CN101246148A - 一种血管紧张素酶抑制肽体外活性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种体外直接测定血管紧张素酶(ACE)抑制肽活性的高效液相色谱(HPLC)分析方法，属生物技术领域。本方法以茄参(Acaudina Molpadioidea)胶原肽作为ACE抑制肽，通过多次试验，得出一种直接进样、等度洗脱便能达到良好分析效果的HPLC测定该抑制肽体外活性的方法。该方法经验证，也适用于其他水产胶原ACE抑制肽体外活性的检测，具有操作简便、重复性好、灵敏度和准确性高等特点。

Description

一种血管紧张素酶抑制肽体外活性的检测方法

技术领域：

本发明涉及一种体外直接测定血管紧张素酶(ACE)抑制肽活性的高效液相色谱(HPLC)分析方法，属生物技术领域。本发明以茄参(Acaudina Molpadioidea)胶原肽作为ACE抑制肽，通过多次试验，得出一种直接进样、等度洗脱便能达到良好分析效果的HPLC测定该抑制肽体外活性的方法。该方法经验证，也适用于其他水产胶原ACE抑制肽体外活性的测定，具有操作简便、重复性好、灵敏度和准确性高等优点。

背景技术：

原发性高血压是由多种因素引起的，其中包括遗传，饮食习惯，精神状态等。研究表明血压正常与否，与肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统密切相关，而血管紧张素酶(ACE)在上述两个系统中都起着重要的调节作用，造成血压的升高，引发高血压。水产胶原ACE抑制肽是从水产品胶原蛋白中提取出的具有ACE抑制活性的多肽，它通过抑制血浆和血管内皮细胞ACE的活性，达到降低血压的目的。

水产胶原ACE抑制活性肽具有安全性高；降压效果温和、专一、持久；无副作用的优点。它在食品和医药领域中具有广阔前景。因此，在分离鉴定ACE抑制肽的过程中，有必要开发一种简便、灵敏及可靠的分析方法对ACE抑制肽的体外活性进行检测。Cushman和Cheung建立的乙酸乙酯萃取法是体外检测ACE活性及抑制程度最常用的方法。该方法通过测定ACE酶解马尿酰一组氨酰一亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)生成的马尿酸(Hip)的量来确定ACE的活性。当ACE与ACE抑制剂作用后，ACE活性受到抑制，其与Hip-His-Leu作用生成的马尿酸量减少，测定加入抑制剂前后的马尿酸的生成量即可反映抑制剂对ACE的抑制程度。这种方法先是从反应混合物中用乙酸乙酯萃取马尿酸，然后在高温或真空条件下蒸干乙酸乙酯，最后把马尿酸重新溶于水中，在波长228nm处用分光光度计进行定量测定。其操作繁琐，而且用乙酸乙酯萃取马尿酸的同时也将一部分Hip-His-Leu萃取出来，而Hip-His-Leu在228nm处也具有强吸收，致使分析结果偏高。在应用HPLC检测ACE抑制剂体外活性的初期研究中，其检测样品是乙酸乙酯萃取物；2002年，Wu等提出一种改进的直接用HPLC测定ACE催化反应的方法，但采用的洗脱方式是梯度洗脱；2005年，吴琼英等建立了等度洗脱的HPLC测定ACE抑制剂活性的方法。该方法对化学合成的卡托普利等治疗高血压药物有良好的分析效果，但对水产胶原ACE抑制肽的体外活性分析却不是很理想。

本发明建立了一种直接进样、等度洗脱的HPLC分析方法，该方法适用于水产胶原ACE抑制肽体外活性的测定，具有操作简便、重复性好、灵敏度和准确性高等优点。

发明内容：

本发明以茄参(Acaudina Molpadioidea)胶原肽作为ACE抑制肽，通过多次试验，得出一种直接进样、等度洗脱便能达到良好分析效果的HPLC测定该抑制肽体外活性的方法，它能弥补现有技术的上述不足。

一种体外直接测定ACE抑制肽活性的高效液相色谱(HPLC)分析方法，其特征是取一定浓度的ACE抑制肽溶液(茄参胶原肽)30～40ul，加入20～40ul ACE溶液(25mU/ml)，在37℃下保温4～5min后加入30～50ul HHL溶液开始反应，在37℃条件下反应30～60min后加入150～200ul 1.0mol/L HCl终止反应，得到反应液，未加酶抑制剂的反应为空白对照。反应液经过0.45um滤膜过滤后用Zorbax SB-C₁₈分析柱(4.6×200mm，填料粒径5um)进行分析，条件为柱温25℃，流动相是乙腈-超纯水(体积比为50∶50，各含0.05％三氟乙酸)，流速0.4ml/min，检测波长228nm，进样量10ul～20ul。计算公式为：

$R=\frac{A-B}{A}\×100\%$

R为ACE抑制肽样品对ACE的抑制率(％)；

A为空白对照组(用硼酸缓冲液替代ACE抑制肽)中马尿酸的峰面积(mAU·s)；

B为添加ACE抑制肽组中马尿酸的峰面积(mAU·s)。

附图说明：

图1是空白对照组中马尿酸(Hip)的色谱图，马尿酸的出峰时间为7.085min，峰面积为2216.5(mAU·s)。图2是添加茄参胶原肽(ACE抑制肽)组中马尿酸的色谱图，马尿酸的出峰时间为7.093min，峰面积为238.3(mAU·s)。图1和图2显示马尿酸能够从混合液中被很好的分离出来。根据公式计算，茄参胶原肽对ACE的抑制率为89.3％。ACE抑制肽组中马尿酸的峰面积重复测定3次，其相对标准偏差(RSD)为0.2％，方法的精密度高、重复性好。

具体实施方式：

取2.0mg/ml的茄参胶原肽溶液40ul，加入40ul ACE溶液(25mU/ml)，在37℃下保温5min后加入50ul HHL溶液开始反应，在37℃条件下反应60min后加入200ul 1.0mol/L HCl中止反应，得到反应液。同时用40ul pH8.3的硼酸缓冲液替代胶原肽溶液来制备反应液，作为空白对照组。反应液经过0.45um滤膜过滤后用Zorbax SB-C₁₈分析柱(4.6×200mm，填料粒径5um)进行分析，条件为柱温25℃，流动相是乙腈-超纯水(体积比为50∶50，各含0.05％三氟乙酸)，流速0.4ml/min，检测波长228nm，进样量20ul。根据公式计算，茄参胶原肽对ACE的抑制率为89.3％，ACE抑制肽组中马尿酸的峰面积重复测定3次，其相对标准偏差(RSD)为0.2％。经验证，该方法也适用于其他水产胶原ACE抑制肽体外活性的测定，具有操作简便、重复性好、灵敏度和准确性高等优点。

Claims (2)

1.一种体外直接测定血管紧张素酶抑制肽活性的高效液相色谱(HPLC)分析方法，其色谱条件为：Zorbax SB-C₁₈分析柱(4.6×200mm，填料粒径5um)，柱温25℃，流动相为乙腈一超纯水(体积比为50∶50，各含0.05％三氟乙酸)，流速0.4ml/min，检测波长228nm，进样量10ul～20ul。

2.反应液的制备：取一定浓度的ACE抑制肽溶液30～40ul，加入20～40ul ACE溶液(25mU/ml)，在37℃下保温4～5min后加入30～50ul HHL溶液开始反应，在37℃条件下反应30～60min后加入150～200ul 1.0mol/L HCl中止反应，得到反应液。同时用30～40ul pH8.3的硼酸缓冲液替代ACE抑制肽溶液来制备反应液，作为空白对照组。反应液经过0.45um滤膜过滤后用HPLC进行分析。

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