CN101261203A

CN101261203A - 碱溶性香菇多糖提取、分离、纯化及分子量的测定

Info

Publication number: CN101261203A
Application number: CNA2007100516443A
Authority: CN
Inventors: 金文准; 王务鼎; 王卫健; 周晓海; 胡荣大
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-03-09
Filing date: 2007-03-09
Publication date: 2008-09-10
Anticipated expiration: 2027-03-09
Also published as: CN101261203B

Abstract

本发明公开了10－100万Da碱溶性香菇多糖提取、分离、纯化新工艺及分子量测定的方法，以香菇子实体为原料，通过粉碎、碱水浸提、过滤、浓缩、洗涤、级分、低温干燥得粗品、粗品溶解、离心、DEAE纤维素柱除杂纯化、离子交换树脂吸附脱色、过滤通过不同分子量的膜包超滤浓缩。采用GPC激光光散射凝胶色谱仪测定分子量，按测定分子量的范围，再分别装入透析袋透析、冻干得分子量为10－100万Da含量为98％以上的各组分碱溶性香菇多糖。本方法工艺先进、产品质量稳定、纯度高、目标明确、易工业化生产。

Description

碱溶性香菇多糖提取、分离、纯化及分子量的测定

技术领域

本发明是对现有香菇多糖提取工艺的改进，公开了碱溶性香菇多糖提取、分离、纯化新工艺及分子量测定的新方法。以香菇子实体为原料进行提取、分离、纯化、涉及天然生物反应调节剂的制备及其检测方法。

背景技术

香菇中富含蛋白质、杂多糖和香菇多糖等多种成分，是我国传统的中药材，具有补肝益气的作用。香菇多糖(英文名Lentinan)，其一级结构是β-(1-3)葡萄糖为主链，β-(1-6)葡萄糖为侧链的葡聚糖，是一种免疫调节型抗肿瘤辅助药物。1965年日本千原吴郎发现其有抗肿瘤活性后，各国科学家就对香菇多糖进行广泛研究，发现香菇多糖不但治疗多种免疫缺乏疾病，如慢性病毒性肝炎和由病毒引起的慢性疾病，还能对多种肿瘤有较强的抑制和治疗作用。1985年日本首先开发成功注射用香菇多糖作为抗肿瘤新药上市。我国1988年开始进口日本味之素的香菇多糖，并用于临床。

香菇多糖提取工艺十分复杂，香菇除含有多糖物质外，还含有一定量蛋白质、胶质、粗纤维及脂肪等成分。目前常采用的方法是沸水浸提乙醇析出的方法，而这样提取多糖的纯度并不高，仍需经过一系列后续处理才能使多糖含量达到90％左右。此提取步骤不仅耗费了大量的乙醇。而且得到的香菇多糖含量并不高，造成后续工艺处理复杂。有关香菇多糖的分子量测定，目前我国均采用GPC凝胶色谱(示差仪)测定。由于所采用的凝胶柱型号各不相同，对分子量的测定误差很大，无法准确判断香菇多糖原料是否合格。为了使香菇多糖原料分子量测定更准确，我们用GPC凝胶色谱仪激光光散射的方法来测定香菇多糖的分子量，该方法是通过香菇多糖粒径来判断分子量的大小，再计算出重均分子量。具有测定分子量简便、准确率高、无需对照品，即可测出香菇多糖样品的准确分子量。

发明内容

本发明目的就是为了寻找一种新的较为易于生产、成本低、目标明确、检测方便、可行的碱溶性香菇多糖的提取、分离、纯化新工艺及其分子量测定方法。

香菇多糖提取、分离、纯化具体过程通过下列步骤实施：

干香菇→粉碎→碱提3次(40-50℃)→浓缩→碱洗→水洗→级分→低温干燥→粗品溶解→离心→上清液上DEAE纤维素纯化→离子交换树脂柱吸附→过滤→超滤膜浓缩→测分子量→透析→透析物冷冻干燥

操作工艺：

1.取干香菇子实体粉碎后，加8-10倍，0.3-1mol/LNaoH溶液、温控30-50℃搅拌提取3次。每次3-4小时。合并提取液，滤去不溶物、浓缩至原液体积8-10分之一。用0.3mol/LNaOH浓缩液洗涤2次再用同样体积去离子水洗涤2次浓缩液，用茚三酮检测，基本无残余蛋白质，将洗涤后的浓缩液在快速搅拌下加不同含量的乙醇进行级分，将级分粘稠物低温干燥，得粗品，将粗品溶解后离心，取上层清液上DEAE纤维素柱除杂纯化，用0.15mol/LNaoH洗脱，合并洗脱液，上离子交换树脂柱吸附脱色，合并洗脱液，过滤，按设定分子量膜包分别超滤浓缩，用GPC激光光散射凝胶色谱仪测定分子量，按分子量范围，分别透析、冻干得各组份碱溶性香菇多糖。经检测分子量为40-80万Da的碱溶性香菇多糖其外观、吸湿性、溶解度、比旋度、熔点、特性粘度、酸碱度、干燥失重、分子量及分子量分布、纯度、含量、红外吸收光谱(见图1、图2)均与国家标准WS₁-(X-032)-2004Z香菇多糖的规定一致。

提取、分离、纯化香菇多糖具体实施方式

实施例1：

取合格的干香菇原料8公斤，粉碎后，置于带夹套的反应锅中。加入0.5mol/LNaoH的碱溶液80公斤加热至40℃，保温搅拌4小时，过滤，残渣再用上述方法提取2次。合并全部溶液，浓缩至原体积的十分之一，再加入0.3mol/L NaOH 2倍于浓缩液的碱液浓缩洗涤2次，再用同样体积去离子水浓缩洗涤2次，洗涤后的浓缩液用茚三酮检测反应不显蓝紫色。将洗涤后的浓缩液在快速搅拌下用50-70％的乙醇进行级分，继续搅拌15分钟后静置4小时，沉淀产生、倾去上清液，沉淀物再用80-90％的酒精溶解搅拌15分钟后静置4小时，沉淀产生，沉淀物在50℃低温干燥得无蛋白残留碱溶性香菇多糖粗品400克。

将香菇多糖粗品按1∶100比例溶于0.15mol/L的碱溶液中溶解。溶解后离心，取上清液，上DEAE纤维素柱除杂化，上离子交换树脂柱吸附脱色，洗脱液过滤后分别用5-30万分子量膜包依次浓缩至最小体积，用GPC激光光散射凝胶色谱仪测定分子量，将不同级别分子量的浓缩液分别装入透析袋，用去离子水透析48小时后冻干，得含量为98％以上。重均分子量为10万-100万Da的各组份香菇多糖共20克。

实施例2：

取合格的干香菇原料10公斤，粉碎后，置于带夹套的反应锅中。加入0.5mol/LnaoH的碱溶液100公斤加热至40℃，保温搅拌4小时，过滤，残渣再用上述方法提取2次。合并全部溶液，浓缩至原体积的十分之一，再加入0.3mol/L NaOH 2倍于浓缩液的碱液浓缩洗涤2次，再用同样体积去离子水浓缩洗涤2次，洗涤后的浓缩液用茚三酮检测反应不显蓝紫色。将洗涤后的浓缩液在快速搅拌下用50-70％的乙醇进行级分，继续搅拌15分钟后静置4小时，沉淀产生、倾去上清液，沉淀物再用80-90％的酒精溶解搅拌15分钟后静置4小时，沉淀产生，沉淀物在50℃低温干燥得无蛋白残留碱溶性香菇多糖粗品500克。

将香菇多糖粗品按1∶100比例溶于0.15mol/L的碱溶液中溶解。溶解后离心，取上清液，上DEAE纤维素柱除杂化，上离子交换树脂柱吸附脱色，洗脱液过滤后分别用5-30万分子量膜包依次浓缩至最小体积，用GPC激光光散射凝胶色谱仪测定分子量，将不同级别分子量的浓缩液分别装入透析袋，用去离子水透析48小时后冻干，得含量为98％以上。重均分子量为10万-100万Da的各组份香菇多糖共25克。

实施例3：

取合格的干香菇原料13公斤，粉碎后，置于带夹套的反应锅中。加入0.5mol/LnaoH的碱溶液130公斤加热至40℃，保温搅拌4小时，过滤，残渣再用上述方法提取2次。合并全部溶液，浓缩至原体积的十分之一，再加入0.3mol/L NaOH 2倍于浓缩液的碱液浓缩洗涤2次，再用同样体积去离子水浓缩洗涤2次，洗涤后的浓缩液用茚三酮检测反应不显蓝紫色。将洗涤后的浓缩液在快速搅拌下用50-70％的乙醇进行级分，继续搅拌15分钟后静置4小时，沉淀产生、倾去上清液，沉淀物再用80-90％的酒精溶解搅拌15分钟后静置4小时，沉淀产生，沉淀物在50℃低温干燥得无蛋白残留碱溶性香菇多糖粗品650克。

将香菇多糖粗品按1∶100比例溶于0.15mol/L的碱溶液中溶解。溶解后离心，取上清液，上DEAE纤维素柱除杂化，上离子交换树脂柱吸附脱色，洗脱液过滤后分别用5-30万分子量膜包依次浓缩至最小体积，用GPC激光光散射凝胶色谱仪测定分子量，将不同级别分子量的浓缩液分别装入透析袋，用去离子水透析48小时后冻干，得含量为98％以上。重均分子量为10万-100万Da的各组份香菇多糖共32克。

实施例4：

取合格的干香菇原料12公斤，粉碎后，置于带夹套的反应锅中。加入0.5mol/LnaoH的碱溶液120公斤加热至40℃，保温搅拌4小时，过滤，残渣再用上述方法提取2次。合并全部溶液，浓缩至原体积的十分之一，再加入0.3mol/L NaOH 2倍于浓缩液的碱液浓缩洗涤2次，再用同样体积去离子水浓缩洗涤2次，洗涤后的浓缩液用茚三酮检测反应不显蓝紫色。将洗涤后的浓缩液在快速搅拌下用50-70％的乙醇进行级分，继续搅拌15分钟后静置4小时，沉淀产生、倾去上清液，沉淀物再用80-90％的酒精溶解搅拌15分钟后静置4小时，沉淀产生，沉淀物在50℃低温干燥得无蛋白残留碱溶性香菇多糖粗品600克。

将香菇多糖粗品按1∶100比例溶于0.15mol/L的碱溶液中溶解。溶解后离心，取上清液，上DEAE纤维素柱除杂化，上离子交换树脂柱吸附脱色，洗脱液过滤后分别用5-30万分子量膜包依次浓缩至最小体积，用GPC激光光散射凝胶色谱仪测定分子量，将不同级别分子量的浓缩液分别装入透析袋，用去离子水透析48小时后冻干，得含量为98％以上。重均分子量为10万-100万Da的各组份香菇多糖共30克。

香菇多糖分子量测定方法通过下列步骤实施：

操作工艺：

1.流动相的处理：采用纯度较高的盐水溶液作为流动相(使用其它有机溶剂作为流动相处理方法相同)，将溶液过滤并超声脱气至少30min，加入凝胶渗透色谱仪的流动相瓶中待用。

2.配制样品：用流动相作溶剂，将香菇多糖用流动相溶解，并稀释至约1mg/mL。

3.基线平衡：分别将示差折光检测器多角度静态激光光散射仪、机械泵、柱温箱及其控制单元的电源打开，并打开仪器操作软件ASTRA4.90.08调节柱温30-35℃，调节机械泵，使流动相的流速缓慢升至1mL/min。通过示差折光控制面板上的TAB键选中Purge键，按ENTER键使之处于Purge ON的状态，流动相同时冲洗参比池和样品池，开机后，至少让仪器平衡2h，待两个检测器基线稳定后再进行测定。

4.香菇多糖分子量的测定：打开软件Collect菜单，并进一步打开其中的Sample set子菜单选择Edit进行编辑，分别输入香菇多糖样品与保存的文件名、保存目录、采集时间、流动相流速及样品的dn/dc值、编辑完毕，按OK键。将样品通过过滤头注入进样阀中，打开Inject菜单选择Sample Set即打开数据采集窗口，连着按两次OK按钮，将进样阀的控制阀扳至Inject软件自动开始采集数据。在设定的时间内采集完数据。将采集到数据的文件打开，选择View菜单中的Baseline选项，分别拖拽鼠标设定示差折光检测器和多角静态激光光散射仪第十一角度检测器的信号基线，然后选择Options菜单中的Autobaseline对其它角度的光散射信号自动设定基线，基线设定完毕后，选择View菜单中的Peaks项，通过鼠标选定色谱峰区域，点击Reports菜单的Summary，看所得到的分子量及分子量结果，更详细的结果可以通过Distrbution菜单来查看。GPC激光光散射凝胶渗透色谱仪的结构(见图3)

香菇多糖重均分子量测定方法具体实施方式

实施例1

操作工艺：

配制0.9％Nacl水溶液作为流动相，过滤并超声脱气至少30min，加入凝胶渗透色谱仪的流动相瓶中待用。用流动相作溶剂，将香菇多糖样品A用流动相溶解，并稀释至约1mg/mL。分别将示差折光检测器多角度静态激光光散射仪、机械泵、柱温箱及其控制单元的电源打开，并打开仪器操作软件ASTRA4.90.08调节柱温30-35℃，调节机械泵，使流动相的流速缓慢升至1mL/min。通过示差折光控制面板上的TAB键选中Purge键，按ENTER键使之处于Purge ON的状态，流动相同时冲洗参比池和样品池，开机后，让仪器平衡2h，待两个检测器基线稳定后，再打开软件Collect菜单，并进一步打开其中的Sample set子菜单选择Edit进行编辑，分别输入香菇多糖样品A与保存的文件名、保存目录、采集时间、流动相流速及样品的dn/dc值、编辑完毕，按OK键。将样品A通过过滤头注入进样阀中，打开Iniect菜单选择Sample Set即打开数据采集窗口，连着按两次OK按钮，将进样阀的控制阀扳至Iniect软件自动开始采集数据。在设定的时间内采集完数据。将采集到数据的文件打开，选择View菜单中的Baseline选项，分别拖拽鼠标设定示差折光检测器和多角静态激光光散射仪第十一角度检测器的信号基线，然后选择Options菜单中的Autobaseline对其它角度的光散射信号自动设定基线，基线设定完毕后，选择View菜单中的Peaks项，通过鼠标选定色谱峰区域，点击Reports菜单的Summary，对所有的级分进行加和计算得到香菇多糖样品A数均分子量为47万，重均分子量为74万，Z均分子量为94万(见图4)。

实施例2

操作工艺：

配制0.9％Nacl水溶液作为流动相，过滤并超声脱气至少30min，加入凝胶渗透色谱仪的流动相瓶中待用。用流动相作溶剂，将香菇多糖样品B用流动相溶解，并稀释至约1mg/mL。分别将示差折光检测器多角度静态激光光散射仪、机械泵、柱温箱及其控制单元的电源打开，并打开仪器操作软件ASTRA4.90.08调节柱温30-35℃，调节机械泵，使流动相的流速缓慢升至1mL/min。通过示差折光控制面板上的TAB键选中Purge键，按ENTER键使之处于Purge ON的状态，流动相同时冲洗参比池和样品池，开机后，让仪器平衡2h，待两个检测器基线稳定后，再打开软件Collect菜单，并进一步打开其中的Sample set子菜单选择Edit进行编辑，分别输入香菇多糖样品B与保存的文件名、保存目录、采集时间、流动相流速及样品的dn/dc值、编辑完毕，按OK键。将样品B通过过滤头注入进样阀中，打开Iniect菜单选择Sample Set即打开数据采集窗口，连着按两次OK按钮，将进样阀的控制阀扳至Iniect软件自动开始采集数据。在设定的时间内采集完数据。将采集到数据的文件打开，选择View菜单中的Baseline选项，分别拖拽鼠标设定示差折光检测器和多角静态激光光散射仪第十一角度检测器的信号基线，然后选择Opt ions菜单中的Autobaseline对其它角度的光散射信号自动设定基线，基线设定完毕后，选择View菜单中的Peaks项，通过鼠标选定色谱峰区域，点击Reports菜单的Summary，对所有的级分进行加和计算得到香菇多糖样品B数均分子量为41万，重均分子量为66万，Z均分子量为110万(见图5)。

实施例3

操作工艺：

配制0.9％Nacl水溶液作为流动相，过滤并超声脱气至少30min，加入凝胶渗透色谱仪的流动相瓶中待用。用流动相作溶剂，将香菇多糖样品C用流动相溶解，并稀释至约1mg/mL。分别将示差折光检测器多角度静态激光光散射仪、机械泵、柱温箱及其控制单元的电源打开，并打开仪器操作软件ASTRA4.90.08调节柱温30-35℃，调节机械泵，使流动相的流速缓慢升至1mL/min。通过示差折光控制面板上的TAB键选中Purge键，按ENTER键使之处于Purge ON的状态，流动相同时冲洗参比池和样品池，开机后，让仪器平衡2h，待两个检测器基线稳定后，再打开软件Collect菜单，并进一步打开其中的Sample set子菜单选择Edit进行编辑，分别输入香菇多糖样品C与保存的文件名、保存目录、采集时间、流动相流速及样品的dn/dc值、编辑完毕，按OK键。将样品C通过过滤头注入进样阀中，打开Iniect菜单选择Sample Set即打开数据采集窗口，连着按两次OK按钮，将进样阀的控制阀扳至Iniect软件自动开始采集数据。在设定的时间内采集完数据。将采集到数据的文件打开，选择View菜单中的Baseline选项，分别拖拽鼠标设定示差折光检测器和多角静态激光光散射仪第十一角度检测器的信号基线，然后选择Options菜单中的Autobasclinc对其它角度的光散射信号自动设定基线，基线设定完毕后，选择View菜单中的Peaks项，通过鼠标选定色谱峰区域，点击Reports菜单的Summary，对所有的级分进行加和计算得到香菇多糖样品C数均分子量为50万，重均分子量为66万，Z均分子量为86万(见图6)。

Claims

1. 碱溶性香菇多糖提取、分离、纯化新工艺及分子量的测定方法，其特征在于：取干香菇子实体粉碎后，加水加热浸提、过滤、浓缩、洗涤、级分、低温干燥、溶解、离心、DEAE纤维素除杂纯化、离子交换树脂柱吸附脱色、过滤、超滤、浓缩，用GPC凝胶色谱仪测定分子量，按测定分子量的范围透析、冻干即得本发明产物。

2. 根据权利要求1所述的浸提方法，其特征在于：所用的碱为NaOH、KOH、NaHCO₃、KHCO₃、KCO₃。提取碱溶性香菇多糖的碱液浓度为0.3-1mo1/L NaOH。温度范围在30-60℃。

3. 根据权利要求1所述分离方法，其特征在于：离心机的转数为每分钟4000-16000转。洗涤应采用0.1-0.5mol/NaOH。二次洗涤应采用去离子水。

4. 根据权利要求1所述分离方法，其特征在于：中空纤维超滤器的膜包分子量为1-30万Da。

5. 根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：低温干燥，温度为45-55℃。

6. 根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：纤维素柱采用DEAE纤维素A25.A50(二乙胺基乙基纤维素)。阴离子树脂采用717，阳离子树脂采用732。

7. 根据权利要求1所述纯化分离方法，其特征在于：洗脱碱液的浓度为0.1-0.8mol/L。

8. 根据权利要求1所述分子量测定方法，其特征在于：采用wyattDAWN EOS型多角度激光光散射凝胶色谱仪测定分子量。GPC激光光散射凝胶色谱仪测定分子量的固定相采用Shodex水系广普线性凝胶柱。

9. 根据权利要求1所述分子量测定方法，其特征在于：采用waters 515高效液相机械泵和wyatt optiiad DSP型示差折光检测器作为分子量测定的配套仪器。

10. 根据权利要求1所述分子量测定方法，其特征在于：以0.5-1％Nacl水溶液为流动相，流速1mL/min，用于分子量的测定。