CN101287840A

CN101287840A - 表达在酰胺化产物的制备中有用的酶的细胞系

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Publication number: CN101287840A
Application number: CNA2006800309023A
Authority: CN
Inventors: D·A·米勒; N·M·梅塔; A·P·康萨尔沃
Original assignee: Unigene Laboratories Inc
Current assignee: Enteris Biopharma Inc
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2008-10-15
Anticipated expiration: 2026-06-23
Also published as: AU2006261909A1; JP2011139714A; CA2613471C; AU2006261909B2; EP1907561A4; CA2613471A1; EP1907561A2; JP2008543344A; US8815583B2; JP5568703B2; DK1907561T3; US20060292672A1; WO2007002532A2; JP4856177B2; ES2437068T3; CN101287840B; WO2007002532A3; EP1907561B1; JP5677918B2; JP2012016354A

Abstract

提供了表达肽基甘氨酸α－酰胺化单加氧酶(PAM)或它的两个催化结构域之一的细胞系。在利用非动物来源的、低蛋白组织培养基时实现了高水平酶表达。强大的两步下游纯化产生了高的酶纯度。产生的PAM或它的PHM催化结构域被用于催化X－Gly向X－α－羟基－Gly或X－NH₂(X是肽或任何化合物，其具有可以共价连接甘氨酸基团的羰基)的转化。还阐述了制备优选的细胞系的方法。

Description

表达在酰胺化产物的制备中有用的酶的细胞系

相关技术的说明

许多人类激素、生长因子、细胞因子、神经递质、衍生的脂肪酸和其他重要的生物学化合物具有氨基酸或肽作为它们分子结构的实质部分。许多疾病主动地响应来提高患者中这些生物学化合物的水平。治疗有效量的这些生物学上相关的化合物可以以各种途径施用给患者。因而，这些化合物的有效的、低成本生产过程是非常重要的。当生物学化合物在用于口服递送的剂型中制备时这是特别实在的，尽管相对于其他施用方式有较低的生物利用率，口服递送是通常优选的施用方式。

哺乳动物细胞和其他真核生物可以进行某些翻译后加工过程，而原核生物不能。某些原核生物，例如E.coli，被广泛采用作为宿主用于通过重组DNA(rDNA)技术的哺乳动物蛋白生产，因为它们可以容易地在分批发酵过程中生长并且因为它们在遗传学上被良好地表征了。然而，许多哺乳动物蛋白需要某些类型的翻译后加工。例如，如果这些蛋白通过E.coli的遗传工程化来生产，翻译后加工通常必需使用复杂的、体外的化学操作来实现，这些化学操作对于大规模生产应用是成本上禁止性的。即使当使用哺乳动物宿主重组地生产肽时，通常希望的是有效地生产前体，其仅在后来经受进一步的修饰。

这种进一步的加工的一种类型包括肽或蛋白的羧基末端氨基酸的特异性酰胺化。许多天然发生的激素和肽含有这种修饰，如果该蛋白将要是生物学活性的，其通常是必需的。一个实例是降血钙素，非酰胺化脯氨酸残基对天然形式的酰胺化脯氨酸的替换引起了生物学活性方面非常显著的降低。对于完全活性需要翻译后酰胺化的其他生物学肽包括但不限于生长激素释放因子、其他降血钙素、降血钙素基因相关的肽、分泌素、肽YY等等。

为了最大效力需要酰胺化的许多重要的生物学蛋白的多肽序列可以通过例如遗传工程技术来产生。然而，重要的和有时必需的羧基末端酰胺化通常必需在体外进行。希望的是在此时避免费钱的和麻烦的化学酰胺化技术，因而希望的是利用酰胺化酶来进行特异性酰胺化。蛋白的羧基末端氨基酸的特异性酰胺化通常由α-酰胺化酶来催化。

肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM)催化肽底物向酰胺化肽产物的转变。这种转变是两步的反应。PAM具有两个催化结构域：肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶(PHM)催化步骤1(底部向中间物的转变)，肽基甘氨酸α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂解酶(PAL)催化步骤2(中间物向产物的转变)。全长PAM是双功能的并且催化两个步骤。如果中间物与路易斯碱接触，步骤2也可以非酶学地有效实现。

在自然中，大约50％的肽激素和神经递质按上述方式通过PAM来酰胺化。PAM活性已经在许多物种中认识到，在多样性如大鼠、牛和蛙的物种之中，PAM倾向于具有显著的结构同源性。还已知的是PAM的功能、底物和辅助因子在物种间是类似的(通常是相同的)。底物是化合物，通常是肽，具有带有游离羧基的甘氨酸残基。PAM催化的酰胺化反应是本领域公知的。例如，在美国专利6,103,495中详细描述了一种，其中肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶被用于催化甘氨酸延伸的鲑鱼降血钙素前体成为在其C-末端酰胺化的真正的鲑鱼降血钙素(即，具有代替前体的C-末端甘氨酸的氨基基团)。

PAM和表达PAM的细胞系的来源是本领域已知的。为了最好的成本效率，酰胺化肽的大规模PAM催化生产需要稳定的高产PAM来源。另外，由于PAM经常用于潜在的人类药物产物的生产，重要的是用于PAM生产的系统(PAM表达细胞系和细胞系生长的培养基)在PAM表达期间引入尽可能少的混杂物。特别的关注是最小化哺乳动物蛋白质的使用以避免可传播的海绵状脑病(TSE)的风险。尽管如此，培养基中的哺乳动物蛋白质生长因子(根据TSE的立场不希望的)可能在帮助PAM表达细胞系的存活和产物表达方面是有用的。因而，本领域需要PAM表达(或PHM表达)细胞系，其提供了强的表达并显示了甚至在缺少哺乳动物蛋白质的情况下的良好稳定性和存活率，所述哺乳动物蛋白质在其他情况下在培养基中是需要的。

发明概述

因而本发明的目的是提供PAM表达或PHM表达细胞，其足够强壮以在培养基中具有良好存活率和良好表达产量，所述培养基基本上缺少在所述酶后期用于产物的生产(例如，酰胺化药物产物的生产)时是成问题的哺乳动物蛋白质种类和其他混杂物。

本发明的进一步的目的是提供PAM表达或PHM表达细胞，其本身不共表达显著的不希望的混杂物。

进一步的目的是提供PAM表达或PHM表达细胞，其提供了良好的表达产量。

进一步的目的是提供在这种细胞中有用的表达载体。

进一步的目的是提供转染和选择这种细胞的良好技术。

进一步的目的是提供用于酶反应的高活性和高纯度的PAM或PHM，并因而提供良好的酶反应和产生酰胺化产物。

在此公开的发明提供了这些和其他目的。

在一个实施方式中，本发明提供了用用于表达肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的表达载体转染的CHO K1细胞。

在另一个实施方式中，本发明提供了具有编码区的重组表达载体，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点、启动子和所述启动子上游的SV40增强子。

在另一个实施方式中，本发明提供了具有编码区的重组表达载体，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点和人类金属硫蛋白IIA启动子。

在另一个实施方式中，本发明提供了制备用于肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶表达的细胞系的方法，所述方法包括步骤：

(A)在存在第一、第二和第三表达载体的情况下转染潜在的宿主细胞，其中所述第一载体包括编码第一可选择标记的编码区，其中所述第二载体包括编码第二可选择标记的编码区，其中所述第三载体包括编码肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的编码区，其中所述第三载体与所述第一载体的浓度比是至少3∶1，以及其中所述第三载体与所述第二载体的浓度比是至少3∶1；

(B)使产自步骤(A)的细胞经历选择压力来选择用所述第一载体转染了的细胞；

(C)使产自步骤(B)的细胞经历选择压力来选择用所述第二载体转染了的细胞；

(D)使产自步骤(C)的细胞经历有限稀释并选择表达肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的细胞。

在另一个实施方式中，本发明提供了细胞系UGL 73-26/M。

在另一个实施方式中，本发明提供了由细胞系UGL 73-26/M表达的肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶。

在另一个实施方式中，本发明提供了在表达和分泌到培养基中之后纯化肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的方法，其中所述方法包括步骤：

(A)使不纯的肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶样品经历阴离子交换层析，其中洗脱是等浓度的；

(B)使步骤(A)的洗脱物经历疏水性相互作用层析，其中不使用硫酸铵并且其中洗脱是等浓度的。

在另一个实施方式中，本发明提供了用用于表达肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的表达载体转染的CHO K1细胞。

在另一个实施方式中，本发明提供了具有编码区的重组表达载体，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点、启动子和所述启动子上游的SV40增强子。

在另一个实施方式中，本发明提供了具有编码区的重组表达载体，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点和人类金属硫蛋白IIA启动子。

在另一个实施方式中，本发明提供了制备用于肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶表达的细胞系的方法，所述方法包括步骤：

(A)在存在第一、第二和第三表达载体的情况下转染潜在的宿主细胞，其中所述第一载体包括编码第一可选择标记的编码区，其中所述第二载体包括编码第二可选择标记的编码区，其中所述第三载体包括编码肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的编码区，其中所述第三载体与所述第一载体的浓度比是至少3∶1，以及其中所述第三载体与所述第二载体的浓度比是至少3∶1；

(D)使产自步骤(C)的细胞经历有限稀释并选择表达肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的细胞。

在另一个实施方式中，本发明提供了在表达和分泌到培养基中之后纯化肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的方法，其中所述方法包括步骤：

(A)使不纯的肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶样品进行阴离子交换层析，其中洗脱是等浓度的；

期望酶通过本发明的细胞和细胞系表达，在优选的实施方式中，根据本发明的纯化技术来纯化。然后从前体开始在存在酶的情况下进行反应，所述前体具有处于游离酸形式并附着于羰基的甘氨酸残基。反应条件和辅助因子是本领域已知的。此处的实施例1和2显示了典型的酰胺化反应和酰胺化产物的纯化。产生优选的酰胺化产物。当使用肽基α-羟基化单加氧酶时，中间产物需要使用路易斯碱或肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂解酶的进一步反应来形成酰胺化产物。

当例如在此讨论的那些的酶生产细胞系表达并分泌酶到培养基中时，可以跟随一系列的步骤，在某些实施方式中，来纯化所述酶。收获步骤从细胞中分离条件培养基。首先的切向流动过滤(浓缩，渗滤)除去低分子量成分。主要使用阴离子交换层析步骤和疏水性相互作用层析步骤用于从蛋白混杂物和培养基成分的纯化。在病毒过滤之前的最终的切向流动过滤、浓缩和缓冲液交换是在保存之前期望采用的。在此要求了改进的阴离子交换层析和疏水性相互作用层析。

令人惊讶地发现，尽管存在内源的二氢叶酸还原酶基因，希望地稳定的CHO K1细胞可以在本发明的环境中使用。内源基因不显著地干扰根据具有二氢叶酸还原酶基因的可选择标记的氨甲蝶呤选择。

如在此描述，在独立的载体上与两个可选择标记共转染PAM基因，被认为显著提高在基因组的更期望的部分发生共扩增的机会。

当使用SV40增强子时，要理解的是该增强子可以与任何转录启动子一同使用，包括但不限于SV40转录启动子、在此讨论的优选的金属硫蛋白IIA启动子，等等。

根据本发明表达和纯化的肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶基本上没有不希望的蛋白酶活性，并且适合于在此描述的有效的底物α-酰胺化。

在此讨论的优选的细胞系UGL 73-26/M显示了良好的长寿命长寿命分布型，因而被认为对于稳定性非常重要的规模扩大特别有用。

同样地，在此讨论的优选的纯化技术提供了可量的特征和显著的产品纯度。特别地，使用等浓度洗脱，其显著地简化了馏分收集。先有技术中硫酸铵连同疏水性相互作用层析的使用被期望地避免，引物硫酸铵可能引起酶的沉淀和钝化。

通过类推，预期的是在此描述的发明对于肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶将是有益的，同样它们对于肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶是有益的。

可以组合使用在此声明的一种或多种优先选择。例如，而不是限制性的，优选的启动子可以与优选的增强子和/或与优选的宿主细胞一同使用。

当(A)PHM和(B)PAL或路易斯碱被用于代替PAM酰胺化时，PHM和PAL(当使用时)可以以多种方式获得。以下阐述了一些。

PHM

表达PAM基因的天然发生的形式，其在表达时仅含有PHM活性

来自蛙的一种酶是天然发生的PHM酶。参见Mizuno et al(1986)，″Peptide C-Terminal α-Amidating Enzyme Purified to Homogeneity FromXenopus laevis Skin″Biochem Biophys.Res.Commun.，137(3)984-991，其后来被发现是PHM而不是全长PAM。参见Suzuki et al(1990)，EMBO9(13)4259-4265。

全长PAM的表达和裂解

特异性蛋白酶可以用于在PHM活性和PAL活性之间的位点、例如二碱裂解位点裂解PAM酶。然后可以通过纯化获得PHM催化结构域。例如Ouafik et al，(1992)″The Multifunctional Peptidylglycine α-Amidating Monooxygenase Gene：Exon/Intron Organization of Catalytic，Processing，and Routing Domains″Molecular Endocrinology 6(10)1571-1584描述了大鼠衍生的PAM中两个催化结构域的位置，并注释“在配对的碱性位点的内蛋白水解裂解可以分离两个催化结构域”。还参见Eipper et al(1993)，″Peptidylglycine α-Amidating Monooxygenase：AMultifunctional Protein With Catalytic，Processing，and RoutingDomains″Protein Science 2，489-497.

在PAM中引入终止密码子或改变阅读框的点突变

可选择的翻译终止密码子(TAA、TAG、TGA)可以引入来自任何物种的任何PAM cDNA的PAM两个功能结构域(PHM和PAL)之间，或在这个位置上的点突变可以被引入来改变阅读框。

重新工程化仅具有PHM cDNA的表达载体

利用PCR，仅编码PHM结构域的截短的PAM基因可以被合成，并插入到表达载体中启动子或增强子/启动子序列的下游。

以下列出的是不同类型的PAM酶和其催化结构域的其他参考文献：

Mizuno，K.et al.，(1987)″Cloning and sequence of cDNA encodinga peptide C-terminal α-amidating enzyme″from Xenopus Laevis BiochemBiophys.Res.Commun.，148(2)546-552.

Ohsuye，K.，et al.，(1988)″Cloning of a cDNA encoding a newC-terminal α-amidating enzyme having a putative membrane-spanningdomain″from Xenopus Laevis Biochem.Biophys.Res.Commun.，150(3)1275-1281.

Koljekar，A.S.，et al，(1997)″Peptidylglycine α-amidatinghydroxylating monooxygenase：active site residues，disulfide linkages andtow-domain model of the catalytic core″，Biochemistry 36：13901-13909.

Koljekar，A.S.，et al.，(2002)″Essential features of the catalytic coreof Peptidylglycine α-hydroxyglycine α-amidating lyase″，Biochemistry，41：12384-12394.

Bertelsen，A.H.，et al，(1990)″Cloning and characterization of twoalternatively spliced rat α-amidating enzyme cDNAs from rat medullarythyroid carcinoma″，Arch.Biochem.Biophys.，279(1)87-96.

Jimenez N.，et al.，(2003)″Androgen-independent expression ofadrenomedullin and peptidylglycine α-amidatmg monooxygenase in humanprostatic carcinoma″，Molecular Carcinogenesis 35：14-24.

PAL

表达PAL的天然发生形式

在果蝇和腔肠动物(海葵)中PAM的两个催化结构域由独立的基因编码。因而，当放入表达载体的启动子或增强子/启动子序列下游时，编码来自这些物种的PAL的基因可以被表达。参见Kolhekar，A.S.，et al.(1997)″Neuropeptide Amidation in Drosophila：Separate Genes Encodethe Two Enzymes Catalyzing Amidation″/.Neuroscience 17(4)：1363-1376.

全长PAM的表达和裂解

可以表达全长双功能PAM，特异性蛋白酶位置处的裂解可以在PHM和PAL结构域之间进行和/或在PHM结构域内进行来钝化PHM。任何适合的特异性蛋白酶可以用于从PAL活性上分离PHM活性，例如，二碱裂解位置。PAL活性/蛋白可以被进一步纯化。类似的操作和二碱裂解位点的定位如上连同获得PHM被描述。

重新工程化仅具有PAL cDNA的表达载体

利用PCR，仅编码PAL结构域的截短的PAM基因可以被合成，并插入到表达载体中启动子或增强子/启动子序列的下游。

本发明的其他特征和益处将根据以下的参考附图、图表、表格等等的发明描述而变得更加明显。

附图的简要说明

附图1是pHS 1的质粒图。

附图2是pUC8的质粒图。

附图3是pSV402MT的质粒图。

附图4是α-AE cDNA基因序列的衍化。

附图5是pAE73的质粒图。

附图6是73-26悬浮适应方案。

附图7是旋转烧瓶中的溶解氧浓度和α-AE生产力。

附图8是旋转器体积对DO和α-AE生产力的影响。

附图9是UGL 73-26/M的旋转培养物pH值。

附图10是没有pH控制的搅拌的罐生物反应器和旋转烧瓶的pH值分布。

附图11是在搅拌的罐生物反应器中pH值对UGL 73-26/Mα-AE生产力的影响。

附图12是纯化的PAM酶的SDS PAGE。

附图13是SDS PAGE凝胶的密度计扫描和峰面积百分比的计算。

附图14是α-AE生产的加工流程图。

附图15是UGL 73-26/M的接种方案。

本发明的实施方式的详细说明

根据本发明的PAM表达细胞系(内部称为UGL 73-26/M MWCB 00)根据关于专利程序目的的微生物保藏的国际认可的布达佩斯条约在或约在2005年6月10日保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas Virginia，20110-2209，U.S.A.。ATCC登记号码是PTA 6784。这个保藏的细胞系服从于这个条约下颁布的细则，在条约要求的时间和条件下并且遵照条约签署国的专利法和细则，样品将成为可获得的。例如，在基于本申请或要求其优先权或进行参考的任何其他美国申请的美国专利授权时，关于保藏的材料的可获得性的所有限制将不可撤销地移动到布达佩斯条约或35U.S.C.§112所要求的程度。

本发明的PAM表达载体的构建在下文中详细描述。在此处的质粒图中，标记“a酰胺化酶”的区域(参见，例如附图5，pAE 73的质粒图)具有附加在此的SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列，并且编码如附加在此的SEQ ID NO：2所列的715个氨基酸的原始翻译产物。该翻译产物包括氨基酸1-25的信号肽、26-41的前区域以及42-715的成熟肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶。根据本发明表达和纯化的大多数酶继续包括前区域，并被证明是非常有效的。

以下详述的是优选的PAM表达细胞系、它的发酵、加工开发、纯化和使用的实例。

如下文更详细地讨论的，PAM基因被克隆到pSV402MT表达载体中来创建PAM表达质粒pAE73。用pAE73DNA转染CHO K1细胞。在双选择过程和有限稀释克隆之后，使用提高浓度的氨甲蝶呤进一步扩增CHO细胞系。粘附细胞系73-26转变成无选择、无血清悬浮培养物UGL73-26/M。在BioReliance Corp.产生UGL 73-26/M MCB和MWCB。MCB和MWCB都已经被完全地表征，被认为对于在GMP设备中PAM的生产是可接受的。UGL 73-26/M细胞系已经适合于在搅拌的罐生物反应器中生长。发酵开发导致限定了接种过程，其在旋转烧瓶中处理14天。发酵/细胞培养阶段是17天的过程。发酵过程的关键参数如下：在第5、10和14天葡萄糖添加(2g/L)，溶解氧浓度＞70％，发酵的pH值达到它的天然调整点，无蛋白的、非动物来源的组织培养基，Sigma C5467，补充有谷氨酰胺到2mM的终浓度。对来自C5467条件CHO培养基的PAM开发了简单和强大的下游纯化过程。在纯化后通常地实现纯度的四倍提高和活性酶的40％总回收率。加工利用了常规的过滤系统和生物过程层析树脂，其能够规模扩大到工业水平。整个细胞培养发酵和下游的纯化过程已经扩大到10L中试工厂/工业水平。所描述的加工应当可经受可验证的生产过程用于大量PAM的生产。

开发了CHO细胞系，其表达大量的PAM，UGL 73-26/M。为UGL73-26/M开发的细胞培养过程处在非动物蛋白来源的培养基中。简单的分批细胞培养过程是优选的。纯化方案的目标是开发具有催化活性酶的良好产量的强大的和可扩大的过程。

载体构建

用于产生细胞系的表达载体pAE73的创建基于Friedman et al.Bio/Technology 7：359-362(1989)的工作的结果。在这篇文献描述的过程之后，我们着手创建pAE73表达载体用于测试。每个载体的主要成分是人类金属硫蛋白IIA(hMTIIA)启动子(位于pHS1，来自M.Karin)、SV40增强子(来自pSV40，ATCC)和在此描述的酰胺化酶基因。

pAE73的衍生

pHS 1

用于pAE73创建的起始质粒是质粒pHS1(附图1)，1990年2月来自UCSD的M.Karin的赠送。荣光将人类金属硫蛋白IIA启动子剪接到pUC8中(附图2)，在Dr.Karin的实验室中得到pHS1。846bp的Hind III/Bam HI片段克隆到pUC8多克隆位点(MCS)的Hind III-Bam HI位置。产生的质粒pHS1具有插入到多克隆位点中的人类金属硫蛋白IIA启动子。

pSV401MT和pSV402MT

通过在人类金属硫蛋白启动子上游插入SV40增强子将pHS1转变成表达载体pSV401MT或pSV402MT(附图3)。通过用Hind III消化pSV40质粒DNA来制备SV40 DNA片段。1167bp的Hind III片段克隆到pHS1的Hind III位点中。SV40增强子不对称地位于Hind III DNA片段内，因而将增强子放置为靠近或远离hMTIIA启动子。SV40增强子内Bgl I位点相对于原始质粒中lac Z基因的取向决定了质粒名称。pSV401MT具有远离hMTIIA启动子的SV40增强子，pSV402MT具有靠近hMTIIA启动子的SV40增强子。pSV402MT被选择用于进一步的载体构建。

pAE73

通过将a酰胺化酶基因(SEQ ID NO：1)克隆到pSV402MT的BamHI位点来制备pAE73。在用Bgl 1和Bam HI DNA限制性内切酶消化pAE64之后分离2870bpα-AE基因片段。pAE64质粒含有SV40启动子/增强子下游的PAM基因，其被修饰以表达可溶的75kDa PAM蛋白。这种PAM DNA序列已经用于另一个CHO表达细胞系UGL B3/A1-7来表达75kDa PAM蛋白。PAM基因序列的衍化在附图4中示出。

纯化2870bp的DNA片段，片段的Bgl 1末端用两个互补的DNA寡核苷酸片段(AE96/AE97)修饰，其将该片段的Bgl 1末端转变成新的Bam HI末端。

AE96(+)235′GATCCATCGATCGCACTAGTGCC 3′

AE97(-)165′ACTAGTGCGATCGATG 3′

修饰的PAM DNA片段克隆到表达载体pSV402MT的Bam HI位点中。具有两个Bam HI末端的PAM DNA片段可以以正义或反义方向连接到表达载体中，因而PAM基因的取向由使用Eco R1对质粒的限制性消化作图来决定。PAM基因和表达载体中的Eco R1位点容许质粒DNA的简单分析。具有正确取向的PAM的质粒被称为pAE73，它的质粒图在附图5中示出。

α酰胺化酶表达细胞系的创建

转染和克隆

三种质粒用于CHO K1细胞的转化：pAE73、pSV2neo和pSV2dhfr。使用质粒pSV2neo和pSV2dhfr(都从ATCC获得)，因为转染的细胞对这些质粒的掺入容许容易地选择转化的细胞系。质粒pSV2dhfr还是特别选择的，因为SV40启动子/dhfr DNA掺入CHO基因组中容许该基因和其他近端基因的选择性扩增。要共同扩增的基因是质粒pAE73中携带的α-酰胺化酶基因。通过质粒DNA的磷酸钙沉淀来转化CHO K1细胞。以pAE73：pSV2neo：pSV2dhfr的10∶1∶1比例将质粒转染到细胞中。将20μg pAE73添加到每个100mm平皿中。转染后两天，在含有250mg/L G418的培养基中在选择压力下生长细胞以仅容许转化的细胞生存。这种培养基中的CHO细胞生长将需要pSV2neo质粒的稳定掺入。一旦在G418选择培养基中建立了稳定的生长，氨甲蝶呤在转染后27天添加到生长培养基。转化的细胞的G418库在含有100nM、500nM、1μM或5μM氨甲蝶呤和250mg/L G418的培养基中生长。两周之后(转染后六周)分离的细胞灶可以通过克隆圆筒从5μM氨甲蝶呤+G418培养基中生长的细胞中建立。通过这种方法进行尝试来从二十五个灶建立细胞系，但是在转染和这种技术之后生长的来自仅两个灶的细胞被放弃。细胞在含有1μM氨甲蝶呤+G418的培养基中生长的同时开始有限的稀释克隆，0.5细胞/孔。在较低浓度的氨甲蝶呤中生长的转化细胞被放弃。开始有限稀释克隆之后三周，将分离物转移到24孔平板中，然后到100mm平皿中用于在2-3天内扩展生长。CHO K1细胞的开始转染后十周，建立了一个称为73-26的分离物。该细胞系被低温保存，并评估a酰胺化酶表达。73-26在此时是最好的生产细胞系之一，产生6953U/10⁶个细胞/天。

细胞系73-26的扩增

73-26的原始克隆进行传代来产生在含有1μM氨甲蝶呤+G418的培养基中维持的建立的细胞系。选择pSV2dhfr质粒用于转染的目的不仅因为它提供了鉴定转化细胞系的第二种选择方法，还因为已经广泛地确定了当细胞在高浓度的氨甲蝶呤中生长时dhfr迷你基被扩增。UnigeneLaboratories早先使用这种质粒转化的细胞系的经验显示，20-50μM的氨甲蝶呤是引发α-酰胺化酶的最大生产所需的。α-酰胺化酶细胞系73-26直接分开到含有1μM、20μM或50μM氨甲蝶呤的培养基中。所有培养基都含有G418作为选择的第二方法。这种细胞系以各种时间间隔的α-酰胺化酶表达的发展在表1中示出。

表1CHO细胞系73-26的扩增和表达

日期	细胞系	氨甲蝶呤(μM)	α-AE(U/10⁶细胞/天)	与B3/A1-7对照的相对活性	注释
日期	细胞系	氨甲蝶呤(μM)	α-AE(U/10⁶细胞/天)	与B3/A1-7对照的相对活性	注释	08/19/1991					细胞系移到具有提高浓度的氨甲蝶呤的培养基
09/26/1991	73-26	1	15138			08/19/1991					细胞系移到具有提高浓度的氨甲蝶呤的培养基
09/26/1991	73-26	1	15138				73-26	20	ND		细胞系生长缓慢
	73-26	50	ND		细胞系生长缓慢		73-26	20	ND		细胞系生长缓慢
	73-26	50	ND		细胞系生长缓慢	10/28/1991.	73-26	1	25000
	73-26	20	6923			10/28/1991.	73-26	1	25000
	73-26	20	6923				73-26	50	114162
	73-26						73-26	50	114162
	73-26					11/21-22/1991	B3-A1/7		5714/4087
	73-26	1	73099/30065	16.5		11/21-22/1991	B3-A1/7		5714/4087
	73-26	1	73099/30065	16.5			73-26	20	55925/7570	5.8
	73-26	50	22055/40937	7.0			73-26	20	55925/7570	5.8
	73-26	50	22055/40937	7.0		11/22/1991.12/10/1991	B3-A1/7		325/4087
	73-26	1	15277	4.7		11/22/1991.12/10/1991	B3-A1/7		325/4087
	73-26	1	15277	4.7			73-26	20	41898	12.9
	73-26	50	96941	29.8			73-26	20	41898	12.9
	73-26	50	96941	29.8		04/26/1992	B3-A1/7		4692
	73-26	1	22934/26340	5.2		04/26/1992	B3-A1/7		4692
	73-26	1	22934/26340	5.2			73-26	20	24935/17237	4.5
	73-26	50	47088/78462	13.4			73-26	20	24935/17237	4.5

ND＝未测定

表1中是数据显示，与早先开发的B3/A1-7细胞系的相比，在这种细胞系中α-酰胺化酶的提高的表达水平。α-酰胺化酶基因和dhfr基因的共扩增通过细胞系表达更多酶和在提高的氨甲蝶呤浓度下继续传代培养的能力来显现。在存在20μM或50μM氨甲蝶呤的情况下的细胞生长在3-4个月的选择性扩增之后具有最好的表达水平。当连续传代培养数月之后，α-酰胺化酶的表达水平降低。这种细胞系的早期冷冻储备物因此用于制备的悬浮适应的细胞系。

悬浮适应的α-酰胺化酶表达细胞系73-26的表征

开发这种细胞系的最终目标是开发稳定的而没有氨甲蝶呤和G418的选择压力的一种过程。细胞系的另一种期望的性质是它应在悬浮培养物中生长到相对高的细胞密度。用于实现这些目标的方法描述如下。

悬浮适应的、无选择细胞系的制备

无选择悬浮适应的细胞的制备需要UGL 73-26粘附细胞断除血清、氨甲蝶呤和G418。开发了多种prong attack，附图5，来实现这个任务；建立了基质去除，最终目标是添加尽可能少的在最终的细胞系上加倍的细胞数量。将早期的冷冻物，12/16/91的73-2620μM氨甲蝶呤细胞系解冻来建立悬浮适应的无血清无选择细胞系用于将来的开发研究。虽然50μM氨甲蝶呤中的PAM活性有些高，重建活跃生长的73-2650μM细胞系的尝试是不成功的。在开始悬浮适应方案之前评定细胞系的α-酰胺化酶生产力，表2。

表273-2620μM的生产力

细胞系	α-AE(U/10⁶细胞/天)
细胞系	α-AE(U/10⁶细胞/天)	CHO K1B3/A1-773-26	022,555446,625

在使它适应悬浮培养之前这个细胞系的PAM活性具有与B3/A1-7对照相比在每个细胞的基础上高20倍的活性。对照细胞系和73-26两者的酶活性是细胞系冷冻之前原始测试中观察到的5-10倍12/16/91(表1)。

如附图6所示，产生了四种新的悬浮适应的无血清细胞系。称为73-26/K-N的细胞系在37天处理后被低温保存。

悬浮适应的73-26的α-酰胺化酶产生

来自新的73-26细胞系的存库的细胞(73-26/K、73-26/L、73-26/M、73-26/N)被解冻并在旋转烧瓶中生长。在Ex-Cell 301培养基中每周传代细胞三次来维持细胞系。在周期性的间隔时，进行完全的培养基交换，以及通过α-AE分析评估的酶生产力24h评定。细胞系在培养中维持直至80天。前述细胞系B3/A1-7的半连续分批处理是40天的处理，我们选择在这个操作的两倍时长下评估细胞系产量稳定性。这项研究的数据在表3中示出。在这个研究的过程中，在第22天和第40天终止细胞系73-26/L终止，所有其他细胞系在80天时期的结束时活跃地生长。

表3悬浮适应的细胞系73-26/K-N的酶生产力

注：对比的培养测试期的天数是15-22，40-47，60，70和80天的结果

虽然在早期间隔、＜40天时所有细胞系表达了比B3/A1-7显著更多的α-酰胺化酶，在70天后仅73-26/M和73-26/N仍然产生大量的酶。选择UGL 73-26/M用于进一步的开发，因为它在80天时期中一致地产生更多的α-酰胺化酶。其他三种细胞系要么在80天测试期结束之前停止生长，要么它们的生产力/细胞/天在最后20天衰退消失。

CHO K1、UGL 73-26、UGL 73-26/M MCB和UGL 73-26/M MWCB00 的预备库、细胞库表征研究

对宿主细胞系(CHO K1)、祖细胞系(73-26)和UGL 73-26/M种子库进行表征研究。在2/4/98制备40小瓶UGL 73-26/M种子库。种子库的每个小瓶含有90％Ex-Cell 301/10％DMSO中的4×10⁶个细胞/mL。进行的所有研究按照CHO细胞系需要的结果来评估，制成MCB和MWCB，参见表4。

主细胞库UGL73-26/M细胞系在BioReliance Corp.制成。几个118MCB小瓶用于细胞系的完全表征。UGL 73-26/M MCB研究的所有结果符合CHO来源的细胞系并且对于传染原是阴性的。在BioRelianceCorp.，UGL 73-26/M MCB的小瓶用于产生238瓶厂家的工作细胞库，UGL 73-26/M MWCB00。UGL 73-26/M MWCB00研究的所有结果符合CHO来源的细胞系并且对于传染原是阴性的。

UGL 73-26/M在旋转烧瓶和搅拌罐生物反应器中的过程开发研究

由于初步实验表明细胞系的生产力不能在许多世代上维持一致，研究了分批发酵方案。分批方案还提供了易于调度、容易的可扩大性和不太极端的批次失败结果的益处。UGL 73-26/M的发酵过程开发需要研究可能影响细胞系的细胞生产力的许多参数。以下详述的发酵开发显示了研究溶解氧(DO)、pH值和培养基添加物的关键性研究。没有研究的发酵参数是转子RPM和发酵温度。

溶解氧对α-酰胺化酶表达的影响

进行实验来检查旋转烧瓶中CHO培养基的溶解氧浓度的影响。使用0.1×10⁶个细胞/mL播种旋转烧瓶。两个旋转烧瓶含有在250mLTechne旋转烧瓶中的150mL的培养基，而第三个旋转烧瓶含有250mL的培养基。对所有旋转烧瓶进行溶解氧的每日测量。每天采集澄清的条件培养基的等分量，用于通过α-AE分析评定α-AE生产力。两种培养基用于这项研究中，低蛋白CHO培养基(C1707，Sigma-Aldrich)和无蛋白的CHO培养基(C5467，Sigma-Aldrich)。在两种培养基中生长的UGL 73-26/M的直接比较在附图7中示出。两种培养物中的溶解氧水平是显著不同的。与在同体积的C5467培养基中生长的那些细胞相比，在150mL C1707中生长的细胞产生较少的总酶/mL。虽然培养基的初始溶解氧浓度是相同的，～80％DO，C5467培养基培养的溶解氧浓度从不低于50％。C1707培养物的DO含量到第9天低于50％，培养物的峰值活性是两天后。这些数据表明，在DO含量/细胞生存力/α-AE生产力之间可能存在相关性。

还研究了旋转器体积作为潜在的关键参数。由于旋转烧瓶没有维持值稳定的溶解氧浓度下，培养物维持溶解氧的能力与培养物的表面：体积比例相关。提高旋转器的培养体积略微改变了表面：体积比例。开始相同的培养，只是一个旋转器中的培养物体积是150mL(5467s)，另一个是250mL(5467sa)。表面：体积比例的改变对DO％和α-AE生产力的影响在附图8中示出。

附图8中显示的数据显示了，培养物的生产力大大地受到溶解的O₂的影响。无论溶解的O₂浓度是由于培养物的利用还是由于表面：体积比例方面的差异的影响而降低；当DO浓度低于50％时，在48-72h内培养物停止表达更多的α-酰胺化酶。在细胞最健康和最多产的培养阶段，生物反应器中溶解的O₂应当维持在70％来反映溶解氧浓度。

培养基对α-酰胺化酶表达的影响

作为设计以促进用于UGL 73-26/M的最合适生长培养基选择、或确定生物反应器生长条件的研究的部分，使用两种CHO培养基C1707和C5467(Sigma-Aldrich)开始许多旋转器培养。确定了两种培养基，C1707是具有添加到培养基中的转铁蛋白的低蛋白培养基，C5467无动物蛋白的培养基。当购买时，两种培养基都需要添加L-谷氨酰胺到2μM的终浓度。以下的表5列出了来自具有两种培养基之一的旋转烧瓶的大采样的数据。

表5C1707和C5467CHO培养基的旋转培养数据的概述

培养基配方	n＝		峰值酶活性(单位/mL)	峰值活性的天数	峰值细胞密度(10⁶细胞/mL)	峰值细胞密度的天数
培养基配方	n＝		峰值酶活性(单位/mL)	峰值活性的天数	峰值细胞密度(10⁶细胞/mL)	峰值细胞密度的天数	C5467	21	平均	363,366	15	1.48	11
		SEM	51,708	0.5	0.11	0.6	C5467	21	平均	363,366	15	1.48	11
		SEM	51,708	0.5	0.11	0.6	C1707	12	平均	322,691	14	1.92	10
		SEM	86,045	2.9	0.66	3.0	C1707	12	平均	322,691	14	1.92	10

表5中的数据显示了在任一培养基中UGL 73-26/M细胞系的酶生产力方面没有实质上的差异。考虑到在美国和欧盟的未来的监管原则，Sigma CHO培养基C5467可能是更为被法规接受的培养基选择，因为它不含动物来源的培养基成分。Sigma CHO培养基C5467是用于将来的研究的培养基选择。

葡萄糖对α-酰胺化酶表达的影响

调查UGL73-26/M分批培养的营养状况的研究揭示了开始培养后5天培养基中的葡萄糖浓度是原始培养基的大约50％(2g/L)。作为将额外的葡萄糖添加到培养物的一系列旋转烧瓶实验，进行了葡萄糖补充对酶生产力的影响的彻底的研究。以特定时间间隔用2g/L葡萄糖补充旋转烧瓶1到3次。葡萄糖添加对α-AE生产力的影响在表6中示出。

表6葡萄糖补充-相对酶表达

表7葡萄糖补充-峰值酶表达的天数

取决于葡萄糖添加方式，向UGL 73-26/M的分批培养物中添加葡萄糖提高了培养物的最大生产力大50％-100％。与未补充的对照物相比，在第5、10和15天补充葡萄糖的旋转烧瓶看起来表达了最多的酶。这些培养物的平均相对生存力是对照物的195％。与补充三次的那些相比，其他补充的培养物仅仅是稍微地多产的(143-164％)。补充有额外的葡萄糖的所有培养物显示了培养基中延迟的峰酶浓度。对于补充了葡萄糖的培养物在第17/18天观察到峰值酶浓度，而在对照的未补充的培养物中在第13天，参见表7.

pH值对α-酰胺化酶表达的影响

条件培养基的pH值是过程变量之一，其可以在搅拌罐生物反应器中控制，不能在旋转烧瓶中解决。在旋转烧瓶中，随着培养基成分被消费和细胞副产物产生，培养物的pH值容许降低。含有150mL(5467s)或250mL(5467sa)的UGL 73-26/M的两个250mL旋转烧瓶的pH值分布型在以下附图9中显示。培养物的pH值在分批的第一部分期间降低，然后在培养的最后部分期间升高。pH值的降低可能是由于在培养开始时培养物中提高的乳酸浓度。在培养结束时pH值的提高是由于细胞将乳酸盐作为碳源来同化。培养物的生产力不受pH降低的影响(附图8)。

将几个(n＝5)6-10L搅拌罐生物反应器没有pH值控制地运行来模拟旋转烧瓶中的条件。搅拌罐生物反应器中的CHO细胞生长在C5467培养基、70％DO和37℃中。生物反应器中条件培养基的平均pH值分布类似于在两个旋转烧瓶中观察到的，附图10。生物反应器中的溶解氧浓度维持在70％，温度维持在37℃。

除了如上所述没有pH值控制的生物反应器运行之外，运行了一系列的生物反应器，其中反应器的pH值被容许自由降低到设置的pH值点(7.0-7.4之间)。在到达期望的pH值的时候，将其维持在该pH值下持续整个发酵时间。搅拌罐生物反应器中的CHO细胞生长在C5467培养基、70％DO和37℃中。pH值控制的维持对于搅拌罐生物反应器中α-AE生产力的影响在附图11中显示。

附图11显示了当pH值设置点没有开始时这些运行的生物反应器中运行的每一天的平均α-AE活性。当pH值处于设置点的0.5pH值单位之内之后pH值设置点被设置时，来自独立的运行的数据也在附图11中显示。在培养物pH值和酶活性之间存在清楚的相关性。在培养物开始的16天期间，对于所有的运行，没有pH值设置点的生物反应器运行的活性分布是优越的。单独的例外是pH值设置点为7.1的运行的分布型。差异可能因为培养物比另一个运行持续更久。平均的无pH值设置点研究的峰值α-AE活性在第16天是280,707单位/mL。

pH值对活细胞密度没有影响(数据未显示)。培养物生长到1.0-1.5×10⁶个细胞每mL的峰值活细胞密度。在生物反应器接种之后8到10天到达最大细胞密度。除了在pH值7.1运行的一个培养物之外pH值对细胞生存力没有影响(数据未显示)。在培养中细胞培养物生存力大于50％存活持续15天或更久。以pH值设置点7.1运行的一个生物反应器在培养中维持了＞50％活细胞持续20天。

UGL 73-26/M的研究可开发发酵参数的概述

在建立α-AE表达细胞系UGL 73-26/M之后，进行了一系列实验来确定α-酰胺化酶的最佳表达的关键参数。确定的是，无动物蛋白的培养基(Sigma，C5467)支持了高水平的酶表达。CHO细胞可以作为分批培养在补充有2mM终浓度的L-谷氨酰胺的C5467培养基中生长。然而，培养需要D-葡萄糖补充以进一步促进培养物的生产力。最佳的葡萄糖补充是在第5、10和15天2g/L。生物反应器的DO浓度应当维持在70％，生物反应器的pH值容许调整到一pH值，其是培养基的缓冲能力与CHO细胞对培养基成分的新陈代谢的函数。

下游纯化开发UGL 73-26/M

以下小节概述了我们对使用UGL 73-26/M克隆生产的PAM的下游纯化开发。仅仅代表性的实验被包括在概述中，其提供了过程开发工作的逻辑进展。提供了每个步骤的简要说明，其描述了该步骤在纯化过程中的功能。使用SDS-PAGE(稳定的蛋白和稳定的单位)、PAM活性分析和Bradford蛋白分析来分析纯化运行。在技术转让给Boonton，NJ中试系统(pilot facility)厂之前或之后不久完成了所有的实验。在此描述的方法用于工业PAM批次1330-D-1003、1330-D-1004、1330-D-1005、1330-D-1006、1330-1009和1330-1010。

切向流动过滤NO.1(TFF1)

步骤描述：在层析之前利用TFF1步骤来浓缩和渗滤条件CHO细胞培养基。条件培养基被浓缩，通过渗滤来降低导电率以便于与阴离子交换柱结合。TFF1步骤采用装备有再生纤维素PLCTK 30kDa膜(Millipore)的Pellicon 2模块。

研究和开发：这个步骤的初始研究集中于TFF是否是层析之前必需的。研究了通过用水稀释来降低条件CHO培养基的导电率作为TFF的替代。在层析之前未能稀释条件培养基导致在加载之后大部分的PAM活性存留于流通物中。降低条件培养基的导电率到大约5mS最小化了流通物中检测的PAM活性的数量。然而，当条件培养基直接加载到阴离子交换柱上时鉴定了两个难题。一种培养基部分不可逆结合柱并引起树脂的严重变色。另一种展现了巨大的UV吸光度特征的培养基成分与PAM活性在梯度洗脱之后共同洗脱。

条件CHO细胞培养基(C5467)用水稀释来降低导电率到大约5mS，并直接加载到用50mM TRIS、120mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0平衡的Q-Sepharose FF柱(Pharmacia)上。柱在60分钟内经历从100％A(50mM TRIS、120mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0)到68％B(50mM TRIS、475mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0)的线性梯度。在加载之后大的深色条带立即出现在柱的顶部并在整个层析运行中保持。使用2M NaCl清洗柱并用1.0M NaOH消毒。清洗和消毒操作不能从柱上除去暗色带。随后，柱经历更严格的清洗操作。柱经历以下的清洁试剂系列：0.5M NaOH、1M NaCl、0.1M乙酸、0.1M乙酸、1M NaCl和70％乙醇。测试的条件都没能从柱上除去暗色带(NEG：001：225-245)暗色带被鉴定为金精三羧酸，在原始C5467培养基中存在的成分。用TRIS缓冲到pH 8.0的金精三羧酸的6mg/L溶液(中等浓度)直接加载到用50mM TRIS、120mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0平衡的Q-SepharoseFF柱上。在加载后有色条带立即出现在柱顶部。该柱经历如上所述相同的梯度洗脱和清洗操作。在整个运行上金精三羧酸保持与阴离子交换柱结合(NEG：001：276-290)。在pH 8.0下金精三羧酸容易在水溶液中聚合产生具有高电荷密度的大分子。带负电的大分子似乎不可逆地结合到阴离子交换柱上，很像DNA。这种材料对柱的重复应用可能降低加载能力，因而将消极地影响总体的柱寿命。

第二种培养基成分被发现与PAM共洗脱。未调节的原始培养基直接加载到用50mM TRIS、120mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0平衡的Q-Sepharose FF柱上。柱再次经历如上所述的相同的梯度洗脱条件。在一般洗脱酶的区域中观察到大的UV峰(NEG：001：248-257)。从条件培养基纯化的峰的SDS-PAGE分析揭示该材料是低分子量蛋白或非蛋白培养基成分(NEG：001：225-245)。C5467培养基含有蛋白水解物，这可以说明与酶峰一致的大的UV峰。两种培养基成分，金精三羧酸和未鉴别的UV峰在层析之前通过TFF有效地除去。通过30kDa膜保留了酶(滞留物)，低分子量培养基成分穿过了过滤器(渗透)。

条件培养基被浓缩10倍，使用装备有再生纤维素PLCTK 30kDa膜(Millipore)的Pellicon XL设备进行渗滤。用4-5倍体积的25mMTRIS、0.0005％TX-100pH 7.0对材料渗滤到大约3mS的最终导电率。材料加载到用50mM TRIS、120mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0平衡的Q-Sepharose FF柱上。柱经历如上所述的梯度洗脱。没有观察到树脂的变色，没有与酶共洗脱的大UV峰。产生的酶峰的回收％和比活性分别测定为47％和2.1×10⁶U/mg(NEG：004：263-283)。

研究了TFF步骤的各个阶段的酶稳定性。首先用50mM TRIS、0.001％TX-100、pH 7.0渗滤条件培养基，随后是5倍浓缩。分析渗滤和浓缩的样品流出物的活性损失和降解。通过SDS-PAGE没有观察到降解，回收了大约95％的酶活性(NEG：008：245-251)。

阴离子交换层析(Q-Sepharose FF)

步骤说明：阴离子交换(AEX)层析步骤提供了PAM从条件CHO细胞培养基的粗略纯化。该步骤主要除去了高分子量蛋白。然而，某些低分子量蛋白也被除去，包括酶的截短形式。层析步骤通常提供了酶的2到3倍纯化。活性酶的回收％一般是50-75％。可能存在于CHO细胞的发酵之后的原料流中的DNA在这个阶段的处理被有效地除去。

研究和开发：在开发Q-Sepharose FF步骤之前，我们简单地研究了使用阳离子交换(CEX))的PAM纯化。研究了有或没有TFF步骤的CEX层析的使用。在采用pH 5.0-6.0的流动相的SP550C(TosoHaas)柱上进纯化。在每种情况下，产生不良的分辨和恢复；在加载后的流通物中鉴定了大部分的酶活性(NEG：004：006-029和NEG：004：102-119)。由于酶在低pH值下潜在地缺乏稳定性，没有考虑降低流动相的pH值以便于结合。为此，放弃了CEX层析。

在Q-Sepharose FF柱上研究了采用梯度洗脱的一系列AEX层析。所有Q-Sepharose FF纯化在以180cm/hr操作的(1.1×13.7cm)柱上进行。在纯化开发早期，新鲜条件培养基的可用性是有限的；因而许多这些实验使用冷冻/解冻材料进行。条件培养基通过TFF浓缩/渗滤，并施加到用50mM TRIS、120mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0平衡的柱上。柱在60分钟内经历从100％A(50mM TRIS、120mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0)到68％B(50mM TRIS、475mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0)的线性盐梯度。还研究了在pH 7.0或pH 8.5下采用HEPES缓冲液的类似梯度。一般地，梯度运行提供了很少的纯化并且产生了不良的酶比活性(NEG：004-139-156、NEG：005：119-132、NEG：009：009-022和NEG：009：024-038)。在许多情况下，酶活性扩大到整个梯度上，可能是差异糖基化的结果。

随着开发继续，在Q-Sepharose FF柱上研究了采用连续盐步骤的分步洗脱方法。浓缩/渗滤的条件培养加载到用50mM TRIS、120mMNaCl、0.001％TX-100、pH 8.0平衡的柱上。柱经历使用175mM NaCl、225mM NaCl和275mM NaCl的连续分步洗脱。酶活性在175mM和225mM盐步骤之间相等地分步，总体的回收％大约41％。SDS-PAGE的分析揭示了在175mM和225mM NaCl级分中75kDa酶的存在(NEG：005：198-211)。在两个盐步骤中的酶活性可能由于糖基化的差异或可能是保持了活性的酶的截短的形式。

来自旋转烧瓶或10L生物反应器运行的新鲜的条件培养基用于阴离子交换实验的其他部分。来自旋转烧瓶00020S3的条件CHO培养基经历TFF，然后加载到用50mM TRIS、120mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0平衡的Q-Sepharose FF上。使用单个盐步骤50mM TRIS、225mMNaCl、0.001％TX-100、pH 8.0从柱上洗脱酶。收集的峰的回收％和比活性值分别测定为34％％和1.9×10⁶U/mg(NEG：008：021-033)。类似地，来自10L生物反应器(00021BR，14天)的条件CHO培养基经历TFF，并使用单个225mM NaCl步骤在Q-Sepharose上纯化。这个运行的回收％和比活性值分别测定为37％％和2.3×10⁶U/mg(NEG：008：065-075)。

还研究了使用HEPES流动相的分步洗脱试图改善活性酶的回收。进行了采用50mM HEPES、225mM NaCl、0.001％TX-100pH 8.0作为洗脱缓冲液的双份纯化运行。来自10L生物反应器运行的条件CHO培养基(Boonton中试系统，运行NO.1，15天)用作这些纯化运行的输入材料。两个纯化运行的回收％和比活性值分别测定为大约60％和3.0×10⁶U/mg(NEG：008：263-288)。HEPES流动相的使用似乎改善了酶的回收％和纯度。

研究了细胞生存力对Q-Sepharose FF纯化的影响。比较了在14天和21天从10L生物反应器运行(BOO 101)收获的条件CHO培养基的纯化。测量了在14天和21天的细胞生存力，分别确定为95％和48％。来自14天和21天的条件CHO培养基经历TFF和使用50mM HEPES、225mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0作为分步洗脱缓冲液的Q-Sepharose FF纯化。14天材料的纯化产生49％的回收和2.15×10⁶U/mg的比活性，而21天的运行提供了40％的回收和2.1×10⁶U/mg(NEG：009：114-125和NEG：009：149-166)。还使用来自12天和15天的10L生物反应器运行(00107BR)的条件CHO培养基进行了纯化。测量了在12天和15天的细胞生存力，分别确定为86％和80％。在每种情况下，使用50mM TRIS、225mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0从Q-Sepharose FF柱上洗脱酶。12天的材料产生了62％回收和1.9×10⁶U/mg的比活性，而15天的材料得到了54％的回收和4.3×10⁶U/mg的比活性(NEG：009：195-203和NEG：009：227-236)。看起来细胞生存力对AEX层析之后的酶的总体回收％和比活性没有显著影响。

鉴定和研究了Q-Sepharose FF层析的关键参数以建立工作范围。定义并研究了被设计以挑战纯化操作的情况以确定对酶的回收和纯度的影响。使用不同的分步洗脱缓冲液50mM TRIS、250mM NaCl、0.001％TX-100、pH 7.8或50mM TRIS、200mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.2(低pH/高盐和高pH/低盐)比较了两种Q-Sepharose FF纯化运行。这些实验的理论将使层析经历极端洗脱条件以确定工作范围。来自10L生物反应器运行(2132-D-1004)的TFF处理的条件CHO培养基用作纯化的输入。在低pH值/高盐情况下，条件培养基加载到用50mM TRIS、120mM NaCl、0.001％TX-100平衡的柱上。使用50mM TRIS、250mM NaCl、0.001％TX-100、pH 7.8从Q-Sepharose FF柱上洗脱酶。酶的回收％和比活性值分别为66％和2.0×10⁶U/mg(NEG：010：151-161)。高pH值/低盐情况中的条件培养基加载到用50mM TRIS、120mM NaCl、0.001％TX-100、DH 8.2平衡的柱上，并用50mM TRIS、200mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.2洗脱。在这种情况下酶的回收％和比活性值分别为66％和2.4×10⁶U/mg(NEG：010：140-150)。根据这些数据，Q-Sepharose FF柱可以在[7.8-8.2]的pH值范围下操作，洗脱缓冲液中的氯化钠浓度可以在200mM-250mM NaCl]之间变动。

确定了Q-Sepharose FF柱的工作能力以帮助纯化规模扩大到30L生物反应器运行。以两种方式确定柱的工作能力：[酶单位/ml树脂]和[mg蛋白/ml树脂]。这些实验的穿透被定义为在流通物和洗涤步骤中鉴定总共＞10％的酶活性。经历了TFF的条件CHO培养基(100ml)(2132-D-1002)加载到用50mM TRIS、120mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0平衡的Q-Sepharose FF柱上。条件培养基的酶活性和蛋白浓度分别测定为1.97×10⁶U/mL和2.41mg/mL。AEX柱(Millipore Vantage-L，1.1×13.7cm)以180cm/小时的线速度操作。使用50mM TRIS、225mMNaCl、0.001％TX-100、pH 8.0进行分步洗脱。在柱流通物和洗涤步骤中鉴定了低于1％的总酶活性。大约51％的酶单位在主峰中回收。根据13.0mL的柱体积，工作能力计算为[1.51×10⁷U/mL树脂]或[18.5mg蛋白/mL树脂](NEG：010：081-092)。计划进一步的实验来确定Q-SepharoseFF步骤的真实加载能力。

疏水性相互作用层析(Phenyl-Sepharose FF，低取代)

步骤说明：疏水性相互作用层析(HIC)步骤除去了AEX步骤后保留的大部分蛋白混杂物，并提供了额外2倍的纯化。HIC之后的SDS-PAGE分析揭示了单个的主条带，具有几个小的低分子量混杂物。一般地，HIC之后活性酶的回收％是50-75％。

研究和开发：为产自B3/A1-7克隆的PAM开发的纯化过程也利用HIC。采用含有硫酸铵的流动相来提高配体-蛋白相互作用。酶对含有硫酸铵的缓冲液的延长的暴露引起不可预见的沉淀和酶变性。研究了Hofmeister系列中的其他盐，例如氯化钠和柠檬酸钠以最小化这些难题。

首先研究了利用含有氯化钠的流动相的反线性梯度。这些层析研究的输入材料是TFF 1输出物或Q-Sepharose FF输出物。研究了在开始的TFF步骤之后的直接HIC以试图消除AEX步骤。一般地，用等体积的水随后是等体积的20mM TRIS、4M NaCl pH 7.0来稀释酶。在盐添加之前用水稀释降低了蛋白浓度，最小化由“盐析”引起的沉淀的可能性。稀释的材料加载到用10mM TRIS、2.0M NaCl、pH 7.0平衡的Phenyl-Sepharose FF柱上。酶在68分钟内使用从100％A(10mM TRIS、2.0M NaCl、pH 7.0)到100％B(10mM TRIS、pH 7.0)的反线性梯度从柱上洗脱。一般地，活性酶的回收％是大约50％(NEG：005：170-185和NEG：005：212-226)。

还研究了采用氯化钠流动相的分步洗脱方法。经历TFF1或Q-Sepharose FF层析的酶使用等体积的水和随后等体积的20mM TRIS、4M NaCl pH 7.0稀释。稀释的材料加载到用10mM TRIS、2M NaCl、pH 7.0平衡的HIC柱上。柱用另外的平衡缓冲液洗涤，随后用10mMTRIS、1.0M NaCl、pH 7.0洗涤。使用10mM TRIS、400mM NaCl、pH7.0从柱上洗脱酶。活性酶的产量是合理的，但仅实现了勉强够格的纯化(NEG：008：034-046和NEG：008：135-148)。使用氯化钠看起来不像使用硫酸铵的情况一样引起“盐析”，然而在高浓度的氯化钠中酶随着时间变性。

发现柠檬酸钠在相对低的浓度下促进酶与HIC柱的结合。经历TFF的条件CHO培养基用等体积的水随后是等体积的20mM TRIS、1.0M柠檬酸钠、pH 7.0稀释，并加载到用10mM TRIS、0.5M柠檬酸钠、pH7.0平衡的Phenyl-Sepharose FF柱上。柱用另外的平衡缓冲液洗涤，随后用10mM TRIS、pH 7.0脱除。在柱流通物或洗涤级分中都没有鉴定到酶活性。在10mM TRIS、pH 7.0级分中鉴定到大约50％的酶活性(NEG：005：064-076)。使用低浓度的柠檬酸钠重复这个实验。在较低的盐浓度下，酶用等体积的水随后是等体积的20mM TRIS、0.6M柠檬酸钠、pH 7.0稀释，之后加载到用10mM TRIS、300mM柠檬酸钠、pH 7.0平衡的HIC柱上。柱用另外的平衡缓冲液洗涤，随后用10mM TRIS、pH 7.0脱除。结果基本上相同于早先的运行；在流通物或洗涤级分中都没有鉴定到活性(NEG：008：203-213)。

研究了使用柠檬酸钠缓冲系统的梯度洗脱来帮助分步洗脱方法的开发。TFF输出物用等体积的水随后是等体积的20mM TRIS、0.6M柠檬酸钠、pH 7.0稀释，之后加载到在10mM TRIS、300mM柠檬酸钠、pH 7.0中平衡的柱上。柱在70分钟内经历从100％A(10mM TRIS、300mM柠檬酸钠、pH 7.0)到100％B(10mM TRIS、pH 7.0)的反线性梯度。在靠近梯度的末端鉴定了酶活性的峰。在梯度的这个区域中也洗脱出其他蛋白混杂物，并扩展到10mM TRIS、pH 7.0柱条带(NEG：008：252-262)。检查分步洗脱来实现酶和在10mM TRIS、pH 7.0带中洗脱的蛋白之间的更好分离。

来自Q-Sepharose FF纯化(10L生物反应器运行，00107BR，12天)的峰级分用等体积的水随后是等体积的50mM TRIS、600mM柠檬酸钠、pH 7.0稀释。稀释的材料加载到用25mM TRIS、300mM柠檬酸钠、pH 7.0平衡的Phenyl-Sepharose柱上。柱用其他平衡缓冲液洗涤，随后用25mM TRIS、75mM柠檬酸钠、pH 7.0第二次洗涤，用25mM TRIS、pH 7.0脱除。在75mM柠檬酸钠级分中鉴定到所有的酶活性。回收％和比活性计算分别为42％和2.0×10⁶U/mL(NEG：009：204-218)。使用这种方法在酶和其他蛋白混杂物之间实现了更好的分辨。

直接跟随TFF的HIC(无AEX步骤)被放弃，由于该步骤从粗原料流清除DNA的无效性。使用以上详述的氯化钠分步洗脱方法进行了四个HIC纯化。这些运行的输入物是在层析之前经历了TFF的B3/A1-7条件CHO培养基。此时我们的内部DNA规格是＜10ng/mg蛋白。在每种情况下，HIC后在主酶峰中存在的残余DNA的水平高于该规格6-10倍，从而使得单步骤HIC纯化不能接受(NEG：006：137-159、NEG：006：176-187和NEG：006：192-200)。

研究了HIC纯化步骤的工作能力以帮助30L规模扩大努力。穿透被定义为在柱流通物或洗涤级分中＞10％的酶活性。来自生产运行1330-D-1003的Q-Sepharose输出物(125mL，0.368mg/mL，710,563U/mL)用等体积的水随后是等体积的50mM TRIS、0.6M柠檬酸钠、pH 7.0来稀释。稀释的材料加载到用25mM TRIS、300mM柠檬酸钠、pH 7.0平衡的Phenyl-Sepharose FF柱(Millipore Vantage-L，1.1×15.8cm)柱上。柱以180cm/小时操作。柱用额外的平衡化缓冲液洗涤，用25mMTRIS、75mM柠檬酸钠、pH 7.0洗脱酶。在流通物或洗涤级分中没有鉴定到酶活性。主峰含有大约75％的酶活性单位，比活性被计算为2.6×10⁶U/mg。根据15.0mL的柱体积，工作能力被计算为5.92×10⁶U/mL树脂(NEG：010：111-124)。工作能力没有按照[mg蛋白/mL树脂]来报道，因为在AEX之后加载到柱上的蛋白是极其低的。计划了其他研究来测定HIC步骤的真实加载能力。

通过取消水稀释并将操作流速从180cm/h提高到240cm/h，显著地缩短了HIC单位操作的总体时间。最小化对柠檬酸钠的暴露时间和在树脂上经历的时间可以最终帮助降低活性酶的损失。来自1330-D-1003的Q-Sepharose FF输出物用等体积的50mM TRIS、0.6M柠檬酸钠、pH 7.0稀释，使用前面段落中描述的HIC分步洗脱方法来纯化。主峰(25mMTRIS、75mM柠檬酸钠、pH 7.0)的回收％和比活性被分别计算为77％和2.4×10⁶U/mg(NEG：010：125-139)。在用柠檬酸盐稀释期间或之后没有观察到蛋白沉淀，然而材料必需慢慢地稀释以避免“盐析”现象。

通过修改流动相的盐浓度来挑战HIC方法以确定工作范围。通过进行两个不同的纯化操作研究了对回收％和酶比活性的影响。在第一个运行中，加载和洗脱期间的柠檬酸盐浓度被降低，而在第二个运行中，加载期间的柠檬酸盐浓度被降低而洗脱缓冲液中的柠檬酸盐浓度被提高。来自10L生物反应器运行的Q-Sepharose FF输出物(133O-D-1005)用等体积的50mM TRIS、0.5M柠檬酸钠、pH 7.0稀释并加载到用25mMTRIS、250mM柠檬酸钠、pH 7.0平衡的HIC柱上。用25mM TRIS、50mM柠檬酸钠、pH 7.0洗涤柱。在50mM柠檬酸钠级分中鉴定到大约51％的酶活性，在流通物和洗涤级分中鉴定到低于1％。在主峰中的酶的比活性被计算为1.35×10⁶U/mg(NEG：010：175-186)。在第二个HIC运行中，Q-Sepharose FF输出物如上所述稀释和加载，然而应用25mM TRIS、100mM柠檬酸钠、pH 7.0作为洗脱缓冲液。在这种情况下，在100mM柠檬酸钠级分中鉴定到50％的酶活性，在流通物和洗涤级分中鉴定到低于2％。在100mM柠檬酸盐馏分中酶的比活性是2.5×10⁶U/mg(NEG：010：163-174)。在第一个HIC运行中观察到的更低的比活性表明提高洗脱缓冲液中的柠檬酸盐浓度使得通常在脱除物中发现的其他蛋白与酶共洗脱，因而降低了最终纯度。相比之下，提高洗脱缓冲液中的柠檬酸盐浓度看起来不降低纯度。根据这些数据，洗脱缓冲液中的柠檬酸钠浓度可以在75-100mM之间变动而不损害最终的纯度。

切向流动过滤NO.2(TFF2)

步骤描述：在病毒过滤之前利用TFF2来浓缩和渗滤Phenyl-Sepharose FF输出物。HIC输出物立即经历TFF以最小化在洗脱缓冲液(25mM TRIS、75mM柠檬酸钠、pH 7.0)中延长的保持产生的酶的钝化。Phenyl-Sepharose FF输出物浓缩大约3倍，渗滤以将酶置入适合的缓冲液用于病毒过滤和随后的贮存。TFF2步骤采用制备有再生纤维素PLCTK 30kDa膜(Millipore)的Pellicon 2模块。

研究和开发：首先为使用B3/A1-7克隆产生的PAM开发TFF2步骤。已经显示了在50mM TRIS、25mM NaCl、0.0005％TX-100、pH 8.0中在各种条件下酶是稳定的，为此，没有尝试其他R&D。

来自C5467条件CHO培养基的代表性的小规模纯化

来自10L生物反应器运行(00107BR，15天)的条件CHO细胞培养基(500mL)的样品浓缩8倍并相对50mM TRIS、0.001％TX-100、pH 8.0渗滤。

大约三分之一的TFF输出物使用如上所述的纯化过程的规模缩小的版本来纯化(NEG：009：219-249)。纯化数据在表8中概述。这个纯化运行的步骤产量相对不良，酶的比活性实际上在HIC步骤之后降低。然而，SDS-PAGE分析揭示，在大约75kDa处总体的α-酰胺化酶被纯化成单一的主要条带(附图12，泳道10)。凝胶和密度测定法扫描(附图13)清楚地表明酶是高纯度的(近似纯度67％)，仅存在微小的低分子量混杂物。在许多纯化缓冲液中酶随着时间而钝化；因而加工的执行必需在这些步骤之间不延迟地进行。纯化过程中的变异性是由于无活性酶的存在，其降低了总回收率和比活性。更重要地，纯化和发酵开发同时地进行，其也可能说明了某些观察到的变异性。随后发现在生产规模下的步骤产量和比活性要好得多，或许是材料在过程之间移动更快和立即分析级分的结果。

表8由UGL 73-26/M条件CHO培养基进行PAN的小规模纯化

处理步骤	产量(u)	步产量(％)	总产量(％)	总蛋白(mg)	比活性(U/mg)
处理步骤	产量(u)	步产量(％)	总产量(％)	总蛋白(mg)	比活性(U/mg)	TFF#1	5.89E+07	NA	NA	36.16	1.63E+06
AEX	3.17E+07	53.7	53.7	7.42	4.27E+06	TFF#1	5.89E+07	NA	NA	36.16	1.63E+06
AEX	3.17E+07	53.7	53.7	7.42	4.27E+06	HIC	1.09E+07	34.5	18.5	4.25	2.57E+06
TFF#2	8.18E+06	74.8	13.9	2.41	3.39E+06	HIC	1.09E+07	34.5	18.5	4.25	2.57E+06

PAM下游纯化过程的概述

以下详述了每个加工步骤的纯化操作，其反映了在技术转让中给予中试系统的信息。来自代表性小规模纯化允许的数据，包括SDS-PAGE和密度测定扫描，被包括在表8和附图11和12中。

TFF1过程：澄清的条件CHO培养基浓缩5倍并用50mM TRIS、0.001％TX-100、pH 8.0渗滤直到达到4-6mS的最终导电率。整个过滤中穿膜压力维持在＜10psi。

AEX过程：通过TFF浓缩/渗滤的澄清的条件CHO细胞培养基施加到用50mM TRIS、120mM NaCl、0.001％TX-100、pH 8.0平衡的(Amersham Biosciences)柱上。柱以180cm/hr操作，在280nm监视UV吸光度。柱用额外的平衡化缓冲液洗涤，用50mM TRIS、225mMNaCl、pH 8.0从柱上洗脱PAM。使用2.0M NaCl清洗柱并用1.0M NaOH消毒。在运行之间柱保存在10mM NaOH中。

HIC过程：Q-Sepharose输出物用等体积的50mM TRIS、600mM柠檬酸盐、pH 7.0稀释，加载到用25mM TRIS、300mM柠檬酸盐、pH7.0平衡的(Amersham Biosciences)上。柱以240cm/hr操作，在280nm监视UV吸光度。用25mM TRIS、300mM柠檬酸盐、pH 7.0洗涤柱，用25mM TRIS、75mM柠檬酸盐、pH 7.0从柱上洗脱PAM。分别用25mM TRIS、pH 7.0以及1.0M NaOH清洗和消毒柱。在运行之间柱保存在10mM NaOH中。

TFF2过程：Phenyl-Sepharose FF输出物首先浓缩大约3倍，用50mMTRIS、25mM NaCl、0.0005％TX-100、pH 8.0渗滤，并进一步浓缩到适合的体积用于病毒过滤和保存。

10L搅拌罐生物反应器过程运行

α-酰胺化酶的10L发酵和纯化过程的概述

在几个10L搅拌罐生物反应器运行之后制备纯化的α-AE。产生α-酰胺化酶的加工步骤是14天接种期、17天发酵期和2天的纯化方案，在上文和附图14中详述。用于这些实验的培养基是无蛋白CHO培养基C5467(Sigma-Aldrich)。来自这些运行的所有加工细节可以在适当的批次记录中找到。

加工流程图附图14说明了为使用UGL 73-26/M克隆产生的α-AE/PAM开发的最终加工步骤。

阶段1-接种

为了制备用于10L搅拌罐生物反应器的接种物，解冻UGL 73-26/MMWCB00的一个小瓶。移出来自冷冻瓶的细胞并放置在新鲜培养基中。细胞团重悬浮到新的培养基中并添加到含有C5467CHO培养基的旋转烧瓶。在后来的14天期间，培养基扩大到含有400mL培养基加细胞的四个烧瓶中(参见接种方案，附图15)。

在接种阶段2的结束时测试培养物的α-AE表达。在第12天，平均酶活性浓度是＞13,000U/mL，参见表9画面C。每次修改接种培养物时进行培养物的细胞计数和细胞生存力。在这个阶段培养物生存力一般大于95％，参见表9画面A。在第14天接种培养物平均总活细胞计数是2.03×10⁹个，参见表9画面B。

表9细胞培养统计-接种阶段

画面A

画面B

画面C

阶段2-发酵

在每个接种阶段的完成时开始10L生物反应器。生物反应器以1×10⁵个细胞/mL在具有L-谷氨酰胺的原始无蛋白培养基(Sigma，C5467)中接种。在以下设置点设置生物反应器参数：温度＝37℃，PRM＝60，pH＝不维持pH设置点，容许pH值变化(在开始时，不容许pH值大于pH 7.5)，DO设置点是70％DO。原始培养基的溶解氧浓度是大于70％，生物反应器的溶解氧浓度容许趋向于70％，然后维持在该设置点。在第5、10和14天用2g/L葡萄糖补充生物反应器。在第17天收获条件培养基。收获物收获物材料通过Millipore Opticap过滤器澄清。在第18天而不是第17天收获前两个以下描述的发酵物2131-D-1003和2131-D-1004。在第10天和17/18天达到并维持培养物的最大细胞密度。这些发酵的平均最大细胞密度是1.5-1.6×10⁶个细胞/mL，表10画面B。培养的开始14天培养物的生存力是＞80％，在收获的当天平均生存力是76.0％，表10画面A。在第17/18天收获时评估培养物的生产力。澄清的收获物平均含有378,567单位α-AE/mL，表10画面C。

阶段3-纯化

如以上详述的，纯化过程有5个不同的步骤。相对50mM TRIS、0.001％TX-100、pH 8.0浓缩和渗滤澄清的收获物。酶材料被平均浓缩大约4倍(数据未显示，参见批次记录)。这种加工材料施加到Q-Sepharose柱上，在NaCl分步梯度之后在含有225mM NaCl的50mMTRIS、0.001％Triton缓冲液中洗脱。酶溶液用50mM TRIS、600mM柠檬酸盐、pH 7.0稀释并施加到phenyl sepharose柱上。在柠檬酸盐分步梯度之后从柱上洗脱α-酰胺化酶。酶材料浓缩到大约1L的最终容积。经过除病毒过滤加工四组六批次的酶。两个批次通过Millipore NFP过滤器处理(1330-D-1005和1330-D-1006)，两个批次通过Pall Trincor DV50过滤器处理(1330-1009和1330-1010)。来自每个加工步骤的数据在以下的表11中示出。

第一步骤TFF1对于α-酰胺化酶活性单位保留是几乎定量的步骤。来自10L生物反应器运行的TFF浓缩物具有1.60×10⁶单位/mg蛋白的平均比活性，表11。施加到Q-Sepharose层析柱的TFF1浓缩物在大约3L中从柱上洗脱。这个加工步骤中酶的比活性提高大约2倍到3.33×10⁶单位/mg。Q-sepharose洗脱物的蛋白浓度和酶活性浓度是非常一致的，参见表11。在phenyl-sepharose层析之后，酶的平均比活性从3.33×10⁶提高到4.96×10⁶单位/mg蛋白。phenyl-sepharose洗脱物使用第二TFF步骤浓缩到1L。在这个浓缩步骤之后比活性没有改变，表11。来自某些酶批次的TFF2浓缩物施加到除病毒过滤器上。4个酶批次的3个的比活性降低，表11。最终纯化的酶的平均比活性降低350,000单位/mg到4.61×10⁶单位/mg蛋白。比活性的降低可能是由于酶的某些部分的钝化。

表11各个纯化加工步骤

TFF 1

Q Sepharose FF

表11续

Phenyl Sepharose FF

TFF 2

表11续

病毒过滤

说明纯化过程的每个步骤的相容性的数据是重要的。然而，也重要的是每个加工步骤下期望的产物的回收率。表12显示了α-酰胺化酶纯化过程的每个步骤的回收率和四或五个加工步骤之后加工的总回收率。表12显示了酶从每个TFF步骤定量地回收。层析步骤Q-sepharose和phenyl sepharose的平均回收百分比分别是65.3％和72.0％。测试的除病毒过滤器都回收了～80％的α-AE活性。通过TFF2或病毒过滤从澄清的收获物材料从酶纯化过程的总回收率分别是40.8％或38.8％。

结论

已经开发了稳定良好表征的CHO细胞系UGL 73-26/M，其表达高水平的α-AE活性。在17天分批发酵过程中实现了高水平的酶表达，其利用了非动物来源、含低蛋白的组织培养基C5467(Sigma)。研究并优化了关键发酵参数例如pH值、DO和葡萄糖浓度。还已经开发了强大的两步下游的纯化过程，其能够将酶纯化到接近匀质。发酵和纯化过程的一致性很好地适合规模扩大到工业水平。

以下阐述实例，显示了使用通过本发明的细胞表达的PAM生产酰胺化的产品。

实施例1：利用肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶将甘氨酸延长的甲状旁腺激素片段转变成酰胺化对应物。

利用丙酮酸的rhPTH(1-34)Gly35-OH的酰胺化

用于rhPTH(1-34)Gly35-OH的酰胺化的成分和终浓度在表12中显示。随后是酰胺化的简要说明。

·在1,900mL 25mM MES、200mM NaCl、pH 6.0中的大约12.4克rhPTH(1-34)Gly35-OH装到备有搅拌器和气体起泡器的玻璃容器中。

·向这种溶液中按顺序添加以下成分：3,025mL水、741mL 250mMMES、pH 6.3、1.03mL 3mM硫酸铜、124mL碘化钾、62mL 190强度的乙醇、124mL 400mM丙酮酸钠和124mL 100mM抗坏血酸钠。

·反应容器放入水浴中，反应混合物搅拌加热到25-27℃。

·用21mL的2M HCl将反应混合物的pH值调节到5.8。启动氧喷射：调节喷射速度以避免反应混合物的过多泡沫。

·添加47mL的PAM，反应混合物在25-27℃孵育4小、时35分钟(氧喷射在整个孵育期进行)。

·用74mL的2M HCl将反应混合物酸化到pH 2.4。

用于这个实施例的PAM酶从本发明的优选的CHO K1细胞表达，其是如上所描述的构建的，在此被称为UGL 73-26/M。这种细胞系也用于提供上文讨论的ACTT保藏。

甘氨酸延长的前体可以从已知的来源获得，或可以按已知的方法产生。例如，通过以类似于美国专利6,103,495(其实施例1-2)描述的方式发酵来产生，和在酰胺化之前如美国专利6,103,495(其实施例3)描述的来纯化。在如上所述的当前的酰胺化中使用的特定前体由2005年3月9日提交的同待决美国专利申请系列号NO.11/076,260、2005年10月6日作为公开号NO.US 2005/0221442的细胞系所表达。

在用于酰胺化的酶是肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶(PHM)的情况下，可以使用与以上描述的相同的反应混合物，用PHM代替PAM。此外，在4到6小时的孵育期的结束时，反应混合物的pH值通过添加碱来提高到8到9之间。在终止反应之前搅动反应混合物额外的4到8小时。通过表达在此教导的PAM、随后从PAM分子的其他部分分离PHM催化结构域，可以获得PHM。做为选择，在此使用的载体可以被修饰以在PHM之后、但在PAL催化结构域之前终止翻译。做为选择，在第一种情况下，可以构建载体，其具有上文讨论的代替PAM编码区的PHM编码区。通过仅表达PAM的N-末端部分(约前40kDa)可以获得PHM。在文献中报道了PAM和它们的催化结构域的位置。任何这样的PAM或PHM据信是根据本发明有用的。参见，例如Mizuno et al，BBRC Vol.148，No.2，pp.546-52(1987)，通过引用将其公开内容合并在此。特别参见Mizuno′s″AE1.″。已知蛙皮天然地表达PHM。

实施例2：酰胺化后的纯化

阳离子交换(CEX)层析

rhPTH(1-34)-NH₂从残余的rhPTH(1-34)Gly35-OH中的纯化使用CEX层析实现。CEX层析方法的简要说明如下描述。酸化的酰胺化输出物加载到用25mM MES pH 6.5平衡的9cm×19cm ToyopearlSP650M(Tosoh Bioscience LLC)柱上。柱以180cm/hr操作，在280nm监视柱流出物的UV吸光度。用25mM MES pH 6.5洗涤柱指导柱流出物pH值回到6.5。用25mM MES、80mM NaCl、pH 6.5洗涤柱，指导洗涤峰完全地洗脱并且达到稳定的UV基线。用25mM MES、200mMNaCl、pH 6.5从柱上洗脱产物rhPTH(1-34)-NH₂。收集整个UV峰；通过RP-HPLC筛选级分来确定收集指标。

反相(RP)层析

利用PR层析来将肽的盐形式从氯化物交换到醋酸盐；RP层析提供了肽的勉强够格的纯化。CEX层析输出物用3倍体积的333mM醋酸钠稀释并彻底地混合。在加载之前容许混合物在室温下保持75分钟。将醋酸盐稀释的样品加载到用250mM醋酸钠、pH 7.5平衡的6cm×17cm的Amberchrom CG300M(Tosoh Bioscience LLC)柱上。柱以180cm/hr操作，在280nm监视柱流出物的UV吸光度。柱用250mM醋酸钠、pH7.5洗涤60分钟。在0.1％乙酸中平衡柱。用0.1％乙酸、40％乙醇从柱上洗脱产物rhPTH(1-34)-NH₂。收集整个UV峰。

rhPTH(1-34)-NH₂的表征

通过冻干将RP层析输出物浓缩成白色絮状粉未，产生11.8克(酰胺化95％总回收率)的rhPTH(1-34)-NH₂。通过电子喷射电离质谱法(ESI-MS)测定rhPTH(1-34)-NH₂的分子量为4,116.9Da，其与计算的4,116.8Da的平均分子量一致。

序列表

<110>Miller，Duncan A.Mehta，Nozer M.Consalvo，Angelo P.

<120>表达在酰胺化产物的制备中有用的酶的细胞系

<130>P/546-368 PCT

<140>PCT/US2006/024687

<141>2006-06-23

<150>60/693.612

<151>2005-06-24

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2868

<212>DNA

<213>Rattus norvegicus

<220>

<221>CDS

<222>(58)..(2205)

<400>1

gatccatcga tcgcactagt gcccggccac tgcccgctgc cctggtcctg cgcggac 57

atg gcc gga cgc gcc cgc agc ggt ctg cta ctg ctg ctg ctg ggg ctg 105

Met Ala Gly Arg Ala Arg Ser Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu

1 5 10 15

ctc gcc ctg cag agc agc tgc ctg gcc ttc aga agc cca ctt tct gtc 153

Leu Ala Leu Gln Ser Ser Cys Leu Ala Phe Arg Ser Pro Leu Ser Val

20 25 30

ttt aag agg ttt aaa gaa act acc aga tca ttt tcc aat gaa tgc ctt 201

Phe Lys Arg Phe Lys Glu Thr Thr Arg Ser Phe Ser Asn Glu Cys Leu

35 40 45

ggt acc att gga cca gtc acc cct ctt gat gca tca gat ttt gcg ctg 249

Gly Thr Ile Gly Pro Val Thr Pro Leu Asp Ala Ser Asp Phe Ala Leu

50 55 60

gat att cgc atg cct ggg gtt aca cct aaa gag tct gac aca tac ttc 297

Asp Ile Arg Met Pro Gly Val Thr Pro Lys Glu Ser Asp Thr Tyr Phe

65 70 75 80

tgc atg tcc atg cgt ctg cct gtg gat gag gaa gcc ttc gtg att gac 345

Cys Met Ser Met Arg Leu Pro Val Asp Glu Glu Ala Phe Val Ile Asp

85 90 95

ttc aag cct cgt gcc agc atg gat act gtc cac cat atg ctg ctg ttt 393

Phe Lys Pro Arg Ala Ser Met Asp Thr Val His His Met Leu Leu Phe

100 105 110

gga tgc aat atg ccc tcg tcc act gga agt tac tgg ttt tgt gat gaa 441

Gly Cys Asn Met Pro Ser Ser Thr Gly Ser Tyr Trp Phe Cys Asp Glu

115 120 125

gga acc tgt aca gat aaa gcc aat att cta tat gcc tgg gca agg aat 489

Gly Thr Cys Thr Asp Lys Ala Asn Ile Leu Tyr Ala Trp Ala Arg Asn

130 135 140

gct ccc ccc acc cgg ctc ccg aaa ggt gtt gga ttc aga gtt gga gga 537

Ala Pro Pro Thr Arg Leu Pro Lys Gly Val Gly Phe Arg Val Gly Gly

145 150 155 160

gaa act gga agc aaa tac ttc gtc ctt caa gtt cac tat ggc gat atc 585

Glu Thr Gly Ser Lys Tyr Phe Val Leu Gln Val His Tyr Gly Asp Ile

165 170 175

agt gct ttt cga gat aat cac aaa gac tgc tct ggc gtg tcc gta cat 633

Ser Ala Phe Arg Asp Asn His Lys Asp Cys Ser Gly Val Ser Val His

180 185 190

ctc aca cgt gtg ccc cag cct tta att gcg ggc atg tac ctt atg atg 681

Leu Thr Arg Val Pro Gln Pro Leu Ile Ala Gly Met Tyr Leu Met Met

195 200 205

tct gtt gac act gtc ata cca cca gga gag aaa gta gtg aat gct gac 729

Ser Val Asp Thr Val Ile Pro Pro Gly Glu Lys Val Val Asn Ala Asp

210 215 220

att tcg tgc caa tac aaa atg tat cca atg cat gtg ttt gcc tac aga 777

Ile Ser Cys Gln Tyr Lys Met Tyr Pro Met His Val Phe Ala Tyr Arg

225 230 235 240

gtc cac act cac cat tta ggt aag gtg gtg agc gga tac aga gta aga 825

Val His Thr His His Leu Gly Lys Val Val Ser Gly Tyr Arg Val Arg

245 250 255

aac gga cag tgg aca ctg att gga cgc cag aac ccc cag ctg cca cag 873

Asn Gly Gln Trp Thr Leu Ile Gly Arg Gln Asn Pro Gln Leu Pro Gln

260 265 270

gct ttc tac cct gtg gaa cac ccc gtt gat gtt act ttt ggt gat ata 921

Ala Phe Tyr Pro Val Glu His Pro Val Asp Val Thr Phe Gly Asp Ile

275 280 285

ctg gca gcc aga tgt gtg ttc act ggt gaa ggg agg aca gag gcc acc 969

Leu Ala Ala Arg Cys Val Phe Thr Gly Glu Gly Arg Thr Glu Ala Thr

290 295 300

cat atc ggc ggc act tct agt gac gaa atg tgt aac ctg tac atc atg 1017

His Ile Gly Gly Thr Ser Ser Asp Glu Met Cys Asn Leu Tyr Ile Met

305 310 315 320

tat tac atg gaa gcc aaa tat gca ctt tcc ttc atg acc tgt aca aag 1065

Tyr Tyr Met Glu Ala Lys Tyr Ala Leu Ser Phe Met Thr Cys Thr Lys

325 330 335

aac gtg gct cca gat atg ttc aga act atc cca gca gag gcc aat atc 1113

Asn Val Ala Pro Asp Met Phe Arg Thr Ile Pro Ala Glu Ala Asn Ile

340 345 350

cca att cct gtc aaa ccg gac atg gtt atg atg cac ggg cat cac aaa 1161

Pro Ile Pro Val Lys Pro Asp Met Val Met Met His Gly His His Lys

355 360 365

gaa gca gaa aac aaa gaa aag agt gct tta atg cag cag cca aaa cag 1209

Glu Ala Glu Asn Lys Glu Lys Ser Ala Leu Met Gln Gln Pro Lys Gln

370 375 380

gga gag gaa gaa gta tta gag cag gat ttc cat gtg gaa gaa gaa ctg 1257

Gly Glu Glu Glu Val Leu Glu Gln Asp Phe His Val Glu Glu Glu Leu

385 390 395 400

gac tgg cct gga gtg tac ttg tta cca ggc cag gtt tct ggg gtg gcc 1305

Asp Trp Pro Gly Val Tyr Leu Leu Pro Gly Gln Val Ser Gly Val Ala

405 410 415

ctg gat tct aag aat aac cta gtg att ttc cac aga ggt gac cat gtt 1353

Leu Asp Ser Lys Asn Asn Leu Val Ile Phe His Arg Gly Asp His Val

420 425 430

tgg gat gga aac tct ttt gac agc aag ttt gtt tac cag caa aga ggt 1401

Trp Asp Gly Asn Ser Phe Asp Ser Lys Phe Val Tyr Gln Gln Arg Gly

435 440 445

ctt ggg cca att gaa gaa gac acc atc ctg gtc att gac cca aat aat 1449

Leu Gly Pro Ile Glu Glu Asp Thr Ile Leu Val lle Asp Pro Asn Asn

450 455 460

gct gaa atc ctc cag tcc agt ggc aag aac ctg ttt tat tta cca cac 1497

Ala Glu Ile Leu Gln Ser Ser Gly Lys Asn Leu Phe Tyr Leu Pro His

465 470 475 480

ggc ttg agc ata gat aca gat gga aat tat tgg gtc aca gat gtg gct 1545

Gly Leu Ser Ile Asp Thr Asp Gly Asn Tyr Trp Val Thr Asp Val Ala

485 490 495

ctc cac cag gtg ttc aaa ttg gac ccg cat agc aaa gaa ggc cct ctc 1593

Leu His Gln Val Phe Lys Leu Asp Pro His Ser Lys Glu Gly Pro Leu

500 505 510

tta att ctg gga agg agc atg caa cct ggg agt gac caa aat cat ttc 1641

Leu Ile Leu Gly Arg Ser Met Gln Pro Gly Ser Asp Gln Asn His Phe

515 520 525

tgc cag ccc acc gat gtg gct gtg gag ccc agt act gga gct gtc ttc 1689

Cys Gln Pro Thr Asp Val Ala Val Glu Pro Ser Thr Gly Ala Val Phe

530 535 540

gtg tca gac ggt tac tgt aac agt cgg att gtg cag ttt tca cca agc 1737

Val Ser Asp Gly Tyr Cys Asn Ser Arg lle Val Gln Phe Ser Pro Ser

545 550 555 560

gga aag ttc gtc acc cag tgg gga gaa gag tcc tct gga agc agt cct 1785

Gly Lys Phe Val Thr Gln Trp Gly Glu Glu Ser Ser Gly Ser Ser Pro

565 570 575

agg cca ggc cag ttc agt gtt cct cac agt ttg gcc ctt gtg cct cat 1833

Arg Pro Gly Gln Phe Ser Val Pro His Ser Leu Ala Leu Val Pro His

580 585 590

ttg gac cag ttg tgt gtg gca gac agg gaa aat ggc cga atc caa tgc 1881

Leu Asp Gln Leu Cys Val Ala Asp Arg Glu Asn Gly Arg Ile Gln Cys

595 600 605

ttc aaa act gac acc aaa gaa ttt gtg aga gag att aag cac gca tca 1929

Phe Lys Thr Asp Thr Lys Glu Phe Val Arg Glu Ile Lys His Ala Ser

610 615 620

ttt gga agg aat gtc ttt gcc att tca tat ata cca ggt ttc ctc ttt 1977

Phe Gly Arg Asn Val Phe Ala Ile Ser Tyr Ile Pro Gly Phe Leu Phe

625 630 635 640

gcc gta aac ggg aag cct tac ttt gga gac caa gag ccc gtg caa gga 2025

Ala Val Asn Gly Lys Pro Tyr Phe Gly Asp Gln Glu Pro Val Gln Gly

645 650 655

ttt gtg atg aac ttt tcc agt ggg gaa att ata gac gtc ttc aag cca 2073

Phe Val Met Asn Phe Ser Ser Gly Glu Ile Ile Asp Val Phe Lys Pro

660 665 670

gta cgc aag cac ttc gac atg cct cat gat att gtg gct tct gaa gat 2121

Val Arg Lys His Phe Asp Met Pro His Asp Ile Val Ala Ser Glu Asp

675 680 685

ggg act gtg tac att gga gac gca cac aca aac acc gtg tgg aag ttc 2169

Gly Thr Val Tyr Ile Gly Asp Ala His Thr Asn Thr Val Trp Lys Phe

690 695 700

acc ctg act gaa aaa atg gag cat cgg tca gtc taa aaggctggca 2215

Thr Leu Thr Glu Lys Met Glu His Arg Ser Val

705 710 715

ttgaagtcca ggaaatcaaa gccgaggcag ttgttgaacc caaagtggag aacaaaccca 2275

cctcctcaga attgcagaag atgcaagaga aacagaaact gagcacagag cccggctcgg 2335

gagtgtccgt ggttctcatt acaacccttc tggttattcc tgtgctggtc ctgctggcca 2395

ttgtcatgtt tattcggtgg aaaaaatcaa gggcctttgg agcagatcat gaccgcaagc 2455

tcgagtcaag ttctggaaga gtcctgggaa gaagaggagg aggaggagga agaagagaag 2515

gaagaggaag agaaggagga agaaaagcag aaggaggaag aagaggagaa ggaggaagat 2575

gaaggcagca ttagccatgg gcagggctct gagaataagt agaaggggaa agggattggc 2635

taagcaccga ttcaaagctg tcagtccttt gggctgcaga tgcaatgtgg ctgcggaatt 2695

ctcatgtttg acagcttatc atcgataagc ttggctgcag gtcaacttgt ttattgcagc 2755

ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc 2815

actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tct 2868

<210>2

<211>715

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>2

Met Ala Gly Arg Ala Arg Ser Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu

1 5 10 15

Leu Ala Leu Gln Ser Ser Cys Leu Ala Phe Arg Ser Pro Leu Ser Val

20 25 30

Phe Lys Arg Phe Lys Glu Thr Thr Arg Ser Phe Ser Asn Glu Cys Leu

35 40 45

Gly Thr Ile Gly Pro Val Thr Pro Leu Asp Ala Ser Asp Phe Ala Leu

50 55 60

Asp Ile Arg Met Pro Gly Val Thr Pro Lys Glu Ser Asp Thr Tyr Phe

65 70 75 80

Cys Met Ser Met Arg Leu Pro Val Asp Glu Glu Ala Phe Val Ile Asp

85 90 95

Phe Lys Pro Arg Ala Ser Met Asp Thr Val His His Met Leu Leu Phe

100 105 110

Gly Cys Asn Met Pro Ser Ser Thr Gly Ser Tyr Trp Phe Cys Asp Glu

115 120 125

Gly Thr Cys Thr Asp Lys Ala Asn Ile Leu Tyr Ala Trp Ala Arg Asn

130 135 140

Ala Pro Pro Thr Arg Leu Pro Lys Gly Val Gly Phe Arg Val Gly Gly

145 150 155 160

Glu Thr Gly Ser Lys Tyr Phe Val Leu Gln Val His Tyr Gly Asp Ile

165 170 175

Ser Ala Phe Arg Asp Asn His Lys Asp Cys Ser Gly Val Ser Val His

180 185 190

Leu Thr Arg Val Pro Gln Pro Leu Ile Ala Gly Met Tyr Leu Met Met

195 200 205

Ser Val Asp Thr Val Ile Pro Pro Gly Glu Lys Val Val Asn Ala Asp

210 215 220

Ile Ser Cys Gln Tyr Lys Met Tyr Pro Met His Val Phe Ala Tyr Arg

225 230 235 240

Val His Thr His His Leu Gly Lys Val Val Ser Gly Tyr Arg Val Arg

245 250 255

Asn Gly Gln Trp Thr Leu Ile Gly Arg Gln Asn Pro Gln Leu Pro Gln

260 265 270

Ala Phe Tyr Pro Val Glu His Pro Val Asp Val Thr Phe Gly Asp Ile

275 280 285

Leu Ala Ala Arg Cys Val Phe Thr Gly Glu Gly Arg Thr Glu Ala Thr

290 295 300

His Ile Gly Gly Thr Ser Ser Asp Glu Met Cys Asn Leu Tyr Ile Met

305 310 315 320

Tyr Tyr Met Glu Ala Lys Tyr Ala Leu Ser Phe Met Thr Cys Thr Lys

325 330 335

Asn Val Ala Pro Asp Met Phe Arg Thr Ile Pro Ala Glu Ala Asn Ile

340 345 350

Pro Ile Pro Val Lys Pro Asp Met Val Met Met His Gly His His Lys

355 360 365

Glu Ala Glu Asn Lys Glu Lys Ser Ala Leu Met Gln Gln Pro Lys Gln

370 375 380

Gly Glu Glu Glu Val Leu Glu Gln Asp Phe His Val Glu Glu Glu Leu

385 390 395 400

Asp Trp Pro Gly Val Tyr Leu Leu Pro Gly Gln Val Ser Gly Val Ala

405 410 415

Leu Asp Ser Lys Asn Asn Leu Val Ile Phe His Arg Gly Asp His Val

420 425 430

Trp Asp Gly Asn Ser Phe Asp Ser Lys Phe Val Tyr Gln Gln Arg Gly

435 440 445

Leu Gly Pro Ile Glu Glu Asp Thr Ile Leu Val Ile Asp Pro Asn Asn

450 455 460

Ala Glu Ile Leu Gln Ser Ser Gly Lys Asn Leu Phe Tyr Leu Pro His

465 470 475 480

Gly Leu Ser Ile Asp Thr Asp Gly Asn Tyr Trp Val Thr Asp Val Ala

485 490 495

Leu His Gln Val Phe Lys Leu Asp Pro His Ser Lys Glu Gly Pro Leu

500 505 510

Leu Ile Leu Gly Arg Ser Met Gln Pro Gly Ser Asp Gln Asn His Phe

515 520 525

Cys Gln Pro Thr Asp Val Ala Val Glu Pro Ser Thr Gly Ala Val Phe

530 535 540

Val Ser Asp Gly Tyr Cys Asn Ser Arg Ile Val Gln Phe Ser Pro Ser

545 550 555 560

Gly Lys Phe Val Thr Gln Trp Gly Glu Glu Ser Ser Gly Ser Ser Pro

565 570 575

Arg Pro Gly Gln Phe Ser Val Pro His Ser Leu Ala Leu Val Pro His

580 585 590

Leu Asp Gln Leu Cys Val Ala Asp Arg Glu Asn Gly Arg Ile Gln Cys

595 600 605

Phe Lys Thr Asp Thr Lys Glu Phe Val Arg Glu Ile Lys His Ala Ser

610 615 620

Phe Gly Arg Asn Val Phe Ala Ile Ser Tyr Ile Pro Gly Phe Leu Phe

625 630 635 640

Ala Val Asn Gly Lys Pro Tyr Phe Gly Asp Gln Glu Pro Val Gln Gly

645 650 655

Phe Val Met Asn Phe Ser Ser Gly Glu Ile Ile Asp Val Phe Lys Pro

660 665 670

Val Arg Lys His Phe Asp Met Pro His Asp Ile Val Ala Ser Glu Asp

675 680 685

Gly Thr Val Tyr Ile Gly Asp Ala His Thr Asn Thr Val Trp Lys Phe

690 695 700

Thr Leu Thr Glu Lys Met Glu His Arg Ser Val

705 710 715

虽然已经结合具体实施方式对本发明进行了描述，但对于本领域技术人员来说，很多其他的变体和改变以及其他应用将是明显的。因此，本发明不受此处具体公开的内容的限制，而只受所附权利要求的限制。

Claims

1.一种用用于表达肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的表达载体转染的CHO K1细胞。

2.权利要求1的转化的细胞，其中所述表达载体具有编码区，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点、启动子和所述启动子上游的SV40增强子。

3.权利要求1的转化的细胞，其中所述表达载体具有编码区，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的核酸，所述控制区域具有核糖体结合位点、人类金属硫蛋白IIA启动子。

4.权利要求3的转化的细胞，其中所述载体进一步包括所述启动子上游的增强子。

5.权利要求4的转染的细胞，其中所述增强子是SV40增强子。

6.一种具有编码区的重组表达载体，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点、启动子和所述启动子上游的SV40增强子。

7.一种具有编码区的重组表达载体，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点和人类金属硫蛋白IIA启动子。

8.权利要求7的载体，其中所述载体进一步包括所述启动子上游的增强子。

9.权利要求8的载体，其中所述增强子是SV40增强子。

10.一种制备用于肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶表达的细胞系的方法，所述方法包括步骤：

11.权利要求10的方法，进一步包括通过使产自步骤(D)的细胞经历增大的选择压力来扩增肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的步骤。

12.权利要求10的方法，其中所述第一可选择标记是编码新霉素抗性的基因。

13.权利要求10的方法，其中所述第二可选择标记是编码二氢叶酸还原酶的基因。

14.权利要求11的方法，其中至少一种所述可选择标记是编码二氢叶酸还原酶的基因以及其中所述扩增是在存在氨甲蝶呤的情况下进行的。

15.权利要求10的方法，其中所述第三载体与所述第一载体的浓度比是至少10∶1，以及所述第三载体与所述第二载体的浓度比是至少10∶1。

16.权利要求10的方法，其中所述第三载体包括编码区，所述编码区具有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点、启动子和所述启动子上游的SV40增强子。

17.权利要求10的方法，其中所述第三载体包括编码区，所述编码区具有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点、人类金属硫蛋白的启动子和所述启动子上游的SV40增强子。

18.权利要求17的方法，其中所述增强子是SV40增强子。

19.权利要求10的方法，其中所述潜在的宿主细胞包括CHO K1细胞。

20.一种从权利要求10的方法产生的细胞系。

21.一种包含用权利要求6的载体转染的宿主细胞的细胞系。

22.由权利要求1-5、20或21的任一项的细胞或细胞系表达的肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶。

23.一种体外产生酰胺化产物的方法，所述方法包括使具有游离酸形式并附着于羰基的甘氨酸残基的前体在存在权利要求22的肽基甘氨酸α酰胺化单加氧酶的情况下反应。

24.权利要求23的方法，其中所述前体是具有C-末端甘氨酸的肽。

25.一种从权利要求23的方法产生的酰胺化产物。

26.细胞系UGL 73-26/M。

27.由细胞系UGL 73-26/M表达的肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶。

28.权利要求23的方法，其中所述肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶由细胞系UGL 73-26/M表达。

29.从权利要求28的方法产生的酰胺化产物。

30.一种在表达和分泌到培养基中之后纯化肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的方法，其中所述方法包括步骤：

(A)使不纯的肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶样品进行阴离子交换层析，其中洗脱是等浓度的；

31.权利要求30的方法，其中利用柠檬酸钠来促进步骤(B)中的柱结合。

32.一种酰胺化产物的体外生产的方法，所述方法包括：

(A)通过使具有游离酸形式并附着于羰基的甘氨酸残基的前体在存在肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的情况下反应来形成羟基化的中间物；和

(B)同时地或随后地使所述中间物与路易斯碱或肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂解酶反应；

其中所述肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶已经通过从由权利要求1-5、20或21的细胞或细胞系表达的肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶中分离肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶催化结构域来衍生。

33.权利要求32的方法，其中对步骤(B)利用路易斯碱。

34.一种用用于表达肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的表达载体转染的CHO K1细胞。

35.权利要求34的转化的细胞，其中所述表达载体具有编码区，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点、启动子和所述启动子上游的SV40增强子。

36.权利要求34的转化的细胞，其中所述表达载体具有编码区，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的核酸，所述控制区域具有核糖体结合位点、人类金属硫蛋白IIA启动子。

37.权利要求36的转化的细胞，其中所述载体进一步包括所述启动子上游的增强子。

38.权利要求37的转化的细胞，其中所述增强子是SV370增强子。

39.一种具有编码区的重组表达载体，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点、启动子和所述启动子上游的SV40增强子。

40.一种具有编码区的重组表达载体，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点和人类金属硫蛋白IIA启动子。

41.权利要求40的载体，其中所述载体进一步包括所述启动子上游的增强子。

42.权利要求41的载体，其中所述增强子是SV40增强子。

43.一种制备用于肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶表达的细胞系的方法，所述方法包括步骤：

44.权利要求43的方法，进一步包括通过使产自步骤(D)的细胞经历增大的选择压力来扩增肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的步骤。

45.权利要求43的方法，其中所述第一可选择标记是编码新霉素抗性的基因。

46.权利要求43的方法，其中所述第二可选择标记是编码二氢叶酸还原酶的基因。

47.权利要求44的方法，其中至少一种所述可选择标记是编码二氢叶酸还原酶的基因以及其中所述扩增是在存在氨甲蝶呤的情况下进行的。

48.权利要求43的方法，其中所述第三载体与所述第一载体的浓度比是至少10∶1，以及所述第三载体与所述第二载体的浓度比是至少10∶1。

49.权利要求43的方法，其中所述第三载体包括编码区，所述编码区带有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点、启动子和所述启动子上游的SV40增强子。

50.权利要求43的方法，其中所述第三载体包括编码区，所述编码区具有与控制区域可操作连接的编码肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的核酸，所述控制区域包括核糖体结合位点、人类金属硫蛋白的启动子和所述启动子上游的增强子。

51.权利要求50的方法，其中所述增强子是SV40增强子。

52.权利要求43的方法，其中所述潜在的宿主细胞包括CHO K1细胞。

53.一种从权利要求43-52的任一种方法产生的细胞系。

54.一种包含用权利要求39-42的任一种载体转染的宿主细胞的细胞系。

55.由权利要求34-38的任一种细胞或细胞系表达的肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶。

56.一种体外产生酰胺化产物的方法，所述方法包括使具有游离酸形式并附着于羰基的甘氨酸残基的前体在存在权利要求55的肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的情况下反应，随后进一步在存在路易斯碱或肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂解酶的情况下反应。

57.权利要求56的方法，其中所述前体是具有C-末端甘氨酸的肽。

58.一种从权利要求56的方法产生的酰胺化产物。

59.一种在表达和分泌到培养基中之后纯化肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的方法，其中所述方法包括步骤：

60.权利要求59的方法，其中利用柠檬酸钠来促进步骤(B)中的柱结合。

61.一种酰胺化产物的体外生产的方法，所述方法包括：

其中所述肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶已经由权利要求34-38的细胞或细胞系表达。

62.权利要求61的方法，其中所述步骤(B)利用路易斯碱。

63.一种包含用权利要求7的载体转染的宿主细胞的细胞系。