴离子时，k＝2；当X为负二价阴离子时，k＝1。
本发明的配合物的具体例子例如：
1a：[Ru(Hdppz)3]Cl2，即通式[RuAmLn]Xk中m＝0，n＝3，L为Hdppz，X＝Cl-，k＝2，该配合物的结构式如下：
1b：[Ru(bpy)2(Hdppz)](PF6)2，即通式[RuAmLn]Xk中m＝2，n＝1，A为联吡啶(bpy)，L为Hdppz，X＝PF6 -，k＝2，该配合物的结构式如下：
1c：[Ru(phen)2(Hdppz)]Cl2，即通式[RuAmLn]Xk中m＝2，n＝1，A为邻菲咯啉(phen)，L为Hdppz，X＝Cl-，k＝2，该配合物的结构式如下：
上述钌配合物[RuAmLn]Xk的制备方法如下：
在氮气保护下，将[Ru(A)m]Cl(3-m/2)与配体L在溶剂中加热至100-140℃进行配位反应，反应结束后，加入含有抗衡阴离子X的盐，搅拌反应一定时间。粗产品再重结晶或是柱层析(硅胶或氧化铝)提纯，获得本发明的钌配合物。
上述配位反应的溶剂例如乙二醇、乙醇、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈等；配位反应的时间一般为8小时或者更长，例如24h以上。
本发明发现以过渡金属钌为中心离子，以Hdppz为配体的配合物具有单线态氧荧光探针的性能，适用于中性和碱性体系的水溶液中1O2定性或定量测定。
该以Ru为中心离子的单线态氧荧光探针的应用过程为：在中性或碱性溶液中，利用所述的配合物作为荧光探针捕获体系中的1O2后，使体系的荧光强度显著增强，通过可见光激发的荧光测定法可以检测体系中的1O2。具体步骤是：
1.在已知的能有效产生单线态氧的中性或碱性体系中加入本发明的配合物，在一系列的单线态氧浓度条件下，通过可见光激发测定体系的荧光强度和吸光度，得到相对应的荧光量子效率，获得荧光量子效率相对于单线态氧浓度的标准曲线；
2.在含所述配合物的中性或碱性缓冲溶液中加入一定量的待测溶液，通过可见光激发测定体系的荧光强度和吸光度，计算得到其荧光量子效率；
3.根据步骤2测得的荧光量子效率的值，通过步骤1获得的标准曲线确定待测溶液中含有的单线态氧的量。
上述步骤1和2中荧光量子效率可通过如下公式计算得出：
Φs＝Φstd(Astd/As)(Is/Istd)(hs/hstd)2
其中，下标s和std分别表示待测体系和标准物质，φ为荧光量子效率，A为激发波长处的吸光度，I为发射的荧光强度，η为溶液的折光率。以[Ru(bpy)3]2+为标准物质，其水溶液的荧光量子效率是φstd＝0.028，在Astd、Istd、ηstd和ηs已知的情况下，通过测定待测体系在激发波长处的吸光度As和荧光强度Is，即可计算得到其荧光量子效率φs。
本发明采用Hdppz为配体的钌配合物作为单线态氧荧光探针，其水溶性好而本身荧光很弱，可见光激发且与单线态氧反应后导致荧光强度大幅度增强。其优点主要有：
1、水溶性好，该钌配合物探针易溶于水，可在各种缓冲溶液中使用，克服了水不溶性荧光探针需要加入有机溶剂帮助溶解而对测定带来的干扰，非常适用于生物体系中1O2的测定。
2、具有较好的选择性，与其他的活性氧物种(H2O2，·OH，ONOO-)作用荧光信号几乎无变化。
3、具有较高的单线态氧检测灵敏度，检测下限可达19.5nM。
4、探针与1O2作用后荧光强度增强因子大，最高可达170倍。
附图说明
图1为在中性和碱性体系中单线态氧对配合物[Ru(Hdppz)3]Cl2(12.4×10-6M)紫外-吸收光谱的影响，其中：(a)是在pH＝6.75的50mM Tris-HCl缓冲溶液中的紫外-可见吸收光谱的变化；(b)是在pH＝10.3的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的紫外-可见吸收光谱的变化。
图2为在中性和碱性体系中单线态氧对配合物[Ru(Hdppz)3]Cl2(12.4×10-6M)荧光发射光谱的影响，其中：(a)是在pH＝6.75的50mM Tris-HCl缓冲溶液中的荧光发射光谱的变化；(b)是在pH＝10.3的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的荧光发射光谱的变化。
图3为在中性和碱性体系中的配合物[Ru(Hdppz)3]Cl2(12.4×10-6M)的荧光强度与体系中单线态氧浓度之间的关系，其中：(a)是在pH＝6.75的50mM Tris-HCl缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光强度之间的关系；(b)是在pH＝10.3的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光强度之间的关系。
图4为在中性和碱性体系中的配合物[Ru(Hdppz)3]Cl2(12.4×10-6M)的荧光量子效率与体系中单线态氧浓度之间的关系，其中：(a)是在pH＝6.75的50mM Tris-HCl缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光量子效率之间的关系；(b)是在pH＝10.3的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光量子效率之间的关系。
图5为在中性和碱性体系中配合物[Ru(Hdppz)3]Cl2(12.4×10-6M)与活性氧物种([ROS]＝0.1mM)的作用，其中：(a)是在pH＝6.75的50mM Tris-HCl缓冲溶液中；(b)是在pH＝10.3的0.1M碳酸盐缓冲溶液中。
图6为在中性和碱性体系中单线态氧对配合物[Ru(bpy)2(Hdppz)](PF6)2(8.8×10-6M)紫外-吸收光谱的影响，其中：(a)是在pH＝7.03的50mM Tris-HCl缓冲溶液中的紫外-可见吸收光谱的变化；(b)是在pH＝10.5的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的紫外-可见吸收光谱的变化。
图7为在中性和碱性体系中单线态氧对配合物[Ru(bpy)2(Hdppz)](PF6)2(8.8×10-6M)荧光发射光谱的影响，其中：(a)是在pH＝7.03的50mM Tris-HCl缓冲溶液中的荧光发射光谱的变化；(b)是在pH＝10.5的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的荧光发射光谱的变化。
图8为在中性和碱性体系中的配合物[Ru(bpy)2(Hdppz)](PF6)2(8.8×10-6M)的荧光强度与体系中单线态氧浓度之间的关系，其中：(a)是在pH＝7.03的50mM Tris-HCl缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光强度之间的关系；(b)是在pH＝10.5的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光强度之间的关系。
图9为在中性和碱性体系中的配合物[Ru(bpy)2(Hdppz)](PF6)2(8.8×10-6M)的荧光量子效率与体系中单线态氧浓度之间的关系，其中：(a)是在pH＝7.03的50mM Tris-HCl缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光量子效率之间的关系；(b)是在pH＝10.5的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光量子效率之间的关系。
图10为在中性和碱性体系中配合物[Ru(bpy)2(Hdppz)](PF6)2(8.8×10-6M)与活性氧物种([ROS]＝1.5mM)的作用，其中：(a)是在pH＝7.03的50mM Tris-HCl缓冲溶液中；(b)是在pH＝10.5的0.1M碳酸盐缓冲溶液中。
图11为在中性和碱性体系中单线态氧对配合物[Ru(phen)2(Hdppz)]Cl2(13.2×10-6M)紫外-吸收光谱的影响，其中：(a)是在pH＝6.75的50mM Tris-HCl缓冲溶液中的紫外-可见吸收光谱的变化；(b)是在pH＝10.3的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的紫外-可见吸收光谱的变化。
图12为在中性和碱性体系中单线态氧对配合物[Ru(phen)2(Hdppz)]Cl2(13.2×10-6M)荧光发射光谱的影响，其中：(a)是在pH＝6.75的50mM Tris-HCl缓冲溶液中的荧光发射光谱的变化；(b)是在pH＝10.3的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的荧光发射光谱的变化。
图13为在中性和碱性体系中的配合物[Ru(phen)2(Hdppz)]Cl2(13.2×10-6M)的荧光强度与体系中单线态氧浓度之间的关系，其中：(a)是在pH＝6.75的50mM Tris-HCl缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光强度之间的关系；(b)是在pH＝10.3的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光强度之间的关系。
图14为在中性和碱性体系中的配合物[Ru(phen)2(Hdppz)]Cl2(13.2×10-6M)在一定范围内荧光强度对数值与体系中单线态氧浓度对数值之间的关系，其中：(a)是在pH＝6.75的50mM Tris-HCl缓冲溶液中单线态氧浓度对数值与体系荧光强度对数值之间的关系；(b)是在pH＝10.3的0.1M碳酸盐缓冲溶液中单线态氧浓度对数值与体系荧光强度对数值之间的关系。
图15为在中性和碱性体系中的配合物[Ru(phen)2(Hdppz)]Cl2(13.2×10-6M)的荧光量子效率与体系中单线态氧浓度之间的关系，其中：(a)是在pH＝6.75的50mM Tris-HCl缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光量子效率之间的关系；(b)是在pH＝10.3的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光量子效率之间的关系。
图16为在中性和碱性体系中配合物[Ru(phen)2(Hdppz)]Cl2(13.2×10-6M)与活性氧物种([ROS]＝0.1mM)的作用，其中：(a)是在pH＝6.75的50mM Tris-HCl缓冲溶液中；(b)是在pH＝10.3的0.1M碳酸盐缓冲溶液中。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步说明。
实施例一、配合物[Ru(Hdppz)3]Cl2的合成。
合成路线如下所示：
基本操作过程如下：
配体Hdppz是按文献[M.J.Han，Y.M.Chen，Ke-Zhi Wang*，Ruthenium(II)complexes of6-hydroxyl-dipyrido[3，2-a：2′，3′-c]phenazine：self association，and concentration-dependentacid-base and DNA-binding properties，New J.Chem.，2008，32(6)，970-980.]合成的。
将配体Hdppz(0.070g，0.023mmol)溶于120mL乙醇-水(1/1)的混合溶液中，加热至全溶后加入RuCl3·3H2O(0.020g，0.008mmol)，氮气保护，回流反应20小时。热过滤，少量活性炭处理后，将溶剂蒸干，得到粗产品为橘红色固体。接着用无水甲醇重结晶两遍，得到产品为红色粉末(0.030mg，42％)。氢核磁共振谱(δH，ppm，500Hz，DMSO-d6)：11.03(s，1H)，10.01(d，1H)，9.61(d，1H)，8.36(m，2H)，8.02(m，2H)，7.95(s，2H)，7.46(d，2H)；元素分析C54H30Cl2N12O3Ru·8H2O·4CH3OH(F.W＝1339.16)。计算值：C，52.01；N，12.55；H，4.66。测量值：C，52.36；N，12.08；H，3.90。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱：m/z＝995.5([M-2Cl-+H+]+)，m/z＝498.4([M-2Cl-]2+)。红外光谱(KBr压片，cm-1)：3420vs，1590s，1425m，1088vs。
实施例二、配合物[Ru(bpy)2(hdppz)](PF6)2的合成。
合成路线如下所示，基本操作过程见文献[M.J.Han，Y.M.Chen，Ke-Zhi Wang*，Ruthenium(II)complexes of 6-hydroxyl-dipyrido[3，2-a：2′，3′-c]phenazine：self association，andconcentration-dependent acid-base and DNA-binding properties，New J.Chem.，2008，32(6)，970-980.]。
实施例三、配合物[Ru(phen)2(Hdppz)]Cl2的合成。
合成过程参考文献[X.W.Liu，J.Li，H.Li，K.C.Zheng，H.Chao，L.N.Ji，Synthesis，characterization，DNA-binding and photocleavage of complexes[Ru(phen)2(6-OH-dppz)]2+and[Ru(phen)2(6-NO2-dppz)]2+.J.Inorg.Biochem.，2005，99(12)，2372-2380.]进行。具体为：将配体Hdppz(0.080g，0.27mmol)溶于150ml乙醇-水(1/1)的混合溶液中，加热至全溶后加入Ru(phen)2Cl2·2H2O(0.152g，0.27mmol)，氮气保护，回流反应10小时，反应溶液逐渐由黑紫色转变成黑红色透明溶液。热过滤后，将溶剂蒸干得紫红色粗产品。然后乙醇/乙醚扩散重结晶两次，得0.217g橘红色粉末(产率97％)。氢核磁共振谱(δH，ppm，500Hz，DMSO-d6)：11.01(s，1H)，9.98(d，1H)，9.57(d，1H)，8.80(t，4H)，8.41(s，4H)，8.28(s，3H)，8.16(d，1H)，8.14(d，1H)，8.05(d，2H)，8.02(d，1H)，7.90(m，3H)，7.78(m，4H)，7.45(d，1H)。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱：m/z＝760([M-2Cl-+H+]+)，m/z＝380([M-2Cl-]2+)。红外光谱(KBr压片，cm-1)：3415vs，1590s，1120vs，1100vs。紫外-可见吸收光谱(溶剂：水)，λmax/nm(ε×10-4/L·mol-1·cm-1)：330(2.3119)；450(1.4026)。
实施例四、配合物探针在缓冲溶液中单线态氧的方法和检测性能
1、以Ru(phen)2(Hdppz)Cl2为例，介绍本发明配合物作为荧光探针在中性和碱性溶液中检测单线态氧的方法和检测性能。
中性体系中1O2的检测：首先在含有10mM NaOCl的pH＝6.75的Tris-HCl缓冲溶液中加入配合物，然后在该体系中加入H2O2，H2O2/NaOCl体系在中性溶液中单线态氧产率几乎是100％[A.M.Held，D.J.Halko，J.K.Hurst，J.Am.Chem.Soc.1978，100，5732-5740.]。随着H2O2的加入，体系中不断产生1O2，所产生的1O2与配合物作用，测得其紫外-可见吸收光谱的变化如图11(a)所示。随着单线态氧的加入，330nm处的吸光度值迅速下降，之后便保持在一个稳定的值附近波动，而450nm处的MLCT特征吸收峰的吸光强度变化很小。从而，证明羟基是与1O2反应的活性基团；同时体系在610nm处的荧光强度逐渐增强，增强倍数约为19.6(如图12(a)所示)。
碱性体系中1O2的检测：在含有10mM Na2MoO4的pH＝10.3的碳酸盐缓冲溶液中加入配合物，然后在体系中加入H2O2，H2O2/Na2MoO4体系在碱性溶液中能有效的产生单线态氧[K.Tanaka，T.Miura，N.Umezawa，Y.Urano，K.Kikuchi，T.Higuchi，T.Nagano，J.Am.Chem.Soc.，2001，123，2530-2536；M.Q.Tan，B.Song，G.L.Wang，J.L.Yuan，Free Radic.Biol.Med.，2006，40，1644-1653.]。随着H2O2的加入，体系不断产生1O2，所产生的1O2与配合物作用，同样可以看到，在其紫外可见光谱(见图11(b))中，330nm附近的吸光度值迅速下降，之后便保持在一个稳定的值附近波动，而450nm处的MLCT特征吸收峰的吸光强度变化很小；而同时体系的荧光强度逐渐增强，增强倍数约为39.6(见图12(b))。
配合物在中性和碱性溶液中对单线态氧均有较好的检测性能，参见图11～图16，中性条件下的单线态氧是由H2O2/NaClO体系在pH＝6.75的50mM Tris-HCl缓冲溶液产生的；碱性环境中单线态氧可由H2O2/Na2MoO4体系在pH＝10.3的0.1M的碳酸盐缓冲溶液产生。测定用仪器为GBC Cintra 10e紫外-可见分光光度计和Cary Eclipse荧光分光光度计。在中性(碱性)缓冲溶液中加入H2O2体系即会产生1O2，随着1O2浓度的逐渐增加，其与配合物不断作用，使得配合物紫外可见光谱中，330nm左右的吸光度值迅速下降，而450nm处的MLCT特征吸收峰的吸光强度变化很小。这个变化可归因于配体Hdppz所含的羟基被单线态氧氧化成为了羰基，产生了新的n→π*跃迁，而原来的π→π*跃迁消失，所以吸光度值降低且峰位发生了红移。而荧光光谱方面，在未加入H2O2，即还未产生1O2时体系的荧光发射很弱，随着1O2浓度的增加，610nm处的发射强度逐渐增强，如图12所示，中性和碱性体系中在有单线态氧和无单线态氧存在时，荧光强度增强倍数分别达到19.6和39.6。这是因为，未与单线态氧反应时的配合物[Ru(phen)2(Hdppz)]Cl2含有羟基等基团，易和水形成氢键，发生质子转移反应，所以其MLCT的三重态的能量都以非辐射的形式消耗，发光极弱。而加入了单线态氧后，原配合物被氧化，羟基被破坏，所以荧光性质发生了明显的变化。而且，磷光强度的对数值与单线态氧浓度的对数值在一定的浓度范围内(21.9μM～1.28mM)成很好的线性关系，线性相关系数最大可达0.9993。因此，若将图13或14中的曲线作为标准曲线，可以以Ru(phen)2(Hdppz)Cl2为探针在中性和碱性条件下测定任一未知体系中的单线态氧浓度。
根据如下公式计算出该体系的荧光量子效率：
φs＝φstd(Astd/As)(Is/Istd)(ηs/ηstd)2
上式中，下标s和std分别代表待测体系和标准物质，φ为量子效率，A为激发波长处的吸光度，I为荧光发射强度，η为溶液的折光率。以[Ru(bpy)3]2+为标准物质，其水溶液的荧光量子效率是φstd＝0.028，在Astd、Istd、ηstd和ηs已知的情况下，通过测定待测体系在激发波长处的吸光度As和荧光发射强度Is，即可计算得到其量子效率φs。配合物Ru(phen)2(Hdppz)Cl2(13.2×10-6M)在中性和碱性条件下的量子效率与单线态氧浓度之间的关系如图15所示。这里，亦可将图15中的曲线作为标准曲线，用以在中性和碱性条件下测定任一未知体系中的单线态氧浓度。
配合物与活性氧物种的作用实验中，配合物与H2O2，·OH，ONOO-等活性氧物种作用时体系荧光强度变化很小，而配合物与1O2作用后体系的荧光大大增强，如图16所示，这表明配合物对1O2具有很好的选择性。在中性和碱性条件下对1O2的检测最低浓度根据背景标准偏差的三倍计算分别为66.8nM和172nM，表明该配合物对1O2具有很高的灵敏度。
2、与配合物Ru(phen)2(Hdppz)Cl2在溶液中检测单线态氧的方法相同，其余配合物的单线态氧检测性能如下表所示：
Claims (4)
1.钌配合物[RuAm(Hdppz)n]Xk作为单线态氧荧光探针的用途，其中Hdppz是6-羟基-二吡啶并(3,2-a:2',3'-c)吩嗪配体，其结构如式I所示；A为联吡啶或邻菲咯啉；X为抗衡离子，所述抗衡离子选自Cl-，PF6 -，ClO4 -，NO3 -，BF4 -和CF3SO3 -中的一种；m＝0或2，n＝1或3，且m+n＝3；k＝2；
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述钌配合物[RuAm(Hdppz)n]Xk是下列配合物1a、1b和1c之一：
3.如权利要求1～2任一所述的用途，其特征在于，利用所述钌配合物测定中性或碱性水溶液中单线态氧的含量，包括以下步骤：
1)在已知的能有效产生单线态氧的中性或碱性溶液体系中加入所述钌配合物，在一系 列的单线态氧浓度条件下，通过可见光激发测定体系的荧光强度和吸光度，得到相对应的荧光量子效率，获得荧光量子效率相对于单线态氧浓度的标准曲线；
2)在含所述钌配合物的中性或碱性缓冲溶液中加入一定量的待测溶液，通过可见光激发测定其荧光强度和吸光度，计算出荧光量子效率；
3)根据步骤2)测得的荧光量子效率的值，通过步骤1)获得的标准曲线确定待测溶液中单线态氧的含量。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述步骤1)和2)中荧光量子效率通过如下公式计算得出：
φs＝φstd(Astd/As)(Is/Istd)(ηs/ηstd)2
其中，下标s和std分别表示待测体系和标准物质，φ为荧光量子效率，A为激发波长处的吸光度，I为发射的荧光强度，η为溶液的折光率。
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