CN101280022B - 一种d-氨基酸氧化酶融合蛋白及其载体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种D-氨基酸氧化酶融合蛋白及其载体和应用，本发明主要是将D-氨基酸氧化酶与透明颤菌血红蛋白融合在一起形成同时具有两种蛋白活性的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，该融合蛋白的催化活性比其初始蛋白提高85％以上，其具有的透明颤菌血红蛋白活性促进了重组细菌的生长；本发明还通过多聚氨基酸标签进行亲和层析实现高效的分离纯化；本发明D-氨基酸氧化酶融合蛋白可应用于催化底物头孢菌素C生成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地说涉及一种D-氨基酸氧化酶融合蛋白及其表达载体；以及D-氨基酸氧化酶融合蛋白在制备戊二酰基-7-氨基头孢烷酸上的应用。
背景技术
D-氨基酸氧化酶(D-Amino acid oxidase，DAAO，EC1.4.3.3)是一种以黄素腺嘌呤(FAD)为辅酶的黄素蛋白，它对催化反应底物有高度的立体异构选择性和广谱性，被广泛用于D-氨基酸定性定量分析、生物传感器、L-氨基酸和α-酮酸生产等。它在工业上的重要应用之一即为两步酶法生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)(Pollegioni L等.Appl Microbiol Biotechnol，2008，78：1-16)。DAAO广泛存在于哺乳动物的内脏、藻类、真菌和细菌中(孙兵兵等.化学与生物工程.2007，24(2)：8-11)。研究人员对DAAO基因进行了一系列克隆、测序和重组表达研究，以实现其高效表达和酶的有效生产。其中，红酵母(Rhodotorulagracilis)和三角酵母(Trigonopsis variabilis)中表达的RgDAAO和TvDAAO在工业上的应用最为广泛，其cDNA序列同源性为26％(Pollegioni L等.J Biotechnol，1997，58(2)：115-123)。
针对D-氨基酸氧化酶的高表达和分离纯化研究主要集中在酶的改造和载体的构建筛选方面。百瑞全球有限公司的专利《重组D-氨基酸氧化酶》(专利号：ZL200410030842.8)提供了一种突变DAAO及其编码序列，其第53位的苏氨酸突变为其它氨基酸，酶活提高了25％以上。复旦大学的专利申请《一种制备D-氨基酸氧化酶的方法》(申请号：200410016825.9)，在毕赤酵母表达载体中引入6聚组氨酸标签(His-tag)，可进行三角酵母DAAO的高效分离。百瑞全球有限公司的专利申请《一种大肠杆菌表达载体及其应用》(申请号：200510089966.8)提供了一种用于高效表达DAAO大肠杆菌表达载体pRSET-A。
通过基因融合引入一些具有特异功能的蛋白或多肽，有可能改善表达宿主菌细胞的生长状况、提高目的蛋白的表达水平、改进目的蛋白的提取纯化方法以及从分子水平上提高酶的催化活性和稳定性等。常见的用于构建融合蛋白的特异性功能蛋白有大肠杆菌麦芽糖结合蛋白、硫氧化还原蛋白、谷胱甘肽转移酶、荧光蛋白、透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin，VHb)和多聚丝氨酸(Poly-Ser)、多聚组氨酸(Poly-His)等。
其中，VHb是透明颤菌在贫氧条件下合成的一种可溶性血红素蛋白分子，它的一个重要生理功能是从分子水平上提高细胞对氧气的利用能力，协助细胞在贫氧环境中生长(吴奕等.生物工程学报，1996，12(3)，276-283)；它还可以降低外源蛋白对细胞的毒性(Chien LJ等.Biotechnol Prog，2004，20：1359-1365)、提高重组目标蛋白表达的活性和稳定性(Khang Y等.BiotechBioeng，2003，82：480-488)以及增加目标产品在重组细胞内的产率(Yu HM等.FEMS Microbiol lett，2002，214：223-227)。VHb的开放阅读框有441bp(包括终止密码子)，编码146个氨基酸残基。而多聚氨基酸极性肽段的融合表达可以通过亲和层析方法实现目的蛋白的高效分离纯化。
头孢菌素类药物(Cephalosporins)是一族β-内酰胺类广谱抗生素，通过干扰细菌细胞壁的合成并加速细胞壁的破坏而起到杀菌的作用。头孢菌素的抗菌部位为其母核7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)，由双氢噻嗪环和β-内酰胺环融合而成，它是各类半合成头孢菌素类抗生素药物的重要中间体。7-ACA主要由头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)通过酶法或化学法裂解脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链得到。酶法具有工艺简单、安全、高效、无污染及产品质量稳定等优点，与传统的、污染严重的化学法相比具有较大的竞争优势，因而用酶法裂解CPC生产7-ACA已成为发展趋势。DAAO可以催化CPC生成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic Acid，GL-7-ACA)中间产物，然后其在GL-7-ACA酰化酶的作用下脱去侧链，生成7-ACA。
发明内容
本发明第一个目的是提供一种催化活性高的的D-氨基酸氧化酶融合蛋白。
本发明第二个目的是提供含有上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的载体和转化体。
本发明第三个目的是提供上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白在制备7-氨基头孢烷酸上的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明一种D-氨基酸氧化酶融合蛋白，由D-氨基酸氧化酶(DAAO)与透明颤菌血红蛋白(VHb)融合而成，且具有D-氨基酸氧化酶活性和透明颤菌血红蛋白活性。
上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其透明颤菌血红蛋白可以融合在D-氨基酸氧化酶的N-端或C-端；优选融合在D-氨基酸氧化酶的N-端。
上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白，由下述(a)或(b)所述的氨基酸序列组成：
(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
(b)由在(a)的氨基酸序列中替换、添加或缺失1个或几个氨基酸的氨基酸序列，且该蛋白质具有D-氨基酸氧化酶活性。
上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白，是由去除了终止密码子的146个氨基酸残基(aa)的透明颤菌血红蛋白与三角酵母D-氨基酸氧化酶的356个氨基酸残基(aa)连接在一起，透明颤菌血红蛋白连接在三角酵母D-氨基酸氧化酶的N-端，得到全长具有502个氨基酸的融合蛋白(见SEQ ID NO：1)。
上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白，在其氨基酸序列的N-端或C-端携带有长度为6～12个的多聚氨基酸标签，优选插入位置为该融合蛋白的C-端，以实现融合酶的高效分离纯化。
所述的多聚氨基酸的优选长度为6个多聚氨基酸。
所述的多聚氨基酸是指多聚组氨酸、多聚丝氨酸、或由组氨酸、丝氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸等组成的混合多聚氨基酸。
和上述多聚氨基酸标签螯合的金属离子可以是镍离子、钴离子、铜离子、铅离子等金属离子。
上述多聚氨基酸优选为多聚组氨酸，多聚组氨酸的优选长度为6个。
上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白，由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成；即在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的C-端插入6个组氨酸的氨基酸序列。
编码上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白的基因，由下述(a)或(b)的DNA序列组成：
(a)SEQ ID NO：2所示的DNA序列；
(b)与(a)的DNA序列具有80％以上的同源性的DNA序列，且所编码的蛋白质具有D-氨基酸氧化酶活性。
编码在上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白C-端携带有6个组氨酸标签的基因，由SEQ ID NO：4所示的DNA序列组成。
含有上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的重组表达载体、宿主菌均属于本发明的保护范围。
按照本领域技术人员熟知的方法，可以构建含有上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的重组表达载体和转化体。
含有上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的表达载体，可以是大肠杆菌诱导型或组成型表达载体，优选是诱导型表达载体。
所述的诱导型表达载体，包括pET或其它系列诱导型表达载体。如一种携带上述融合蛋白基因的诱导型表达载体PET-VDAAO(见图1)。
上述含有D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的宿主菌，其所述的宿主菌是指E.coli BL21(DE3)(Promega公司)或JM109(DE3)(鼎国公司)等。
上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因转化体的构建方法，可以采用常规的氯化钙法或电穿孔转化法(Sambrook J等.《分子克隆实验指南》，1989)。
上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白，采用硫酸铵饱和沉淀进行初步纯化。
上述携带多聚组氨酸标签的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，可通过Ni2+金属螯合层析方法进行高效分离纯化。
上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白、携带多聚组氨酸标签的D-氨基酸氧化酶融合蛋白、携带有上述融合蛋白编码基因的重组表达载体或转化体在制备戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)上的应用。
本发明所述融合蛋白的粗酶液或纯化酶液可以直接用于从CPC制备GL-7-ACA，也可以进一步采用树脂、硅胶或亲和层析柱等载体进行固定化后，再用于从CPC制备GL-7-ACA。
本发明具有如下优点：(1)、本发明D-氨基酸氧化酶融合蛋白的基因表达活性高，可以在重组大肠杆菌中高活性表达，比初始三角酵母D-氨基酸氧化酶的活性提高85％以上；(2)、本发明D-氨基酸氧化酶融合蛋白中表达的透明颤菌血红蛋白可以促进重组菌的生长；(3)本发明多聚组氨酸标签的引入可以实现融合蛋白的快速分离纯化。采用本发明提供的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，能够高效催化底物CPC生成GL-7-ACA，为7-ACA的两步酶法工业化生产奠定基础。
附图说明
图1.携带D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的重组质粒pET-VDAAO示意图
图2.D-氨基酸氧化酶融合蛋白的酶活性柱形图
1.原始D-氨基酸氧化酶单表达的酶活；
2.N-端插入(His)6标签的(His)6-TvDAAO融合蛋白的酶活性(HDAAO)；
3.C-端插入(His)6标签的TvDAAO-(His)6的D-氨基酸氧化酶的酶活性(DAAOH)；
4.D-氨基酸氧化酶融合蛋白的VHb-TvDAAO(VDAAO)酶活；
5.C-端插入(His)6标签的D-氨基酸氧化酶融合蛋白VHb-TvDAAO-(His)6(VDAAOH)酶活。
图3.采用多聚组氨酸(His)6标签和Ni2+金属螯合层析分离纯化DAAO与VHb融合蛋白的SDS-PAGE蛋白质电泳图谱
1分离纯化前的融合蛋白酶粗酶液；
2蛋白质分子量标准；
3分离纯化后的杂酶液；
4分离纯化后C-端携带组氨酸标签的融合蛋白VDAAOH，分子量为55kD。
具体实施方式
实施例1
N-端融合型D-氨基酸氧化酶(VHb-TvDAAO)融合蛋白基因的构建
VHb-TvDAAO融合蛋白基因的构建采用overlap-PCR方法，分别使用三对引物PV-1/PV-2、PD-1/PD-2和PV-1/PD-2进行三步扩增。引物由北京赛百盛生物工程公司合成，所用聚合酶及相应扩增缓冲液、四种脱氧核苷酸溶液均由宝生物工程(大连)有限公司购得。基因测序由宝生物工程(大连)有限公司完成。
(1)VHb-TvDAAO融合蛋白的VHb基因搭接片段的扩增：首先，以质粒pBR322-vgb(于慧敏等.清华大学学报，2000，40(2)，32-35)为模板，扩增N-端携带NcoI酶切位点，C-端携带TvDAAO部分序列的透明颤菌血红蛋白基因搭接片段SEQ ID NO：5。其中，引物PV-1序列为：CATGCCATGGGCATGTTAGACCAGCAAACC(下划线为NcoI酶切位点)(SEQID NO：7)；PV-2为：AACGATTTTAGCCATTTCAACCGCTTGAGC(SEQ ID NO：8)；扩增反应体积为20μl。在一已灭菌的0.2ml PCR薄壁管中，依次加入14.1μl无菌水、2.0μl的扩增缓冲液、1.6μl的四种脱氧核苷酸混合液(每种dNTP浓度2.5mM)、1μl的引物PV-1(10μmol/L)、1μl的引物PV-2(10μmol/L)、0.2μl的pBR322-vgb质粒模板、0.12μl的EX Taq DNA聚合酶。将PCR管置于PCR仪中，首先在94℃、5min，接着按94℃、30s，52℃、30s、72℃、30s反应条件循环30次，最后于72℃、10min，结束扩增反应，获得用于融合蛋白基因搭接的VHb基因延伸片段(SEQ ID NO：5)。
(2)VHb-TvDAAO融合蛋白的TvDAAO基因搭接片段的扩增：采用同(1)所述的PCR反应条件和类似的反应体系，只是将质粒模板替换为pET-DAAO (罗晖等.三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达.微生物学报，2004，44(3)：336-339)，所用引物为PD-1和PD-2，其中，PD-1为：GCTCAAGCGGTTGAAATGGCTAAAATCGTT(SEQ ID NO：9)；PD-2序列为：CCCAAGCTTCTAAAGGTTTGGACGAGTAAG(SEQ ID NO：10)(下划线为Hind III酶切位点)；52℃退火时间延长为1分钟，扩增获得N-端携带VHb部分序列、C-端携带HindIII酶切位点的TvDAAO基因片段(SEQ ID NO：6)，用于融合蛋白的构建。
(3)VHb和TvDAAO基因的搭接：采用同(1)所述的PCR反应条件和类似的反应体系，只是将基因模板替换为第(1)步扩增获得的SEQ ID NO：5片段和第(2)步扩增获得的SEQ ID NO：6片段各0.1μl。使用的引物为第(1)步中的PV-1和第(2)步中的PD-2。52℃退火时间延长为1.5分钟，扩增获得N-端携带NcoI酶切位点、C-端携带HindIII酶切位点的VHb-TvDAAO融合蛋白基因，DNA测序结果证实其基因序列是SEQ ID NO：2。
实施例2
在N-端插入(His)6-tag的TvDAAO基因的构建
在TvDAAO基因的N-端插入(His)6-tag采用PCR方法。PCR反应条件同实施例1(2)，所用引物为PHD-1和PHD-2，其中，
PHD-1为：CATGCCATGGCTCACCACCACCACCACCACAAAATCGTTGTT
ATTGGTGCCG(SEQ ID NO：11)(下划线为NcoI酶切位点)，
PHD-2为：CCCAAGCTTCTAAAGGTTTGGACGAG T(SEQ ID NO：12)(下划线为HindIII酶切位点)。引物由北京赛百盛生物工程公司合成。
扩增后得到N-端携带6个组氨酸标签(CACCACCACCACCACCAC)和NcoI酶切位点的的TvDAAO基因(HDAAO)。
实施例3
在C-端插入(His)6-tag的TvDAAO基因的构建
在TvDAAO基因C-端的插入(His)6-tag采用PCR扩增方法。PCR反应条件同实施例1(2)，只是扩增引物替换为PDH-1/PDH-2，其中，
PDH-1为：CATGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTG(SEQ ID NO：13)(下划线为NcoI酶切位点)，
PDH-2为：CCCAAGCTTCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAGGTTT
GGACGAGT(SEQ ID NO：14)(下划线为HindIII酶切位点)。引物由北京赛百盛生物工程公司合成。
扩增后得C-端携带6个组氨酸标签(CACCACCACCACCACCAC)和HindIII酶切位点的TvDAAO基因(DAAOH)。
实施例4
VHb-TvDAAO-(His)6融合蛋白(VDAAOH)基因的构建
融合蛋白VHb-TvDAAO-(His)6的基因构建采用PCR方法。PCR反应条件同实施例1(3)，只是反应体系中PCR扩增模板替换为实施例1(3)中扩增获得的VHb-TvDAAO融合基因，所用引物为PVDH-1和PDH-2，其中，
PVDH-1的序列为：CATGCCATGGGCATGTTAGACCAGCAAACC(SEQ IDNO：15)(下划线为NcoI酶切位点)，PDH-2同实施例3(SEQ ID NO：14)。引物由北京赛百盛生物工程公司合成。扩增获得融合酶VHb-TvDAAO-(His)6(VDAAOH)基因，其基因序列见SEQ ID NO：4。
实施例5
携带融合蛋白基因的质粒载体的构建
对实施例1～4中获得的融合蛋白基因VHb-TvDAAO(VDAAO)、(His)6-DAAO(HDAAO)、DAAO-(His)6(DAAOH)、VHb-TvDAAO-(His)6(VDAAOH)与质粒载体pET-28a(Novagen公司)分别采用NcoI/HindIII进行双酶切，酶切反应体系的组成为：
PCR产物 10μl 质粒pET-28a DNA 4μl
NcoI(10U/μl) 1μl Nc oI(10U/μl) 1μl
HindIII(10U/μl) 1μl Hi ndIII(10U/μl) 1μl
缓冲液(10×Buffer) 2μl 缓冲液(10×Buffer) 2μl
无菌水 6μl 无菌水 12μl
总体积 20μl 总体积 20μl
在37℃下反应4小时，分别获得VDAAO、HDAAO、DAAOH和VDAAOH各融合蛋白的基因片段和质粒pET-28a的线性质粒骨架片段。采用常规0.7％琼脂糖凝胶电泳，分别回收得到各融合蛋白的基因片段和质粒骨架。采用T4DNA连接酶(Promega公司)进行连接，连接样品组成为：
各融合蛋白基因酶切片段 6μl
pET-28a酶切片段(50ng/μl) 2.5μl
连接缓冲液 1μl
T4DNA连接酶(3U/μl) 0.5μl
总体积 10μl
连接反应在4℃进行16小时，得连接反应物。
将连接反应物转化宿主菌E.coli TOP-10F’的感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)，步骤如下：取200μl感受态大肠杆菌TOP-10F’细胞，置于无菌的1.5mL离心管中。分别加入5μl连接反应物，在冰上放置30分钟，立即将管转移至42℃的循环水浴中，放置90秒，立即将管转移至冰浴中，放置2分钟，每管加入0.8mL的LB液体培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH7.0)，在37℃下放置45分钟，取50μl涂布在含50μg/ml卡那霉素和20g/L琼脂粉的LB固体培养基上，37℃温育20小时，出现单菌落。挑取菌落接入LB培养基，培养12小时，分别收获细胞，采用常规质粒提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取质粒，分别获得重组质粒pET-VDAAO，pET-HDAAO，pET-DAAOH和pET-VDAAOH。其中，重组质粒pET-VDAAO的结构见图1所示。
实施例6
含有融合蛋白基因的转化体的构建与摇瓶培养
将实施例5中构建的重组质粒pET-VDAAO，pET-HDAAO，pET-DAAOH和pET-VDAAOH，按照实施例5所述的质粒转化方法，分别转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)的感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)，获得表达融合蛋白的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-VDAAO，BL21(DE3)/pET-HDAAO，BL21(DE3)/pET-DAAOH以及BL21(DE3)/pET-VDAAOH。
平行培养各融合蛋白表达菌株，同时以单独表达TvDAAO基因的重组菌BL21(DE3)/pET-DAAO为对照。首先在含50mg/L卡那霉素的LB培养基中(50ml/300ml摇瓶)分别接种单菌落，37℃、200rpm培养12h，制作种瓶。
从种瓶中按照1％接种量转接到含50mg/L卡那霉素的新鲜LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养2h，至OD600为0.7。加入1mM诱导剂异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)，28℃继续培养20h。取5ml菌液，8000rpm离心2min，以5ml 0.1M的磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬沉淀；在功率为200W、占空比3/3的条件下超声破碎90个循环；13000rpm离心2min，分别取上清液和沉淀，4℃保存用于比色法测定酶活(罗晖等.三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达.微生物学报，2004，44(3)：336-339)。每分钟生成1微摩尔丙酮酸所需的酶量定义为1个酶活单位，用U表示。各重组菌株表达的TvDAAO融合蛋白与DAAO单酶的酶活对照结果如图2所示。
由图2可见，(His)6标签插入TvDAAO的N-端降低了DAAO的活性，而C-端插入则没有影响。VHb与TvDAAO的融合表达使得摇瓶培养中DAAO的酶活提高了85％。(His)6标签在VHb-TvDAAO融合酶C-端的插入使得融合蛋白的酶活略有降低，但仍然比原始TvDAAO酶活提高62％。
实施例7
D-氨基酸氧化酶融合蛋白的发酵罐放大培养
在5L发酵罐中放大培养BL21(DE3)/pET-VDAAOH，初始装液量2.5L，发酵培养基：玉米浆3％，酵母膏1％，乳糖0.3％，NH4Cl 0.25％，甘油0.3％；KH2PO4 0.23％，K2HPO4 1.64％，pH7.2。种瓶培养同实施例6，接种量为5％，通气量为1VVM。每隔3小时检测酶活。培养9h时，融合蛋白VDAAOH的酶活就高达28.5U/ml，比相同条件下培养的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAOH提高123％，同时，表达融合蛋白VDAAOH的发酵液的OD600达到43.0，比对照菌株提高了40％。
实施例8
采用(His)6标签和Ni2+金属螯合层析分离纯化融合蛋白VDAAOH
收获实施例7中的BL21(DE3)/pET-VDAAOH细胞，按照实施例6所述的方法进行超声破碎。采用0.25um的滤膜过滤(天根生化科技(北京)有限公司)，然后采用Ni2+金属螯合层析柱HiTrap Chelating HP(5ml，GE Healthcare LifeScience公司)进行上柱纯化。纯化设备采用AKTA explorer(Amersham pharmaciabiotech公司)。纯化过程中流动相流速为4ml/min，进样量为120ml。其中，蛋白样品与结合缓冲液(0.02M Na3PO4，0.5M NaCl，0.01M咪唑，调节pH至7.4)按1∶1的比例进样。使用洗脱缓冲液(0.02M Na3PO4，0.5M NaCl，0.5M咪唑，调节pH至7.4)进行梯度洗脱。检测流出液在280nm的吸光度并收集流出样品，结果表明，在30％梯度可以洗脱杂蛋白，在50％梯度洗脱得到目的蛋白VDAAOH。
取2ul纯化后的目的蛋白VDAAOH，稀释10倍进行十二烷基璜酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结果(见图3)携带(His)6标签的融合蛋白VDAAOH与杂酶液实现了有效分离。VDAAOH的比酶活从纯化前的3.5U/mg蛋白，提高到了264.9U/mg，VDAAOH的纯度达到92％。
实施例9
VHb与TvDAAO的融合蛋白催化CPC生成GL-7-ACA试验
按照实施例6的方法，对转化体BL21(DE3)/pET-VDAAO进行摇瓶培养。收集50ml菌液，用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤后，按照实施例6的方法低温超声破碎，细胞破碎后的粗酶液直接用于3％CPC钠盐(溶于0.1M Tris-HCl缓冲液，pH 8.0)的催化转化。将2ml粗酶液加入1.5ml 3％CPC钠盐，37℃水浴摇床反应30min，每隔10min加入5μl的H2O2；。取样500μl，8000rpm离心3min，取100ul上清液与1.9ml的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH＝8.0)混合均匀；采用Shimadzu C18柱，在流动相为7.5％乙腈-15％甲醇-1％乙酸、流速1mL/min、检测波长为260nm的条件下，进行高压液相色谱(HPLC)分析。结果表明，底物CPC成功地转化生成了GL-7-ACA，转化率为75％。对照TvDAAO粗酶液的转化率是70％。
实施例10
插入(His)6标签的融合蛋白VDAAOH催化CPC生成GL-7-ACA试验
按照实施例8所述的方法，采用Ni2+金属螯合层析柱制备融合蛋白VDAAOH的纯化酶液。按照实施例9所述的方法，进行CPC催化转化。结果表明，融合蛋白VDAAOH成功地将底物CPC转化生成了GL-7-ACA，底物转化率为95％。
序列表
Claims (9)
1.一种D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成。
2.一种D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于该融合蛋白由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成。
3.编码权利要求1所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白的基因，其特征在于由SEQ ID NO：2所示的DNA序列组成。
4.编码权利要求2所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白的基因，其特征在于由SEQ ID NO：4所示的DNA序列组成。
5.含有权利要求3或4所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的重组表达载体。
6.含有权利要求3或4所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的宿主菌。
7.按照权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述的表达载体是大肠杆菌诱导型或组成型表达载体。
8.按照权利要求6所述的宿主菌，其特征在于所述的宿主菌是E.coli BL21(DE3)或E.coli JM109。
9.权利要求1所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白在制备戊二酰基-7-氨基头孢烷酸上的应用。
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| Chien LJ., et al,.Coexpression of Vitreoscilla Hemoglobin Reduces the Toxic Effect of Expression of D-Amino Acid Oxidase in E. coli.《Biotechnol. Prog.》.2004,第20卷(第5期),1359-1365,参见摘要，第1359页右栏倒数第1段-第1361页右栏第1段. * |
| Zheng H., et al,.Expression, purification, and immobilization of His-tagged D-amino acid oxidase of Trigonopsis variabilis in Pichia pastoris.《Appl Microbiol Biotechnol》.2005,第70卷683-689. * |
| 林欣.重组D-氨基酸氧化酶的表达、纯化与固定化.《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士） 基础科学辑》.2006,(第4期),摘要，第39页-第44页. * |
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