CN101252934A

CN101252934A - 促动力素1受体

Info

Publication number: CN101252934A
Application number: CNA200680017645XA
Authority: CN
Inventors: J·R·马布斯; J·M·帕尔默; S·M·普罗蒂; P·J·霍恩比; P·R·瓦德
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2005-03-24
Filing date: 2006-03-15
Publication date: 2008-08-27
Also published as: TW200720260A; AU2006229793A1; US8362247B2; BRPI0609315A2; CA2602576A1; WO2006104715A1; EP1866290A1; CN101326168A; KR20080006564A; US20060235018A1; EP1866290B1; JP2008534500A; AR053451A1; MY153719A; MX2007011848A; US7968710B2; US20120129862A1

Abstract

本发明涉及具备PK1受体调节剂功能的化合物，特别是一类有效和选择性的PK1受体拮抗剂。化合物可用作哺乳动物PK1受体的有效和选择性拮抗剂，可用作由PK1受体活性导致的哺乳动物疾病的治疗剂。

Description

促动力素1受体

相关申请的交叉引用

本申请要求2005年3月24日提交的申请号60/665,002和2005年10月28日提交的申请号60/731,421的优先权。

关于联邦资助的研究或开发的声明

下文所述发明的研究和开发并非由联邦资助。

发明领域

本发明涉及具备PK1受体调节剂功能的新化合物，特别涉及一类新的有效和选择性的PK1受体拮抗剂。本发明还涉及可用作有效和选择性的哺乳动物PK1受体拮抗剂的新化合物、它们药学上可接受的盐及其药学上可接受的组合物，以及用这些拮抗剂作为治疗剂治疗由PK1受体活性导致的哺乳动物疾病的方法。

本发明还涉及可用于PK1受体生物学活性的功能分析的生物学材料，及其在鉴定调节PK1受体生物学活性的化合物中的用途。本发明还涉及测定促动力素(prokineticin)1受体生物学活性的方法。具体来讲，本发明涉及鉴定增加或降低促动力素1受体生物学活性的化合物的方法。

发明背景

消化作用包括将食物材料分解成可转运至机体的个体细胞并被其利用的分子。这些分子可作为能量来源；它们可提供必需化学元素，如钙、氮或铁；或者它们可以是细胞需要但不能自身合成的完整分子，如某些氨基酸、脂肪酸和维生素。包括食物原料分解和同化过程以及废物排出在内的消化作用发生在称为胃肠(GI)道的从口延伸至肛门的旋绕的长管腔内。胃肠道从口腔、口开始，接着包括咽、食道、胃、小肠、大肠和肛门。胃肠道从始至终都具有四层组织：(1)粘膜，最内层，由柱状上皮细胞组成，直接接触摄入的食物材料，促进液体和电解质转运，消化和吸收营养，下面的基底膜由结缔组织和薄层平滑肌组成；(2)粘膜下层，最内的第二层，由含有少簇神经细胞和神经纤维的结缔组织以及血管和淋巴管组成；(3)肌层，最内的第三层，由两层分离的纹理走向相对的平滑肌组织组成，两层之间包含大量夹杂神经细胞簇和神经纤维的网状系统；和(4)浆膜，最外层，由接触腹膜腔环境的结缔组织组成。

在大部分胃肠道内，肌层由两层走向相对的平滑肌组成，内层的细胞走向与肠道长轴垂直，外层的细胞走向与肠道长轴平行。这些肌层协同收缩产生环样收缩使食物混合，以及称为蠕动的波状移动使食物通过胃肠道。(参见图29)。在几个点上，环肌层变厚成重带，形成活瓣样收缩，称为括约肌，通过舒张和收缩调节食物从一处胃肠道到达另一处。

食物原料中营养的分解和同化主要通过胃和小肠活性的高度协调完成。神经和内分泌系统都影响胃。期待进食和食物出现在口中刺激胃搅动和产生胃液。当食物到达胃时，它的出现引起激素胃泌素从胃的内分泌细胞释放入血流中。胃泌素作用于胃的细胞，增加它们的胃液分泌。

由于胃液(包括胃蛋白酶、盐酸)和搅动的作用，食物在胃内被转化为半流体块状物。当食物完全分解时，食物被排空入小肠内。所得营养分子接着被吸收入循环系统中，从中将其转运至个体细胞。小肠含有大量消化液，有的由肠细胞产生，有的由胰腺和肝产生。其它上皮细胞，粘膜的杯状细胞分泌粘液。小肠的消化活性由激素协调和调节。除了受激素影响之外，肠道还受自主神经系统调控，包括分泌消化酶和收缩。因此，刺激和抑制和平衡复杂的相互作用激活消化酶，调节化学环境和调整摄入的材料在肠内移动。

大肠涉及吸收水、钠及其它电解质。它的一些上皮细胞分泌粘液，润滑未消化的食物残渣。从体液通过渗透作用或者从沿消化道排列的腺体中分泌大量水进入胃和小肠内。当吸收过程受到干扰和/或粘液腺的分泌增强(如腹泻)，可导致严重脱水。

功能性肠病包括胃肠道器官内异常移动和分泌，特征在于腹部不适/疼痛。这些疾病的标准由胃肠病学家概述于‘Rome II标准’(参见如Rome II Diagnostic criteria for the Functional GastrointestinalDisorders，第2版，高级编辑Douglas A.Drossman，M.D.，ManagementServices，McLean，VA(2000))中。根据这些标准，常见疾病包括但不限于功能性消化不良、肠易激综合征(IBS)、胃食管反流疾病(GERD)、非糜烂性反流病(NERD)和慢性便秘(包括结肠无力、原发性假性肠梗阻)。GERD非常常见，常伴有非心源性胸痛，可用制酸剂和促动力剂治疗。IBS特征在于反复出现便秘和/或腹泻，可伴随胀气/胃胀和腹部不适/疼痛(Thompson，W.G.和Heaton，K.W.Gastroenterology 1980，79，283-288)。IBS疼痛的出现伴随排便频率和/或粪便外形的改变，排便后可缓解。IBS是很常见的疾病，不同严重度地出现在10-15％人群中(Saito，Y.A.；Schoenfeld，P.；和Locke，G.R.Am.J.Gastroenterol.2002，97，1910-1915)。这种疼痛可用平滑肌松弛剂和抗抑郁药治疗(Jackson，J.L.；O′Malley，P.G.；Tomkins，G.；Balden，E.；Santoro，J.；和Kroenke，K.；Am.J.Med.2000，108，65-72；Jailwala，J.；Imperiale，T.F.；和Kroenke，K.；Ann.Intern.Med.2000，133：136-147；Akehurst，R.和Kaltenthaler，E.Gut 2001，48，272-282；Poynard，T.；Regimbeau，C；和Benhamou，Y.；Aliment Pharmacol.Ther.2001，75，355-361)。以严重腹泻为主的IBS用阿洛司琼治疗，但以便秘为主的IBS用替加色罗治疗。功能性消化不良是上消化道疾病，进食后症状加重，伴有早饱、恶心和呕吐。虽然不清楚其病因学，但是促动力药可缓解IBS的症状。在一些患者中，存在GERD/NERD、功能性消化不良与IBS之间症状的重叠。对功能性肠病如IBS的治疗方法功效低，有不良反应。例如，FDA批准阿洛司琼的风险处理程序，因为伴随缺血性结肠炎的增加。没有疗法可有效缓解功能性肠病的疼痛。

除了功能紊乱之外，炎性肠病(IBD)也常见，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。虽然CD可能有遗传成分，但UC和CD的病因学都不清楚。UC是弥漫性结肠粘膜疾病，特征在于炎症和溃疡，伴有腹泻和腹绞痛。粘膜炎症从直肠区开始发展，最终延伸遍及大肠。CD是透壁性炎症，最常累及末端小肠和结肠。炎症可导致各种溃疡，严重者可引起透壁疤痕形成和慢性炎症。传染性和失调的免疫功能都可促成发病。IBD的疗法包括皮质激素、免疫抑制剂(硫唑嘌呤、巯嘌呤和甲氨蝶呤)和氨基水杨酸盐(5-ASA)。这些方法通过模拟皮质激素抑制免疫系统，或者作用机制未明。口服皮质激素伴随严重不良反应，免疫抑制剂和氨基水杨酸盐只能中度有效。虽然Infliximab(嵌合型单克隆抗肿瘤坏死因子抗体)对CD有效，但其使用伴随抗体出现，降低其功效。目前没有治疗可针对与肠道炎症有关的活动力和分泌异常或疼痛感觉。

称为促动力素1(PK1)和促动力素2(PK2)的半胱氨酸富集蛋白以及具备PK活性的变体、片段和分子已经得到鉴定。已显示PK1和PK2可收缩胃肠平滑肌(Li，M.；Bullock，CM.；Knauer，DJ.；Ehlert，FJ.；和Zhou，Q.Y.，Mol.Pharmacol.2001，59，692-698)和抑制进食(Negri，L.；Lattanzi，R.；Giannini，E.；De Felice，M.；Colucci，A.和Melchiorri，P.Brit.J.Pharmacol.2004，142，181-191)。PK1和PK2都作用于PK1和PK2受体，这些相关PK富半胱氨酸区的C端有限的结构改变是可以接受的。例如嵌合型PK，其中PK1和PK2的半胱氨酸富集域在两者间交换且在C端区含有21个残基插入的PK2剪接变体保留活性(Bullock，CM；Li J.D.；Zhou，Q.Y.；Mol.Pharmacol.2004，65(3)，582-8)。PK变体与初级感觉神经元的受体结合，导致外周伤害性感受器对热和机械刺激强烈敏感(Mollay，C；Weschelberger，C；Mignogna，G.；Negri，L.；Melchiorri，P.；Barra，D.；Kreil，G.；Eur.J.Pharmacol.1999，374，189-196；Negri，L.；Lattanzi，R.；Giannini，E.；Metere，A.；Colucci，M.；Barra，D.；Kreil，G.；Melchiorri，P.；Brit.J.Pharmacol 2002，137(8)，1147-54)。

PK1诱导来自内分泌腺的毛细管内皮细胞增殖、迁移和形成膜间断(fenestration)。PK mRNA的表达可见于类固醇生成腺、卵巢、睾丸、肾上腺和胎盘(LeCouter，J.；Kowalski，J.；Foster，J.；Hass，P.，Zhang，Z.；Dillard-Telm，L.，Frantz，G.，Rangell，L.；DeGuzman，L.；Keller，G.A.；Peale，F.；Gurney，A.；Hillan，K.J.；Ferrara，N.Nature 2001，412(6850)，877-84)。在2002年，PK1受体的鉴定为调控内分泌腺的血管生成提供新的分子基础(Masuda，Y.；Takatsu，Y.；Terao，Y.；Kumano，S.；Ishibashi，Y.；Suenaga，M.；Abe，M.；Fukusumi，S.；Watanabe，T.；Shintani，Y.；Yamada，T.；Hinuma，S.；Inatomi，N.；Ohtaki，T.；Onda，H.；Fujino，M.；Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，293(1)，396-402；LeCouter，J.；Lin，R.；Ferrara，N.；Cold Spring Harb Symp QuantBiol.2002，67，217-21)。例如，将PK1通过腺病毒传递至小鼠睾丸引起有效的血管生成反应(LeCouter，J.；Lin，R.；Tejada，M.；Frantz，G.；Peale，F.；Hillan，KJ.；Ferrara，N.Proc.Natl.Acad.Sci USA.2003，100，2685-90)。最近，显示PK1 mRNA正常不表达于结肠直肠的正常粘膜，但可见于结肠直肠癌细胞中(Goi，T.；Fujioka，M.；Satoh，Y.；Tabata，S.；Koneri，K.；Nagano，H.；Hirono，Y.；Katayama，K.；Hirose，K.和Yamaguchi.，Cancer Res.2004，64，1906-1910)。

因此，PK1受体调节剂特别是PK1受体拮抗剂可用于治疗和预防各种哺乳动物疾病，如与IBS和IBD有关的内脏痛。另外，PK1受体调节剂特别是PK1受体拮抗剂可用于治疗GERD或其它形式的分泌性腹泻。此外，PK1受体调节剂特别是PK1受体拮抗剂可用于治疗大肠和生殖器官中的癌症特异性血管生成因子。

WO200236625公开PK1和PK2多核苷酸和多肽及其用途。

U.S.20040156842和对应的美国专利号6,485,938公开PK1和PK2的肽拮抗剂治疗肠道炎症的用途。该文献公开拮抗剂包括与PK1和PK2特异性结合的抗体以及与其中公开的氨基酸序列结合的受体。

WO2004087054公开通过给予促动力素受体拮抗剂改变一种或多种胃酸分泌标记物调节胃酸或胃蛋白酶原分泌的方法。该文献公开促动力素受体拮抗剂是改良的促动力素，可用任何包含至少80％氨基酸序列与其中公开的氨基酸序列一致的种类形成。

这些文献都没有公开或提示PK1受体的小分子调节剂。此类调节剂的鉴定应加速新疗法的开发，用于涉及胃肠蠕动和/或分泌受损或增强的疾病。

本发明一方面提供PK1受体调节剂，特别是PK1受体拮抗剂。本发明的一个目的是提供治疗或缓解由PK1受体介导的疾病的方法。另外，本发明的目的是提供用作PK1受体拮抗剂的含本发明化合物的有效的药用组合物。

本发明另一方面是监测动物PK1受体生物学活性的方法。

通过以下描述将清楚本发明的这些及其它方面和优点。

发明概述

本发明人已经发现有效的PK1受体拮抗剂。因此本发明涉及式(I)化合物及其对映体、非对映体、互变异构体、溶剂合物和药学上可接受的盐：

式(I)

其中：

A₁是氢、芳基、杂芳基、C_5-8环烷基或杂环基，前提是A₁不同于哌啶-4-基、N-叔丁氧基羰基-哌啶-4-基或N-甲基-哌啶-3-基；其中不同于氢的A₁的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、羟基(C_1-6)烷基、C_1-6烷氧基、卤素、硝基、卤代C_1-6烷基、卤代C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷氧基羰基、氨基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6烷基)氨基、氰基、羟基、氨基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基羰基、C_1-6烷氧基羰基氨基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷硫基羰基、甲酰基、C_1-6烷基磺酰基、C_1-6烷基磺酰基氨基、氨基磺酰基、C_1-6烷基氨基磺酰基和二(C_1-6烷基)氨基磺酰基；

L₁是-(CH₂)_r-或-CH₂CH₂X(CH₂)_s-，任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_2-6链烯基、C_2-6炔基和卤素；前提是当A₁是氢时，r大于或等于4；

r是整数1-5；

s是整数1-3；

X是O或S；

D是-P-A₂；

A₂是氢、苯基、不同于未被取代的吡啶-2-基的杂芳基或者C_3-8环烷基；其中苯基任选在间位或对位、A₂(不同于氢和苯基)的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、卤代C_1-6烷基、卤代C_1-6烷氧基、芳基(C_1-6)烷氧基、苯基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷氧基羰基、氨基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6烷基)氨基、氰基、羟基、硝基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷硫基羰基、氨基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基羰基、C_1-6烷基羰基氨基和非稠合的C_3-6环烷氧基；前提是至多两个A₂上的取代基是芳基(C_1-6)烷氧基、苯基或非稠合的C_3-6环烷氧基；

前提是当A₁是未被取代的苯基且L₂是-X₁(CH₂)₂-(其中X₁是NH)时，A₂不同于未被取代的苯基、被芳基(C_1-6)烷氧基或苯基取代的苯基、或者在间位被氰基取代的苯基；

进一步的前提是当A₁是未被取代的苯基且L₂是-X₁(CH₂)₃-(其中X₁是NH)时，A₂不同于被甲氧基取代的苯基；

前提是当A₁是3，4-二氯-苯基且P是-CH₂-时，A₂不同于在间位被三氟甲基或三氟甲氧基取代的苯基；

进一步的前提是当A₁是3，4-二氯-苯基且P是-(CH₂)₂-时，A₂不同于4-甲氧基-苯基；

另外，当A₂是氢时，P是-(CH₂)_4-6-，当A₂不是氢时，P是-(CH₂)_1-2-或-CH₂X₂-；

W是N或CH；

L₂是选自下列的二价基团：

通过氮原子与式(I)的三嗪环连接的吡咯烷基或哌啶基，其中所述吡咯烷基或哌啶基在碳原子上被-(CH₂)_0-2-取代；

-NH-C_5-7环烷基-(CH₂)_0-2-，以便当C_5-7环烷基是环己基时，Q在相对于-NH-位置的2-或顺式-4-位连接；

-X₁-C_2-6烷基-；

-X₁(CH₂)_1-3-X₂-(CH₂)_1-3-；

-X₂-(CH₂)_0-4-；

-X₁(CH₂)_2-3-X₃-(CH₂)_2-3-；

-NH(CH₂)_1-4C(＝O)-，前提是至少一个R^b、R^c或R^d不是氢且m是0；

-NHC(＝O)-(CH₂)_1-4-；和

-X₁CH(R^x)-(CR^xR^y)_1-5-；

其中X₁是-NH-或直接键；X₂是-CH＝CH-；X₃是O、S、NH或C＝O；R^x和R^y独立是H或C_1-4烷基；前提是任何情况下L₂的长度都不超过7个原子；

Q是-(O)_mN(R^a)-G；m是0或1；

G是-C(＝NR^b)NR^cR^d；

R^a和R^d独立是氢、C_1-6烷基、C_2-6链烯基或C_3-6炔基，其中R^a和R^d(不同于氢)的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：羟基、C_1-4烷氧基、氟、氨基、C_1-4烷基氨基、二C_1-4烷基氨基和C_1-4烷基羰基；或者R^a和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

R^b是氢、C_1-6烷基、C_2-6链烯基、C_3-6炔基、C_2-6烷氧基羰基或氰基；或者R^b和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

R^c是氢、C_1-10烷基、C_2-10链烯基、C_3-10炔基、C_3-7环烷基、金刚烷基、氨基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6烷基)氨基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、杂环基羰基、芳基、杂芳基或杂环基；其中C_1-10烷基、C_2-10链烯基和C_2-10炔基任选被1-3个独立选自羟基、C_1-6烷氧基、三氟甲基、芳基、杂芳基和杂环基的取代基取代；其中任何含芳基或杂芳基的R^c取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、氟代C_1-6烷基、氟代C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、氨基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基羰基、C_1-6烷氧基羰基氨基、甲酰基、C_1-6烷基磺酰基、C_1-6烷基磺酰基氨基、氨基磺酰基、C_1-6烷基氨基磺酰基和二(C_1-6烷基)氨基磺酰基、硝基、甲硫基、羟基和氰基；或者R^c和R^d与它们连接的原子结合一起形成5-8元单环，环内任选含有1-2个O或S杂原子，所述环任选被氧代取代；

前提是在任何情况下，只有一个环任选存在于R^a和R^b、R^b和R^c或者R^c和R^d之间。

还提供通过使含PK1受体的标本与一种或多种候选化合物接触鉴定PK1受体调节剂的方法，以及鉴定特异性增加或降低PK1受体活性的化合物的方法。将此类化合物表征为PK1受体调节剂。

还提供通过使含PK1受体的标本与一种或多种候选化合物接触鉴定PK1受体激动剂的方法，以及鉴定选择性促进PK1受体信号产生的化合物的方法。将此类化合物表征为PK1受体激动剂。

还提供通过在PK1存在下使含PK1受体的标本与一种或多种候选化合物接触鉴定PK1受体拮抗剂的方法，以及鉴定选择性抑制PK1受体信号产生的化合物的方法。将此类化合物表征为PK1受体拮抗剂。

本发明调节PK1受体的方法可包括将PK1受体拮抗剂给予能够产生PK1受体信号的细胞、组织或动物。

还提供刺激哺乳动物蠕动和/或分泌的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量的PK1和/或PK1激动剂。

附图简述

图1显示PK1配体制剂混合物的MALDI-TOF ANALYSIS(基质辅助激光解吸分析)。该混合物包含截断4个C端残基的产物(MW＝9172)和全长PK1配体(MW＝9668)。

图2A显示安装在Ussing型离子流量腔内PK1暴露的大鼠回肠组织中，对PK1肽反应的短路电流(Isc)诱导的累积浓度-反应曲线。

图2B是图示，显示将肽加入安装在Ussing型离子流量腔的离体上皮组织浆膜侧时，在大鼠回肠粘膜中只得到PK1诱导的Isc反应(分泌相关)。将PK1肽加入粘膜组织表面不能诱导Isc改变(数据报道为均数和标准差；单因素ANOVA和Neunann-Kuels多重比较检验)。

图3显示在电压钳条件下，从安装在Ussing型离子流量腔的缺乏肌层的大鼠回肠粘膜离体碎片得到的典型短路电流示踪，其中已经以累积方式加入终浓度为10nM(～EC₅₀)和100nM(～最大反应)的PK1肽。该方案通用于PK1肽促分泌作用的研究，用于表征小分子拮抗剂功效。

图4是图示，显示在大鼠回肠粘膜中PK1诱导的Isc反应通过释放内源性神经递质乙酰胆碱，不依赖内在神经活性或者胆碱能毒蕈碱受体的激活。

图5是图示，显示与野生型[WT]同胞小鼠相比，外源性PK1肽在PK1受体敲除[KO]小鼠的上皮组织中无法诱导Isc明显改变。

图6是图示，显示PK1在大鼠回肠粘膜中的促分泌作用只依赖于从网状基底侧向上皮顶端的生电氯离子转运机制的刺激。

图7是图示，显示PK1诱导大鼠回肠粘膜中Isc的增加部分依赖于环氧合酶产生内源性前列腺素。

图8是图示，显示PK1诱导大鼠回肠粘膜中Isc的增加部分依赖于内源性前列腺素的产生，与位于上皮内的前列腺素EP4受体作用。

图9A和9B是图示，证明PK1诱导Isc的增加在PK1受体的小分子拮抗剂即取代的氨基胍JNJ 27624675(见下文)(图9A)和JNJ28480894(见下文)(图9B)存在下被抑制。

图10是图示，证明PK1诱导Isc的增加在取代的氨基胍JNJ28611921(见下文)存在下不受抑制，该小分子对PK1受体无活性但结构上与JNJ 27624675和JNJ 28480894相关。

图11是图示，证明PK1诱导Isc的增加被PK1受体的小分子拮抗剂氨基苯并咪唑JNJ 28845557(见下文)抑制。

图12是图示，证明口服PK1(100μg/kg)刺激液体蓄积在大鼠体内小肠中。

图13是图示，证明腹膜内PK1(100μg/kg)刺激液体蓄积在大鼠体内小肠中。

图14是图示，证明口服PK1(100μg/kg)增强胭脂红试验餐在大鼠体内小肠中推进。

图15显示在大鼠胃肠道得到的组织段收缩反应，用1μM乙酰胆碱诱导的收缩标化。

图16证明在等长条件下将PK1应用于完整的大鼠回肠段可诱导双相收缩反应。

图17A和17B分别是在离体大鼠回肠中PK1诱导的收缩反应的早期和晚期浓度-反应关系的半对数图。N＝2。

图18是图示，证明在无粘膜的大鼠回肠标本中缺乏PK1(250nM)诱导的晚期收缩反应。

图19是图示，证明JNJ-28845557拮抗PK1诱导的大鼠回肠纵向平滑肌收缩的早期和晚期成分。

图20A和20B显示荧光显微镜得到的图像，证明(A)PK1免疫反应性可见于大鼠胃粘膜，和(B)在只用AlexaFluor 488轭合的二抗但没用一抗抗PK1抗血清培养的相邻部分(作为对照)缺乏免疫荧光。

图21A、21B和21C显示荧光显微镜得到的图像，证明PK1受体免疫反应性局限于豚鼠回肠(A)粘膜下丛和(B)肠肌丛神经元，但不存在于(C)无一抗对照中。

图22是示意图，显示PK1受体mRNA在鼠类DSS诱导的结肠炎中的表达水平。

图23是示意图，显示分别在T＝0、2、6、24和72小时PK1受体mRNA在鼠类芥子油诱导的结肠炎中的表达水平。

图24是示意图，显示分别在T＝0、2、6、24和72小时PK1 mRNA在鼠类芥子油诱导的结肠炎中的表达水平。

图25是图示，显示PK1和PK1肽受体在各种大鼠组织中的表达水平。

图26是示意图，分别显示PK1受体mRNA在PK1受体敲除小鼠(-/-)和PK1受体野生型小鼠(+/+)中的表达水平。

图27是示意图，分别显示PK1 mRNA在PK1受体敲除小鼠(-/-)和PK1受体野生型小鼠(+/+)中的表达水平。

图28是示意图，显示PK1对离子和相关的水跨肠上皮转运的作用。

图29是示意图，显示环状和纵向肌肉如何交替收缩使食物沿消化道移动。

发明详述

本文举例的所有出版物都通过引用结合到本文中。除非另有限定，否则本文使用的所有专业和科学术语都具有本发明相关领域技术人员通常理解的相同含义。

用于本文时，下列加下划线的术语意欲具有下列含义：

化学

用于本文时，术语“酰基”指烷基羰基取代基。

用于本文时，除非另外注明，否则“烷基”无论是单独或是作为取代基团的部分使用，都指具有1-8个或者该范围内任何数目碳原子的直链和支链碳链。术语“烷氧基”指-O烷基取代基，其中烷基如上定义。同样，术语“链烯基”和“炔基”指具有2-8个或者该范围内任何数目碳原子的直链和支链碳链，其中链烯基链内具有至少一个双键，炔基链内具有至少一个三键。烷基和烷氧基链可在碳原子上被取代。在多个烷基的取代基如(C_1-6烷基)₂氨基-中，二烷基氨基的C_1-6烷基可以相同或不同。

术语“芳基”指6个碳成员的不饱和芳族单环，或指10-14个碳成员的不饱和芳族多环。此类芳基环的实例包括但不限于苯基、萘基或蒽基。本发明的实施优选芳基是苯基和萘基。

术语“芳基烷基”指被芳基取代的烷基(如苄基、苯乙基)。同样，术语“芳基烷氧基”指被芳基取代的烷氧基(如苄氧基)。

当术语“烷基”或“芳基”或者它们的前缀出现在取代基命名中(如芳基烷基、烷基氨基)时，应将其理解为包含上文对“烷基”和“芳基”的限定。碳原子的指定数目(如C₁-C₆)应独立指烷基部分或者烷基作为前缀出现的较大取代基的烷基部分的碳原子数。对于烷基和烷氧基取代基，碳原子的指定数目包括具体指定范围内包含的所有独立成员以及指定范围之内的所有范围组合。例如C_1-6烷基将具体包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基及其亚组合(如C_1-2、C_1-3、C_1-4、C_1-5、C_2-6、C_3-6、C_4-6、C_5-6、C_2-5等)。

“C _a-b”(其中a和b是整数)指含a-b个(包含a和b)碳原子的基团。例如C_1-3表示含1、2或3个碳原子的基团。

术语“环烷基”指3-20个碳原子成员(优选3-14个碳原子成员)的饱和或部分不饱和的单环或多环烃环。此类环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或金刚烷基。术语环烷基包括与苯环(苯并稠合环烷基)、5或6元杂芳环(包含1个O、S或N，以及任选1个另外的氮)稠合形成杂芳基稠合的环烷基的环烷基环。

术语“卤素”指氟、氯、溴和碘。以形成稳定化合物的方式用多卤素取代取代基。

“卤代烷基”指从母体烷基脱除1个氢原子得到的饱和支链或直链烷基；母体烷基链包含1-8个碳原子，一个或多个氢原子被卤素原子取代，直到所有氢原子都被卤素取代。优选卤代烷基包括三氟甲基取代的烷基和全氟烷基；更优选氟代烷基包括三氟甲基。

“卤代烷氧基”指卤代烷基衍生的与氧原子连接的基团，该氧原子具有1个开放价用于连接母体结构。

术语“杂芳基”指5或6元芳环，其中该环由碳原子组成，具有至少一个杂原子成员。合适的杂原子包括氮、氧或硫。在5元环的情况下，杂芳环包含一个氮、氧或硫成员，另外可包含至多3个另外的氮。在6元环的情况下，杂芳环可包含1-3个氮原子。在其中6元环具有3个氮时，最多有两个氮原子相邻。术语杂芳基包括与苯环(苯并稠合杂芳基)、5或6元杂芳环(包含1个O、S或N，以及任选1个另外的氮)、5-7元环烷基环或5-7元杂环(如上限定但不存在更多稠环选择)稠合的杂芳环。杂芳基的实例包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基或吡嗪基；稠合的杂芳基包括吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、喹嗪基、喹啉基、异喹啉基或喹唑啉基。

术语“杂环基”指其中1-4个成员是氮的5-10元非芳族环，或是其中0、1或2个成员是氮且至多2个成员是氧或硫的5-10元非芳族环；其中，任选该环包含0、1或2个不饱和键。术语杂环基包括与苯环(苯并稠合杂环基)、5或6元杂芳基环(包含1个O、S或N，以及任选1个另外的氮)、5-7元环烷基或环烯基环、5-7元杂环基环(如上限定但不存在更多稠环选择)稠合或者与环烷基、环烯基或杂环基环连接的碳原子稠合形成螺旋部分的杂环基环。例如本发明化合物，形成杂环基环的碳原子环成员是完全饱和的。其它本发明化合物可具有部分饱和的杂环基环。另外，杂环基包括桥接形成双环的杂环。优选部分饱和的杂环基环可具有1-2个双键。此类化合物不应视为完全芳香性，不能称为杂芳基化合物。杂环基的实例包括但不限于吡咯啉基(包括2H-吡咯、2-吡咯啉基或3-吡咯啉基)、吡咯烷基、2-咪唑啉基、咪唑烷基、2-吡唑啉基、吡唑烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基和哌嗪基。

关于取代基，术语“独立”指当存在多于一个此类取代基时，此类取代基相互之间可以相同或不同。因此，碳原子的指定数目(如C1-8)应独立指烷基或环烷基部分或者指其中烷基作为前缀出现的较大取代基的烷基部分中碳原子的数目。

术语“氧代”无论是单独或是作为取代基部分使用，都指与碳或硫原子连接的O＝。例如，邻苯二甲酰亚胺和糖精是具有含氧取代基的化合物实例。

在本说明书中，首先描述指定侧链的末端部分，接着描述与连接点相邻的官能度。

因此，例如“苯基C _1-6 链烷基氨基羰基C _1-6 烷基”取代基指下式基团

生物学

用于本文时，术语“组合物”意欲包括含特定量特定成分的产物，以及用特定量特定成分组合直接或间接产生的任何产物。

术语“PK1受体激动剂”指选择性激活或增加PK1受体活性的分子。

术语“PK1受体拮抗剂”指选择性抑制或降低PK1受体活性的化合物。

术语“PK1受体调节剂”指增加或降低PK1受体活性的化合物。

术语“主体”用于本文时，指作为治疗、观察或实验目标的动物，优选哺乳动物，最优选人。

术语“治疗有效量”用于本文时，指活性化合物或药物在组织系统、动物或人中表现研究者、兽医、医学博士或其它临床医生所寻求的生物学或医学反应的量，所述反应包括受治疗疾病或病症症状的缓解。

本发明的实施方案包括式(I)化合物，其中：

a)A₁是氢、芳基、杂芳基或者C_5-8环烷基；其中A₁(不同于氢)的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、羟基(C_1-6)烷基、C_1-6烷氧基、卤素、硝基、卤代C_1-6烷基、卤代C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷氧基羰基、氨基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6烷基)氨基、氰基、羟基、氨基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基羰基、C_1-6烷氧基羰基氨基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷硫基羰基、甲酰基、C_1-6烷基磺酰基、C_1-6烷基磺酰基氨基、氨基磺酰基、C_1-6烷基氨基磺酰基和二(C_1-6烷基)氨基磺酰基；

b)A₁是氢、芳基、杂芳基、C_5-8环烷基或杂环基；前提是A₁不同于哌啶-4-基、N-叔丁氧基羰基-哌啶-4-基或N-甲基-哌啶-3-基；其中A₁(不同于氢)的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、羟基(C_1-6)烷基、C_1-6烷氧基、卤素、硝基、卤代C_1-6烷基、卤代C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷氧基羰基、氨基、氰基、羟基、氨基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基羰基和C_1-6烷基羰基；

c)A₁是氢、芳基、杂芳基、C_5-8环烷基或者不同于哌啶基的杂环基；其中A₁(不同于氢)的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、羟基(C_1-6)烷基、C_1-6烷氧基、卤素、硝基、卤代C_1-6烷基、卤代C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷氧基羰基、氨基、氰基、羟基、氨基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基羰基和C_1-6烷基羰基；

d)A₁是氢、取代的苯基、苯并呋喃基、呋喃基、噻唑基、苯硫基或环戊基；其中A₁(不同于氢)的取代基被任选取代，苯基被1-2个独立选自下列的取代基取代：C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、卤素、硝基、卤代C_1-4烷基、卤代C_1-4烷氧基、甲硫基、C_1-4烷氧基羰基、氨基、氰基、羟基、氨基羰基和C_1-4烷基羰基；

e)A₁是取代的苯基、苯并呋喃基、噻唑基或苯硫基；其中苯基被以及苯并呋喃基、噻唑基和苯硫基任选被1-2个独立选自下列的取代基取代：C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、卤素、硝基、卤代C_1-4烷基、卤代C_1-4烷氧基、甲硫基、氨基、氰基和C_1-4烷基羰基；

f)A₁是苯基或苯并呋喃基；其中苯基在对位或间位和对位被1-2个独立选自乙基、甲氧基、氟、氯、硝基、二氟甲氧基和甲硫基的取代基取代；

g)L₁是-(CH₂)_r-，任选被1-3个独立选自C_1-6烷基、C_2-6链烯基、C_2-6炔基和卤素的取代基取代；前提是当A₁是氢时，r大于或等于4；

h)L₁是-(CH₂)_r-，任选被选自C_1-4烷基、C_2-4链烯基和C_2-4炔基的取代基取代，前提是当A₁不同于氢时，r是1-3；或者当A₁是氢时，r大于或等于4；

i)L₁是任选被选自甲基和烯丙基的取代基取代的-(CH₂)_r-，前提是当A₁不同于氢时r是1-3；

j)L₁是被甲基或烯丙基任选取代的-CH₂-；

k)A₂是氢、苯基、不同于未被取代的吡啶-2-基的杂芳基或C_3-8环烷基；其中苯基在间位或对位以及A₂(不同于氢和苯基)的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、卤代C_1-6烷基、卤代C_1-6烷氧基、芳基(C_1-6)烷氧基、苯基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷氧基羰基、氨基、氰基、羟基、硝基、氨基羰基、C_1- ₆烷基羰基氨基和非稠合的C_3-6环烷氧基；前提是不超过两个A₂上的取代基是芳基(C_1-6)烷氧基、苯基或非稠合的C_3-6环烷氧基；

前提是当A₁是未被取代的苯基且L₂是-X₁(CH₂)₂-(其中X₁是NH)时，A₂不同于未被取代的苯基、被芳基(C_1-6)烷氧基或苯基取代的苯基或者在间位被氰基取代的苯基；

另外，当A₂是氢时，P是-(CH₂)_4-6-，当A₂不同于氢时，P是-(CH₂)_1-2-或-CH₂X₂-；

l)A₂是苯基、不同于未被取代的吡啶-2-基的杂芳基或者非稠合的C_3-8环烷基；其中苯基任选在间位或对位，以及不同于苯基的A₂取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、卤代C_1-6烷基、卤代C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷氧基羰基、氨基、羟基、硝基、氨基羰基、C_1-6烷基羰基氨基和非稠合的C_3-6环烷氧基；前提是不超过两个A₂上的取代基是非稠合的C_3- ₆环烷氧基；

前提是当A₁是未被取代的苯基且L₂是-X₁(CH₂)₂-(其中X₁是NH)时，A₂不同于未被取代的苯基；

前提是当A₁是3，4-二氯-苯基时，A₂不同于在间位被三氟甲基或三氟甲氧基取代的苯基；

m)A₂是苯基、呋喃基、吡啶-3-基或吡啶-4-基；其中苯基任选在间位或对位，以及不同于苯基的A₂取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、卤素、卤代C_1-3烷氧基、C_1-3烷硫基、羟基、氨基、氨基羰基、C_1-3烷基羰基氨基和非稠合的C_3-6环烷氧基；前提是不超过两个A₂上的取代基是非稠合的C_3-6环烷氧基；

前提是当A₁是3，4-二氯-苯基时，A₂不同于在间位被三氟甲氧基取代的苯基；

n)A₂是苯基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中苯基在间位或对位，以及不同于苯基的A₂取代基任选被1-2个独立选自下列的取代基取代：甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、羟基、氨基羰基和甲基羰基氨基；

进一步前提是当A₁是未被取代的苯基且L₂是-X₁(CH₂)₃-(其中X₁是NH)时，A₂不同于被甲氧基取代的苯基；

o)A₂是在对位被选自甲氧基、乙氧基、异丙氧基、二氟甲氧基、羟基和氨基羰基的取代基取代的苯基；或者A₂是被甲氧基取代的吡啶-3-基或吡啶-4-基；

p)P是-CH₂-；

q)L₂是选自下列的二价基团

-NH-C_5-7环烷基-(CH₂)_0-2-；前提是当C_5-7环烷基是环己基时，Q在相对于-NH-位置的2-或顺式-4-位连接；

-X₁-C_2-6烷基-；

-X₂-(CH₂)_0-4-；

-X₁-(CH₂)_2-3-X₃-(CH₂)_2-3-；

-NHC(＝O)-(CH₂)_1-4-；和

-X₁-CH(R^x)-(CR^xR^y)_1-5-；

其中X₁是-NH-或直接键；

X₂是-CH＝CH-；X₃是O、S、NH或C＝O；R^x和R^y独立是H或C_1-4烷基；

前提是在任何情况下L₂长度都不超过7个原子；

r)L₂是选自下列的二价基团

-NH-C_5-6环烷基-(CH₂)_0-2-；前提是当C_5-6环烷基是环己基时，Q在相对于-NH-位置的2-或顺式-4-位连接；

-NH-C_2-6烷基-；和

-NH-(R，R-CH(CH₃)CH(CH₃))-；

s)L₂是选自下列的二价基团

-NH-环己基-(CH₂)_0-2-，Q在相对于-NH-位置的2-或顺式-4-位连接；

-NH-C_2-5烷基-；和

-NH-(R，R-CH(CH₃)CH(CH₃))-；

t)L₂是选自下列的二价基团

-NHCH₂CH₂-；和

-NH-(R，R-CH(CH₃)CH(CH₃))-；

u)m是0；

v)R^a和R^d独立是氢或C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：羟基、C_1-4烷氧基、氟、氨基、C_1-4烷基氨基、二C_1-4烷基氨基和C_1-4烷基羰基；或者R^a和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

w)R^a和R^d独立是氢或C_1-3烷基，其中C_1-3烷基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：羟基、C_1-4烷氧基、氟、氨基、C_1-4烷基氨基、二C_1-4烷基氨基和C_1-4烷基羰基；或者R^a和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

x)R^a和R^d独立是氢、甲基或乙基；或者R^a和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

y)R^a和R^d独立是氢、甲基或乙基；

z)R^b是氢、C_1-6烷基、C_2-6烷氧基羰基或氰基；或者R^b和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

aa)R^b是氢或C_1-4烷基；或者R^b和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

bb)R^b是氢；

cc)R^c是氢、C_1-10烷基、C_2-10链烯基、C_3-7环烷基、金刚烷基、氨基、芳基羰基、芳基、杂芳基或杂环基；其中C_1-10烷基任选被1-2个独立选自C_1-4烷氧基、三氟甲基、芳基、杂芳基和杂环基的取代基取代；其中任何含芳基或杂芳基的R^c取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、氟代C_1-6烷基、氟代C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、硝基、甲硫基、羟基和氰基；或者R^c和R^d与它们连接的原子结合一起形成环内任选含有1-2个O或S杂原子的5-8元单环，所述环任选被氧代取代；

dd)R^c是氢、C_1-6烷基、C_2-6链烯基、C_3-7环烷基、金刚烷基、杂环基、芳基羰基、苯基或杂芳基；其中C_1-6烷基任选被1-2个独立选自C_1-3烷氧基、三氟甲基、苯基、杂芳基和杂环基的取代基取代；其中任何含芳基、苯基或杂芳基的R^c取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、氟代C_1-6烷基、氟代C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、硝基、甲硫基、羟基和氰基；或者R^c和R^d与它们连接的原子结合一起形成5-8元单环，所述环任选被氧代取代；

ee)R^c是氢、C_1-6烷基、C_2-6链烯基、C_3-7环烷基、杂环基、苯基羰基、苯基或杂芳基；其中C_1-6烷基任选被1-2个独立选自C_1-3烷氧基、苯基、吡啶基、呋喃基和四氢呋喃基的取代基取代；其中任何含苯基或杂芳基的R^c取代基任选被1-2个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氯、氟、溴、氟代C_1-3烷氧基、硝基、甲硫基、羟基和氰基；或者R^c和R^d与它们连接的原子结合一起形成5-8元单环；

ff)R^c是氢、C_1-4烷基、C_2-4链烯基、环己基、苯基羰基、苯基、嘧啶基、呋喃基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯基或吡啶基；其中C_1-4烷基任选被1-2个独立选自C_1-3烷氧基、苯基、吡啶基、呋喃基和四氢呋喃基的取代基取代；其中任何含苯基或杂芳基的R^c取代基任选被1-2个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氯、氟、溴、氟代C_1-3烷氧基、硝基、甲硫基、羟基和氰基；或者R^c和R^d与它们连接的原子结合一起形成5-8元单环；

gg)R^c是氢、C_1-4烷基、C_2-4链烯基、环己基、苯基羰基、苯基、嘧啶基、呋喃基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯基或吡啶基；其中C_1-4烷基任选被1-2个独立选自甲氧基、苯基、吡啶基、呋喃基和四氢呋喃基的取代基取代；其中任何含苯基或杂芳基的R^c取代基任选被1-2个独立选自下列的取代基取代：C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、氯、氟、溴、三氟甲氧基、硝基、羟基和氰基；或者R^c和R^d与它们连接的原子结合一起形成5-6元单环；

前提是任何情况下，只有一个环任选存在于R^a和R^b、R^b和R^c或R^c和R^d之间；

以及上文a)-gg)的组合。

本发明一方面涉及含式(Ia)化合物及其对映体、非对映体、互变异构体、溶剂合物和药学上可接受的盐的组合物：

式(Ia)

其中：

A₁是氢、芳基、杂芳基、C_5-8环烷基或杂环基，前提是A₁不同于哌啶-4-基、N-叔丁氧基羰基-哌啶-4-基或N-甲基-哌啶-3-基；其中A₁(不同于氢)的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1- ₆烷基、羟基(C_1-6)烷基、C_1-6烷氧基、卤素、硝基、卤代C_1-6烷基、卤代C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷氧基羰基、氨基、氰基、羟基、氨基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基羰基和C_1-6烷基羰基；

L₁是任选被1-3个独立选自C_1-6烷基、C_2-6链烯基、C_2-6炔基和卤素的取代基取代的-(CH₂)_r-；前提是当A₁是氢时，r大于或等于4；

r是整数1-5；

A₂是氢、苯基、不同于未被取代的吡啶-2-基的杂芳基或者C_3-8环烷基；其中苯基任选在间位或对位，以及A₂(不同于氢和苯基)的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、卤代C_1-6烷基、卤代C_1-6烷氧基、芳基(C_1-6)烷氧基、苯基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷氧基羰基、氨基、氰基、羟基、硝基、氨基羰基、C_1-6烷基羰基氨基和非稠合的C_3-6环烷氧基；前提是至多两个A₂上的取代基是芳基(C_1-6)烷氧基、苯基或非稠合的C_3-6环烷氧基；

W是N或CH；

L₂是选自下列的二价基团

-NH-C_5-7环烷基-(CH₂)_0-2-，前提是当C_5-7环烷基是环己基时，Q在相对于-NH-位置的2-或顺式-4-位连接；

-X₁-C_2-6烷基-；

-X₂-(CH₂)_0-4-；

-X₁-(CH₂)_2-3-X₃-(CH₂)_2-3-；

-NHC(＝O)-(CH₂)_1-4-；和

-X₁-CH(R^x)-(CR^xR^y)_1-5-；

其中X₁是-NH-或直接键；

前提是任何情况下L₂的长度都不超过7个原子；

m是0或1；

G是-C(＝NR^b)NR^cR^d；

R^a和R^d独立是氢或C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：羟基、C_1-4烷氧基、氟、氨基、C_1-4烷基氨基、二C_1-4烷基氨基和C_1-4烷基羰基；或者R^a和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

R^b是氢、C_1-6烷基、C_2-6烷氧基羰基或氰基；或者R^b和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

R^c是氢、C_1-10烷基、C_2-10链烯基、C_3-7环烷基、金刚烷基、氨基、芳基羰基、芳基、杂芳基或杂环基；其中C_1-10烷基任选被1-2个独立选自C_1-4烷氧基、三氟甲基、芳基、杂芳基和杂环基的取代基取代；其中任何含芳基或杂芳基的R^c取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、氟代C_1-6烷基、氟代C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、硝基、甲硫基、羟基和氰基；或者R^c和R^d与它们连接的原子结合一起形成5-8元单环，环内任选含有1-2个O或S杂原子，所述环任选被氧代取代；

本发明另一方面涉及式Ia化合物及其对映体、非对映体、互变异构体、溶剂合物和药学上可接受的盐，其中：

A₁是氢、芳基、杂芳基、C_5-8环烷基或不同于哌啶基的杂环基；其中A₁(不同于氢)的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、羟基(C_1-6)烷基、C_1-6烷氧基、卤素、硝基、卤代C_1-6烷基、卤代C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷氧基羰基、氨基、氰基、羟基、氨基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基羰基和C_1-6烷基羰基；

L₁是任选被选自C_1-4烷基、C_2-4链烯基和C_2-4炔基的取代基取代的-(CH₂)_r-；前提是当A₁不同于氢时，r是1-3；或者当A₁是氢时，r是4或5；

A₂是苯基、呋喃基、吡啶-3-基或吡啶-4-基；其中苯基任选在间位或对位、以及A₂(不同于苯基)的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、卤素、卤代C_1-3烷氧基、C_1-3烷硫基、羟基、氨基、氨基羰基、C_1-3烷基羰基氨基和非稠合的C_3-6环烷氧基；前提是至多两个A₂上的取代基是非稠合的C_3-6环烷氧基；

P是-CH₂-；

W是N或CH；

L₂是选自下列的二价基团

-NH-C_5-6环烷基-(CH₂)_0-2-，前提是当C_5-6环烷基是环己基时，Q在相对于-NH-位置的2-或顺式-4-位连接；

-NH-C_2-6烷基-；和

-NH-(R，R-CH(CH₃)CH(CH₃))-；

m是0或1；

G是-C(＝NR^b)NR^cR^d；

R^a和R^d独立是氢或C_1-3烷基，其中C_1-3烷基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：羟基、C_1-4烷氧基、氟、氨基、C_1-4烷基氨基、二C_1-4烷基氨基和C_1-4烷基羰基；或者R^a和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

R^b是氢或C_1-4烷基；或者R^b和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

R^c是氢、C_1-6烷基、C_2-6链烯基、C_3-7环烷基、金刚烷基、杂环基、芳基羰基、苯基或杂芳基；其中C_1-6烷基任选被1-2个独立选自C_1-3烷氧基、三氟甲基、苯基、杂芳基和杂环基的取代基取代；其中任何含芳基、苯基或杂芳基的R^c取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、氟代C_1-6烷基、氟代C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、硝基、甲硫基、羟基和氰基；或者R^c和R^d与它们连接的原子结合一起形成5-8元单环，所述环任选被氧代取代；

A₁是取代的苯基、苯并呋喃基、噻唑基或苯硫基；其中苯基被以及苯并呋喃基、噻唑基和苯硫基任选被1-2个独立选自下列的取代基取代：C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、卤素、硝基、卤代C_1-4烷基、卤代C_1-4烷氧基、甲硫基、氨基、氰基和C_1-4烷基羰基；

L₁是任选被选自甲基和烯丙基的取代基取代的-(CH₂)_r-，r是1-3；

A₂是苯基、吡啶-3-基或吡啶-4-基，其中苯基任选在间位或对位以及A₂(不同于苯基)的取代基任选被1-2个独立选自甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、羟基、氨基羰基和甲基羰基氨基的取代基取代；前提是当A₁是3，4-二氯-苯基时，A₂不同于在间位被三氟甲氧基取代的苯基；

P是-CH₂-；

W是N或CH；

L₂是选自下列的二价基团

-NH-C_2-5烷基-；和

-NH-(R，R-CH(CH₃)CH(CH₃))-；

m是0；

G是-C(＝NR^b)NR^cR^d；

R^a和R^d独立是氢、甲基或乙基；或者R^a和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

R^b是氢；

R^c是氢、C_1-6烷基、C_2-6链烯基、C_3-7环烷基、杂环基、苯基羰基、苯基或杂芳基；其中C_1-6烷基任选被1-2个独立选自C_1-3烷氧基、苯基、吡啶基、呋喃基和四氢呋喃基的取代基取代；其中任何含苯基或杂芳基的R^c取代基任选被1-2个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氯、氟、溴、氟代C_1-3烷氧基、硝基、甲硫基、羟基和氰基；或者R^c和R^d与它们连接的原子结合一起形成5-8元单环；

A₁是苯基或苯并呋喃基；其中苯基在4-位或3和4-位被1-2个独立选自下列的取代基取代：乙基、甲氧基、氟、氯、硝基、二氟甲氧基和甲硫基；

L₁是被甲基和烯丙基任选取代的-CH₂-；

A₂是在对位被选自甲氧基、乙氧基、异丙氧基、二氟甲氧基、羟基和氨基羰基的取代基取代的苯基；或者A₂是被甲氧基取代的吡啶-3-基或吡啶-4-基；

P是-CH₂-；

W是N或CH；

L₂是选自下列的二价基团

-NHCH₂CH₂-；和

-NH-(R，R-CH(CH₃)CH(CH₃))-；

m是0；

G是-C(＝NR^b)NR^cR^d；

R^a和R^d独立是氢、甲基或乙基；

R^b是氢；

R^c是氢、C_1-4烷基、C_2-4链烯基、环己基、苯基羰基、苯基、嘧啶基、呋喃基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯基或吡啶基；其中C_1-4烷基任选被1-2个独立选自C_1-3烷氧基、苯基、吡啶基、呋喃基和四氢呋喃基的取代基取代；其中任何含苯基或杂芳基的R^c取代基任选被1-2个独立选自C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氯、氟、溴、氟代C_1-3烷氧基、硝基、甲硫基、羟基和氰基的取代基取代；或者R^c和R^d与它们连接的原子结合一起形成5-8元单环。

本发明另一方面涉及表1的式(I)化合物，其中A₁、L₁、D、W、L₂和Q如本发明定义。

表1

本发明化合物还可以药学上可接受的盐形式存在。用作药物时，本发明化合物的盐指无毒性“药学上可接受的盐”(参考International J.Pharm.，1986，33，201-217；J.Pharm.Sci.，1997(Jan)，66，1，1)。然而，可用本领域技术人员熟知的其它盐制备本发明的化合物或其药学上可接受的盐。典型有机或无机酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸、苯甲酸、杏仁酸、甲磺酸、羟乙磺酸、苯磺酸、草酸、扑酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、环己烷磺酸、水杨酸、糖精酸或三氟乙酸。典型有机或无机碱包括但不限于碱性或阳离子盐如苄星、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺、普鲁卡因、铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌。

本发明的范围包括本发明化合物的前药。一般来讲，此类前药将是化合物的功能衍生物，在体内很容易转化为所需化合物。因此，在本发明的治疗方法中，术语“给药”应包括用具体公开的化合物或者没有具体公开但给予患者后在体内转化为特定化合物的化合物治疗各种所述疾病。选择和制备合适的前药衍生物的常规方法描述于如“Design of Prodrugs”H.Bundgaard编辑，Elsevier，1985。

当本发明化合物具有至少一个手性中心时，它们可能因此作为对映体存在。当化合物具有两个或多个手性中心时，它们可另外作为非对映体存在。应理解所有此类异构体及其混合物都涵盖在本发明范围之内。而且，一些化合物的晶形可存在多晶型，这也包括在本发明之内。另外，一些化合物可与水(即水合物)或常用有机溶剂形成溶剂合物，此类溶剂合物意欲涵盖在本发明范围之内。

当制备本发明化合物的过程产生立体异构体混合物时，可用常规方法如制备层析分离这些异构体。可将化合物制备成外消旋形式，或者可通过对映特异性合成或通过拆分制备个别对映体。例如可通过标准方法将化合物拆分成它们的组分对映体，如通过用旋光活性酸如(-)-二-对甲苯酰基-d-酒石酸和/或(+)-二-对甲苯酰基-1-酒石酸形成盐形成非对映体对，接着分步结晶，得到游离碱。还可通过形成非对映体酯或酰胺，接着层析分离和除去手性助剂拆分化合物。或者，可用手性HPLC柱拆分化合物。

在制备本发明化合物的任何过程中，可能必须和/或需要保护任何关注的分子上的敏感或反应基团。这可通过常规保护基团的方法完成，如描述于Protective Groups in Organic Chemistry，编辑J.F.W.McOmie，Plenum Press，1973；和T.W.Greene & P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley & Sons，1991。保护基团可在方便的后续阶段用本领域已知的方法脱除。

即使可以单独给予本发明化合物(包括其药学上可接受的盐和药学上可接受的溶剂合物)，但它们通常与根据预期给药途径和标准药用和兽医实践选择的药用载体、赋形剂或稀释剂混合给药。因此，本发明涉及含有式(I)化合物以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药用和兽医组合物。

例如，在本发明的药用和兽医组合物中，本发明化合物可与任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂层剂和/或增溶剂混合。

化合物的片剂或胶囊剂可按需一次给予一个或两个或多个。还可能给予化合物的持续释放制剂。

或者，通式(I)化合物可通过吸入或者采用栓剂或阴道栓剂形式给药，或者它们可采用洗剂、溶液、霜剂、软膏剂或扑粉剂形式局部应用。经皮给药的备选方法是用皮肤贴剂。例如可将它们加入由聚乙二醇或液状石蜡的水性乳剂组成的霜剂中。还可将它们以1-10％重量的浓度加入由需要的稳定剂和防腐剂以及白蜡或白软石蜡基质组成的软膏剂中。

在一些应用时，优选组合物以含赋形剂如淀粉或乳糖的片剂形式，或者以胶囊剂或胚珠(单独或与赋形剂混合)形式，或者以含矫味剂或着色剂的酏剂、溶液或混悬液形式口服给药。

组合物(以及单独化合物)还可胃肠外例如海绵窦内、静脉内、肌内或皮下注射。在这种情况下，组合物将包含合适的载体或稀释剂。

胃肠外给药时，最好用无菌水溶液形式的组合物，可包含其它物质如足量盐或单糖使溶液与血液等渗。

口腔或舌下给药时，可给予片剂或锭剂形式组合物，可用常规方法配制。

再例如，含有一种或多种本文描述的本发明化合物作为活性成分的药用和兽医组合物可通过使一种或多种化合物与药用载体根据常规制药配料方法均匀混合制备。根据所需给药途径(如口服、胃肠外)可使用各种形式的载体。因此对于液体口服制剂如混悬液、酏剂和溶液，合适的载体和添加剂包括水、二醇、油、醇、矫味剂、防腐剂、稳定剂、着色剂等；对于固体口服制剂，如散剂、胶囊剂和片剂，合适的载体和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。固体口服制剂还可用如糖的物质包衣或者肠溶包衣，以调节主要吸收部位。对于胃肠外给药，载体将通常由无菌水及其它可加入以增加溶解度或防腐作用的成分组成。注射用混悬液或溶液还可用水载体连同适当添加剂一起制备。

最好本发明化合物可以单次日剂量给药，或者可将总的日剂量分成每天2、3或4次分剂量给药。而且，本发明化合物可采用鼻内形式通过局部使用合适的鼻内溶媒、或者通过本领域技术人员熟知的透皮贴剂给药。当然，为了以透皮给药系统形式给药，在剂量方案过程中给予的剂量将是连续而不是间断的。

对于一般(70kg)人而言，本化合物或其药用组合物使用的治疗有效量包含的剂量范围每天从约0.001mg至约1,000mg，特别是从约0.1mg至约500mg，或更特别从约1mg至约250mg活性成分。

对于口服给药，优选提供片剂形式的药用组合物包含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250和500毫克活性成分，根据症状调节给予受治疗主体的剂量。

本领域技术人员还清楚本发明的活性化合物或其药用组合物的治疗有效量将根据所需效果而不同。因此，很容易确定将给予的最佳剂量，根据所用具体化合物、给药方式、制剂强度以及疾病的进展度而不同。另外，包括主体年龄、体重、饮食和给药时间在内的与具体受治疗主体有关的因素，都需要将剂量调节至适当治疗水平。因此以上剂量只是一般情况下的例子。当然，在个别情况下可能出现更高或更低剂量，这都在本发明范围之内。

当需要在有需要的主体中将本发明化合物用作促动力素受体拮抗剂时，都可按照上述组合物和剂量方案或者通过本领域已建立的那些组合物和剂量方案给予本发明化合物。

本发明还提供药用或兽医包装或试剂盒，包括一个或多个装满一种或多种本发明的药用和兽医组合物成分的容器。任选附随此类容器的是管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构给出的标识，该标识表示得到机构批准制造、使用或销售用于人体给药。

作为PK1受体的拮抗剂，式(I)化合物可用于治疗或预防哺乳动物疾病或病症的方法，其中通过拮抗一种或多种PK1受体的活性治疗该疾病或病症。此类方法包括给予需要这样治疗或预防的哺乳动物治疗有效量的式(I)化合物、盐或溶剂合物。式(I)化合物可用于预防或治疗胃肠道(GI)疾病、胃肠道和生殖器官癌症以及疼痛的方法。本发明范围内胃肠道疾病的实例包括但不限于：肠易激综合征(IBS，包括以腹泻为主，以及交替性腹泻/便秘形式的IBS)、炎性肠病(IBD，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)和GERD以及由病原体引起的分泌性肠紊乱。本发明范围内癌症的实例包括但不限于：睾丸癌、卵巢癌、Leydig细胞癌和小肠或大肠癌。包括在本发明范围内的疼痛实例是但不限于常见于IBS和IBD的痛觉过敏。

虽然本发明包括含一种或多种式(I)化合物的组合物，但本发明也包括含有用于制备式(I)化合物的中间体的组合物。

本发明化合物的典型IUPAC命名用ACD/LABS SOFTWARE^TMIndex Name Pro Version 4.5命名软件程序产生，该程序由AdvancedChemistry Development，Inc.，Toronto，Ontario，Canada提供。

以下是用于本说明书特别是流程和实施例中的缩写：

Cpd或Cmpd＝化合物

d＝天

DIAD＝偶氮二甲酸二异丙酯

DIPEA或DIEA＝二异丙基乙胺

DMEM＝Dulbecco′s改良Eagle培养基

DMF＝N，N-二甲基甲酰胺

DMSO＝二甲基亚砜

EtOAc＝乙酸乙酯

EtOH＝乙醇

h＝小时

M＝摩尔

MeCN＝乙腈

MeOH＝甲醇

min＝分钟

NaOMe＝甲醇钠

PyBOP＝六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-鏻

rt/RT＝室温

THF＝四氢呋喃

TFA＝三氟乙酸

通用流程

本发明的典型化合物可根据下文描述然后用流程举例说明的通用合成法合成。已知用于以下流程的原料和试剂可市售获得或者用本领域技术人员已知的方法制备。既然流程是举例说明，所以本发明不应视为受限于表达的化学反应和条件。

流程A说明本发明化合物的通用合成，其中L₂不同于-NHC(＝O)-(CH₂)_1-4-和-X₂-(CH₂)_0-4-，L₂的X₁是NH。可在极性溶剂如甲醇中用甲基化试剂如甲基碘使式A1化合物甲基化，得到式A2化合物。可在过量叔胺如二异丙基乙胺存在下使式A2化合物与适当取代的异氰酸酯如N-氟羰基异氰酸酯缩合，得到式A3三嗪。

流程A

可通过技术人员已知的常规化学方法，用式A4化合物将式A3化合物烷基化，其中LG₁是离去基团。例如，当LG₁是羟基时，可在非醇类极性溶剂如THF或二氯甲烷中在三苯膦存在下，用偶合剂如DIAD使化合物A4与化合物A3偶合。或者，LG₁可以是卤化物、甲苯磺酸酯等，以便LG₁被化合物A3的氨基部分置换，得到式A5化合物。

式A5化合物可用式A6化合物(其中X₁是NH且m是0)进一步亲核取代加工，得到式A7化合物。技术人员清楚当L₂不对称时，可能需要氮保护基团避免竞争反应。可通过用式A8的活性脒(其中LG₂是离去基团，如卤化物、醇化物、咪唑或吡唑、活性醇化物等)处理式A7化合物的末端胺插接式(I)的G-取代基，得到其中m是0的式(I)化合物IA。或者，当m＝1时，可通过用式A9化合物处理式A7化合物加入氧基胍取代基，形成其中m是1的式(I)化合物(I)A。

流程B说明本发明化合物的通用合成，其中L₂是-NHC(＝O)-(CH₂)_1-4-。可通过用氨或其它氨源如氢氧化铵处理，将式A5化合物转化为其对应的胺，得到式B1化合物。可通过常规化学方法用式B2化合物将化合物B1的氨基酰基化，其中LG₃是离去基团，如当B2是酰基氯时为卤化物，当B2是羧酸时为羟基，当B2是酐时为羧酸烷基酯，或者当B2是酰基咪唑时为咪唑。或者，B2可以是活性酯等。式B2化合物的K取代基是本文限定的离去基团LG₁，或者K是用适当的氨基保护基团(PG)保护的R^a-取代的氨基。

流程B

为了制备式B4化合物，可将式B3化合物用技术人员已知的试剂和方法进行N-脱保护(当K是-NR^a(PG)时)，或者可用胺H₂NR^a(当K是LG₁时)进行亲核置换。然后将所得式B4的胺用式A8的活性脒处理，得到式(I)的化合物(I)B。

流程C描述本发明化合物的通用合成，其中L₂的X₁是直接键。可将式C1化合物与式C2异氰酸酯缩合，得到式C3化合物，加热后得到式C4的三嗪。可将式C4化合物的氨基用式C5烷化剂适当取代，得到式C6化合物。用本文描述的方法将G-取代基插接入式C6化合物中，得到式(I)的化合物(I)C。

流程C

流程D说明本发明化合物的通用合成，其中W是CH，L₂不同于-NHC(＝O)-(CH₂)_1-4-，L₂的X₁是NH。通过加热使式D1化合物与式D2化合物缩合，其中LG₂如本文限定，形成式D3化合物。然后可将式D3化合物用磷酰氯、PCl₅等处理和加热，得到式D4化合物。可通过常规烷基化方法用式C5化合物插接-P-A₂。可进一步加工式D5化合物，用胺A6(当X₁是NH时)进行氯化物的亲核置换，得到式D6化合物。可用本文描述的化学方法再加工，得到式(I)的化合物(I)D。

流程D

流程E说明本发明化合物的通用合成，其中W是CH且L₂是-NHC(＝O)-(CH₂)_1-4-。可将式D5化合物用氨或其它氨源如氢氧化铵处理，得到对应的式E1氨基化合物。用式B2化合物将氨基酰基化，用本文描述的方法再加工成式(I)的化合物(I)E。

流程E

流程F说明本发明化合物的通用合成，其中W是CH，L₂的X₁是直接键，L₂是任何包含X₁的基团。可在低级烷醇存在下，用碱性条件使式F1化合物与式F2化合物缩合，形成式F3化合物。可将式F3化合物与式F4的脲缩合，形成式F5的环状化合物。

流程F

可通过技术人员已知的常规化学方法用烷化剂C5使式F5化合物烷基化，制备式F6化合物。用胺H₂NR^a亲核置换LG₁得到式F7化合物，可用本文描述的方法进一步加工将G-取代基包含在内，得到式(I)的化合物(I)F。

流程G说明本发明化合物的通用合成，其中W是N且L₂是-X₂-(CH₂)_0-4-。可将式G1化合物用碱处理然后用式A4化合物烷基化，得到式G2化合物。在碱性水溶液如氢氧化物存在下，用过氧化氢处理式G2化合物，得到式G3的双酰氨基化合物，然后使其与式G4化合物缩合，形成式G5的三嗪化合物。

流程G

通过使用技术人员已知的常规试剂和方法，可将式G5化合物的羧基还原成对应的醇，接着氧化为式G6的醛。可通过偶合化学法或标准烷基化化学法用式C5化合物取代仲氨基，得到式G7化合物。化合物的醛部分可参与与式G8化合物(其中PG如前限定)的Wittig烯化反应，得到式G9化合物，其中L₂包括链烯基X₂。后来脱除氨基保护基团，接着脒基化，得到式(I)的化合物(I)G。

流程H说明本发明化合物的通用合成，其中W是CH且L₂是-X₂-(CH₂)_0-4-。可使式H1化合物与O-烷基化的异脲缩合，得到式H2的环状化合物。可将胺用有机金属碱去质子，接着用式A4化合物处理，插接式(I)的-L₁A₁取代基。将烷基化化合物H2进行O-脱甲基得到式H3化合物。通过常规氧化化学法，可将H3的甲基取代基转化为其对应的醛，得到式H4化合物。用流程G描述将化合物G7转化为式(I)G化合物的合成步骤可将醛加工成其中L₂是-X₂-(CH₂)_0-4-的式(I)化合物。

流程H

具体实施例

按照以下各实施例和反应顺序制备代表本发明的具体化合物；描述反应顺序的实施例和流程图只用于例证，帮助理解本发明，无论如何不应视为限制稍后权利要求中提出的本发明。还可将本化合物用作后续实施例的中间体，以制备另外的本发明化合物。未试图优化任何反应得到的产率。本领域技术人员将清楚如何通过常规改变反应时间、温度、溶剂和/或试剂增加此类产率。

试剂市售获得。氢原子的核磁共振(NMR)谱在Bruker AM-360(360MHz)光谱仪上用(TMS)为内标物在标明的溶剂中测定。该值以TMS以下的百万分率表示。质谱(MS)用电喷射法在MicromassPlatform LC光谱仪或Agilent LC光谱仪上测定。微波加速反应用CEMDiscover或Personal Chemistry Smith Synthesizer微波仪器进行。可用X射线晶体学或本领域技术人员已知的其它方法将立体异构化合物表征为外消旋混合物或其单独的非对映体和对映体。除非另有标明，否则用于实施例的材料很容易从供应商获得或者用化学合成领域技术人员已知的标准方法合成。除非另有标明，否则实施例之间变化的取代基是氢。

实施例1

N-{2-[5-(4-乙基-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍(化合物46)

A.1-(4-甲氧基-苄基)-6-甲基硫烷基-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(化合物1c)。向MeOH(40mL)中的(4-甲氧基-苄基)硫脲(2.00g，10.1mmol)内加入甲基碘(0.64mL，10.1mmol)。在室温下将反应物搅拌24小时。将反应混合物浓缩，得到2.00g粗化合物(1b)，不需再纯化即可用于下一步。

B.向二氯甲烷(40mL)中的化合物1b(3.6g，17.1mmol)内加入过量二异丙基乙胺(6.61g，51.3mmol)。将反应混合物冷却至0℃。滴加一部分N-氯羰基异氰酸酯(1.78g，17.1mmol)。让反应混合物缓慢温热至室温。24小时后，加入水，将反应混合物用乙酸乙酯提取。分离各相，将有机层用硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将甲醇加入粗产物内，将固体真空过滤收集，得到化合物1c(1.5g)。¹H NMR(DMSO-d₆)δ2.45(3H，s)，3.73(3H，s)，4.98(2H，s)，6.89-6.92(2H，d，J＝8.5Hz)，7.22-7.25(2H，d，J＝8.5Hz)，11.58(1H，s)。

C.3-(4-乙基-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-6-甲基硫烷基-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(化合物1d)。向四氢呋喃中的化合物1c(0.1g，0.35mmol)内加入4-乙基苄醇(0.049g，0.35mmol)、三苯膦(0.19g 0.71mmol)和偶氮二甲酸二异丙酯(0.087g，0.43mmol)。在室温下将反应物搅拌64小时。使反应混合物吸收在乙酸乙酯中，用水洗涤，分离各相。将有机层用硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将所得材料用ISCO自动化系统用正相层析纯化，得到化合物1d(0.14g)，为白色固体。

D.6-(2-氨基-乙基氨基)-3-(4-乙基-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(化合物1e)。向甲苯中的1-(4-甲氧基-苄基)-6-甲基硫烷基-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(0.14g，0.33mmol)内加入过量乙二胺(0.10g，1.76mmol)。在110℃下将反应混合物加热18小时。将反应混合物冷却至室温，用水稀释，用乙酸乙酯提取。分离各相，将有机层用硫酸钠干燥，过滤和浓缩。所得化合物1e(0.11g)不需再纯化即可用于下一步。

E.N-{2-[5-(4-乙基-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍(化合物46)。向化合物1e(0.11g，0.26mmol)在乙腈(4mL)中的混合物内加入过量二异丙胺(0.069g，0.53mmol)和1H-吡唑-1-羧脒(carboxamidine)盐酸盐化合物1f(0.039g，0.26mmol)。在室温下将反应混合物搅拌18小时。从反应混合物中沉淀出白色固体，过滤收集，得到标题化合物46(通过HPLC纯度为98％，0.0119g)。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ1.01-1.04(3H，t，J＝7.5Hz)，2.41-2.47(2H，q，J＝7.4Hz)，3.26-3.16(4H，m)，3.61(3H，s)，4.75(2H，s)，4.93(2H，s)，6.77-6.79(2H，d，J＝8.64Hz)，7.00-7.12(6H，m)，7.55(1H，m)，8.06(1H，m).

使用实施例1的方法以及本领域技术人员已知的合适试剂、原料和纯化方法，制备下列本发明化合物：化合物39，45，77，78，79，80，82，83，109，111，112，123，124，131，136，137，145和146。

实施例2

N-{2-[5-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍(化合物17)

A.((4-氟苄基)氨基)羰基)carbamimidothioic acid甲基酯(化合物2a)。使硫酸S-甲基异硫脲鎓(10.0g，35.9mmol)溶于8∶2∶1 MeOH/H₂O/THF中，用3N NaOH(12mL，35.9mmol)处理混合物。然后将溶液冷却至0℃，用30分钟滴加4-氟苄基异氰酸酯(5.43g，35.9mmol)。将反应物搅拌过夜，逐渐温热至室温。然后将混合物用饱和NH₄Cl水溶液洗涤，用二氯甲烷提取。将合并的有机相用Na₂SO₄干燥，过滤和减压浓缩。所得残留物用Isco快速柱(20％EtOAc-100％EtOAc/庚烷)纯化，得到化合物2a(4.1g)，为白色粉末状物。

B.5-(甲硫基)-3，7-二氧代-1-(4-氟苄基)-2-氧杂-4，6，8-三氮杂壬-4-烯-9-酸甲基酯(化合物2b)。用三乙胺(3.08mL，22.1mmol)处理化合物2a(4.1g，17.0mmol)的二氯甲烷溶液，将混合物冷却至-10℃。用15分钟通过加液漏斗滴加氯甲酸甲酯(2.62mL，34.0mmol)，将反应物搅拌4小时，逐渐温热至室温。然后将溶液用饱和NH₄Cl水溶液洗涤，用二氯甲烷提取。将合并的有机相用Na₂SO₄干燥，过滤和浓缩。所得残留物用Isco快速柱(5％MeOH)纯化，得到化合物2b(3.63g)，为白色固体。

C.3-(4-氟-苄基)-6-甲基硫烷基-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(化合物2c)。使化合物2b(3.63g，12.1mmol)溶于MeOH(100mL)中，用NaOMe/MeOH(4.6M，2.90mL，13.3mmol)处理溶液，在室温下将反应物搅拌1小时。加入NaOMe后形成白色沉淀物。将反应混合物用1N HCl(50mL)稀释，过滤收集所得沉淀物。在160℃下用二甲苯将固体减压干燥，得到化合物2c(3.6g)，为其HCl盐。

D.3-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-6-甲基硫烷基-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(化合物2d)。使化合物2c(500mg，1.65mmol)溶于THF中，用4-甲氧基苄醇(227mg，1.65mmol)、三苯膦(866mg，3.30mmol)和偶氮二甲酸二异丙酯(334mg，1.65mmol)处理。在室温下将反应物搅拌过夜。用HPLC检测反应物后，使溶液分配在水和乙酸乙酯之间。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤和还原。将粗混合物用Isco快速柱(20％乙酸乙酯-100％乙酸乙酯/庚烷，40分钟)纯化，得到390mg化合物2d，为白色固体。¹H NMR(DMSO，d₆)δ3.29(s，3H)，3.74(s，3H)，4.93(s，2H)，5.03(s，2H)，6.89-6.92(d，2H，J＝8.62)，7.12-7.36(m，4H)，7.38-7.41(m，2H)。

E.4-[3-(3，4-二氯-苄基)-6-甲基硫烷基-2，4-二氧代-3，4-二氢-2H-[1，3，5]三嗪-1-基甲基]-苯甲酰胺(化合物2d)。使化合物2c(二氯苄基)(200mg，0.56mmol)溶于MeCN中，用二异丙基乙胺(0.196mL，113mmol)和4-氯甲基苄基氯(96mg，0.56mmol)处理。将反应混合物加热至80℃，搅拌过夜。将反应混合物用饱和NH₄Cl水溶液洗涤，用乙酸乙酯提取。将合并的有机提取物用Na₂SO₄干燥，过滤和浓缩。所得粗混合物用Isco快速柱(20％-100％EtOAc/庚烷，40分钟)纯化，得到70mg化合物2d，为白色粉末状物。

F.6-(2-氨基-乙基氨基)-3-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(化合物2e)。用乙二胺(302mg，5.03mmol)处理化合物2d(390mg，1.01mmol)的甲苯(8mL)溶液。将反应物加热至90℃，搅拌过夜。使混合物分配在水和乙酸乙酯之间。将合并的有机层用Na₂SO₄干燥，过滤和还原。还原得到390mg化合物2e，为粗混合物。该粗化合物不需另外纯化即可用于进一步合成。

G.N-{2-[5-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍(化合物17)。使化合物2e的粗混合物(390mg，0.98mmol)溶于乙腈(10mL)中，用吡唑-1-羧脒盐酸盐(143mg，0.98mmol)和二异丙基乙胺(0.340mL，1.95mmol)处理。在室温下让反应继续进行过夜。检查反应混合物显示已形成白色沉淀物，将沉淀物收集和真空过滤干燥。将固体收集，得到307mg化合物17，为白色粉末状物。

M⁺(ES+)＝442.3¹H NMR(DMSO，d₆).δ3.33(m，4H)，3.73(s，3H)，4.89(s，2H)，5.04(s，2H)，6.89-6.91(d，2H，J＝8.66Hz)，7.10-7.16(t，2H，J＝8.91Hz)，7.21-7.24(d，2H，J＝8.63Hz)，7.32-7.36(dd，2H，J＝2.90，5.57Hz)，7.66(s，1H)，8.19(s，1H).

使用实施例2的方法以及本领域技术人员已知的合适试剂、原料和纯化方法，制备下列本发明化合物：化合物1，2，3，4，5，6，7，8，9，11，12，13，14，15，16，18，19，20，21，22，23，24，25，25，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，40，41，50，51，52，57，68，69，85，86，87，129，130，142，144和147。

化合物51：4-[3-(3，4-二氯苄基)-6-(2-胍基乙基氨基)-2，4-二氧代-3，4-二氢-2H-[1，3，5]三嗪-1-基-甲基]-苯甲酰胺

δ(DMSO，d₆)3.30-3.37(m，4H)，4.90(s，2H)，5.10(s，1H)，7.27-7.32(m，3H)，7.51-7.61(m，2H)，7.83(d，2H，J＝9.7Hz)，7.94(s，1H)，8.08(t，1H，J＝3.7Hz).

实施例3

N-{2-[1-苄基-3-(4-甲氧基-苄基)-2，6-二氧代-1，2，3，6-四氢-嘧啶-4-基氨基]-乙基}-胍(化合物81)

A.1-苄基-嘧啶-2，4，6-三酮(化合物3a)。使N-苄基脲(500mg，3.33mmol)溶于乙醇(8mL)中，用丙二酸二乙酯(640mg，4.0mmol)和NaOEt/EtOH(1.29mL，3.1M，4.0mmol)处理混合物。然后在微波条件下在140℃使反应进行30分钟。真空还原溶液，将残留物用乙醇研磨。将所需化合物真空过滤收集，得到化合物3a(500mg)，为白色粉末状物。¹H NMR(DMSO，d₆)δ3.69(s，2H)，4.87(s，2H)，7.21-7.31(m，5H)，11.41(s，1H)。

B.6-氯-3-苄基尿嘧啶(化合物3b)。使化合物3a(500mg，2.29mmol)溶于三氯氧化磷(3.5mL，22.9mmol)中，谨慎地用水(0.103mL，5.7mmol)处理反应混合物。将溶液加热至60℃，搅拌过夜。然后浓缩反应混合物，将残留物倒在2N NaOH(15mL)上。将粗材料真空过滤收集，用乙醇再结晶纯化，得到化合物3b(60mg)，为白色粉末状物。将第二部分300mg粗化合物3b再结晶回收，不需再纯化用于下一反应。¹H NMR(MeOD，d₄).δ5.04(s，2H)，5.87(s，1H)，7.25-7.38(m，5H)。

C.1-(4-甲氧基苄基)-6-氯-3-苄基尿嘧啶(化合物3c)。将化合物3b(60mg，0.25mmol)在THF中的搅拌溶液用4-甲氧基苄醇(35mg，0.25mmol)、三苯膦(133mg，0.51mmol)和偶氮甲酸二异丙酯(51mg，0.25mmol)处理。在室温下将反应物搅拌过夜。将混合物用水洗涤，用乙酸乙酯提取。将合并的有机提取物用Na₂SO₄干燥，过滤和浓缩。所得残留物用Isco快速柱层析(20％EtOAc-100EtOAc/庚烷，40min)纯化，得到化合物3c(60mg)，为白色粉末状物。M⁺(ES+)＝356.9。

D.6-(2-氨基-乙基氨基)-3-苄基-1-(4-甲氧基苄基)-尿嘧啶(化合物3d)。使化合物3c(60mg，0.17mmol)溶于乙醇(3mL)中，用乙二胺(51mg，0.84mmol)处理反应混合物。在微波反应器中用功率最大条件使溶液在140℃下运行20分钟。将溶液用水洗涤，用乙酸乙酯提取。将合并的有机相用Na₂SO₄干燥，过滤和浓缩，得到粗化合物3d(35mg)，为黄色油状物。粗混合物不需再纯化即可用于下一反应。

E.N-{2-[1-苄基-3-(4-甲氧基-苄基)-2，6-二氧代-1，2，3，6-四氢-嘧啶-4-基氨基]-乙基}-胍(化合物81)。按照实施例2步骤G的描述制备标题化合物。将粗材料用反相制备HPLC纯化，得到标题化合物(8.2mg)，为其TFA盐。

M+(ES+)＝422.9.¹H NMR(MeOD，d₄).δ3.19-3.24(m，4H)，3.67(s，3H)，4.77(s，1H)，4.99(s，2H)，5.03(s，2H)，6.77-6.80(d，2H，J＝8.79Hz)，7.01-7.04(d，2H，J＝8.75Hz)，7.12-7.25(m，5H).

使用实施例3的方法以及本领域技术人员已知的合适试剂、原料和纯化方法，制备下列本发明化合物：化合物84。

化合物84：N-{2-[1，3-双-(4-甲氧基-苄基)-2，6-二氧代-1，2，3，6-四氢-嘧啶-4-基氨基]-乙基}-胍

(DMSO，d₆)δ3.25-3.27(m，2H)，3.35-3.37(m，2H)，3.74(s，3H)，3.75(s，3H)，4.83(s，1H)，4.90(s，2H)，5.15(s，2H)，6.81-6.89(m，4H)，7.14-7.24(m，4H)，7.70(s，1H).

实施例4

N-{2-[5-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-N′-(4-氟-苯基)-胍(化合物119)

A.1-(4-氟-苯基)-2-甲基-异硫脲(化合物4b)。向(4-氟-苯基)-硫脲(18.7mg，0.11mmol)的甲醇(0.25mL)溶液内加入碘甲烷(8mL，0.13mmol)。在25℃下将混合物搅拌16小时，然后浓缩为残留物，得到粗化合物4b。

C.N-{2-[5-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-N′-(4-氟-苯基)-胍(化合物127)。向化合物4b的乙醇溶液(0.5mL)内加入化合物2e(40mg，0.10mmol)。在微波反应器中将混合物在160℃照射15分钟，然后浓缩。使所得残留物溶于二甲基亚砜中，用反相层析纯化，得到标题化合物119(18.3mg，0.024mmol)，为其TFA盐。

¹H NMR(甲醇-d₄)：δ7.42(m，2H)，7.24-7.12(m，6H)，7.00(m，2H)，6.89(m，2H)，5.06(s，2H)，5.01(s，2H)，3.75(s，3H)，3.56(m，2H)，3.43(m，2H)；HRMS m/z(M+H)⁺

计算值536.2222，实测值536.2227。

使用实施例4的方法以及本领域技术人员已知的合适试剂、原料和纯化方法，制备下列本发明化合物：化合物

44，53，54，58，61，62，63，64，65，66，67，70，71，72，73，74，75，76，88，89，90，91，92，103，104，105，106，107，108，114，115，116，117，118，120，121，126，127，128，133，134，135，138，139，和140.

化合物58：N-{2-[5-(3，4-二氯-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-N′-异丙基-胍。

¹HNMR(甲醇-d₄)：□7.56(s，1H)，7.45(d，1H，J＝8.3Hz)，7.35(d，1H，J＝8.3Hz)，7.22(d，2H，J＝8.3Hz)，6.89(d，2H，J＝8.4Hz)，5.12(s，2H)，5.01(s，2H)，3.77(s，3H)，3.68(m，1H)，3.57(t，2H，J＝6.3Hz)，3.41(t，2H，J＝6.3Hz)，1.17(d，6H，J＝6.5Hz)；HRMS m/z(M+H)⁺

计算值534.1787，实测值534.1792。

化合物90：N-(4-氰基-苯基)-N′-{2-[5-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍。

¹HNMR(甲醇-d₄)：□7.74(d，2H，J＝8.7Hz)，7.44(m，2H)，7.35(d，2H，J＝8.3Hz)，7.21(d，2H，J＝8.6Hz)，7.01(t，2H，J＝8.8Hz)，6.88(d，2H，J＝8.8Hz)，5.11(s，2H)，5.02(s，2H)，3.75(s，3H)，3.61(t，2H，J＝6.3Hz)，3.51(m，2H)；HRMS m/z(M+H)⁺

计算值543.2268，实测值543.2273。

化合物104：N-{2-[5-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-N′-吡啶-2-基-胍。

¹HNMR(DMSO-d₆)：□10.90(br，1H)，9.78(br，1H)，8.65(br，2H)，8.17(d，1H，J＝5.4Hz)，8.07(m，1H)，7.87(t，1H，J＝7.8Hz)，7.33(m，2H)，7.13(m，4H)，7.05(d，1H，J＝8.2Hz)，6.78(d，2H，J＝8.7Hz)，4.98(s，2H)，4.86(s，2H)，3.67(s，3H)，3.54(m，2H)，3.36(br，2H)；HRMS m/z(M+H)⁺

计算值519.2268，实测值519.2253。

化合物118：N-{2-[5-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-N′-(2-氟-苯基)-胍。

¹H NMR(甲醇-d₄)：□7.47-7.37(m，3H)，7.31(t，1H，J＝7.8Hz)，7.23(m，2H)，7.18(d，2H，J＝8.6Hz)，7.01(t，2H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝8.8Hz)，5.06(s，2H)，5.01(s，2H)，3.76(s，3H)，3.56(t，2H，J＝6.3Hz)，3.45(t，2H，J＝6.3Hz)；HRMS m/z(M+H)⁺

计算值536.2222，实测值536.2227。

化合物134：N-苯甲酰基-N′-{2-[5-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍。

¹H NMR(甲醇-d₄)：□7.93(d，2H，J＝8.2Hz)，7.70(t，1H，J＝7.5Hz)，7.57(t，2H，J＝7.5Hz)，7.41(m，2H)，7.16(d，2H，J＝8.7Hz)，6.97(t，2H，J＝8.7Hz)，6.85(d，2H，J＝8.7Hz)，5.08(s，2H)，4.99(s，2H)，3.70(s，3H)，3.66(t，2H，J＝6.2Hz)，3.55(t，2H，J＝6.2Hz)；HRMS m/z(M+H)⁺

计算值546.2265，实测值546.2259。

实施例5

N-{2-[5-苄基-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-氧基胍(化合物27)

A.用实施例1步骤C描述的方法制备化合物5a，但用苯甲醇代替4-乙基苄醇。

B.向DMSO(1mL)中的3-苄基-1-(4-甲氧基-苄基)-6-甲基硫烷基-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮5a(0.056g，0.15mmol)内加入N-(2-氨基-乙基)-氧基胍二盐酸盐(0.058g，0.30mmol)和Cs₂CO₃(0.098mg，0.30mmol)。在70℃下将反应混合物加热5小时，冷却至室温。再加入N-(2-氨基-乙基)-氧基胍二盐酸盐(0.058g，0.30mmol)和Cs₂CO₃(0.098mg，0.30mmol)，在40℃下将所得浆状物搅拌16小时。将反应混合物冷却至室温，装在1g C-18SPE柱体上，用CH₃CN洗脱。将洗脱液浓缩，所得残留物用梯度为90∶10(乙腈∶水，含0.1％TFA)至90∶10(乙腈∶水，含0.1％TFA)的反相液相层析纯化，得到标题化合物27(通过HPLC纯度为99％，0.0289g)。

¹H NMR(d⁶-DMSO/CDCl₃)δ3.65-3.73(2H，m)，3.78(3H，s)，3.96-4.04(2H，m)，5.01(2H，s)，5.10(2H，s)，6.85(2H，d，J＝8.7Hz)，7.21-7.40(7H.m)，7.74(4H，bs)；7.89(1H，m)11.58(1H，bs)；

C₂₁H₂₆N₇O₄的HRMS m/z计算值440.2046(M+H)，实测值：440.2030。

使用实施例5的方法以及本领域技术人员已知的合适试剂、原料和纯化方法，制备下列本发明化合物：化合物10。

实施例6

4-[4-(2-胍基-乙基氨基)-3-(4-甲氧基-苄基)-2，6-二氧代-3，6-二氢-2H-[1，3，5]三嗪-1-基甲基]-苯甲酸(化合物101)

A.按照实施例1描述的方法制备化合物6a，但用4-羟基甲基-苯甲酸甲酯代替4-乙基苄醇。

B.4-[4-(2-胍基-乙基氨基)-3-(4-甲氧基-苄基)-2，6-二氧代-3，6-二氢-2H-[1，3，5]三嗪-1-基甲基]-苯甲酸(化合物101)。在室温下将化合物6a(20mg，0.028mmol)和氢氧化锂(6mg，0.014mmol)在5mL MeOH和1mL H₂O中的混合物搅拌过夜。之后加入另外6mg氢氧化锂，将混合物再搅拌18小时。接着将混合物浓缩，用HPLC纯化。得到标题化合物101(10mg，0.014mmol)，为其TFA盐。

¹HNMR(GMSO-d₆)δ3.26(m，2H)，3.40(m，2H)，3.68(s，3H)，4.97(s，2H)，5.02(s，2H)，6.79-6.82(d，2H，J＝8.7Hz)，7.06-7.09(d，2H，J＝8.7Hz)，7.35-7.38(d，2H，J＝8.2Hz)，7.86-7.88(d，2H，J＝8.3Hz).

实施例7

N-{2-[5-(4-羟基-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍(化合物110)

A.按照实施例1描述的方法制备化合物7a，但用(4-叔丁氧基-苯基)-甲醇代替4-乙基苄醇。

B.N-{2-[5-(4-羟基-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍(化合物110)。使粗化合物7a(假定约0.24mmol)溶于CH₃CN中。向混合物内加入3mL TFA。在室温下将所得混合物搅拌过夜。将混合物浓缩，用HPLC纯化，得到标题化合物110(31mg，0.046mmol)，为其TFA盐。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ1.25-1.28(m，1H)，3.28-2.31(m，2H)，3.31-3.36(m，2H)，3.73(s，3H)，4.78(s，2H)，4.98(s，2H)，6.65-6.68(d，2H，J＝8.4Hz)，6.89-6.91(d，2H，J＝8.7Hz)，7.11-7.14(d，2H，J＝8.6Hz)，7.52-7.54(d，2H，J＝5.5Hz)，7.99(m，1H).

实施例8

N-{2-[1-(4-甲氧基-苄基)-5-(4-硝基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍(化合物95)

A.1-(4-甲氧基-苄基)-6-甲基硫烷基-3-(4-硝基-苄基)-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(化合物9a)。使化合物1c(200mg，0.73mmol)溶于CH₃CN中，用4-硝基苄基溴(168mg，0.86mmol)和80mL(0.73mmol)二异丙基乙胺处理。将所得混合物加热至87℃，搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。将有机相用MgSO₄干燥，过滤和浓缩。用快速层析纯化残留物，得到化合物8a(44g，0.36mmol)。

B.6-(2-氨基-乙基氨基)-1-(4-甲氧基-苄基)-3-(4-硝基-苄基)-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(化合物9b)。向10mL甲苯中的化合物8a(80mg，0.19mmol)内加入过量乙二胺(64mL，0.95mmol)。将所得混合物加热至90℃26小时。使混合物吸收在乙酸乙酯中，用水洗涤。将有机层分离，用MgSO₄干燥和浓缩。粗产物8b(79mg，0.18mmol，97％产率)不需再纯化即可用于下一步。

C.N-{2-[1-(4-甲氧基-苄基)-5-(4-硝基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍(化合物95)。在室温下将化合物8b(51mg，0.12mmol)、1H-吡唑-1-羧脒盐酸盐(18mg，0.12mmol)和二异丙基乙胺(26μL，0.36mmol)在10mL乙腈中的混合物搅拌几天。将所得混合物浓缩，用液相层析纯化。得到呈白色粉末状物的标题化合物95(17mg，0.036mmol)，为TFA盐。¹H NMR(DMSO-d₆)δ3.65-3.71(m，4H)，3.85(s，3H)，5.30(bm，4H)，6.99-7.02(m，2H)，7.26-7.30(m，2H)，7.54-7.60(m，2H)，8.02-8.20(bs，1H)，8.25(m，2H)。

使用实施例8的方法以及本领域技术人员已知的合适试剂、原料和纯化方法，制备下列本发明化合物：化合物42，43，47，55，56，59，94，97，98，99，100，102和113。

实施例9

N-{2-[5-(4-氨基-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍(化合物125)

将粗化合物95(39mg，0.083mmol)和氯化锡(II)二水合物(94mg，0.42mmol)在20mL EtOH中的混合物加热回流24小时。将溶液浓缩，残留物用HPLC纯化，得到标题化合物125(6.5mg，0.015mmol)，为其TFA盐。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ3.30(m，4H)，3.73(s，3H)，4.80(s，2H)，4.98(s，2H)，6.56-6.78(m，2H)，6.88-6.91(d，2H，J＝8.6Hz)，7.13-7.20(m，4H)，7.43-7.47(m，1H)，7.92-7.99(m，1H).

使用实施例9的方法以及本领域技术人员已知的合适试剂、原料和纯化方法，制备下列本发明化合物：化合物96。

实施例10

3-(3，4-二氯-苄基)-6-[2-(2-亚氨基-咪唑烷-1-基)-乙基氨基]-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(化合物60)

A.按照实施例1步骤C描述的方法制备化合物10a，但用(3，4-二氯-苯基)-甲醇代替4-乙基苄醇。

B.6-[2-(2-氨基-乙基氨基)-乙基氨基]-3-(3，4-二氯-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(化合物10b)。向甲苯(6mL)中的化合物10a(0.400g，0.968mmol)内加入2，2′-二氨基二乙胺(0.300g，2.9mmol)，在110℃下将反应混合物加热4小时。将反应混合物冷却至室温，然后加入水。将混合物用乙酸乙酯提取，用硫酸钠干燥，过滤和浓缩，得到化合物10b(0.46g)，不需再纯化即可用于下一反应。

C.3-(3，4-二氯-苄基)-6-[2-(2-亚氨基-咪唑烷-1-基)-乙基氨基]-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(化合物60)。向苯(2mL)中的化合物10b(0.100g，0.203mmol)内加入溴化氰(0.022g，0.203mmol)。在室温下将反应混合物搅拌2.5小时。使反应混合物浓缩，然后溶于乙腈和甲醇混合物中。将混合物用反相层析纯化，得到标题化合物60(0.017g)。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ3.28-3.59(8H，m)，3.66(3H，s)，4.83(2H，s)，4.92(2H，s)，6.81-6.84(2H，d，J＝8.7Hz)，7.09-7.12(2H，d，8.7Hz)，7.19-7.22(1H，d，J＝8.3Hz)，7.46(1H，s)，7.51-7-54(1H，d，J＝8.3Hz)，7.86-7.95(3H，m).

实施例11

N-{2-[1-(4-羟基-苄基)-5-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍(化合物143)

A.按照实施例2描述的方法制备化合物11a(50mg，0.09mmol)，但在步骤D用[4-(叔丁基-二甲基-甲硅烷基氧基)-苯基]-甲醇代替4-甲氧基苄醇。

B.使化合物11a悬浮于THF(2mL)中，用氟化四丁铵一水合物(24mg，0.09mmol)处理反应混合物。在室温下将溶液搅拌过夜。然后在氮气下浓缩混合物，残留物用反相制备HPLC纯化，得到标题化合物143(3.8mg)，为白色固体。M+(ES+)＝440.1；

¹HNMR(MeOD，d₄).□3.32(m，2H)，3.50(t，2H，J＝7.08Hz)，3.78(s，3H)，4.99(s，2H)，5.03(s，2H)，6.77(d，2H，J＝8.58Hz)，6.85(d，2H，J＝8.71Hz)，7.07(d，2H，J＝8.62Hz)，7.36(d，2H，J＝8.67Hz).

实施例12

N-{2-[1-(4-氨基-苄基)-5-(4-氯-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-胍(化合物122)

A.按照实施例2描述的方法制备化合物12a(50mg，0.09mmol)，但在步骤D用(4-羟基甲基-苯基)-氨基甲酸叔丁酯代替4-甲氧基苄醇。

B.使化合物12a(70mg，0.129mmol)悬浮于二氯甲烷(3mL)中，用三氟乙酸(0.5mL)处理溶液。在室温下将反应物搅拌过夜。在氮气下浓缩混合物，将残留物用反相制备HPLC纯化，得到标题化合物122(35.9mg)，为白色固体。

M+(ES+)＝443.1；¹H NMR(DMSO，d₆).δ3.18-3.25(m，2H)，3.28-3.31(m，2H)，4.76(s，2H)，4.82(s，2H)，4.88(s，2H)，6.75(d，2H，J＝8.25Hz)，7.02(d，2H，J＝8.38Hz)，7.22-7.32(m，4H)，7.53(d，2H，J＝4.02Hz)，7.95(m，1H).

实施例13

N-{2-[5-(3，4-二氯-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-N′-氰基-胍(化合物28)

A.按照实施例1描述的方法制备化合物13a，但在步骤D用3，4-二氯苯甲醇代替4-乙基苄醇。

B.向化合物13a(0.050g，0.11mmol)在异丙醇(1mL)中的混合物内加入三乙胺(0.017mL，0.12mmol)和N-氰基carbonimidate二苯基酯(0.029g，0.12mmol)。在室温下将反应混合物搅拌2小时，然后真空浓缩。使所得残留物悬浮于EtOH(0.75mL)中，加入NH₄OH(0.25mL，14.8N(aq))。在50℃下将反应混合物搅拌16小时，真空浓缩，所得残留物用梯度为90∶10(水∶乙腈，含0.1％TFA)至90∶10(乙腈∶水，含0.1％TFA)的反相液相层析纯化，得到标题化合物28(通过HPLC纯度为99％，0.0017g)；C₂₂H₂₃Cl₂N₈O₃的HRMS m/z计算值517.1270(M+H)，实测值：517.1281。

使用实施例13的方法以及本领域技术人员已知的合适试剂、原料和纯化方法，制备下列本发明化合物：化合物143。

实施例14

A.1，5-二氢-2-(甲硫基)-4H-咪唑-4-酮一氢碘化物(化合物15b)。向化合物14a(420mg，3.6mmol)的EtOH(5mL)溶液内加入碘甲烷(0.268mL，4.3mmol)。在25℃下将混合物搅拌16小时，然后浓缩成残留物，得到化合物14b，不需再纯化即可用于下一反应。

B.3-(3，4-二氯-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-6-[2-(5-氧代-4，5-二氢-1H-咪唑-2-基氨基)-乙基氨基]-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮4(化合物52)。向化合物14b(0.0373mg，0.14mmol)的乙醇(0.75mL)溶液内加入化合物13a(50mg，0.13mmol)。将混合物在160℃照射(□波)15分钟，浓缩，所得残留物用梯度为90∶10(水∶乙腈，含0.1％TFA)至90∶10(乙腈∶水，含0.1％TFA)的反相液相层析纯化，得到标题化合物48(通过HPLC纯度为89％，0.0025g)。C₂₃H₂₄Cl₂N₇O₄的HRMS m/z计算值532.1267(M+H)，实测值：532.1257。

实施例15

3-(3，4-二氯-苄基)-6-[2-(4，5-二氢-1H-咪唑-2-基氨基)-乙基氨基]-1-(4-甲氧基-苄基)-1H-[1，3，5]三嗪-2，4-二酮(化合物49)

向化合物15a(0.054mg，0.22mmol)的乙醇(1mL)溶液内加入化合物13a(50mg，0.11mmol)。将混合物在微波反应器中160℃照射15分钟，浓缩，所得残留物用梯度为90∶10(水∶乙腈，含0.1％TFA)至90∶10(乙腈∶水，含0.1％TFA)的反相液相层析纯化，得到标题化合物49(通过HPLC纯度为93％，0.0082g)。C₂₃H₂₆Cl₂N₇O₃的HRMS m/z计算值518.1474(M+H)，实测值：518.1479。

实施例16

N-{2-[5-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙基}-N’-氨基-胍(化合物93)

向化合物16a(0.061mg，0.22mmol)的乙醇(1mL)溶液内加入化合物2e(50mg，0.13mmol)。将混合物在微波反应器中160℃照射15分钟，浓缩，所得残留物用梯度为90∶10(水∶乙腈，含0.1％TFA)至90∶10(乙腈∶水，含0.1％TFA)的反相液相层析纯化，得到标题化合物93(通过HPLC纯度为99％，0.018g)。

¹H NMR(CDCl₃)□3.22-3.73(2H，m)，3.38-3.55(2H，m)，3.75(2H，t，J＝5.8Hz)，3.77(3H，s)，5.01(2H，s)，5.07(2H，s)，5.44-4.86(2H，bs)，6.83(2H，d，J＝8.7Hz)，6.90-7.03(2H，m)，7.16(2H，d，J＝8.7Hz)，7.48-7.36(2H，m).

C₂₁H₂₆FN₈O₃的HRMS m/z计算值457.2112(M+H)，实测值：457.2101。

实施例17

N-{2-[5-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙酰基}-N′-boc-胍(化合物132)

A.[5-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙酸(化合物17a)。向化合物2d(0.10g，0.26mmol)的乙醇(1mL)溶液内加入甘氨酸(0.056g，0.75mmol)和DIEA(0.143mL，0.82mmol)。将混合物在微波反应器中150℃照射30分钟，然后冷却至室温。再加入甘氨酸(0.056g，0.75mmol)和DIEA(0.143mL，0.82mmol)，将所得混合物在150℃照射(□波)30分钟，冷却至室温和浓缩，所得残留物用梯度为90∶10(水∶乙腈，含0.1％TFA)至90∶10(乙腈∶水，含0.1％TFA)的反相液相层析纯化，得到化合物17a(通过HPLC纯度为99％，0.058g)。C₂₀H₂₀FN₄O₅的MS m/z计算值415.1(M+H)，实测值415.1。

B.N-{2-[5-(4-氟-苄基)-1-(4-甲氧基-苄基)-4，6-二氧代-1，4，5，6-四氢-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙酰基}-N’-boc-胍(化合物132)。向化合物17a(0.025g，0.047mmol)、DIEA(0.032mL，0.18mmol)和monobocguanidine(0.015g，0.091mmol)的DMF(0.40mL)溶液内加入PyBop(0.047g，0.091mmol)。在室温下将混合物搅拌16小时，用水(3mL)猝灭，所得溶液用4×1mL EtOAc提取。将合并的有机层用Na₂SO₄干燥和浓缩，所得残留物用梯度为50∶50(EtOAc∶庚烷，含0.1％Et₃N)至EtOAc(含0.1％Et₃N)的硅胶正相快速层析纯化，得到标题化合物132(通过HPLC纯度为85％，0.0263g)。

¹H NMR(CDCl₃)□1.46(9H，s)，3.79(3H，s)，4.05(2H，s)，5，07(4H，s)，6.90(2H，d，J＝8.7Hz)，6.98(2H，at，J＝6.7Hz)，7.30(2H，d，J＝8.7Hz)，7.50(2H，dd，J＝8.7and 8.6Hz)，8.61(1H，bs)；

C₂₆H₃₁FN₇O₆的MS m/z计算值556.2320(M+H)，实测值：556.2341。

生物学实施例

生物学实施例1

促动力素-1的表达、离析和纯化

将重组N-端FLAG-标记的人PK1(序列-MRGATRVSIMLLLVTVSDCDYKDDDDKAVITGACERDVQCGAGTCCAISLWLRGLRMCTPLGREGEECHPGSHKVPFFRKRKHHTCPCLPNLLCSRFPDGRYRCSMDLKNINF)表达在稳定转染的HEK 293细胞中。

在含10％FBS、20mM HEPES、丙酮酸钠、青霉素和链霉素(各50μg/ml)和G418(400mg/L)的DMEM选择性高糖培养基(Invitrogen，Carlsbad，California)中，使HEK 293细胞生长至100％融合。用两周时间每隔一天都用新鲜培养基装满用于培养HEK 293细胞的DMEM培养基。将含PK1肽的培养基收集，用500mL 0.2μm孔径滤器(Corning Incorporated，Corning，NY)滤过。将滤液贮存在4℃滤液瓶内。在4℃使含PK1肽的培养基依靠重力流动通过M2琼脂糖柱(Sigma Chemical，St.Louis，MO)进行纯化。培养基通过后，将琼脂糖柱用无菌1×PBS(pH 7.4)洗涤，直至在OD 280nm不再检测到蛋白。然后将柱用pH 2.8的0.1M甘氨酸-HCl溶液洗脱。通过将洗脱材料收集入含1M Tris pH8的管内将其立即中和。用OD 280鉴定和汇集峰馏分。在室温下将汇集的馏分用4单位/mL Flag表位进行肠激酶裂解过夜。除去肠激酶，将样品等份贮存在-80℃。

以上纯化后PK1配体的质谱分析结果

用Maldi TOF-MS和LC-Electrospray-Mass Spectral Analysis分析样品。

所需蛋白序列：

AVITGACERDVQCGAGTCCAISLWLRGLRMCTPLGREGEECHPGSHKVPFFRKRKHHTCPCLPNLLCSRFPDGRYRCSMDLKNINF

计算的平均分子量＝9667.4。

MALDI-TOF ANALYSIS

样品制备

按照反相Zip Tip，2002 Millipore Corporation的使用指南用C4 ZipTip除去蛋白样品溶液(10μL)的盐分。

质谱分析

用Micromass TOF Spec E质谱仪测定分子量。用MassLynx软件3.4进行系统控制和数据采集。在0-80,000Da质量范围获得MALDI正离子质谱。将原MS数据减去基线，用Masslynx软件弄平，与参考标准得到的质量相比。

用Agilent反褶积软件计算洗脱成分的质量。

结果

质谱数据显示存在所需蛋白(分子量＝9667)以及质谱响应大致同样丰富的测定分子量为9172的其他相关成分。在测量误差范围内，该质量与下文标明丢失最后4个C端残基的可能的截断产物一致。

提出的其他蛋白成分序列

AVITGACERDVQCGAGTCCAISLWLRGLRMCTPLGREGEECHPGSHKVPFFRKRKHHTCPCLPNLLCSRFPDGRYRCSMDLK

计算的平均分子量＝9178.8。

没有检测到其它相关的蛋白成分。所有测定的质量准确度都接近0.1％。

生物学实施例2

功能测定

在荧光成像读板器(FLIPR)上筛选PK1拮抗剂的方法

在测定前24小时，在细胞培养基(含高糖和L-谷氨酰胺，10％FBS，1％青霉素/链霉素，1％丙酮酸钠，20mM HEPES，Zeocin 200mg/L的DMEM)中，将100μL 1.3×10⁶/ml表达HEK 293 GPR73(PK1受体)的细胞置于96孔聚右旋赖氨酸包被板(Costar)中，培养在37℃和5％CO₂下。进行测定当天，除去培养基，将200μL预先用200mL测定缓冲液[HBSS w/Ca²⁺和Mg²⁺w/o酚红，20mM HEPES，0.1％BSA，10mL丙磺舒(710mg丙磺舒在5mL 1N NaOH中，然后向其内加入5mL含20mM HEPES的HBSS)]悬浮的5×Calcium Plus Dye(MolecularDevices)加入96孔板的各孔内。将板在37℃和5％CO₂避光培养30分钟。取出板，让其避光达到室温15分钟。然后在FLIPR上测定。简而言之：读取基线1分钟，加入化合物(25μL)，培养4分钟15秒，加入预先确定EC₅₀终浓度的PK1配体制剂(25μL)，对荧光计数1分钟45秒。将只有缓冲液加入细胞时读取的相对荧光量描述为基线。所有孔都减去基线。对照的百分数计算如下：

(孔值-基线/最大值-基线)×100。

抑制百分数为100-对照值百分数。

将IC₅₀定义为指定化合物抑制50％最大信号需要的量，由用于本测定的PK1制剂的浓度产生。IC₅₀值用GraphPad Prism计算。

表2包括实施例2描述的PK1功能测定产生的数据。

生物学和质谱数据

表2

^*数值代表多次试验测定的数值范围。

生物学实施例3A-3E

在哺乳动物中PK1对分泌和肠粘膜离子转运的作用

生物学实施例3A

在哺乳动物中PK1对分泌和肠粘膜离子转运的作用

方法学。将回盲连接处近端2cm的点开始延伸至最近端10cm的完整厚度的回肠段新鲜切除，置于Krebs-Ringer碳酸氢盐(KRB)溶液中，将塑料杆轻轻插入完整肠段内清空其中内容物。用手术刀片后脊沿着整个肠系膜边缘修整回肠段，用平头镊小心地除去包括肠肌丛在内的完整肌层。用剩余的肌肉剥除、粘膜-粘膜下层组织制备三片长约1.5cm的矩形组织片，小心地切下，避开Peyer′s淋巴结。将含完整粘膜下神经节的各组织片钉在丙烯酸安装盒半体之间的矩形门(粘膜暴露的总横断面积＝0.50cm²)上，该盒插在改良Ussing型流量腔的组织浴贮器(Physiologic Instruments，Inc.，San Diego，CA)之间。关于用Ussing腔经上皮测量的讨论，参见Martin J.Hug，Transepithelial Measurements Using the Ussing Chamber，The EuropeanWorking Group on CFTR Expression(2002)。

将各组织的顶端(即粘膜)和底端(即浆膜)表面用6ml维持在36℃的氧合KRB溶液浸浴。一旦固定后，让组织平衡0.5-1小时，然后进行电场刺激，加入促分泌剂或药物。KRB溶液包含(mM)120NaCl、6KCl、1.2MgCl₂、1.2NaH₂PO₄、14.4NaHCO₃、2.5CaCl₂和11.5葡萄糖或11.5甘露醇。将KRB溶液继续用95％O₂∶5％CO₂吹气并维持在pH 7.3。各腔配备一对测定跨组织透壁电压差(PD)的饱和KCl-琼脂桥，和一对与自动电压钳装置(VCC MC6型或VCC MC8型，Physiologic Instruments，Inc.，San Diego，CA)连接的Ag-AgCl琼脂电极，补偿PD传感桥之间的溶液电阻和在0mV钳夹时跨组织透壁电压差(PD)的测定偏差。通过用脉冲发生器产生的双极脉冲测定改变1mV PD需要的电流计算(以mS)组织电导(G)。连续测定净离子主动转运的指标即短路电流(Isc，mA)。组织电导(Gt，mS)是对被动离子流屏障作用的指标，用各组织的Isc改变和经上皮电压差计算。

获得记录各组织短路电流(Isc)和G的基线并继续记录15分钟，然后开始实验方案。用电脑数据获得系统(PowerLab 8SP，ADInstruments，Inc.，Colorado Springs，CO)连续测定和记录刺激的Isc改变。通过用电子刺激器(S-48，Grass-Telefactor，Astro-Med，Inc.，WestWarwick，RI)输出的电场刺激(80V，0.5ms，10Hz，5s)得到神经诱导的Isc改变，该电子刺激器通过直接接触各组织对极的粘膜表面的铝箔电极连接。将药物和促分泌剂常规加入基底侧贮器中。加入基底侧后连续记录激动剂或促分泌剂对Isc的作用。通过累积、分步地添加预定增加量的激动剂或促分泌剂构成浓度-反应曲线，加入的量为对前一较低浓度的峰Isc反应的量或其附近。10-20分钟暴露期后接着用特异性激动剂或促分泌剂诱导，评估拮抗剂或抑制剂对分泌的作用。

统计学分析。所有数值都以均数+/-SE表示。将用Ussing流量型腔获得的电生理数据标化为组织表面积，用每cm²表示。将刺激前基线值与指定刺激物或促分泌剂诱导的最大反应(ΔIsc)之间的绝对差确定为刺激的离子转运改变。用PRISM(GraphPad Software，Inc)中电脑计算的曲线拟合功能，从7点累积浓度-反应曲线试验得到PK1对上皮分泌的刺激作用的估计EC₅₀。用非配对双侧Student′s t检验确定任何两组如对照与实验组织之间的统计显著性。用ANOVA联合posthoc Neuman-Keuls多重比较检验确定多组之间的显著性差异。P＜0.05视为有统计显著性。

结果概述。将对指定浓度PK1的峰Isc反应与最初基线(未刺激的)Isc值相比得到的差值记录为Isc的改变，以测定的微安(μA)ΔIsc表示，用安装在Ussing型腔内的组织表面积(cm²)校正。反应曲线的EC₅₀值按照生物学实施例3A的描述计算。基础Isc是35.2+/-2.4μA/cm²，组织电导(G)是33.7+/-0.9mS/cm²(n＝79片组织，来自34只大鼠)。将单剂量PK1给予浸浴基底侧组织表面的Krebs溶液之后，2-4分钟内Isc逐渐增加至峰值，然后在10-15分钟内降回基线。PK1诱导的Isc增加呈浓度依赖性，累积浓度-反应研究测定EC₅₀约为8.2nM。PK1诱导反应的最大反应出现在100nM；与基线相比，100nMPK1诱导Isc增加28.7+/-2.9μA/cm²(n＝42片组织，来自29只大鼠)，10nM PK1诱导增加13.5+/-2.μA/cm²(n＝33片组织，来自22只大鼠)。所有后续研究都使用浓度10nM和100nM。在任何研究中PK1对G都没有明显作用。图4显示在神经传导毒素河豚毒素(TTX)存在下或者用抗胆碱药阿托品阻断肠粘膜细胞上的毒蕈碱受体之后，都没有阻断PK1的促分泌作用。这表明其作用不依赖组织的内在神经活性。

PK1诱导的Isc增加需要存在内源性PK1受体，因为将外源性PK1肽加入PK1受体敲除小鼠的回肠粘膜组织引起的Isc与野生型同种小鼠相比无显著差异。(参见图5)。

生物学实施例3B

在大鼠回肠中PK1诱导肠道分泌增加的作用机制

方法学。用于这些研究的Ussing型离子流量腔的基本方法与上文详细描述的相同，对实验方案作以下修改。为了确定PK1对上皮促分泌作用的作用机制，用三种单独的方法废除跨上皮的生电氯离子或碳酸氢根离子转运。第一种方法包括加入基底侧Na⁺-K⁺-2Cl^-协同转运体抑制剂布美他尼(500μM)，破坏驱动液体和电解质分泌入肠道的从基底侧向顶端方向的净生电Cl^-离子流。第二种方法包括更换用于维持Ussing腔内活组织的生理缓冲液中的所有氯离子，用等摩尔羟乙基磺酸盐和乙酸盐代替上文所列标准KRB配方的盐酸盐，从而带入无氯KRB溶液。第三种方法包括更换生理缓冲液中的所有碳酸氢根离子，用等摩尔哌嗪-N，N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)代替碳酸氢盐从而带入无碳酸氢根的KRB溶液，加入1mM细胞内碳酸酐酶阻滞剂乙酰唑胺，预防肠细胞产生碳酸氢根。

结果概述。用布美他尼和无Cl^-的Krebs溶液阻断基底侧Na⁺-K⁺-2Cl^-协同转运体，用试验测定PK1诱导Isc增加的离子基础。(参见图6)。根据成功用于其它类似离子转运的研究报道选择布美他尼的浓度(500μM)。将布美他尼加入浆膜浴液之后，显示基线Isc降低(-7.1+/-8.6μA/cm²，n＝5)；但是，这与只接受DMSO溶媒的组织(6.6+/-4.0μA/cm²，n＝4)相比无显著差异。另外，布美他尼没有显著改变基线G；然而，布美他尼使PK1诱导的Isc增加明显减弱＞90％。在无Cl^-的Krebs溶液中，加入PK1后浆膜的反应也减少＞90％；但是，含乙酰唑胺的无碳酸氢根KRB溶液对PK1的Isc反应没有影响，提示它不影响碳酸氢根转运。

生物学实施例3C

在大鼠回肠中PK1刺激的肠道分泌部分依赖作用于上皮EP4受体的内源性前列腺素类的合成

方法学。用于这些研究的Ussing型离子流量腔的基本方法与上文详细描述的相同，对实验方案作以下修改。已经显示包含在肠道内的许多不同的肽和神经肽部分通过刺激内源性前列腺素产生发挥它们的促分泌作用。为了阐明内源性前列腺素合成在PK1刺激大鼠回肠的Isc反应中的潜在作用，用预处理的大鼠回肠粘膜进行实验，所述粘膜用加入非选择性环氧合酶(COX)抑制剂吡罗昔康(10μM)、选择性COX-1同工酶抑制剂FR122047(10mM)和选择性COX-2同工酶抑制剂美洛昔康(10μM)的浆膜处理。(参见图7)。在确定内源性产生的前列腺素是否作用于特异性受体亚型的后续实验中，将组织用加入选择性前列腺素受体拮抗剂EP4(AH23848，30μM)和血栓烷受体TP(GR32191B，1μM)的浆膜预处理，以确定涉及PK1驱动前列腺素刺激的Isc反应的假定信号机制。

结果概述。结果提示大鼠回肠中PK1介导的分泌部分依赖于COX合成内源性前列腺素。根据使用选择性COX同工酶抑制剂的实验，结果表明可诱导的COX-2同工酶不涉及PK1刺激的前列腺素的产生。后续实验的结果提示由PK1暴露信号通过激活前列腺素EP4受体亚型刺激的内源性前列腺素优先局限于大鼠肠上皮。

生物学实施例3D

在大鼠回肠中小分子PK1受体拮抗剂有效抑制PK1和霍乱毒素刺激的肠分泌

方法学。用于这些研究的Ussing型离子流量腔的基本方法与上文详细描述的相同，对实验方案作以下修改。在30-45分钟平衡期之后，通过将组织对侧极端上的箔电极与电子矩形脉冲刺激器的极化绝缘输出信号接触相连，对基线稳定的组织进行一连串电场刺激(EFS；80V，0.5ms，10Hz，5s)。用对两种连续EFS的反应计算组织存活率和每只大鼠的具体组织以及大鼠之间反应的可比性。在间隔期测定组织电导，为用欧姆定律从脉冲发生器用1mV波幅双极脉冲诱导的短暂短路电流反应的波幅的改变。研究每只大鼠的3-4片组织。如下将指定动物的组织分组和分配：1片对照组织只接受溶媒，接着以累积方式将两种连续剂量的PK1配体加入组织基底面；剩余2-3片来自同一动物的组织暴露于指定PK1受体拮抗剂(如1只大鼠的3-4片组织：对照、拮抗剂₁、拮抗剂₂、拮抗剂₃)。将待测化合物以1μM终浓度加入基底组织侧贮器内，培养15分钟后用PK1肽刺激。在这次15分钟暴露期结束时，将PK1配体以10和100nM以累积方式加入各组织，以表征待测化合物的抑制作用。在本实验结论中，再用EFS计算组织存活率和反应的稳定性。结果显示于图9-11。

结果概述。只用PK1拮抗剂预处理的组织没有检测到对基线Isc和组织电导(G)的作用。图9-11所示结果表明在已被细胞测定鉴定为公认PK1受体拮抗剂的两种不同系列小分子支架(即氨基胍和氨基苯并咪唑(分别是图9A和9B以及图11))存在下，成功抑制离体大鼠回肠粘膜中PK1诱导Isc的增加。在两种试验系列的各化合物中，观察到两种递增累积浓度PK1诱导Isc反应的抑制作用表现明显可克服的拮抗作用。虽然氨基胍JNJ 28611921不能抑制对PK1的Isc反应；然而，已显示该化合物对PK1受体缺乏明显活性。这些数据提示通过小分子抑制剂调节PK1对肠上皮的促分泌作用，可有效实现选择性功能性阻断PK1受体。

生物学实施例3E

PK1刺激大鼠体内小肠中液体的肠汇集和聚集

方法学。用重量分析实验测定大鼠小肠中PK1肽的体内促分泌作用。用两种不同给药途径评估PK1肽对大鼠完整肠道内液体的肠汇集和聚集的刺激作用。在两个单独的实验中将未禁食的大鼠随机分成两个实验组(每组n＝10)。在第一个实验中，对每只大鼠给予含100μg/kg剂量PK1肽或缓冲溶媒的口服巨丸剂(1.5ml)6％胭脂红染料/0.5％甲基纤维素wt/vol。(参见图12)。在第二个实验中，对大鼠腹膜内注射(i.p)PK1肽(100μg/kg)或缓冲溶媒，接着立即胃内给予6％胭脂红染料/0.5％甲基纤维素试验餐(1.5ml)。(参见图13)。30分钟后，用100％二氧化碳吸入麻醉然后用颈椎脱位法迅速处死大鼠，切除从幽门至回盲连接处的整段小肠。测量小肠全长，然后等分成三段，用4-0号丝线环结扎、隔离和分离各段，预防管腔内容物漏出。将各段(近端、中部和远端)完整称重近似至毫克，小心地纵向切开，轻轻地用吸收纸片吸干，清空其液体内容物，然后再称重。注意不要再分配或取出任何固体或半固体管腔内容物。将完整和清空肠段重量之间的差异计算为液体内容物净重，近似至毫克，标化为克肠段组织湿重。

结果概述。结果证明PK1肽刺激大鼠体内小肠中液体肠汇集和聚集。一般来讲，这种作用涉及小肠所有三个区域；然而，这种作用在更远端(即中和远段)区域最明显。这些数据与作为证据表明用安装在Ussing型离子流量腔中进行离体研究的大鼠回肠粘膜离体标本得到PK1肽的促分泌作用一致。

生物学实施例4A-4C

PK1对胃肠道平滑肌的作用

生物学实施例4A

PK1刺激口服试验餐在大鼠体内小肠的转运

方法学。小肠的转运。通过口服饲管给予大鼠总体积为1.5ml的巨丸剂，含6％胭脂红染料/0.5％甲基纤维素(wt/vol)溶液以及PK1(100μg/kg)或溶媒。30分钟后，迅速用100％二氧化碳吸入麻醉，接着用颈椎脱位法处死。小心地切除每只大鼠的整段小肠，先从回盲连接处开始向后至胃幽门，直至已经切除完整的全部小肠。将切除的小肠沿直尺边排列，以厘米测量小肠全长。可见胭脂红染料面的前缘，也测量胭脂红经过的距离，计算为小肠总切除长度的百分数。将转运以30分钟内胭脂红染料经过的肠道总长度的百分数表示。结果显示于图14。

结果概述。结果表明与溶媒处理的对照相比，用PK1口服处理的大鼠明显加速胭脂红试验餐的小肠转运。因此，PK1显然对受处理大鼠上胃肠道的推进动力具有刺激作用。

生物学实施例4B

PK1刺激离体大鼠体外小肠的收缩性

用“myobath”装置，在体外研究PK1对鼠类离体胃肠(GI)组织段的作用。这种器官浴装置用于在存在或缺乏化合物的情况下测定应用PK1后胃肠平滑肌收缩活性的改变，所述化合物在PK1R体外转染的细胞中阻断PK1受体(PK1R)介导细胞内游离Ca²⁺的增加。

方法。通过CO窒息处死鼠类(小鼠、大鼠和豚鼠)并放血。切除包括胃、十二指肠、空肠、回肠、近端结肠和末端结肠在内的动物胃肠组织段并固定，为完整肠段(即15mm长筒状肠段)或沿纵向肌轴走向的扁条(～2.5mm×15mm)。在一些实验中扁条沿环状肌轴走向。使用两种类型纵向排列的扁条标本：a)由全部肠壁组成的标本和b)已经切去粘膜和粘膜下层，只由肌层(包括肠肌丛和浆膜)组成的标本。

将各组织标本安装在配备固态应变式力量传感器的支架上，该传感器与标本一端连接，将标本浸在维持35℃用95％O₂/5％CO₂吹气的Krebs-Ringers缓冲液(KRB，等渗碳酸氢盐缓冲液，pH 7.4)中。拉长组织，使静息负荷为0.5-1.0gm(根据标本而定)，在这些条件下平衡1小时，每15分钟更换一次新鲜KRB浴液。每次实验开始都将乙酰胆碱(ACh，1μM)加入各浴中，以产生收缩反应；洗去ACh后，将PK1单独或者在加入PK1R拮抗剂之后加入各浴中。将在这些条件下对PK1的反应与同一组织标本对ACh的反应相比，将收缩(或舒张)计算为对ACh反应的百分数。

已报道PK1对豚鼠胃肠平滑肌的作用(Schweitz，Pacaud等，1999；Lai，Liu等，2003)。因为PK1及可被它激活的受体(PK1R和PK2R)在大鼠胃肠道各处的表达不同，所以该肽对大鼠离体肠和结肠段的作用是具有特征的。PK1(100nM)诱导肠组织(中段十二指肠、空肠和末端回肠)纵向收缩，但相同浓度PK1诱导近端和末端结肠纵向舒张。(参见图6)。

结果提示对PK1的最大收缩反应来自回肠组织；因此用回肠段进行进一步实验。第一个研究使用完整肠段，稍后的实验则以离体回肠肌层组成的标本为基础。

PK-1诱导完整回肠标本的双相收缩

将PK1用于离体大鼠回肠诱导双相反应，由早期短暂收缩和晚期强直性收缩组成。(参见图15)。蛋白的应用在箭头处出现，在记录期间保持与标本接触。

测定早相和晚相达到峰收缩的时间分别为6.4分钟和53.8分钟。测定的早相和晚相收缩反应都呈浓度依赖性。(参见图17A和17B)。测定早期和晚期收缩反应的EC₅₀分别为87.8和72.4nM。

为了确定回肠平滑肌的明显收缩是否由肠平滑肌上的受体直接介导，将河豚毒素(TTX，0.1μM)和阿托品(1μM)加入器官浴中。通过加入TTX后完全抑制电场刺激(EFS)诱导的收缩，证实其阻断由肠神经系统(ENS)介导的收缩的功效。通过加入TTX和阿托品后使用乙酰胆碱，检验阿托品阻断由正好位于回肠平滑肌上的毒蕈碱受体介导的收缩的功效。

TTX和阿托品减弱PK1诱导的早期而不是晚期收缩反应。这些结果提示PK1对回肠纵肌缓慢发展、持久的收缩作用既不是神经介导也非胆碱能。其它体内结果(见上文)已经证实PK1对大鼠回肠强有力的分泌作用，因此通过测定PK1对无粘膜回肠标本的作用，检验粘膜受体的刺激释放一种或多种收缩肠平滑肌的物质的设想。切除回肠粘膜抑制由PK1诱导的缓慢发展、“晚期”收缩反应。(参见图18)。

小分子拮抗剂减弱PK1的刺激作用

在本系统中检验PK1R的小分子拮抗剂抑制PK1介导胃肠平滑肌收缩的能力。结果的实例如图19显示，其中可见JNJ-28845557对PK1诱导大鼠回肠纵向平滑肌的收缩具有浓度依赖性抑制作用。虽然早期和晚期反应都被拮抗；然而，与对晚期反应的作用相比，化合物更有能力和有效抑制早期反应。

生物学实施例4C

PK1和PK1受体在鼠类胃肠道组织中的免疫细胞化学定位

已经证明将PK1给予大鼠可刺激液体分泌入肠腔内，增加标记物在胃肠(GI)道内向下的转运率；而且，已经显示将PK1应用于鼠类(大鼠、小鼠和豚鼠)离体肠段刺激胃肠上皮分泌Cl^-离子，导致胃肠平滑肌区域特异性地收缩或舒张。外源性PK1的这些作用被PK1受体(PK1R)的小分子量拮抗剂抑制。用一系列免疫细胞化学实验确定PK1肽在胃肠道的分布及其在PK1R的作用位点。

方法。在家兔中产生抗人PK1肽氨基酸序列CSMDLKNINF和抗大鼠PK1R氨基酸序列DFFSARDGSGAETSP的抗体。用CO₂窒息处死鼠类，接着采集组织：近端胃、远端胃、十二指肠、空肠、回肠、近端结肠和末端结肠。将组织用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，浸在4％多聚甲醛(w/v)/0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4，室温)中1-4小时固定。进行两类实验：在第一种系列的实验中，将完整肠段低温保护，接着在4℃浸在30％蔗糖(w/v)PBS中固定过夜，然后包埋在OCT(Tissue Tek)中，-20℃贮存。将OCT包埋的组织片(10-12μm)用冷冻切片机切开，融裱在载玻片(VWR″Plus″涂层)上。用PBS冲洗玻片除去切片的OCT，将切片培养在含1％牛血清白蛋白(部分IV，w/v)和0.4％Triton X-100(v/v)的4％无免疫性山羊血清(v/v)PBS中阻断非特异性结合。应用一抗过夜(室温)，用PBS洗去，然后用荧光分子(AlexaFluor 488，Molecular Probes，Eugene OR)轭合的二抗4小时(室温)。在第二种系列的实验中，沿肠系膜边缘纵向打开小肠和结肠段，将肠道钉成扁片，粘膜朝上，底部是硅橡胶弹性体平皿(Sylgard，DowCorning，Midland MI)，然后固定(如上文)。固定后，切割扁平的肠段得到薄片，全层铺片由带附着的肠肌丛(LMMP)或粘膜下层(含粘膜下丛(SMP))的纵向肌组成。将全层铺片免疫染色(如上文)，然后装在玻璃载玻片上。用含甘油的抗衰减封固剂(VectaShield，VectorLaboratories，Burlingame，CA)将盖玻片安装在切片和全层铺片上，用落射荧光显微镜检测组织。结果显示于图20和21。

结果。在胃肠组织中检测到PK1免疫反应性(IR)。PK1-IR在胃粘膜中特别明显(图20)。PKR1-IR可见于粘膜下(图21A)和肠肌层(图21B)神经节的神经元。免疫反应性似乎呈特异性，因为省略一抗可导致荧光几乎全部消失。(参见图21B和21C)。这些数据提示肠道是PK1的来源，该肽的受体局限于肠神经元。因此，PK1的促分泌和促蠕动作用可部分通过肠神经元途径介导。

PK1和PK1受体在鼠类DSS诱导的结肠炎的表达

在DSS诱导的小鼠结肠炎中第7天末端结肠中PK1受体的mRNA没有增加。(参见图22)。

芥子油诱导的鼠类结肠炎

单次结肠内给予芥子油后2小时，末端结肠中PK1R的mRNA小量但统计学上显著地增加。(参见图23)。用6小时恢复至对照水平。这提示PK1R可能在结肠对芥子油的快速反应中发挥作用。

结肠内给予芥子油后6小时，末端结肠中PK1的mRNA大量、统计学上显著增加。用24小时恢复至对照水平，提示PK1可能在结肠对芥子油的快速反应中发挥作用。(参见图24)。

正常大鼠胃肠组织

PK1R mRNA最高水平在回肠(肌肉和粘膜)，最低水平在十二指肠和胃，中度水平在末端结肠(标记盐水的泳道)、空肠和肝。(参见图25)。在末端结肠中TNBS诱导后3天末端结肠的PK1R mRNA水平不变(标记TNBS的泳道)。同样，当安装在Ussing腔并用溶媒(标记UC对照的泳道)或霍乱毒素(UC霍乱毒素)处理时，末端结肠中PK1R mRNA水平不变。PK1 mRNA最高水平可见于胃，最低水平可见于十二指肠、空肠和肝，中度水平可见于回肠(肌肉和粘膜)和结肠。这些数据表明胃肠道既产生PK1R也产生PK1，mRNA的稳态水平存在区域差异。胃内高水平PK1提示胃可能产生大量PK1，然后可用于其余胃肠道。回肠内存在配体和受体的mRNA提示可发生局部旁分泌相互作用的可能性。

PK1R敲除小鼠

PK1R敲除小鼠(-/-)在回肠不表达PK1R mRNA，但野生型小鼠(+/+)表达PK1R mRNA。(参见图26)。在KO小鼠的回肠中PK1 mRNA小量但统计学上显著减少。(参见图27)。这些数据证实PK1R基因KO的保真度，提示丧失PK1R可轻微降低回肠中PK1的稳态水平。

RNA分离(Qiagen Rneasy 96 Plate)

RNA购自供应商，组织取自室内动物模型。将组织样品贮存在-80℃或4℃的RNA Later(Qiagen，Valencia CA)中待测。除去RNALater，用qiazol(Qiagen)以及不锈钢组织研磨珠(4.0mm混合球轴承-Montreal Biotech，Montreal Que)代替。用Retsch MM 300匀浆器(Qiagen)使样品均匀。加入氯仿和离心后，将水相收集，用70％乙醇混合，倒入Qiagen Rneasy 96 Plate的过滤柱中。按照制造商指示最终将样品在无RNase的水中洗脱。然后按照Dnase Free Dnase Treatment Kit(Ambion，Austin TX)的制造商指示处理RNA标本的DNase。用紫外分光光度法评估RNA量。用Total Nano RNA Eukaryotes方法检测样品，通过2100 Bioanalyzer Instrument(Agilent Technologies，Palo AltoCA)评估RNA完整性。

LiCl沉淀

对于DSS处理的样品，用以下方法。该方法改良自Cathala等(1983)。使RNA标本与溶于无RNase水中的无RNase氯化锂贮备溶液(LiCl，Ambion)混合，得到终浓度为2.5M LiCl。将该混合物在-20℃培养30分钟，然后在室温下进行。当样品已经融化时，将其在4℃以18000rcf离心15分钟。吸出液体，将片状沉淀物用1ml冰冻70％乙醇洗涤。再一次将样品在4℃以18000rcf自转15分钟。再次洗涤和自转样品，然后风干约15分钟。使片状沉淀物再悬浮于无RNase的水中。然后用光密度读数计算RNA量，每个样品读取3次。

TaqMan Real Time RT-PCR

将High Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems，FosterCity CA)以1∶1(v/v)加入先稀释至250ng/ul的每个RNA样品内。在37℃将混合物培养2小时。然后将样品以15.625×的系数稀释，以便可以每孔5ul将8ng/ul cDNA装入384孔光学读板器内。引物/探针由2×RT-PCR Master Mix(Applied Biosystems)组成，将7ul该溶液加入各孔内，然后用7900Fast Real Time PCR System (AppliedBiosystems)检测该板。Taqman引物/探针是购自Applied Biosystems的商品。用每种测试探针检测样品3次。

虽然以上说明书指出了本发明的原理，出于例证目的提供了实施例，但应理解本发明的实施包括本领域技术人员可理解的所有常规变更、改编和/或修饰。

Claims

1. 一种调节肠上皮功能的方法，所述方法包括调节PK1受体活性。

2. 权利要求1的方法，其中所述肠上皮功能是粘膜离子分泌。

3. 权利要求1的方法，其中所述粘膜离子分泌是Cl^-离子转运。

4. 权利要求1的方法，其中所述肠上皮功能是液体转运。

5. 权利要求1的方法，其中通过抑制所述PK1受体抑制所述肠上皮功能。

6. 权利要求1的方法，其中通过激活所述PK1受体激活所述肠上皮功能。

7. 一种鉴定PK1受体调节剂的方法，所述方法包括使含PK1受体的标本与一种或多种候选化合物接触，鉴定调节所述PK1受体活性的化合物。

8. 权利要求7的方法，其中所述标本是肠粘膜标本。

9. 权利要求7的方法，其中测定所述化合物调节PK1受体信号传导的能力。

10. 权利要求9的方法，其中通过监测短路电流(Isc)测定PK1受体信号传导。

11. 权利要求9的方法，其中通过监测Cl^-离子转运测定PK1受体信号传导。

12. 一种鉴定调节PK1受体活性的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将待测化合物缓冲液应用于回肠粘膜；

b)测定PK1受体的活性；

c)重复步骤a)和b)，但省略缓冲液中的待测化合物；和

d)将步骤b)与步骤c)得到的结果相比。

13. 权利要求12的方法，其中通过测定Cl^-离子转运确定所述活性。

14. 权利要求12的方法，其中通过测定短路电流(Isc)确定所述活性。

15. 一种鉴定降低PK1受体活性的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将待测化合物缓冲液应用于回肠粘膜；

b)将PK1或其功能同等物进行细胞培养；

c)测定PK1受体的活性；

d)重复步骤a)、b)和c)，但省略缓冲液中的待测化合物；和

e)将步骤c)与步骤d)得到的结果相比。

16. 一种PK1受体活性的功能测定法，所述功能测定法包括测定短路电流(Isc)的步骤。

17. 一种PK1受体活性的功能测定法，所述功能测定法包括测定Cl^-离子转运的步骤。

18. 一种减轻和/或治疗有需要的哺乳动物肠道炎症的方法，所述方法包括给予哺乳动物PK1拮抗剂，其中肠道炎症被减轻。

19. 一种减轻和/或治疗有需要的哺乳动物肠道炎症的方法，所述方法包括给予哺乳动物PK1拮抗剂，其中肠道炎症被减轻，其中拮抗剂是式(I)化合物及其对映体、非对映体、互变异构体、溶剂合物和药学上可接受的盐：

式(I)

其中：

r是整数1-5；

s是整数1-3；

X是O或S；

D是-P-A₂；

A₂是氢、苯基、不同于未被取代的吡啶-2-基的杂芳基或者C_3-8环烷基；其中苯基任选在间位或对位、不同于氢和苯基的A₂的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、卤代C_1-6烷基、卤代C_1-6烷氧基、芳基(C_1-6)烷氧基、苯基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷氧基羰基、氨基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6烷基)氨基、氰基、羟基、硝基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷硫基羰基、氨基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基羰基、C_1-6烷基羰基氨基和非稠合的C_3-6环烷氧基；前提是至多两个A₂上的取代基是芳基(C_1-6)烷氧基、苯基或非稠合的C_3-6环烷氧基；

前提是当A₁是未被取代的苯基且L₂是其中X₁是NH的-X₁(CH₂)₂-时，A₂不同于未被取代的苯基、被芳基(C_1-6)烷氧基或苯基取代的苯基、或者在间位被氰基取代的苯基；

进一步的前提是当A₁是未被取代的苯基且L₂是其中X₁是NH的-X₁(CH₂)₃-时，A₂不同于被甲氧基取代的苯基；

W是N或CH；

L₂是选自下列的二价基团：

-NH-C_5-7环烷基-(CH₂)_0-2-，条件是当C_5-7环烷基是环己基时，Q在相对于-NH-位置的2-或顺式-4-位连接；

-X₁-C_2-6烷基-；

-X₁-(CH₂)_1-3-X₂-(CH₂)_1-3-；

-X₂-(CH₂)_0-4-；

-X₁(CH₂)_2-3-X₃-(CH₂)_2-3-；

-NHC(＝O)-(CH₂)_1-4-；和

-X₁CH(R^x)-(CR^xR^y)_1-5-；

Q是-(O)_mN(R^a)-G；m是0或1；

G是-C(＝NR^b)NR^cR^d；

R^a和R^d独立是氢、C_1-6烷基、C_2-6链烯基或C_3-6炔基，其中不同于氢的R^a和R^d的取代基任选被1-3个独立选自下列的取代基取代：羟基、C_1-4烷氧基、氟、氨基、C_1-4烷基氨基、二C_1-4烷基氨基和C_1-4烷基羰基；或者R^a和R^c与它们连接的原子结合一起形成被氧代任选取代的5-8元单环；

20. 权利要求19的方法，其中炎症是慢性的。

21. 权利要求19的方法，其中炎症是散发性的。

22. 权利要求19的方法，其中炎症是肠易激综合征的症状。

23. 权利要求19的方法，其中炎症是炎性肠病的症状。

24. 权利要求23的方法，其中炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。

25. 一种刺激肠腔内液体分泌的方法，所述方法包括给予PK1。

26. 一种刺激肠腔内液体分泌的方法，所述方法包括给予PK1受体激动剂。

27. 一种抑制肠腔内液体分泌的方法，所述方法包括给予PK1拮抗剂。

28. 一种刺激肠道推进的方法，所述方法包括给予PK1。

29. 一种刺激肠道推进的方法，所述方法包括给予PK1受体激动剂。

30. 一种抑制肠道推进的方法，所述方法包括给予PK1拮抗剂。

31. 一种刺激COX的方法，所述方法包括给予PK1。

32. 一种刺激COX的方法，所述方法包括给予PK1受体激动剂。

33. 一种抑制COX的方法，所述方法包括给予PK1受体拮抗剂。