CN101292040B - 寡肽酰胺向寡肽烷基酯的酶促转化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及N→C方向的酶促寡肽合成，特别涉及制备可选被N-保护的C-末端烷基酯的工艺，所述工艺包括下述步骤：在肽酰胺酶存在下，将相应的可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺与烷基醇(优选地，甲醇)反应。形成的C-末端烷基酯随后可用于与另一氨基酸残基或寡肽偶联。因此，本发明的发明人发现了制备寡肽的非常有用的工艺。

Description

寡肽酰胺向寡肽烷基酯的酶促转化
本发明涉及制备可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯的工艺。本发明还涉及制备寡肽的工艺。
寡肽具有很多应用，例如药物、食品或饲料成分或农业化学应用。
就本发明的目的而言，肽表示两个或更多氨基酸的任何链。就本发明的目的而言，寡肽表示2-100个氨基酸的任何线性链。
就本发明的目的而言，酶促寡肽合成被定义为其中通过酶促偶联反应来形成肽键的寡肽合成，其较之化学寡肽合成具有若干优点。例如，由于不需要进行氨基酸侧链保护或仅需要对有限的氨基酸进行侧链保护，使得大规模生产的成本更低。此外，所述工艺对环境更少危害，因为不需要额外的活化试剂以及仅需要更少的有机溶剂。此外，酶催化的偶联没有外消旋(根据N.Sewald和H.-D.Jakubke，in：“Peptides：Chemistry and Biology”，lst reprint，Ed.Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim 2002，section 4.6.2，p250)，这使得产品更纯和/或分离更容易。
在酶促偶联方法的方面，存在两种选择来产生肽键。在所谓的热力学(或平衡控制的)手段中，羧基组分具有游离羧酸官能团，而在动力学控制的手段中，使用经活化的羧基组分，优选地，烷基酯的形式，例如，甲酯的形式。热力学手段具有3个主要缺点：i)平衡通常处于肽键切割这一侧，导致偶联产率低；ii)通常需要大量的酶；iii)反应速率通常非常之低。在动力学控制的手段中，需要烷基酯作为起始材料，但是需要的酶少得多，反应时间显著更短，并且，最重要的，可获得的最大产率通常要高得多得多。因此，对于工业应用而言，基于动力学手段的酶促寡肽合成概念(即，使用活化的羧基组分)最有吸引力(根据N.Sewald和H.-D.Jakubke，in：“Peptides：Chemistry and Biology”，1st reprint，Ed.Wiley-VCHVerlag GmbH，Weinheim 2002，section 4.6.2)。
酶促肽键合成可以以C→N末端方向或者N→C末端方向来进行。
以C→N末端方向进行的酶促寡肽合成的一个例子在流程1中给出。流程1被用作为获得三肽的例子，但是其并非意欲以任何方式限制本发明。
流程1
Figure S2006800390909D00021
在流程1中，P代表N-末端保护基团。R1、R2和R3代表氨基酸侧链。如流程1所示，C→N末端方向的酶促合成起始于式II的被C-保护的氨基酸与式Ia的被N-保护的氨基酸的酶促偶联，后者是经C-活化的，在本情况下是通过甲酯活化的。然后，可对形成的式III的二肽进行N-去保护，得到式IV的、具有游离氨基官能团的二肽，随后可将其与另一被N-保护(以及C-活化)的氨基酸构造单元(式Ib)酶促偶联，导致形成式V的三肽。这种N-去保护和偶联循环可重复进行，直到获得想要的寡肽序列，之后可除去N-和C-保护基团，产生想要的(未被保护的)寡肽。还可以将式Ia的被N-保护的氨基酸与C-末端被保护的寡肽(代替式II的C-末端被保护的氨基酸)偶联。
以C→N方向合成寡肽的一个主要缺点在于，在每个循环之后除去N-保护基团，以允许加入下一个被N-保护的氨基酸残基。在氨基酸(酯)上引入(昂贵的)N-保护基团，以及在肽偶联后除去并且通常弃去该同样的(昂贵的)N-保护基团，使得从实践和经济的角度来看，C→N方向的寡肽合成没有吸引力。
N→C末端方向的酶促寡肽合成的一个例子在流程2中给出。流程2被用作为获得三肽的例子，但是其并非意欲以任何方式限制本发明。
流程2
在流程2中，P代表N-末端保护基团。R1、R2和R3代表氨基酸侧链。如流程2所示，N→C末端方向的酶促合成也起始于式IIa的被C-保护的氨基酸与式I的被N-保护的氨基酸的酶促偶联，后者是经C-活化的，在本情况下是通过甲酯活化的。然后，可对形成的式III的二肽进行C-去保护。得到式VI的、具有游离羧基官能团的二肽，然后可对其进行“重新活化”，以形成式VII的被N-保护的寡肽烷基酯，在流程2的情况下是甲酯。典型地，使用醇(例如甲醇)和反应试剂，例如，硫酸或亚硫酰氯，通过化学转化来实现这种酯化。随后可将式VII的被N-保护的寡肽烷基酯与另一被C-保护的式IIb的氨基酸酶促偶联，导致形成式VIII的三肽。这种C-去保护和偶联循环可重复进行，直到获得想要的寡肽序列，之后可除去N-和C-保护基团，产生想要的(未被保护的)寡肽。还可以将式I的被N-保护的氨基酸与C-末端被保护的寡肽(代替式IIa的C-末端被保护的氨基酸)偶联。
N→C方向的寡肽合成不需要重复加入和除去(昂贵的)N-保护基团。但是，为了加上后续氨基酸残基，需要两个反应步骤：需要对C-末端去保护，之后应当对其活化，例如通过对形成的羧酸基团进行酯化来实现。因此，对于N→C方向的寡肽合成来说，为了向被N-保护的寡肽加上一个氨基酸残基，需要总共三个反应步骤(去保护、活化和偶联)。
用于以N→C方向合成寡肽的合适的C-保护基团是本领域技术人员公知的。合适的C-保护基团的例子包括叔丁基(例如可使用强酸非水性条件，例如通过三氟乙酸，将其切割下来)。使用羧酰胺作为C-末端保护基团(在流程2中，X＝NH2)是有好处的。用羧酰胺作为保护基团时，可以例如通过在一罐式工艺中对氨基酸进行甲酯化然后用氨进行酰胺化，来制备式IIa的氨基酸构造单元，其制备是简单并且具有成本效益的。使用强矿物酸的水溶液通过传统方式进行的羧酰胺切割会导致同时对肽键的部分切割。但是，可以通过酶促来进行对寡肽上被羧酰胺保护的C-末端的选择性去保护，而不切割肽键。EP 0 456 138和EP 0 759 066公开了一种酶促工艺，其中使用分别来自橙皮(也称为“PAF”)或来自Xanthomonas(Stenotrophomonas)maltophilia(也称作“PAM”)的肽酰胺酶，其中，N-(未)被保护的二肽C-末端羧酰胺的羧酰胺基团被水解，以形成相应的C-末端羧酸，由此二肽的肽键保持完整。
但是，EP 0456 138和EP 0 759 066中描述的工艺的缺点在于，对于用氨基酸对寡肽链的每次进一步延伸而言，都需要对形成的相应的羧酸进行单独的酯化，以活化羧酸基团。另一缺点在于，使用硫酸或亚硫酰氯等反应试剂对羧酸进行的这种酯化需要基本上非水性的条件，而对C-末端羧酰胺的酶促去保护反应却是在水溶液中进行的。因此，需要大量的萃取和干燥操作。
因此，本发明的一个目的是提供更为简单的工艺，以将可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺的羧酰胺基团活化为烷基酯官能团，然后可将其用于肽偶联反应。
通过下述工艺来实现此目的，其中，可从相应的可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺直接获得可选被N-保护的寡肽烷基酯。
因此，在第一个方面，本发明涉及制备可选被N-保护的寡肽烷基酯酶的工艺，所述工艺包含下述步骤：b)在肽酰胺酶存在的情况下，将相应的可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺与烷基醇反应。因此，本发明的工艺提供了将被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺的羧酰胺基团活化为烷基酯官能团的一步式工艺，该工艺简单并且具有成本效益。
令人吃惊地，本发明显示，此类肽酰胺酶能催化可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺向可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯的直接转化。就Cerovsky，V.和M.-R.Kula，1998，Angew.Chem.Int.Ed.，pp.1885-1887的观点来看，这是令人吃惊的，该文献写到，肽酰胺酶缺乏酯酶活性，这表示该酶能生产出酯是令人吃惊的。
将可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺与展示出肽酰胺酶活性的酶(在本发明说明书全文中被称为肽酰胺酶)反应。肽酰胺酶已经被描述过，例如在EP 0 456 138和EP 0 759 066中，其中描述了肽酰胺酶水解可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺的C-末端羧酰胺基团而不水解寡肽的一个或数个肽键的能力。优选地，使用来自柑橘类水果(的皮)的肽酰胺酶，更优选地，使用来自桔子(皮)的肽酰胺酶。
可以使用任何形式的肽酰胺酶。例如，可以使用分散体系中、乳液中、溶液中或被固定的形式的肽酰胺酶，其可以作为粗制的酶，作为可商业获得的酶，作为从可商业获得的制剂进一步纯化出来的酶，作为通过已知纯化方法的组合从其来源获得的酶，可以使用天然地具有肽酰胺酶活性或通过遗传改造具有肽酰胺酶活性的整个(可选地，渗透性的和/或固定的)细胞中的酶，或者处于具有此类活性的细胞裂解物中的酶。
对于本领域普通技术人员来说显而易见：在根据本发明的工艺中，可使用具有肽酰胺酶活性的天然存在的(野生型)酶的突变体。野生型的突变体可例如这样获得：使用本领域技术人员已知的诱变技术(随机诱变、定点诱变、定向进化、基因改组等)来修饰编码野生型酶的DNA(使得DNA编码至少有一个氨基酸与野生型酶不同的酶，或者使得其编码较之野生型更短或更长的酶)以及在合适的(宿主)细胞中实现经此修饰的DNA的表达。肽酰胺酶的突变体在针对可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯的选择性和/或活性和/或稳定性和/或溶剂抗性和/或pH状况和/或温度状况和/或底物状况的方面可能具有改进的性质。
如果肽酰胺酶不是以纯的形式使用的话，那么优选除去具有肽键切割活性的其它酶，使得可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺中超过99％都被转化，而肽键中只有不超过1％，更优选不超过0.1％被切割。优选地，使用经纯化形式的酶，例如，可商业获得的形式的酶。
或者，如果肽酰胺酶不是以纯的形式使用的话，可以用能抑制肽键切割活性的化合物来防止肽键切割。
优选地，在本发明的工艺中，肽酰胺酶的水解活性(将可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺转化为相应的C-末端羧酸，而不是转化为相应的C-末端烷基酯)应当被保持为尽量低的水平。为达到此目的，在基本不含水的介质中进行肽酰胺酶的反应。技术人员应当理解，基本不含水表示在反应介质中仅存在能使得酶正确执行其催化活性的量的水。优选地，反应介质含有少于50vol％的水，更优选地，少于30vol％的水，最优选地，少于20vol％的水。优选地，反应介质含有至少0.1vol％的水，更优选地，至少0.3vol％的水，更优选地，至少0.5vol％的水，更优选地，至少1vol％的水，最优选地，至少5vol％的水。反应介质中优选的水含量在0.5至50vol％之间，更优选地，1至30vol％之间，最优选地，5至20vol％之间。
在本发明的一种实施方式中，烷基酯化期间释放的NH3中的至少一部分被从反应混合物中除去。优选地，至少50％，更优选地，至少70％，最优选地，几乎所有释放的NH3都被从反应混合物中除去。从反应混合物中除去NH3可以通过加入能与NH3配合的化合物来实现，例如，加入在与NH3配合之后会沉淀的化合物，其例子包括NgHPO4、Al2O3和K2SO4。或者，可例如通过向反应混合物中加入吸附剂(例如沸石)来除去NH3。还可例如通过应用酸-碱反应由此使得NH3质子化，或者例如通过应用低压和/或通过加热在反应期间从反应混合物蒸发NH3，来除去NH3。在本发明的一种优选的实施方式中，使用在配合之后会沉淀的NH3配合剂，更特别地，使用NgHPO4、Al2O3或K2SO4。
可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯例如可如式IX的化合物所示：
Figure S2006800390909D00071
其中，P代表H或代表N-末端保护基团，其中，n是至少2的整数，其中，m代表至少1但是不大于n的所有整数，以及其中，RmA和RmB每个独立代表H或代表氨基酸侧链，以及其中，R代表可选被取代的烷基。
如果可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯是式X的化合物，那么相应的可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺则如式IX的化合物所示：
其中，P代表H或代表N-末端保护基团，其中，n是至少2的整数，其中，m代表至少1但是不大于n的所有整数，以及其中，RmA和RmB每个独立代表H或代表氨基酸侧链。
R优选代表具有1-6个C原子的可选被取代的烷基，更优选地，具有1-3个碳原子的可选被取代的烷基，最优选地，R代表甲基。
未被取代的烷基的例子是：甲基、乙基、异丁基和正辛基。
被取代的烷基的例子是：氨甲酰甲基、N-甲基-氨甲酰甲基、苯甲基、对硝基苯甲基、氰甲基、2，2，2-三氟乙基、2，2，2-三氯乙基和4-吡啶甲基。
在本发明的工艺中使用何种烷基醇取决于想要得到何种可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯。例如，如果使用甲醇，那么形成的可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯将是可选被N-保护的寡肽C-末端甲酯。例如，如果使用乙酯，那么形成的可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯将是可选被N-保护的寡肽C-末端乙酯，等等。优选地，所述烷基醇是甲醇。
本领域技术人员可通过常规实验来确定最优的烷基醇浓度。在本发明的一种优选的实施方式中，所用的烷基醇是甲醇。
然而，除了烷基醇之外，存在一种或多种其它溶剂也是可能的，在一些情况下，存在一种或多种其它溶剂甚至可能是有好处的，例如，使式IX的可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺增溶。
本发明的一个令人吃惊的方面是：肽酰胺酶活性甚至能在高甲醇浓度下显现，虽然该条件下，酶通常仅展示出可被忽略的活性[K.Drauz和H.Waldmann，在：“Enzyme Catalysis in Organic Synthesis”，Volume 1，2nd Edition，Ed.Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim 2002，sections 1.6和8.6；M.Pogorevc，H.Stecher和K.Faber在Biotechnology Letters 2002，24，857-860]。
优选地，向反应介质中不止一次地加入肽酰胺酶，而不是在工艺开始时一次性加入。
为了防止寡肽C-末端烷基酯的游离N-末端氨基官能团在肽偶联反应期间发生反应，优选地，可用合适的保护基团对该氨基官能团加以保护。合适的N-保护基团是可用于合成(寡)肽的那些N-保护基团，它们是本领域技术人员已知的。合适的N-保护基团的例子包括Z(苯甲氧羰基)、Boc(叔丁氧羰基)和PhAc(苯乙酰基)，其中后者可用PenG酰基转移酶酶促引入并切掉。
在本发明的上下文中，“氨基酸侧链”表示任何成蛋白质性(proteinogenic)或非成蛋白质性的氨基酸侧链。氨基酸侧链中的反应活性基团可被氨基酸侧链保护基团保护，或者可以是未被保护的。成蛋白质性氨基酸的例子包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、色氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和苯丙氨酸。非成蛋白质性氨基酸的例子包括苯基甘氨酸和4-氟-苯基丙氨酸。
n代表至少2的整数，因此代表2、3、4、5、6、7、8、9、10，等等。m代表至少1但是不大于n的所有整数。换句话说，m表示寡肽链中侧基团RA和RB是其一部分的氨基酸残基的位置。因此RmA表示n个RA基团的全集(每个基团可能表示不同的侧基团，即，H或氨基酸侧链)，RmB表示n个RB基团的全集(每个基团可能表示不同的侧基团，即，H或氨基酸侧链)。
原则上，所用的pH并不关键，其可能被选用为5至11之间，优选地，6至9之间。pH在反应期间可以变化，但也可以使用经缓冲的水溶液(使用例如10mM至500mM之间的缓冲液浓度)使其保持恒定。或者，可通过使用自动pH-稳定体系使得反应的pH保持恒定。本领域技术人员可以通过常规实验容易地鉴定出最优pH条件。
原则上，所用的温度并不关键，优选地，可以使用0至45℃之间的温度，更优选地，15至40℃之间。或者，如果使用嗜热肽酰胺酶的话，可以选用更高的温度，例如，40至90℃之间。本领域技术人员可以通过常规实验容易地鉴定出最优温度条件。
为了分离出足够纯的形式的可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯(例如，式X的寡肽)，在一些情况下，将相应的可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺(例如，式IX的C-末端羧酰胺)几乎完全或完全转化为式X的C-末端烷基酯以及部分转化为相应的C-末端羧酸可能是有好处的。C-末端羧酸是水解副反应的结果，因为肽酰胺酶活性需要水的存在。可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺的这种(几乎)完全转化在下述情况下甚至也可能是有好处的，所述情况下，相应的C-末端羧酰胺全部转化时可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯的总量小于仅部分转化的情况，因为通常难于将可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯与相应的C-末端羧酰胺分开，而将其与相应的C-末端羧酸分开则较容易。例如，可使用两相体系来将可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯与相应的C-末端羧酸分开，所述体系具有水可混溶的有机溶剂和pH高于C-末端羧酸的游离羧基官能团的pKa值(通常高于大约3.5)的水相；在这种情况下，可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯保留于有机相中，而相应的C-末端羧酸则在一次或多次萃取中被移至水相。
在第二个方面，本发明提供了制备寡肽的工艺，所述工艺包括根据本发明的工艺。
特别地，本发明提供了下述制备寡肽的工艺，所述工艺包括下述步骤：
b)根据本发明第一方面，在存在肽酰胺酶的情况下，将可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺与烷基醇反应，
c)在存在能催化肽键形成的酶的情况下，将所形成的可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯与氨基酸C-末端羧酰胺或与寡肽C-末端羧酰胺反应，以形成可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺。
因此，本发明还提供了这样的合成寡肽的工艺，其允许以N→C方向来合成寡肽，并且使用比以前更少的反应步骤，因为通过酶促方式对C-末端去保护和同时活化。此外，不需要针对C-末端羧酸中间产物的大量萃取和脱水程序。这有利地允许了以N→C方向进行的完全酶促肽合成工艺，因为寡肽链延伸和对N-末端氨基官能团的保护和去保护都可完全通过酶促来进行。因此，本发明的工艺比以前已知的工艺更有吸引力，例如，从经济和/或环境的角度来看。
在步骤c)的方面，可以使用能催化肽键形成的酶。此类酶是本领域技术人员已知的，其例子包括蛋白酶、酰基转移酶(例如，penG酰基转移酶)和氨基酸酯水解酶。
可重复步骤b)和c)，直到获得具有想要的氨基酸序列的可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺。
因此，本发明还涉及下述合成寡肽的工艺，所述工艺包括下述步骤：
b)根据本发明第一方面，在存在肽酰胺酶的情况下，将可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酰胺与烷基醇反应，
c)在存在能催化肽键形成的酶的情况下，将所形成的可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯与氨基酸C-末端羧酰胺或与寡肽C-末端羧酰胺反应，以形成可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺，
其中，重复步骤b)和c)，直到获得具有想要的氨基酸序列的可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺。
可通过a)在存在能催化肽键形成的酶的情况下，将可选被N-保护的氨基酸C-末端烷基酯或可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯与氨基酸C-末端羧酰胺或与寡肽C-末端羧酰胺反应，来制备在步骤b)中用作为起始材料的可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺。
因此，还本发明还涉及下述制备寡肽的工艺，所述工艺包含下述步骤：
a)在存在能催化肽键形成的酶的情况下，将可选被N-保护的氨基酸C-末端烷基酯或可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯与氨基酸C-末端羧酰胺或与寡肽C-末端羧酰胺反应，
b)根据本发明第一方面，在存在肽酰胺酶的情况下，将所形成的可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酰胺与烷基醇反应，
c)在存在能催化肽键形成的酶的情况下，将所形成的可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯与氨基酸C-末端羧酰胺或与寡肽C-末端羧酰胺反应，以形成可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺，
其中，重复步骤b)和c)，直到获得具有想要的氨基酸序列的可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺。
如果需要的话，可在C-末端和/或在N-末端对具有想要的氨基酸序列的可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺进行去保护，和/或——如果存在至少一个氨基酸侧链保护基团的话，可在氨基酸侧链中的至少一个上对可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺进行去保护，之后可回收被保护或未被保护的寡肽。
可通过本领域技术人员已知的任何方法，来对形成的被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺或被N-保护的C-末端去保护的寡肽的N-末端保护基团进行去保护。优选地，通过酶促除去N-末端保护基团，更优选地，通过酶促引入和除去N-末端保护基团。
酶促引入和/或除去N-保护基团是特别有好处的，因为这使得该工艺更具成本效益并且对环境更友善。i)可酶促引入和切割的N-保护基团和ii)用氨基酸C-末端羧酰胺或寡肽C-末端羧酰胺进行的分步酶促肽链延伸和iii)对生长中的寡肽链进行的重复酶促C-末端羧酰胺去保护和同时活化得到C-末端烷基酯，这三个特征的新颖组合，使得可以实现完全酶促合成寡肽的概念，这在以前从来没有描述过。
能引入和除去寡肽C-末端羧酰胺或烷基酯的N-末端保护基团的酶是技术人员已知的，此类酶的例子包括penG酰基转移酶。
使用强矿物酸的水溶液除去C-末端羧酰胺官能团的传统方式导致同时使肽键部分水解。因此，优选地，可使用肽酰胺酶，在相应的C-末端烷基酯仅以有限程度形成或者根本不形成的条件下，对形成的可选被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺的C-末端进行去保护，所述条件例如含有不超过40wt％的烷基醇的水溶液中，更优选地，不超过10wt％烷基醇，最优选地，不超过3wt％烷基醇。
如果在最后一个肽偶联步骤之后获得的被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺(没有或有一个或数个氨基酸侧链保护基团)是想要的终产物，那么可例如使用本领域技术人员已知的萃取或结晶方法对其进行直接回收。在被部分保护的寡肽是想要的终产物的情况下，可以进行C-和/或N-和/或氨基酸侧链(如果在最后一个肽偶联步骤后存在一个或数个氨基酸侧链保护基团的话)去保护反应，以及，可选地，在后处理(work-up)程序后，可回收想要的被部分保护的终产物。但是，通常，被完全去保护的寡肽是想要的终产物，其可通过连续的N-、C-和氨基酸侧链(如果在最后一个肽偶联步骤后存在一个或数个氨基酸侧链保护基团的话)去保护步骤来获得。本领域技术人员可确定最终回收被完全去保护的寡肽的程序，例如包括萃取和结晶。
优选地，在步骤a)和/或c)的偶联反应后对反应混合物加以后处理，以除去剩余的任何起始化合物和可能已经形成的任何副产物。一种特别有用的实施方式是：将可选被N-保护的氨基酸C-末端烷基酯或可选被N-保护的寡肽C-末端烷基酯与(有限)过量的氨基酸C-末端羧酰胺或寡肽C-末端羧酰胺反应，以实现酯类化合物的全部或几乎全部转化，以及随后在两相体系中将反应混合物分开，所述体系由水不可混溶的有机溶剂和pH低于C-末端羧酰胺或寡肽羧酰胺的pKa值的水相构成。在此类情况下，可将过量的氨基酸C-末端羧酰胺或寡肽C-末端羧酰胺以质子化形式萃取进水相，而想要的偶联产物则保留于有机相中。应用多次水萃取或用有机溶剂对水相反萃取可能是有好处的，以优化被N-保护的寡肽C-末端羧酰胺偶联产物的产率和/或纯度。本领域技术人员可以容易地确定最合适的条件。
可使用本发明的工艺来制备的寡肽的例子是三肽H-Gly-Tyr-Phe-OH和H-Arg-Gly-Asp-OH和四肽H-Tyr-D-Ala-对氟-Phe-Phe-NH2。优选地，通过本发明的工艺生产的寡肽是2-50个氨基酸的线性肽，更优选地，2-20个氨基酸的线性肽，最优选地，2-10个氨基酸的线性肽。
现在将通过下述实施例来阐述本发明，但并非是对本发明加以限制。
                        实施例
材料
从Fluka获得来自桔皮的肽酰胺酶(称作“PAF”)，原样使用(活性，在Z-Gly-Tyr-NH2到Z-Gly-Tyr-OH的脱酰胺作用中，2.4U/mL)。在使用经冷冻干燥的PAF的情况下，使用Sentry Freeze-Mobile 125(G-25)来对5mL商业PAF溶液进行冷冻干燥，产生0.40g固体PAF，其具有30U/g活性以及含有2.5wt％的水，这是通过Karl-Fischer滴定来测定的。从Jülich Fine Chemicals(Jülich，Germany)获得来自Stenotrophomonas(以前称为“Xanthomonas”)maltophilia的微生物肽酰胺酶(称作“PAM”)，原样使用(活性，在Z-Gly-Tyr-NH2到Z-Gly-Tyr-OH的脱酰胺作用中，2.87U/mL)。PAF和PAM的酶活是通过Z-Gly-Tyr-NH2于30℃在含有5vol％DMF的50mM水性Tris/HCl缓冲液(pH＝7.5)中的水解来检测的，其中，通过使用实施例1A所述的HPLC方法来监测向Z-Gly-Tyr-OH的转化。
从Novozymes获得Alcalase(批号PLN 04810)，在使用前加以干燥。干燥这样进行：将8.0mL alcalase溶液悬浮于60mL乙醇中，并在4℃于3000G对悬浮液加以离心。倾析出上清液，将固体以超过3x悬浮于60mL乙醇中，加以离心，得到的残余物原样使用。Assemblase从DSM Anti-infectives(Delft，The Netherlands)获得，其对应于按照专利WO 97/04086共价固定于聚合支持物上的E.coli penG酰基转移酶。从DSM Anti-infectives获得Separase，其对应于按照专利WO 97/04086共价固定于聚合支持物上的A.faecalis penG酰基转移酶。
Z-Gly-Tyr-NH2和Z-Gly-Tyr-OH(Bachem)、甲醇(Fluka)、苯基乙酸和MgHPO4(Acros)和氯磺酸(Merck)都按照获得时的状态来使用。在使用前通过蒸馏对叔丁醇(Merck)加以干燥。
按照EP977726(1998，P.J.L.M.Quaedflieg和W.H.J.Boesten)所述的方法，从Z-Gly-Tyr-OH来制备参考材料Z-Gly-Tyr-OMe：在0-5℃，氮气下，猛烈搅拌下，向甲醇(14mL)中的Z-Gly-Tyr-OH(1.60g，4.30mmol)溶液逐滴加入氯磺酸(0.55g，4.72mmol，1.1当量)。50℃搅拌2小时后，将溶液冷却至20℃，逐滴加入到50mL经猛烈搅拌的7wt％KHCO3水溶液中，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。(用Na2SO4)干燥合并的有机相，在真空下浓缩，产生＞99wt％纯的Z-Gly-Tyr-OCH3，基于Z-Gly-Tyr-OH的产率为85％。
在Bruker 300MHz UltrashieldTM NMR核磁仪上，DMSO-d6中，于300MHz记录1H HMR谱。
在本发明的上下文中，1U对应于：使用Z-Gly-Tyr-NH2作为底物，在pH 7.5和30℃下，水性溶液中，每分钟催化1微摩尔Z-Gly-Tyr-OH形成的酶的量。
实施例1从Z-Gly-Tyr-NH2(1)向Z-Gly-Tyr-OMe(2)的酶促转化
实施例1A：使用重复加入PAF的情况下Z-Gly-Tyr-NH2(1)的转化
于30℃，向3.2g MeOH中的1(15mg，0.04mmol)的溶液中加入250μL来自桔皮的肽酰胺酶(PAF；2.4U/mL)和MgHPO4(35mg，0.2mmol，5当量)。在该温度下对反应混合物搅拌186小时，用HPLC(见下文)加以监测，同时以24小时的间隔加入新鲜的一定量的PAF(250μL)。转化的进程如表1所示。66小时后，酰胺1到酯2的转化达到最大(41％)。此时，也已经形成了10％的酸3。
HPLC分析：使用0.1％HCOOH水溶液和乙腈(1.0mL/分钟，40℃)的梯度，在来自Alltech的Prevail柱(250×4.6mm I.D.，5μm)上，用反相HPLC来监测1向2和3的转化。在t＝0时，使用15vol％的乙腈，其在8分钟期间增加至74.5vol％，并在74.5vol％保持7分钟。在15.1分钟时，梯度回到开始的状态。总的分析时间为22分钟。注射体积为5μL，使用分光光度计，在UV 254和270nm处进行检测。1、3和2的驻留时间分别为5.9、9.8和25.4分钟。
表1.使用重复加入PAF的情况下Z-Gly-Tyr-NH2的转化
  时间(h)  Z-Gly-Tyr-NH2(1)(mol％)  Z-Gly-Tyr-OMe(2)(mol％)   Z-Gly-Tyr-OH(3)(mol％)   加入的PAF(μL)   H2O(wt％)
  0   100   0   0   250   7
  18   84   16   1   250   13
  42   69   28   3   250   18
  66   58   35   7   250   22
  138   50   41   10   250   26
  186   50   40   10   26
实施例1B：在开始时加入所有PAF的情况下，Z-Gly-Tyr-NH2(1)的转化
于30℃，向3.2g MeOH中的1(15mg，0.04mmol)的溶液中加入830μL来自桔皮的肽酰胺酶(PAF；2.4U/mL)和MgHPO4(35mg，0.2mmol，5当量)。用HPLC来监测反应(使用与实施例1A所述相同的方法)，其显示，在24小时和40小时时，1到酯2的转化率为14％，到酸3的为0.2％。
实施例1C：使用重复加入PAF的情况下，Z-Gly-Tyr-NH2(1)的完全转化
于30℃，向3.2g MeOH中的1(15mg，0.04mmol)的溶液中加入250μL来自桔皮的肽酰胺酶(PAF；2.4U/mL)和MgHPO4(35mg，0.2mmol，5当量)。在该温度对反应混合物进行15天的搅拌，用HPLC(见实施例1A)加以监测，同时以1天的间隔加入新鲜的一定量的PAF(250μL)。转化的进程如表2所示。显而易见地，15天后，1已经几乎完全转化为2(30％)和3(60％)。
表2.使用重复加入PAF的情况下Z-Gly-Tyr-NH2的转化
  时间(h)  Z-Gly-Tyr-NH2(1)(mol％)  Z-Gly-Tyr-OMe(2)(mol％)   Z-Gly-Tyr-OH(3)(mol％)  加入的PAF(μL)   H2O(wt％)
  0   100   0   0   250   7
  23   94   6   0   250   13
  48   82   15   2   250   18
  72   75   19   6   250   22
  96   68   23   9   250   26
  168   61   24   15   250   30
  192   56   25   19   250   34
  216   48   29   23   250   37
  239   39   30   31   250   39
  311   27   34   40   250   42
  359   14   31   55   250   44
  383   9   30   60   46
                实施例2添加剂的影响
Figure S2006800390909D00161
向3.16g MeOH中的1(15mg，0.04mmol)的溶液中加入249μL来自桔皮的肽酰胺酶(PAF；2.4U/mL)以及一定量的添加剂(见表3)。在30℃搅拌反应混合物24小时之后，取等分试样，使用与实施例1A所述相同的HPLC方法来进行HPLC分析。形成的酯2的量在表3中给出。
表3.添加剂对于用PAF进行的Z-Gly-Tyr-NH2转化的影响
  添加剂   量(mg)  基于1的当量   Z-Gly-Tyr-OMe(3)(mol％)
  MgHPO4   35   5当量   16
  Al2O3   20.4   5当量   17
  原甲酸三甲酯(Trimethylorthoformiate)   21.2   5当量   7.6
  K2SO4   34.9   5当量   7.5
                实施例3水含量的影响
向MeOH和一定量的去矿物质水或Tris/HCl缓冲液(pH＝7.5，含有5wt％DMF)中的1(15mg，0.04mmol)的溶液(总的溶液体积为4mL)中加入一定量的(见下表)经冷冻干燥的、来自桔皮的肽酰胺酶(PAF；30U/g)，以及在一些情况下(见表4)，随后加入34.9mg(0.2mmol，5当量)的MgHPO4。在30℃对得到的反应混合物进行24小时的搅拌，取等分试样，使用与实施例1A中所述相同的HPLC方法进行HPLC分析。形成的酯2和酸3的量示于表4中。
表4.水含量对于用PAF进行的Z-Gly-Tyr-NH2的转化的影响
  MgHPO4(是/否)   MeOH(wt％)   去矿物质水(wt％)   Tris/HCl(wt％)   经冷冻干燥的PAF(mg)   Z-Gly-Tyr-OH2(mol％)   Z-Gly-Tyr-OCH33(mol％)
  是   100   50   ＜0.5   ＜0.5
  是   80   20   20   3   8
  是   50   50   20   13   10
  是   80   0   20   20   9   7
是   90   10   20   2   4
  否   95   5   6.4   ＜0.5   1.4
  是   95   5   6.4   ＜0.5   1.2
  否   95   5   6.4   ＜0.5   0.5
  是   95   5   6.4   ＜0.5   0.6
  否   95   5   128   ＜0.5   4
  是   95   5   128   1   7
实施例4使用N→C方式用PAF进行的对三肽H-Gly-Tyr-Phe-OH(14)
                    的全酶促合成
为合成14，合成流程如下所示。
Figure S2006800390909D00181
4A.对GlyOMe.HCl(4)酶促N-保护得到PhAc-Gly-OMe(6)
将100.0g GlyOMe.HCl(4，0.796mol)和108.4g苯基乙酸(5，0.796mol)悬浮于500mL水中。通过加入83.3mL 32wt％的NaOH将pH调节为6.3。向得到的溶液中加入48g固定的assemblase，在20℃对反应混合物进行16小时的搅拌。将得到的浆体冷却至0℃，在该温度搅拌1小时，通过过滤分离产物PhAc-GlyOMe(6)和固定的assemblase。在EtOAc(500mL)中对固体物质浆体化，滤掉固定的assemblase。(用Na2SO4)干燥EtOAc层，在真空下浓缩，产生100.0g(0.483mol)的6(基于4的产率为61％)。
1H-NMR(DMSO-d6)，δ(ppm)：3.63(3H，s，OCH3)；3.69(2H，s，CH2PhAc)；3.87(2H，s，CH2 Gly)；7.27-7.34(5H，m，PhAc)；8.5(1H，bs，NH)。
4B.酶促偶联得到PhAc-Gly-Tyr-NH2(8)
向640g叔丁醇中54.6g(0.264mol)的PhAc-Gly-OMe(6)溶液中加入61.8g(0.343mol；1.30当量)的L-Tyr-NH2(7)。向得到的浆体中加入干燥的alcalase(基于8mL alcalase溶液)，在35℃对反应混合物进行160小时的搅拌，同时以24小时的间隔加入同样量的alcalase。在160小时后，从反应混合物中取等分试样，通过HPLC进行分析(见下文)。6向PhAc-Gly-Tyr-NH2(8)的转化率为60％，而向副产物PhAc-Gly-OH的水解率为10％。真空下浓缩反应混合物，残余物在100mL EtOAc和100mL水之间分配，将水相的pH调节为3.0(使用12N HCl水溶液)。剧烈搅拌后，8结晶出来，通过过滤对其进行分离。对得到的母液进行相分离之后，用另一份pH 3.0的100mL水对EtOAc层加以搅拌。这导致另一份8结晶出来，通过过滤对其进行分离。再用另一份100mL pH 7.5(用1N NaOH水溶液调节)的水来搅拌得到的母液中的EtOAc层，导致另一份8结晶出来，也通过过滤来分离。总共获得了30.0g(0.084mol)的8(基于6的产率为32％)。
1H-NMR(DMSO-d6)，δ(ppm)：2.6(1H，dd，CH2 Tyr)；2.9(1H，dd，CH2Tyr)；3.4(2H，s，CH2 PhAc)；3.6(1H，dd，CH2 Gly)；3.8(1H，dd，CH2 Gly)；4.35(1H，m，α-H Tyr)；6.6(2H，d，CH Tyr)；6.9(2H，d，CH Tyr)；7.1(1H，s，NH2)；7.25-7.35(5H，m，PhAc)；7.4(1H，s，NH2)；8.0(1H，d，NH Tyr)；8.25(1H，t，NH Gly)；9.3(1H，s，OH Tyr)。
HPLC分析：使用100mM HClO4水溶液(pH 1.0)和乙腈(1.0mL/分钟)的梯度，于40℃在来自Alltech的Prevail柱(250×4.6mm I.D.，5μm)上，用反相HPLC来监测6和7到8的偶联。在t＝0分钟时，使用25vol％的乙腈，其在8分钟期间增加至70vol％，并在70vol％保持2分钟。在10.1分钟时，梯度回到开始的条件。总的分析时间为16分钟。注射体积为5μL，使用分光光度计，在UV 220nm处进行检测。7、PhAc-Gly-OH、8和6的驻留时间分别为2.9、4.9、5.3和5.9分钟。
4C-1.从PhAc-Gly-Tyr-NH2(8)到PhAc-Gly-Tyr-OMe(10)的酶促转化
于30℃，向1050g MeOH中的5g(14mmol)PhAc-Gly-Tyr-NH2(8)的溶液加入83mL来自桔皮的肽酰胺酶(PAF；24U/mL)以及加入11.7g(67mmol)的MgHPO4。每24小时再加入83mL新鲜的酶。通过HPLC(见下文)来监测反应进程。140小时的搅拌后，8到10的转化率为40％，8到PhAc-Gly-Tyr-OH(9)的水解转化率为60％。可以通过蒸发甲醇，在50mL水(pH 7)和50mL EtOAc之间分配残余物，用另外的50mL水(pH＝7)来洗EtOAc层，随后(用Na2SO4)干燥，在真空下浓缩EtOAc层，得到想要的酯10。这产生了1.9g的10(5.14mmol，基于8的产率位37％)。
1H-NMR(DMSO-d6)，δ(ppm)：2.6(1H，dd，CH2Tyr)；2.9(1H，dd，CH2Tyr)；3.5(2H，s，CH2 PhAc)；3.6(3H，s，CH3)；3.7(1H，dd，CH2 Gly)；3.9(1H，dd，CH2 Gly)；4.4(1H，m，α-H Tyr)；6.7(2H，d，CH Tyr)；7.0(2H，d，CH Tyr)；7.28(5H，m，PhAc)；8.3(1H，d，NH Tyr)；8.3(1H，t，NH Gly)；9.3(1H，s，OHTyr)。
HPLC分析：通过与实施例1A所述相同的反相HPLC方法来监测8到10的转化。8、9和10的驻留时间分别为6.9、7.8和8.9分钟。
4C-2：比较例：将PhAc-Gly-Tyr-NH2(8)酶促水解为PhAc-Gly-Tyr-OH(9)，接着进行化学酯化，产生PhAc-Gly-Tyr-OMe(10)
向4.2L 50mM Tris/HCl水性缓冲液(pH＝7.5)(含有5vol％DMF)中15g(42mmol)PhAc-Gly-Tyr-NH2(8)的悬浮液中加入87.6mL来自桔皮的肽酰胺酶(PAF；2.4U/mL)，在30℃对反应混合物进行24小时的搅拌。从反应混合物中取等分试样，通过HPLC(见下文)进行分析，这显示从8到9的转化率为100％。在真空下将反应混合物浓缩为500mL，将pH调节为1.0(使用32wt％HCl水溶液)。用乙酸乙酯(3×300mL)萃取之后，对合并的有机相加以(Na2SO4)干燥，在真空下浓缩，产生含有10.8g(30mmol)9(基于8的产率为72％)和8.8g(0.12mol)DMF的残余物。
1H-NMR(DMSO-d6)，δ(ppm)：2.6(1H，dd，CH2 Tyr)；2.9(1H，dd，CH2Tyr)；3.4(2H，s，CH2 PhAc)；3.7(1H，dd，CH2 Gly)；3.9(1H，dd，CH2 Gly)；4.4(1H，m，α-H Tyr)；6.7(2H，d，CH Tyr)；7.0(2H，d，CH Tyr)；7.31-7.33(5H，m，PhAc)；8.1(1H，d，NH Tyr)；8.3(1H，t，NH Gly)；9.2(1H，s，OH Tyr)；12(1H，bs，COOH)。
HPLC分析：通过与实施例1A所述相同的反相HPLC方法来监测8到9的转化。8和9的驻留时间分别为6.9和7.8分钟。
向含有10.8g 9的111g冰冷的(0℃)甲醇溶液中逐滴加入3.84g(33mmol)氯磺酸(ClSO3H)，在45℃对反应混合物加热2小时。TLC分析(洗脱液是正丁醇/HCOOH/水75/15/10v/v/v)显示9到10的转化是完全的。将反应混合物冷却至环境温度，倾倒进50mL 0.2M KHCO3水溶液和100mL水的搅拌混合物，用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。(用Na2SO4)干燥合并的有机相，真空下浓缩，产生无色的油。将该油转移进CH2Cl2(100mL)，用水(100mL)洗，(用Na2SO4)干燥CH2Cl2层，真空下浓缩，产生9.2g的10，其作为无色的油存在(24.9mmol，基于9的产率为83％)。
1H-NMR(DMSO-d6)，δ(ppm)：2.6(1H，dd，CH2 Tyr)；2.9(1H，dd，CH2Tyr)；3.5(2H，s，CH2 PhAc)；3.6(3H，s，CH3)；3.65(1H，dd，CH2 Gly)；3.9(1H，dd，CH2 Gly)；4.4(1H，m，α-H Tyr)；6.7(2H，d，CH Tyr)；7.0(2H，d，CH Tyr)；7.28(5H，m，PhAc)；8.3(1H，d，NH Tyr)；8.3(1H，t，NH Gly)；9.3(1H，s，OHTyr)。
4D.酶促偶联得到PhAc-Gly-Tyr-Phe-NH2(12)
向15.6g t-BuOH中3.5g(9.5mmol)PhAc-Gly-Tyr-OMe(10)和4.65g(28.3mmol)L-Phe-NH2(11)的溶液中加入经干燥的alcalase(其基于3mL alcalase溶液)，在35℃对反应混合物加以搅拌。24小时后，加入8g t-BuOH以改善搅拌。40小时后，从反应混合物取等分试样，用HPLC(见下文)分析，显示62％的10已转化为PhAc-Gly-Tyr-Phe-NH2(12)，38％的10转化为水解产物PhAc-Gly-Tyr-OH。在真空下浓缩反应混合物，在30g水和45g EtOAc之间分配残余物。用10g水(pH 3)来洗EtOAc层，(用Na2SO4)干燥，真空下浓缩，产生2.5g(5.0mmol)纯的12(基于10的产率为53％)。
1H-NMR(DMSO-d6)，δ(ppm)：2.6(1H，dd，CH2 Tyr或Phe)；2.7(1H，dd，CH2 Tyr或Phe)；2.9(1H，dd，CH2 Tyr或Phe)；3.0(1H，dd，CH2 Tyr或Phe)；3.45(2H，s，CH2 PhAc)；3.6(1H，dd，CH2 Gly)；3.8(1H，dd，CH2 Gly)；4.45(1H，m，α-H Tyr)；4.45(1H，m，α-H Phe)；6.6(2H，d，CH Tyr)；7.0(2H，d，CHTyr)；7.1(1H，s，NH2)；7.2-7.3(10H，m，PhAc，Phe)；7.4(1H，s，NH2)；8.1(1H，d，NH Tyr或Phe)；8.1(1H，d，NH Tyr或Phe)；8.3(1H，t，NH Gly)；9.3(1H，s，OH Tyr)。
HPLC分析：使用与实施例1A所述相同的方法，用反相HPLC来监测10和11的偶联形成12。11、PhAc-Gly-Tyr-OH、10和12的驻留时间分别为3.4、7.8、8.9和9.1分钟。
4E.对PhAc-Gly-Tyr-Phe-NH2(12)的酶促去保护，产生PhAc-Gly-Tyr-Phe-OH(13)
向含有5vol％DMF的200mL 50mM Tris/HCl水性缓冲液(pH＝7.5)中1.0g(2.0mmol)PhAc-Gly-Tyr-Phe-NH2(12)的悬浮液中加入1mL来自Stenotrophomonas maltophilia的肽酰胺酶(PAM；2.87U/ml)，在30℃对反应混合物加以搅拌。24小时后，从反应混合物中取等分试样，用HPLC加以分析(见下文)，显示到PhAc-Gly-Tyr-Phe-OH(13)的转化率为100％。在真空下浓缩混合物，在23g EtOAc和25g水(pH1.0)之间分配残余物。在剧烈搅拌后，13结晶出来，通过过滤对其进行分离。用20g EtOAc再萃取一次水层，(用Na2SO4)干燥合并的EtOAc相，在真空下浓缩，产生无色的油。在25g CH2Cl2和25g水(pH 1.0)之间对油加以分配。CH2Cl2层用25g水(pH 1.0)来洗，(用Na2SO4)干燥，在真空下浓缩，产生作为白色固体的另一份13。13的总产率为0.6g(1.2mmol，基于12的产率为60％)。
1H-NMR(DMSO-d6)，δ(ppm)：2.5(1H，dd，CH2Tyr或Phe)；2.6(1H，dd，CH2 Tyr或Phe)；2.9(1H，dd，CH2 Tyr或Phe)；3.0(1H，dd，CH2 Tyr或Phe)；3.45(2H，s，CH2 PhAc)；3.55(1H，dd，CH2 Gly)；3.8(1H，dd，CH2 Gly)；4.5(1H，m，α-H Tyr)；4.5(1H，m，α-H Phe)；6.6(2H，d，CH Tyr)；7.0(2H，d，CH Tyr)；7.2-7.3(10H，m，PhAc，Phe)；7.9(1H，d，NH Tyr或Phe)；8.2(1H，t，NH Gly)；8.3(1H，d，NH Tyr或Phe)；9.2(1H，s，OH Tyr)。
HPLC分析：使用与实施例1A所述相同的方法，用反相HPLC来监测12到13的水解。12和13的驻留时间分别为9.1和9.3分钟。
4F.对PhAc-Gly-Tyr-Phe-OH(13)的酶促去保护，产生H-Gly-Tyr- Phe-OH(14)以及对H-Gly-Tyr-Phe-OH(14)的回收
向10mL 0.1M TAPS(三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸)水性缓冲液(pH 9.0)中的50mg(0.1mmol)PhAc-Gly-Tyr-Phe-OH(13)的溶液中加入50mg固定的separase。30分钟后，从反应混合物中取等分试样，通过HPLC(见下文)加以分析，显示13到14的转化率为100％。滤掉酶，在真空下浓缩反应混合物至完全干燥。残余物中含有想要的三肽14(作为其与苯基乙酸5的盐存在)
MS(质谱)证实了14的正确分子量(408[M+Na]+；384[M-H]-)。
1H-NMR(DMSO-d6)，δ(ppm)：2.5(1H，dd，CH2 Tyr或Phe)；2.6(1H，dd，CH2 Tyr或Phe)；2.9(1H，dd，CH2 Tyr或Phe)；3.0(1H，dd，CH2 Tyr或Phe)；3.45(2H，s，CH2 PhAc)；3.55(2H，s，CH2 Gly)；4.0(1H，m，α-H Tyr)；4.5(1H，m，α-H Phe)；6.6(2H，d，CH Tyr)；7.0(2H，d，CH Tyr)；7.2-7.3(5H，m，Phe)。
HPLC分析：使用与实施例1A所述相同的方法，用反相HPLC来监测13到14的水解。14和13的驻留时间分别为6.6和9.3分钟。

Claims (18)

1.制备可选被N-末端保护的寡肽烷基酯的方法，所述方法包含下述步骤：b)在肽酰胺酶存在的情况下，将相应的可选被N-末端保护的寡肽C-末端羧酰胺与烷基醇反应。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述肽酰胺酶来自柑橘类水果的皮。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述肽酰胺酶来自桔子的皮。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述方法在水浓度为5至50vol％之间的反应介质中进行。
5.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，释放的NH3中的至少50％被从所述反应介质中除去。
6.如权利要求5所述的方法，其中，通过加入能与NH3配合的化合物来除去所述NH3。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述能与NH3配合的化合物是MgHPO4、Al2O3或K2SO4。
8.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述烷基醇是甲醇。
9.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，向所述反应介质中不止一次地加入所述肽酰胺酶。
10.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述方法在水浓度为5至50vol％之间的反应介质中进行，通过加入能与NH3配合的化合物来除去所述NH3，其中，所述能与NH3配合的化合物选自MgHPO4、Al2O3和K2SO4构成的组。
11.用于制备寡肽的方法，其中包括如权利要求1-9中任意一项所述的方法。
12.用于制备寡肽的方法，其中包括下述步骤：
b)如权利要求1-9中任意一项所述在存在肽酰胺酶的情况下，将可选被N-末端保护的寡肽C-末端羧酰胺与烷基醇反应，
c)在存在能催化肽键形成的酶的情况下，将形成的可选被N-末端保护的寡肽C-末端烷基酯与氨基酸C-末端羧酰胺或与寡肽C-末端羧酰胺反应，以形成可选被N-末端保护的寡肽C-末端羧酰胺，其中所述能催化肽键形成的酶是蛋白酶、酰基转移酶或氨基酸酯水解酶。
13.如权利要求12所述的方法，其中，重复步骤b)和c)，直到获得具有想要的氨基酸序列的可选被N-末端保护的寡肽C-末端羧酰胺。
14.如权利要求12所述的方法，其中，通过a)在存在能催化肽键形成的酶的情况下，将可选被N-末端保护的氨基酸C-末端烷基酯或可选被N-末端保护的寡肽C-末端烷基酯与氨基酸C-末端羧酰胺或与寡肽C-末端羧酰胺反应，来制备在步骤b)中使用的所述可选被N-末端保护的寡肽C-末端羧酰胺。
15.如权利要求13所述的方法，其中，通过a)在存在能催化肽键形成的酶的情况下，将可选被N-末端保护的氨基酸C-末端烷基酯或可选被N-末端保护的寡肽C-末端烷基酯与氨基酸C-末端羧酰胺或与寡肽C-末端羧酰胺反应，来制备在步骤b)中使用的所述可选被N-末端保护的寡肽C-末端羧酰胺。
16.如权利要求13所述的方法，还包括下述步骤：
d)在C-末端上和/或在N-末端上和/或如果存在至少一个氨基酸侧链保护基团的话在氨基酸侧链的至少一个上，对具有想要的氨基酸序列的可选被N-末端保护的寡肽C-末端羧酰胺进行去保护，和/或
e)回收所述被保护或未被保护的寡肽。
17.如权利要求13所述的方法，其中，通过酶促引入和/或除去N-末端保护基团。
18.如权利要求16所述的方法，其中，通过在肽酰胺酶存在下，在含有不超过40wt％烷基醇的水性溶液中，将所述可选被N-末端保护的寡肽C-末端羧酰胺转化为相应的C-末端羧酸，从而对所述可选被N-末端保护的寡肽C-末端羧酰胺的C-末端进行去保护。
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