CN101239964B

CN101239964B - 15-氧代绣线菊内酯，其药物组合物和其制备方法及其应用

Info

Publication number: CN101239964B
Application number: CN200810058170XA
Authority: CN
Inventors: 郝小江; 陈�全; 刘海洋; 赵丽霞; 邸迎彤; 金海京; 何红平; 乐雯; 高锁; 王晓慧; 杜蕾
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2008-03-07
Filing date: 2008-03-07
Publication date: 2012-01-04
Anticipated expiration: 2028-03-07
Also published as: CN101239964A

Abstract

提供由结构式(1)所示的15-氧代绣线菊内酯(15-oxospiramilactone)化合物，其作为药物活性成分的抗肿瘤药物组合物，该化合物及其组合物可以克服因Bax缺失而引起的肿瘤细胞的抗药性以及克服Bcl-2高表达引起的肿瘤细胞对化疗药物的抗性，诱导Bcl-2高表达的细胞发生凋亡；诱导Bax和Bak双缺失的小鼠胚胎上皮细胞发生凋亡；抑制HCT116 Bax^-/-移植裸鼠肿瘤生长，显示15-氧代绣线菊内酯可以作为化疗药物，在杀伤对多种化疗药物有抗性的肿瘤细胞时，对动物体没有明显损害。

Description

15-氧代绣线菊内酯,其药物组合物和其制备方法及其应用

技术领域：本发明属于药物领域，具体地，涉及式(1)的二萜化合物15-氧代绣线菊内酯、其为药物活性成分的药物组合物，其制备方法与抗肿瘤作用，以及在抗肿瘤药物研制中的应用。

背景技术：粉花绣线菊复合群在我国有7个变种，资源十分丰富。该植物中富含二萜生物碱，其中主要化学成分为绣线菊碱A、B、C和D，最高可达总碱的90％以上。上述4个生物碱及其混合物在强碱作用下，经水解和分子内歧化反应可转化为二萜类化合物绣线菊内酯(spiramilactone)和绣线菊内酯C(spiramilactone C)，绣线菊内酯可经氧化生成15-氧代绣线菊内酯(1)。现有技术中未见有15-氧代绣线菊内酯(1)化合物及其药用作用的报道。

发明内容：本发明的目的在于提供式(1)的二萜化合物15-氧代绣线菊内酯，该化合物为药物活性成分的药物组合物，其制备方法与抗肿瘤作用，以及在抗肿瘤药物研制中的应用。

结构式(1)所示的化合物15-氧代绣线菊内酯(15-oxospiramilactone)。

抗肿瘤药物组合物，含有式(1)所示的药物有效成分15-氧代绣线菊内酯及可药用载体和/或赋形剂。

本发明还提供了式(1)化合物的制备方法，由植物椭圆叶粉花绣线菊中分离得到的绣线菊碱A(spiramine A)和碱B(spiramine B)，在强碱存在下，经水解和分子内歧化反应生成绣线菊内酯(spiramilactone)和绣线菊内酯C(spiramilactone C)，绣线菊内酯再经氧化得到15-氧代绣线菊内酯。

Scheme 1.(a)15％KOH，MeOH reflux，72hr，(b)MnO2，CH2Cl2，r.t.，72hr

本发明同时提供了式(1)化合物在制备抗肿瘤药物中的应用；在制备抗多种化疗药物有抗性的肿瘤细胞的抗肿瘤药物中的应用。

进一步的，本发明还提供了式(1)化合物为药药有效成分的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用；在制备抗多种化疗药物有抗性的肿瘤细胞的抗肿瘤药物中的应用。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选为0.5-90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。苔黑酚-1-氧-β-D-葡萄糖吡喃苷、苔黑酚及其衍生物的组合物采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型、如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行抑郁症的治疗。

具体实施方式：

下面结合本发明实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但不以此来限定本发明。

实施例1：

结构式(1)所示15-氧代绣线菊内酯(15-oxospiramilactone)的

制备方法：

1、绣线菊碱A、B、C和D(spiramine A，B，C and D)的提取分离：

椭圆叶粉花绣线菊全株干粉(Spiraea japonica var.ovalifolia)30kg，用95％乙醇加热回流提取三次(3×4h)，合并提取液，减压回收乙醇，得浸膏4.6kg。将其用3％盐酸捏溶、过滤，酸液分别用石油醚-苯萃取三次以脱脂，再以NaOH水溶液碱化至pH＝11，氯仿萃取三次，氯仿层水洗至中性，无水Na₂SO₄干燥，过滤，回收氯仿，即得绣线菊总生物碱。总碱经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯-二乙胺)，得到spiramine A(500mg)和spiramine B(450mg)，以及它们的混合物10.2g；spiramine C(210mg)和spiramine D(195mg)，以及它们的混合物7.5g。

spiramine A的光谱数据：EIMS m/z(％)：399[M]⁺(99)，382(22)，371(31)，356(59)，340(35)，329(37)，286(23)，268(52)，239(67)，149(100)，109(21)，83(82)，72(31)，57(37)。¹H NMR(C₆D₆，400MHz)δ：1.18(3H，s，H-18)，1.65(3H，s，-COCH₃)，1.80(1H，dd，J＝13，15Hz，H-6α)，2.23(1H，m，H-12)，2.63(1H，ddd，J＝5，15，4Hz，H-6β)，3.24，3.01(each 1H，m，H₂-21)，3.81，3.37(each 1H，m，H₂-22)，3.54(1H，d，J＝5Hz，H-7)，3.87(1H，s，H-19)，4.47(1h，d，J＝2Hz，H-20)，5.30，5.04(each 1H，brs，H₂-17)，5.46(1H，brs，H-15)；¹³C NMR(C₆D₆，100.6MHz)δ：41.0(C-1，t)，22.9(C-2，t)，29.8(C-3，t)，35.4(C-4，s)，45.2(C-5，d)，25.3(C-6，t)，69.2(C-7，d)，40.8(C-8，s)，43.0(C-9，d)，34.2(C-10，s)，23.5(C-11，t)，36.7(C-12，d)，21.1(C-13，t)，20.9(C-14，t)，74.2(C-15，d)，150.1(C-16，s)，114.3(C-17，t)，25.9(C-18，q)，95.3(C-19，d)，85.8(C-20，d)，51.0(C-21，t)，63.1(C-22，t)，171.0(C-23，s)，.20.4(C-24，q)。

spiramine B的光谱数据：¹H NMR(C₆D₆，400MHz)δ：0.97(3H，s，H-18)，1.66(3H，s，-COCH₃)，2.59(1H，ddd，J＝5，15，4Hz，H-6β)，3.02，2.70(each 1H，m，H₂-21)，3.73，3.65(each 1H，m，H₂-22)，3.61(1H，d，J＝5Hz，H-7)，4.27(1H，s，H-19)，4.69(1h，d，J＝2Hz，H-20)，5.30，5.04(each 1H，brs，H₂-17)，5.46(1H，brs，H-15)；¹³C NMR(C₆D₆，100.6MHz)δ：33.9(C-1，t)，22.9(C-2，t)，29.8(C-3，t)，35.4(C-4，s)，47.4(C-5，d)，25.3(C-6，t)，69.7(C-7，d)，41.0(C-8，s)，43.9(C-9，d)，34.9(C-10，s)，23.1(C-11，t)，36.4(C-12，d)，21.2(C-13，t)，20.8(C-14，t)，74.3(C-15，d)，150.1(C-16，s)，114.3(C-17，t)，25.9(C-18，q)，91.3(C-19，d)，83.5(C-20，d)，45.7(C-21，t)，64.9(C-22，t)，171.1(C-23，s)，20.8(C-24，q)。

spiramine C的光谱数据：EIMS m/z(％)：357[M]⁺(95)，340(100)，328(54)，286(33)，268(10)，239(28)，229(50)，72(38)。¹H NMR(C₆D₆，400MHz)δ：0.67(1H，m，H-5)，1.22(3H，s，H-18)，2.22(1H，m，H-12)，3.25，3.00(each 1H，m，H₂-21)，3.79(1H，brs，H-15)，3.80(1H，d，J＝5Hz，H-7)，3.83，3.36(each 1H，m，H₂-22)，3.88(1H，s，H-19)，4.49(1h，d，J＝2Hz，H-20)，4.93，4.90(each 1H，brs，H₂-17)；¹³C NMR(C₆D₆，100.6MHz)δ：40.8(C-1，t)，23.0(C-2，t)，29.9(C-3，t)，35.4(C-4，s)，45.5(C-5，d)，25.2(C-6，t)，69.0(C-7，d)，41.5(C-8，s)，43.1(C-9，d)，34.1(C-10，s)，23.5(C-11，t)，37.0(C-12，d)，19.9(C-13，t)，20.4(C-14，t)，74.3(C-15，d)，155.3(C-16，s)，112.0(C-17，t)，26.4(C-18，q)，95.3(C-19，d)，85.9(C-20，d)，51.0(C-21，t)，63.1(C-22，t)。

spiramine D的光谱数据：¹H NMR(C₆D₆，400MHz)δ：0.77(1H，m，H-5)，0.99(3H，s，H-18)，2.61(1H，m，H-12)，3.04，2.71(each 1H，m，H₂-21)，3.74，3.66(each 1H，m，H₂-22)，3.79(1H，brs，H-15)，3.86(1H，d，J＝5Hz，H-7)，4.29(1H，s，H-19)，4.72(1h，d，J＝2Hz，H-20)，4.94，4.91(each 1H，brs，H₂-17)；¹³C NMR(C₆D₆，100.6MHz)δ：34.2(C-1，t)，23.0(C-2，t)，30.0(C-3，t)，35.6(C-4，s)，47.3(C-5，d)，25.5(C-6，t)，69.6(C-7，d)，41.9(C-8，s)，44.3(C-9，d)，34.2(C-10，s)，23.1(C-11，t)，37.6(C-12，d)，23.1(C-13，t)，20.4(C-14，t)，75.4(C-15，d)，156.2(C-16，s)，111.6(C-17，t)，26.9(C-18，q)，91.5(C-19，d)，83.6(C-20，d)，45.7(C-21，t)，64.9(C-22，t)。

2、绣线菊内酯(spiramilactone)和绣线菊内酯C(spiramilactoneC)的制备：

取spiramine A，B的混合物(8.0g，20.1mmol)[或者是spiramineC，D的混合物]溶于300mL甲醇中，加入慢慢45g KOH，加热回流72h，TLC跟踪，直至生物碱试剂不显色，原料消耗完毕，反应产物点不变。减压回收MeOH，盐酸中和至弱酸性，CHCl₃萃取三次，水洗至中性，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压回收CHCl₃，经硅胶柱层析(洗脱剂：CHCl₃-Me₂CO 10∶1)，得到1.980g spiramilactone C，得率29.7％；1.020g spiramilactone，得率15.3％。

spiramilactone C的光谱数据：EIMS m/z(％)：332[M]⁺(53)，314[M-H₂O]⁺(66)，296(6)[M-2×H₂O]⁺，286(42)，269(28)，255(15)，241(30)，227(21)，213(22)，199(28)，171(29)，145(29)，121(45)，105(70)，91(100)，79(78)，67(43)，55(66)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：1.18(3H，s，H-18)，3.61(1H，dd，J＝1.8，11.6Hz，H-7)，3.64(1H，brs，H-15)，4.07(1H，d，J＝11.4Hz，H-20a)，4.42(1H，dd，J＝2.2，11.6Hz，H-20b)，4.55(1H，d，J＝2.2Hz，H-17a)，4.72(1H，d，J＝2.2Hz，H-17b)；¹³CNMR(CDCl₃，100.6MHz)δ：42.8(C-1，t)，20.6(C-2，t)，37.8(C-3，t)，46.4(C-4，s)，52.1(C-5，d)，20.6(C-6，t)，82.1(C-7，d)，38.2(C-8，s)，48.5(C-9，d)，34.0(C-10，s)，42.4(C-11，t)，36.4(C-12，d)，27.8(C-13，t)，24.4(C-14，t)，70.5(C-15，d)，151.5(C-16，s)，104.4(C-17，t)，26.3(C-18，q)，174.4(C-19，s)，76.7(C-20，t)。

spiramilactone的光谱数据：EIMS m/z(％)：332[M]⁺(60)，314[M-H₂O]⁺(100)，296(21)[M-2×H₂O]⁺，286(85)，255(27)，241(38)，213(30)，199(41)，171(45)，145(43)，105(65)，91(99)，79(77)，67(54)，55(83)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：0.85(3H，s，H-18)，3.60(1H，dd，J＝4.1，10.5Hz，H-7)，3.82(1H，d，J＝1.8Hz，H-15)，3.98(1H，d，J＝11.8Hz，H-19a)，4.14(1H，dd，J＝2.2，11.8Hz，H-19b)，4.88(1H，d，J＝1.8Hz，H-17a)，4.96(1H，d，J＝1.8Hz，H-17b)；¹³C NMR(CDCl₃，100.6MHz)δ：40.5(C-1，t)，20.2(C-2，t)，37.3(C-3，t)，32.5(C-4，s)，46.6(C-5，d)，12.9(C-6，t)，80.1(C-7，d)，41.2(C-8，s)，46.4(C-9，d)，45.6(C-10，s)，28.1(C-11，t)，35.7(C-12，d)，26.5(C-13，t)，24.2(C-14，t)，76.7(C-15，d)，155.9(C-16，s)，107.6(C-17，t)，23.3(C-18，q)，76.3(C-19，t)，174.6(C-20，s)。

3、15-氧代绣线菊内酯(15-oxospiramilactone)的制备：

200mg(0.60mmol)spiramilactone溶于25mL CH₂Cl₂中，分批加入活性MnO₂共900mg(6.34mmol)，常温搅拌3天后，TLC检测，原料点消失，过滤，滤渣反复用CHCl₃洗脱，减压浓缩除去溶剂后得氧化产物，经硅胶柱层析(洗脱剂CHCl₃-Me₂CO 12∶1)，得产物120mg，得率60.4％。

化合物15-oxospiramilactone的结构式如(1)：

15-oxospiramilactone的光谱数据：EIMS m/z(％)：330[M]⁺(56)，312[M-H₂O]⁺(100)，284(55)，238(15)，210(17)，197(22)，171(10)，145(14)，95(5)，69(3)，55(3)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：0.92(3H，s，H-18)，4.07(1H，d，J＝11.6Hz，H-19a)，4.10(1H，dd，J＝4.2，11.9Hz，H-7)，4.23(1H，dd，J＝2.3，11.6Hz，H-19b)，5.23(1H，d，J＝1.5Hz，H-17a)，5.93(1H，d，J＝1.5Hz，H-17b)；¹³C NMR(CDCl₃，100.6MHz)δ：40.7(C-1，t)，20.3(C-2，t)，37.5(C-3，t)，32.8(C-4，s)，47.1(C-5，d)，16.7(C-6，t)，69.8(C-7，d)，50.8(C-8，s)，43.7(C-9，d)，46.0(C-10，s)，27.3(C-11，t)，36.0(C-12，d)，23.5(C-13，t)，27.1(C-14，t)，205.1(C-15，s)，147.9(C-16，s)，117.2(C-17，t)，23.6(C-18，q)，76.5(C-19，t)，174.2(C-20，s)。

综上，由绣线菊碱A(spiramine A)、B(spiramine B)制备15-氧代绣线菊内酯(15-oxospiramilactone)的反应式如下：

Scheme 1.(a)15％KOH，MeOH reflux，72hr，(b)MnO2，CH2Cl2，r.t.，72hr

实施例2：

15-氧代绣线菊内酯诱导细胞凋亡的生物学实验结果：

1、15-氧代绣线菊内酯可以诱导肿瘤细胞的凋亡：

流式细胞仪检测细胞凋亡显示：20μM的15-氧代绣线菊内酯处理人结肠癌HCT116细胞，36小时后有53％的细胞发生凋亡，处理48小时后则有67％的细胞发生凋亡；20μM的15-氧代绣线菊内酯处理人结肠癌SW480细胞48小时后有92％的细胞发生凋亡；20μM的15-氧代绣线菊内酯处理人神经瘤母细胞SH-SY5Y，36小时后有45％的细胞发生凋亡。

2、15-氧代绣线菊内酯可以诱导Bax缺失的人结肠癌肿瘤细胞HCT116发生凋亡：

20μM的15-氧代绣线菊内酯处理HCT116 Bax^-/-细胞，36小时后有46％的细胞发生凋亡，处理48小时后则有55％的细胞发生凋亡.

3、15-氧代绣线菊内酯可以诱导Bcl-2高表达的人多发性骨髓瘤细胞IM-9发生凋亡：

20μM的15-氧代绣线菊内酯处理抑凋亡蛋白Bcl-2高表达的人多发性骨髓瘤IM-9细胞，48小时后有42％的细胞发生凋亡。

4、15-氧代绣线菊内酯可以诱导Bax和Bak双缺失的小鼠胚胎上皮细胞发生凋亡：

10μM的15-氧代绣线菊内酯处理Bax^-/-Bak^-/-MEF细胞48小时，有54％的细胞发生凋亡。

5、15-氧代绣线菊内酯可以抑制HCT116 Bax^-/-移植裸鼠肿瘤生长：

3×10⁶促凋亡蛋白Bax缺失的人结肠癌HCT116细胞注射入裸鼠背部皮下，10天后肿瘤长至约20mm³，腹腔注射30mg/kg的15-氧代绣线菊内酯或者是溶剂对照，每三天注射一次。21天后加药组肿瘤大小约是空白对照组的30％，加药组肿瘤重量约是空白对照组的30％。而加药组和对照组裸鼠的体重没有明显差异。表明15-氧代绣线菊内酯可以作为一个潜在的化疗药物，在杀伤对很多化疗药物有抗性的肿瘤细胞时，对动物体没有明显损害。

Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡调控过程中起着重要作用，Bax是Bcl-2家族中主要的促凋亡蛋白之一，Bax缺失的细胞对于多种凋亡诱导剂不敏感，Bax在肿瘤细胞内的低表达或异常表达造成了很多肿瘤细胞的抗药性。本发明的研究结果表明：15-氧代绣线菊内酯可以克服因Bax缺失而引起的肿瘤细胞的抗药性。

Bcl-2是Bcl-2家族中主要的抗凋亡蛋白之一，Bcl-2的高表达可以抑制很多种化疗药物诱导的细胞凋亡。而在肿瘤细胞中尤其是人淋巴瘤中Bcl-2普遍高表达，造成了对多种化疗药物的抗性。本发明的研究结果表明：15-氧代绣线菊内酯可以诱导Bcl-2高表达的细胞发生凋亡，克服了Bcl-2高表达引起的肿瘤细胞对化疗药物的抗性。

Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中起着重要作用，而除Bax之外，Bak也是一个主要的促凋亡蛋白，共同调节细胞凋亡和细胞色素C释放，如果同时缺失Bax和Bak，细胞将会对多种凋亡刺激产生很大抗性。本发明的研究结果表明：15-氧代绣线菊内酯可以诱导Bax和Bak双缺失的小鼠胚胎上皮细胞发生凋亡，提示与以往的化疗药物不同，该药可以诱导对多种化疗药物有抗性的细胞发生凋亡。

本发明的研究结果还表明：5-氧代绣线菊内酯可以抑制HCT116Bax^-/-移植裸鼠肿瘤生长，而加药组和对照组裸鼠的体重没有明显差异。表明15-氧代绣线菊内酯可以作为一个潜在的化疗药物，在杀伤对很多化疗药物有抗性的肿瘤细胞时，对动物体没有明显损害。

实施例3：

按实施例1的方法先制得15-氧代绣线菊内酯，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例4：

按实施例1的方法先制得15-氧代绣线菊内酯，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例5：

将所分离得到的15-氧代绣线菊内酯与赋形剂重量比为9∶1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

实施例6：

按实施例1的方法先制得15-氧代绣线菊内酯，按其与赋形剂重量比为1∶5-1∶10的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例7：

按实施例1的方法先制得15-氧代绣线菊内酯，按常规口服液制法制成口服液。

实施例8：

按实施例1的方法先制得15-氧代绣线菊内酯，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

实施例9：

按实施例1的方法先制得15-氧代绣线菊内酯，按其与赋形剂重量比为3∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

Claims

1.结构式(1)所示化合物15-氧代绣线菊内酯，

2.抗肿瘤药物组合物，含有权利要求1所述的式(1)所示的药物有效成分15-氧代绣线菊内酯及可药用载体和/或赋形剂。

3.权利要求1所述式(1)化合物的制备方法，由植物椭圆叶粉花绣线菊中分离得到的绣线菊碱A和B，在强碱存在下，经水解和分子内歧化反应生成绣线菊内酯和绣线菊内酯C，绣线菊内酯再经氧化得到15-氧代绣线菊内酯。

(a)15％KOH，MeOH reflux，72hr，(b)MnO₂，CH₂Cl₂，r.t.，72hr。

4.权利要求1式(1)化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.权利要求1式(1)化合物在制备抗多种化疗药物有抗性的肿瘤细胞的抗肿瘤药物中的应用。

6.权利要求2所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.权利要求2所述药物组合物在制备抗多种化疗药物有抗性的肿瘤细胞的抗肿瘤药物中的应用。