CN101565453B - 具有捕获自由基功能的硝酮类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有捕获自由基功能的硝酮类化合物及其制备方法与应用。该硝酮类化合物的结构如式(I)所示。式(I)中R为PLP或PLP-LF的化合物可作为自由基捕获探针，其中，PLP代表含巯基的多肽或蛋白质，LF代表荧光物质。本发明将具有捕获超氧阴离子自由基功能的磷酰基取代线性硝酮与多肽片段和荧光素衍生物三体共价结合，进而在多肽分子识别导向作用下实现活性自由基的电子自旋共振(ESR)和荧光探测及成像多功能分析。实验表明，此系列的自由基捕获探针不单具有高效的自由基捕获能力(包括对十分重要的超氧阴离子自由基)，并且能够在完整细胞或细胞器体系内用于活性自由基分析与鉴定。

Description

具有捕获自由基功能的硝酮类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及具有捕获自由基功能的硝酮类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

自由基，尤其是超氧阴离子自由基(O₂ ^-.)、一氧化氮(NO)与羟基自由基(^.OH)，都是来自机体正常生理代谢过程和生存环境诱导产生的不稳定中间产物。一般而言，当它们产生过量和失调均会造成细胞组织的氧化损伤，进而介导多种疾病、衰老和各组织器官的功能退化；另一方面，在正常生理状态下活性氧也直接参与生物机体内的氧化还原平衡，具有松弛平滑肌与抑制血小板黏附、抑制病原体和调控肿瘤细胞生长等多种生理功能。因此，在一定程度上自由基的动态变化过程直接反映了生物机体的功能状态(Finkel T and Holbrook NJ，Nature，2000 408：239-247)。

尽管氧自由基在脑中风、心肌梗塞、阿尔茨海默氏症(AD症)、衰老以及癌症等诸多危害人类生命的主要顽疾的病理过程都起着重要的作用，但由于小分子自由基自身的化学不稳定性和短寿命，导致对它在检测方法上有很大的局限(选择性低)，从而影响了对其重要生理学功能的准确揭示。针对生物体系自由基检测目前主要有三种主要分析手段：ESR与自由基捕获技术(spin trapping)结合是最经典的自由基分析方法(Rosen GM et al，Free Radicals：Biology and Detection by SpinTrapping，1999，Publisher：Oxford Univ Press，New York，N.Y.，pp-496)，其优势在于该技术对自由基有着很强的结构特征性，易于同时分析鉴别多种自由基的分子结构；荧光探针方法研究的特色是灵敏度高(Gomes et al，J Biochem BiophysMethods，2005 65：45-80)，易于单细胞内自由基生物学研究，但对自由基反应的选择性不高；电化学传感器方法是另一种高灵敏度的自由基分析手段(DalbastiT and Kilinc E，Methods Enzymol，2005 396：584-592)，其特点是适用于动态追踪自由基的浓度变化规律，但对于细胞内的自由基分析仍存在着极大的困难。

发明内容

本发明的目的是提供能捕获多种自由基的硝酮类探针分子及其制备方法。

本发明所提供的硝酮类化合物，结构如式(I)所示：

                    式(I)

其中，R为氯、碘、PLP或PLP-LF；PLP代表含巯基的多肽或蛋白质，如谷胱甘肽、胸腺五肽等，LF代表荧光素物质，如荧光素及其衍生物。

本发明所提供的制备式(I)所示化合物的方法，是将式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物进行缩合反应得到式(I)中R为氯的化合物，然后再对R为氯的化合物进行取代反应得到式(I)中R为碘、PLP或PLP-LF的化合物；

        式(II)                                    式(III)。

式(I)中R为碘的化合物，具体是通过对R为氯的式(I)化合物进行碘代反应得到的。

式(I)中R为PLP的化合物，具体是通过R为碘的式(I)化合物与PLP(含巯基的多肽或蛋白质)进行取代反应得到的；其中，PLP与硝酮衍生物的链接点是巯基中的硫原子。

式(I)中R为PLP-LF的化合物，具体是通过R为PLP的式(I)化合物与LF(荧光素衍生物)进行反应得到的；其中，PLP与LF的链接点有两种选择：a)氨基端的氮原子，b)酪氨酸羟基端的氧原子；

例如：1)PLP的氨基端的N可与异硫氰酸荧光素(FITC)反应，得到R为PLP-LF(FITC)的式(I)化合物；

2)含酪氨酸酚羟基类的PLP的酚羟基端的O可与丹磺酰氯荧光素(DNS)反应，得到R为PLP-LF(DNS)的式(I)化合物。

上述1)直接在温和的室温条件下搅拌3-12小时即可；上述2)需在极性有机溶剂中搅拌3-8小时。

本发明所提供的式(I)中R为PLP或PLP-LF的化合物可作为自由基捕获探针。

所述的自由基捕获探针可与电子顺磁共振波谱技术结合，用于检测与分析鉴定自由基的分子结构，或用于研究细胞内或细胞器内自由基加合物的局域分子运动速度(微环境下局部黏度)。

所述的自由基捕获探针还可与荧光光谱技术结合，用于检测与分析鉴定自由基的浓度。

所述的自由基捕获探针也可与荧光成像方法结合，用于研究细胞内自由基分布。

本发明具有以下技术优点：

1、式(I)化合物作为多功能自由基捕获探针能够有效地提高生物体内自由基的分析灵敏度。通过将荧光素衍生物链接线性硝酮基团是提高自由基检测灵敏度的关键。此外，链接具有分子识别功能的多肽也可使得捕获探针分子有效地到达自由基生成区域，大大降低了高化学活性的自由基的淬灭概率，进而在其局域高效地完成自由基探测；

2、式(I)化合物与电子顺磁共振波谱相结合，可以有效地检测超氧阴离子自由基等生命体内常见，而又不易于检测的活性氧自由基，并且可以实现同时检测和鉴定多个自由基的分子结构；

3、式(I)化合物中的PLP可为所有含巯基的多肽与蛋白质，PLP与LF也可以通过上述两种反应模式进行链接，因此本发明提供了一个自由基捕获探测的平台。

作为多功能自由基捕获探针分子的式(IV)硝酮类化合物，根据其功能的要求包含如下三个组成部分：能捕获自由基的线性硝酮、可实现细胞(或细胞器)内分子识别作用的多肽片段与提供荧光功能的荧光素衍生物，进而在多肽分子识别导向作用下实现活性自由基的电子自旋共振(ESR)和荧光探测及成像多功能分析。下图中所述连接因子(V)可将线性硝酮α-苯基(1，1-甲基，二乙基磷酸酯)乙基硝酮与多肽片段的巯基相连接；而多肽与荧光素衍生物通过温和的化学反应直接链接，不需要额外的连接因子。

    式(IV)                                             式(V)

通过实验表明，本发明的硝酮类化合物作为自由基捕获探针不单具有高效的自由基捕获能力(包括对十分重要的超氧阴离子自由基的捕获)，并且能够在完整细胞或细胞器体系内用于活性自由基分析与鉴定。该自由基捕获探针既能应用电子顺磁共振波谱鉴定活性自由基的分子结构，也宜于采用荧光技术分析检测自由基的浓度与空间分布，可作为自由基分析探针而得到广泛的应用。

附图说明

图1为实施例4中自由基探针III捕获超氧阴离子自由基后所得ESR谱；

图2为实施例4中自由基探针IV捕获甲酸根阴离子自由基所得ESR谱；

图3为实施例4中自由基探针VI捕获对氯苯基自由基后所得ESR谱；

图4为实施例5中自由基探针VI的荧光光谱(a)与它和自由基捕获后的信号衰减曲线(b)；

图5为实施例5中自由基探针IV对莱茵衣藻细胞染色的荧光成像图片；

图6为实施例5中自由基探针IV对BEL 7402细胞染色的荧光成像图片；

图7为实施例6中自由基探针III的超氧阴离子自由基加合物ESR信号旋转相关时间与微环境粘度间的标准曲线；

图8为实施例6中自由基探针III在叶绿体内捕获超氧阴离子自由基后所得的ESR谱。

具体实施方式

本发明的硝酮类化合物结构如下所示：

                式(I)

其中，R为氯、碘、PLP或PLP-LF；PLP代表含巯基的多肽或蛋白质，LF代表荧光物质，如荧光素及其衍生物。

式(I)化合物可按照如下步骤来进行制备：

1)α-苯基(1，1-甲基，二乙基磷酸酯)乙基硝酮与多肽链接化合物合成方法：

三氯化磷与乙醇反应生成亚磷酸二乙酯1，而后反应物1被氨基取代产生氨基取代磷酸酯2；化合物2再经过氧化、还原两步生成羟氨取代的磷酸酯4；4继续与对氯乙酰基胺苯甲醛缩合获得6，6经过碘代后可与多肽在温和条件下反应得目标产物；所述的对氯乙酰基胺苯甲醛是由对氨基苯甲醛与氯乙酰氯反应得到的。

主要反应式如下：

其中，制备亚磷酸二乙酯需要在绝对无水的条件下完成，且反应温度需控制在5-10℃之间，接下来的氨基化反应的条件也应严格无水；化合物3还原成化合物4的反应中，所用的锌粉需进行活化；在制备化合物5、6、7、8的各个反应中，反应条件都应尽量避光和用氮气进行保护。

2)异硫氰酸荧光素标记：

将步骤1)的终产物8与异硫氰酸荧光素(FITC)在4℃-室温(＜20℃)的温和条件下进行反应，例如：常温下温浴。反应式如下：

上述反应适用于FITC对所有含NH₂-基团的线性硝酮与多肽共价链接化合物的荧光标记。

3)丹磺酰氯荧光素标记：

将步骤1)的终产物8与丹酰氯荧光素在4℃-室温(＜20℃)的温和条件下进行反应，例如：常温下温浴。反应式如下：

上述反应适用于丹磺酰氯荧光素对所有含酚羟基基团的线性硝酮与多肽共价链接化合物的荧光标记。

实施例1、制备链接谷胱甘肽的磷酰基自由基捕获探针(化合物III)

1、亚磷酸二乙酯(化合物1)的制备

以500mL干燥的内置磁力搅拌子的两口瓶为反应器，一口接恒压滴液漏斗，一口接温度计。在反应器内加入88mL(1.5mol，70g)的绝对无水乙醇(纯度＞99.95％)和50mL无水苯的混合物。冰水浴冷却至10℃，在搅拌下经1小时滴加由44mL(0.5mol，69g)新蒸馏的三氯化磷和50mL无水苯组成的混合物。反应温度控制在5-10℃之间。反应完成后水泵减压，自毛细管通入氮气以排除氯化氢。蒸出溶剂和剩余反应物(15-20℃)，然后使用油泵减压蒸出产物，即亚磷酸二乙酯57.6g(50℃/2mmHg)。纯亚磷酸二乙酯为有香味的无色液体。化合物1的结构表征如下：

¹H-NMR(CDCl₃/TMS，ppm)：δ＝1.37(s，6H，2CH₃)，4.16(m，4H，2CH₂)，6.82(d，J＝693Hz，1H，PH)。

2、二乙基(1-氨基-1-甲基乙基)磷酸酯(化合物2)的制备

将氨气(由氨水产生)通过CaO干燥管以鼓泡的形式通入到10mL(77.6mmol)步骤1)的亚磷酸二乙酯和10mL丙酮的溶液中；水浴(45℃)加热反应7小时，浓缩后用稀盐酸酸化至pH5.0，加蒸馏水稀释至100mL；用二氯甲烷(每次40mL，萃取3次)萃取回收亚磷酸二乙酯，水层用饱和碳酸氢钠中和至pH8.0，而后用二氯甲烷(每次50mL，萃取3次)萃取，浓缩有机层，得无色或淡红色粘稠状二乙基(1-氨基-1-甲基乙基)磷酸酯。

3、二乙基(1-硝基-1-甲基乙基)磷酸酯(化合物3)的制备

在机械搅拌下，向盛有5.9g步骤2)的二乙基(1-氨基-1-甲基乙基)磷酸酯(30mmol)，75mL丙酮和20mL水的250mL三颈瓶中加入由4.5g硫酸镁与28.4g高锰酸钾组成的混合物，搅拌历时1小时；然后在30-35℃下恒温反应48小时。反应完毕后，冰浴下慢慢加入亚硫酸氢钠，直至反应液澄清；此时将处理液倒入500mL烧杯中，用3×150mL乙醚倾倒萃取，合并乙醚层；依次用100mL亚硫酸氢钠溶液、100mL蒸馏水洗涤，浓缩后得到二乙基(1-硝基-1-甲基乙基)磷酸酯。

4、二乙基(1-羟胺-1-甲基乙基)磷酸酯(化合物4)的制备

将8.7g步骤3)的二乙基(1-硝基-1-甲基乙基)磷酸酯(39mmol)溶于100mL醇水溶液(甲醇∶水＝4∶6(V/V))中，加入5.4g氯化铵(100mmol)和10g经活化的锌粉(150mmol)。室温搅拌反应2小时，然后将温度升至45-55℃继续反应半小时；过滤、浓缩后用稀盐酸酸化至pH4.0，加蒸馏水稀释至100mL；用二氯甲烷(3×40mL)萃取回收二乙基(1-硝基-1-甲基乙基)磷酸酯，水层用饱和碳酸氢钠中和至pH8.0之后，用二氯甲烷(3×50mL)萃取；浓缩后在正己烷中重结晶，即得到无色固体，化合物4。

5、α-氯乙酰基胺苯(1，1-甲基，二乙基磷酸酯)乙基硝酮(化合物6)的制备

在避光、氮气保护下，往步骤4)的二乙基(1-羟胺-1-甲基乙基)磷酸酯(0.40g，2mmol)的30mL干燥THF溶液中分别加入对氯乙酰胺苯甲醛(0.47g，2.2mmol，注：对氯乙酰胺苯甲醛合成请参考文献方法：Liu YP et al，Chem Commun，2005 39：4943-4945)与5克无水MgSO₄做干燥剂；加热回流4小时后，减压过滤，固体在乙醇-乙醚(体积比为1∶1)中重结晶得白色固体(0.72g，1.8mmol，产率91％)。化合物6的结构表征如下：

¹H NMR(CD₃OD)：δ1.356(6H，t)，1.847(6H，d，15.3Hz)，4.204(2H，s)，4.234(4H，m)，7.730(2H，d，J＝8.8Hz)，7.906(H，s)，8.353(2H，d，J＝8.8Hz).

¹³C NMR(CD₃OD)：δ16.72(d，22.2Hz)，23.53，44.09，64.92(d，27.6Hz)，74.51(d，634.8Hz)，120.46，127.83，131.74，135.59，141.90，167.53.

³¹P NMR(CD₃OD，H₃PO₄，外标)：δ24.07.

MS(ESI，m/z)：391.1([M_Cl ³⁵+H]⁺，100％)，393.1([M_Cl ³⁷+H]⁺，28.6)，413.1([M_Cl ³⁵+Na]⁺，15.4)，428.9([M_Cl ³⁵+K]⁺，69.2)，431.1([M_Cl ³⁷+K]⁺，44.0).

6、α-碘乙酰基胺苯(1，1-甲基，二乙基磷酸酯)乙基硝酮(化合物7)的制备

将α-氯乙酰基胺苯(1，1-甲基，二乙基磷酸酯)乙基硝酮(0.36g，0.92mmol)与碘化钠(0.69g，4.6mmol)溶解在30mL乙醇中，在避光条件下，加热搅拌回流80小时。黄绿色的反应液经过滤、浓缩后加入100mL乙酸乙酯溶解；有机溶液用蒸馏水洗涤三次(3×30mL)，并用无水硫酸钠干燥；过滤，减压去除溶剂后得到白色或淡黄色固体(0.14g，0.29mmol，产率61％)。化合物7的结构表征为：

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.216(6H，t)，1.695(6H，d，14.7Hz)，4.068(4H，m)，4.266(2H，s)，7.650(2H，d，J＝7.3Hz)，7.836(H，s)，8.317(2H，d，J＝7.6Hz)，10.548(H，s).

¹³C NMR(DMSO-d₆)：δ16.25，22.85，43.54，62.62，72.55(d，618Hz)，118.57，126.54，129.56，131.22，139.76，164.86.

³¹P NMR(CD₃OD，H₃PO₄，外标)：δ27.92.

MS(ESI，m/z)：483.1([M+H]⁺，100％).

7、链接谷胱甘肽的磷酰基自由基捕获探针(III)

将化合物7(0.20g，0.41mmol)的30mL乙醇溶液加入到谷胱甘肽(0.10g，0.33mmol)的10mL磷酸缓冲液(0.1M，pH 7.4)中；在室温、避光条件下，隔夜搅拌反应；反应完全后所得产物为一无色或淡黄色固体产物(0.19g，产率为87.9％)。化合物III的结构表征数据如下：

¹H NMR(D₂O)：δ1.256(6H，t)，1.774(6H，d，J＝15.65Hz)，1.903(2H，m)，2.312(2H，t)，2.926(1H，m)，3.122(1H，m)，3.257(1H，t)，3.687(2H，m)，4.178(4H，m)，4.558(1H，t)，4.736(2H，s)，7.585(2H，d，J＝8.5Hz)，7.918(1H，s)，8.211(2H，d，J＝8.5Hz)

¹³C NMR(D₂O)：δ17.13，23.55，31.34，33.56，35.08，44.88，54.34，56.73，66.56，73.55，74.60，122.14，127.21，132.76，139.37，141.67，172.50，173.23，177.51，177.67，182.20

³¹P NMR(D₂O，H₃PO₄，外标)：δ25.06

MS(ESI，m/z)：662.1([M+H]⁺，100％)，700.1([M+K]⁺，47.3％).

                化合物III

实施例2、制备链接谷胱甘肽与异硫氰酸荧光素的磷酰基自由基捕获探针(IV)

配置pH值为9.5，500mM的碳酸盐缓冲溶液(1L超纯水中加入17g Na₂CO₃及28gNaHCO₃)。将FITC(1mg/ml，3.7g，0.0095mM)的碳酸盐缓冲溶液在避光条件下，滴入温度为4℃处于搅拌状态下的化合物III(1mg/ml，6.3mg，0.0095mM)的碳酸盐缓冲溶液中，反应在25ml的锥形瓶中进行，5min加料完毕，然后继续搅拌12h，为保证温度，将反应器移入4℃冰箱中。

反应完毕用Sephadex G-10除盐，直接用HPLC分离得到终产物。产物结构经质谱鉴定。MS(ESI，m/z)：1065.3([M+H]⁺，100％)，1103.3([M+K]⁺，32.1％).

                        化合物(IV)

实施例3、制备链接胸腺五肽与丹磺酰氯荧光素的磷酰基自由基捕获探针(VI)

化合物7的合成步骤见实施例1。

1、链接胸腺五肽与磷酰基自由基捕获探针(V)

将胸腺五肽(0.48g，0.7mmol)溶解于含化合物7(0.30g，0.6mmol)的50mLDMSO溶液中；在室温、避光条件下搅拌12小时；反应完全后，溶液中加入冰冻乙醚，得到淡黄色固体，即化合物V(产率为38.9％)。

2、链接胸腺五肽与丹磺酰氯荧光素的磷酰基自由基捕获探针(VI)

将丹磺酰氯荧光素(0.24g)溶于50ml吡啶，4℃下搅拌滴加自由基捕获探针(V)的吡啶溶液(0.01mM，10ml)然后继续搅拌8h，将反应器维持在4℃中进行反应。

反应产物用Sephadex LH-20粗分除去未反应的荧光物质，然后用HPLC分离得到终产物。产物结构经质谱鉴定。MS(ESI，m/z)：978.4([M+H]⁺，100％)，1016.4([M+K]⁺，20.3％).

                        化合物VI

实施例4、自由基捕获探针III、IV与VI对自由基的高效捕获特性

根据发明人在前期自由基捕获探针研究中的类似自由基ESR分析方法(Liu YPet al，Chem Commun，2005 39：4943-4945；Liu YP et al，J Org Chem，2006，71：7753-7762)，分别对自由基捕获探针III、IV与VI的自由基捕获性能进行了实际检验，包括对超氧阴离子自由基、羟基自由基、烷氧自由基与碳中心自由基等的检验。具体的实验方法分别是将在下面表格中列举出的自由基产生源体系外加10～50mM自由基探针后，立即放入共振腔进行ESR检测。自由基产生源体系中所采用试剂浓度与上述两篇文献中描述的数值完全一致。

根据ESR实验，探针III、IV与VI捕获各种自由基所得自由基信号的参数分别参见下列表1、2与3。

           表1自由基捕获探针III捕获自由基的ESR波谱参数

表2自由基捕获探针IV捕获自由基的ESR波谱参数

表3自由基捕获探针VI捕获自由基的ESR波谱参数

上面三个表中参数α_P、α_N与α_H分别代表磷、氮与β-氢核所引起的超精细耦合裂分常数，单位mT代表毫特斯拉(磁场强度单位)。τ_C代表探针捕获自由基后所得加合物分子的旋转相关时间，反应微观分子运动速度与局域环境黏度。

为更形象化展现探针III、IV与VI捕获自由基的效果，将它们所实测的ESR谱图各举一个实例分别列于附图1、2与3。

附图1：探针III捕获次黄嘌呤(0.4mM)/黄嘌呤氧化酶(0.04U mL^-1)体系产生的超氧阴离子自由基加合物ESR谱。

附图2：探针IV捕获Fenton(2％H₂O₂/2mM EDTA/2mM FeSO₄)体系存在下与甲酸钠(200mM)夺氢反应所得的甲酸根阴离子自由基加合物ESR谱。

附图3：探针VI捕获对氯苯基重氮盐(10mM)光照体系产生对氯苯基自由基加合物ESR谱。

实施例5、自由基捕获探针IV与VI的荧光特性与细胞输运功能

自由基探针IV与VI都是链接荧光基团的自由基探针。因此必须检验它们的荧光特性，图4所示的正是捕获探针VI的荧光信号(355nm激发)以及它随自由基产生而衰减的变化曲线，借此可进行捕获自由基的荧光定量分析。

图4中被捕获的活性自由基信号来源于偶氮二异丁氰(AIBN，0.2mM)在200W高压汞灯下光照10分钟产生的自由基，探针IV使用浓度仅为50μM。显然，此时该探针应用浓度远比一般ESR捕获实验中采用的探针浓度(通常为30～100mM)低，大大提高了检测灵敏度。

此外，为实现细胞内自由基捕获探针的靶向输运，图5与图6分别给出自由基探针IV(30-50μM/L)与莱茵衣藻(购自美国杜克大学衣藻研究中心，样本号CC-124)或BEL7402细胞温浴培养5-10分钟后，冲洗细胞外剩余荧光探针分子，拍照得到荧光显微镜图片。图5中的亮黄色斑点显示探针VI可进入莱茵衣藻进行有效标记；图6则展示出探针VI对人肝癌细胞BEL7402的单细胞标记结果。

实施例6、自由基捕获探针III在细胞器内自由基分析中的局域分子定位

自由基探针III有一个重要的波谱学特性，即：它的自由基加合物对溶剂环境的粘度非常敏感，借此可以研究在生物体内局域环境下的自由基信号。

此实施例是探针III在菠菜完整叶绿体内捕获超氧阴离子自由基的ESR信号以及它的微环境粘度。

首先，图7给出探针III与超氧阴离子自由基的加合物在不同环境粘度(分别用0％，10％，30％，50％丙三醇/水混合溶液控制粘度)下与旋转相关时间τ_c(根据自由基捕获ESR信号计算获得)的线型变化规律，绘出标准曲线。然后实测出该完整叶绿体产生的超氧阴离子自由基捕获ESR信号(图8)，再根据标准曲线上所作垂线(图7中虚线所示)可得知实际叶绿体超氧阴离子捕获加合物的局域微环境粘度＝1.33泊松。

实验中菠菜完整叶绿体制备参照文献标准方法(中国科学院上海植物生理研究所编，现代植物生理学实验指南1999北京，科学出版社p 2-3)。将菠菜洗净、去除中脉与叶柄后每10g叶片约加入20-30mL冰冷的提取液[含0.33mol/L山梨醇，0.05mol L^-1MES(pH 6.1)，0.01mol L^-1NaCl，2mmol/L MgCl₂，2mmol/LEDTANa₂，0.5mmol/L KH₂PO₄，2mmol/L抗坏血酸钠]。用电动捣碎机高速捣碎3～4次，每次持续2s。然后将绿豆粒样大小的颗粒经过4层纱布过滤，除去残渣滤液经200g离心1min去除粗颗粒沉淀，上层液体再以1000g离心3min，小心倒掉上层液体，而后再用新的缓冲液HEPES(pH7.6)悬浮可制得完整叶绿体。

ESR实验中探针III浓度100mM。标准曲线中所有粘度控制条件依据文献(Le MesteM and Voilley MA，J.Phys.Chem.1990，94：1326)数据，采用不同比例的丙三醇/水配制(丙三醇含量：0～50％)。

Claims (7)

1.式(I)所示的化合物：

其中，R为氯、碘、PLP或PLP-LF；所述PLP为谷胱甘肽或胸腺五肽；所述LF为异硫氰酸荧光素或丹磺酰氯荧光素。

2.一种制备式(I)所示化合物的方法，是将式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物进行缩合反应得到式(I)中R为氯的化合物，然后再对R为氯的化合物进行取代反应得到式(I)中R为碘、PLP或PLP-LF的化合物；其中，所述PLP为谷胱甘肽或胸腺五肽；所述LF为异硫氰酸荧光素或丹磺酰氯荧光素。

3.权利要求1式(I)中R为PLP或PLP-LF的化合物作为自由基捕获探针的应用；其中，所述PLP为谷胱甘肽或胸腺五肽；所述LF为异硫氰酸荧光素或丹磺酰氯荧光素。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用为检测与分析鉴定自由基的分子结构。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用为检测细胞内或细胞器内自由基加合物的局域分子运动速度。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用为检测与分析鉴定自由基的浓度。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用为检测细胞内自由基分布。

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