CN101239950B - 1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酯或其酰胺类化合物及其合成和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酯或其酰胺类化合物A，经研究证实，它们的抗生育活性强，还具有抗病毒活性，因此可用于制备抗生育药物、抗病毒药物。为临床提供新的男性避孕药及抗病毒药，有较大的应用价值，本发明提供了制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及药物化合物，具体涉及1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酯或其酰胺类化合物及其合成和应用。
背景技术
避孕药物，多年来应用最多的是激素类避孕药，由于这类药物干扰正常人的生理功能，副作用较大，它的应用受到限制。另外，外用避孕药临床也有应用，由于这类药物避孕效果不够满意，加之其它副反应，因此，临床上也未普遍推广应用。预计2020年全球将有10亿人口进入生育高峰期，人口膨胀的压力随之增大，但人类缺乏新的生育控制方法。迄今为止，男性避孕也仅限于避孕套和输精管结扎，而男性避孕药物仍是临床空白。因此，寻找高效、低毒尤其是避孕机理独特的男性避孕药，意义重大。
附睾作为男性的附属性腺，对于精子的成熟、贮存和保护起决定作用，人们试图研发作用于附睾的药物，它不影响睾丸精子发生、生殖内分泌和性功能，但能影响精子成熟，从而发挥避孕效用。该类药物具有副作用少、生育可逆抑制等优点。但是，附睾是一个人体器官，不能以此作为药物设计的靶点。因而必须考虑另外的有效点。附睾是精子获能和成熟的场所。精子成熟的标志之一是头部的顶体与顶体酶形成。顶体酶是存在于精子顶体内的一种类似于胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶，位于精子顶体内层浆膜上，属膜结合性酶，以酶原形式合成并储存在顶体内。当发生顶体反应时，顶体酶原释放，它能将卵细胞的透明带水解出一条通道，便于精子穿过透明带与卵细胞结合。顶体酶是受精过程中的一种重要的蛋白水解酶。此酶的抑制剂能阻止精子的顶体反应、精子与透明带结合，以及阻止精子对透明带和卵黄膜的穿透。因此，贮存在附睾中的精子顶体蛋白酶被抑制，将直接影响受精，从而达到避孕目的。由此可见，顶体蛋白酶在抗生育药物设计中有其重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于研究设计抑制贮存在附睾中的精子顶体蛋白酶的男性避孕药。
本发明人通过同源模建的方法首次构建了人顶体酶的三维蛋白结构，又采用多拷贝同时搜寻(MCSS)方法进一步深入分析人顶体酶活性位点的空间特征、关键力场和关键功能残基的分布，确定重要的药物结合位点，在此基础上，设计合成了1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酯与酰胺类化合物。
本发明提供了一种1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酯或其酰胺类化合物，该化合物的结构通式A如下：
A
式中R1为OH、CH3O，、CH3CH2O或其脂肪酯、芳香脂或杂环酯；或为CH3NH、CH3CH2NH、CH3CH2CH2NH、CH(CH3)2CH2NH或其脂肪胺、芳香胺或杂环胺；
R2为F、Cl、Br、I、OH、NH2、CH3、CH3O、CF3、NO2、CN；
R3为F、Cl、Br、I、OH、NH2、CH3、CH3O、CF3、NO2、CN；
R4为F、Cl、Br、I、OH、NH2、CH3、CH3O、CF3、NO2、CN；
R5为F、Cl、Br、I、OH、NH2、CH3、CH3O、CF3、NO2、CN；
R6为F、Cl、Br、I、OH、NH2、CH3、CH3O、CF3、NO2、CN。
本发明化合物A中各R基团的优选为：
(1)R2，R3，R5，R6各为H；R4为OH、NH2、CH3、CH3O、CF3、NO2、CN或X，所述X为F、Cl、Br或I；R1为CH3CO、CH3CH2CO或C2-C10的直链或支链酯、烯酯、芳香酯或杂环酯或为CH3NH、CH3CH2NH、CH(CH3)2CH2NH或酰胺、烯酰胺、芳酯胺或杂环酰胺。
(2)R2，R4，R5，R6各为H；R3为OH、NH2、CH3、CH3O、CF3、NO2、CN或X，所述X为F、Cl、Br或I；R1为CH3CO、CH3CH2CO、C2-C10的直链或支链酯、烯酯、芳香酯或杂环酯或为CH3NH、CH3CH2NH、CH(CH3)2CH2NH或酰胺、烯酰胺、芳酯胺或杂环酰胺。
(3)R3，R4，R5，R6各为H；R2为OH、NH2、CH3、CH3O、CF3、NO2、CN或X，所述X为F、Cl、Br或I；R1为CH3CO、CH3CH2CO、C2-C10的直链或支链酯、烯酯、芳香酯或杂环酯或为CH3NH、CH3CH2NH、CH(CH3)2CH2NH或酰胺、烯酰胺、芳酯胺或杂环酰胺。
(4)R3，R5，R6各为H；R2，R4各为OH、NH2、CH3、CH3O、CF3、NO2、CN或X，所述X为F、Cl、Br或I；R1为CH3CO、CH3CH2CO、C2-C10的直链或支链酯、烯酯、芳香酯或杂环酯或为CH3NH、CH3CH2NH、CH(CH3)2CH2NH或酰胺、烯酰胺、芳酯胺或杂环酰胺。
(5)R2，R4，R6各为H，R3，R5各为OH、NH2、CH3、CH3O、CF3、NO2、CN或X，所述X为F、Cl、Br或I；R1为CH3CO、CH3CH2CO、C2-C1的直链或支链酯、烯酯、芳香酯或杂环酯或为CH3NH、CH3CH2NH、CH(CH3)2CH2NH或酰胺、烯酰胺、芳酯胺或杂环酰胺。
R2，R4，R6为H，R3，R5为OH、NH2、CH3、CH3O、CF3、NO2、CN或X(X＝F，Cl，Br，I)；R1为CH3CO，CH3CH2CO，C2-C10的直链或支链酯、烯酯、芳香酯或杂环酯；或CH3NH、CH3CH2NH、CH(CH3)2CH2NH或酰胺、烯酰胺、芳酯胺或杂环酰胺。
(6)R3，R4，R5各为H，R2，R6各为OH、NH2、CH3、CH3O、CF3、NO2、CN或X，所述X为F、Cl、Br或I；R1为CH3CO、CH3CH2CO、C2-C10的直链或支链酯、烯酯、芳香酯或杂环酯或为CH3NH、CH3CH2NH、CH(CH3)2CH2NH或酰胺、烯酰胺、芳酯胺或杂环酰胺。
本发明的另一目的是提供了上述1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酯或其酰胺类化合物A的合成方法。
本发明化合物合成方法包括下列步骤：
操作步骤：
(1)1H-吲唑-3-羧酸酯或其酰胺(化合物VI)的制备
取1H-吲唑-3-羧酸(0.5mol)，EDC.HCl(0.5mol)，无水甲醇、无水乙醇、无水丙醇、C2-C10的直链或支链醇或其烯醇或其芳香醇或其杂环醇(0.5-mol)；或氯化亚砜0.5-5mol，三乙胺0.5mol，甲胺或乙胺或异丙胺或其烯胺或芳胺或杂环胺0.5-1mol，反应1~10小时，得粗品，有机溶剂重结晶得化合物VI；
(2)吲唑-3-羧酸酯或其酰胺-1-钠盐(化合物VII)的制备
化合物VI 0.1mol，溶于100～200ml四氢呋喃，搅拌，0～5℃，加入60％氢化钠0.1～0.15mol，反应1～3小时，得化合物VII；
(3)取代苯甲酰氯(化合物VIII)的制备
将取代的苯甲酸0.1mol，溶于0.1～1mol氯化亚砜，DMF 1～5滴，搅拌，回流1～3小时，回收过量氯化亚砜，残留物减压蒸馏，收集液状物馏份，得化合物VIII；
(4)1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酯或其酰胺类化合物A的制备
化合物VII 0.01mol，溶于10～20ml四氢呋喃，0～5℃，搅拌，滴加0.01～0.02mol取代的苯甲酰氯与四氢呋喃5～10ml的混合物，加毕，继续反应2～6小时，常压蒸去四氢呋喃，残留物中加入冰水10～20ml，搅拌，过滤，得粗品，粗品以醇重结晶得纯品。
更具体的合成步骤包括：
(i)1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酯A1的合成步骤：
(1)1H-吲唑-3-羧酸乙酯化合物VIa的合成
取1H-吲唑-3-羧酸81.5g(0.5mol)，无水乙醇700～900ml，EDC.HCl95.5g(0.5mol)，0～5℃搅拌反应4～6小时，回收乙醇至干，残余物加冰水适量，得粗品后，以二氯甲烷重结晶，得化合物VIa 69g，产率72.6％，mp127～128℃。
(2)吲唑-3甲酸乙酯-1-钠盐化合物VIIa的合成
取化合物VIa 1.9g(0.01mol)，四氯呋喃10～20ml，搅拌，0～5℃，加入60％氯化钠0.4g(0.01mol)，反应1～3小时，得化合物VIIa，备用。
(3)取代的苯甲酸酰氯 化合物VIII的制备
取代的苯甲酸0.022mol，氯化亚砜0.132mol，DMF 1～3滴，搅拌，回流1～3小时，回收过量氯化亚砜，残留物减压蒸馏，收集液状物馏份，得化合物VIII。
(4)1-取代-吲唑-3-羧酸酯化合物A1的制备
化合物VIIa 0.01mol，本操作过程中第二步反应的备用反应物，滴加化合物VIII0.01mol与四氢呋喃10～15ml的混合液，加毕，继续反应2小时，常压蒸去四氢呋喃，残留物加入冰水20ml，搅拌，过滤，得粗品，粗品以甲醇重结晶得纯品化合物A1。
(ii)1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酰胺的合成步骤：
操作步骤：
(1)1H-吲唑-3-羧酸酰氯(化合物VIb)的制备
化合物V(0.308mol)，氯化亚砜(0.308mol～3.00ml)，DMF 1～5滴，搅拌回流1～3小时，常压回收过量氯化亚砜，得化合物VIb，产率85％～95％。
(2)1H-吲唑-3-羧酸甲酰胺(化合物VIc)的制备
化合物VIb(0.277mol)，二氯甲烷200～300ml，-5℃～10℃，加入三乙胺(0.277mol～0.554mol)，滴加甲胺(醇溶液)(0.277mol～0.554mol)，加毕，0～10℃继续反应2～6小时。粗品以丙酮重结晶，得化合物VIc，产率70～81％。
(3)吲唑-3-羧酸酰胺-1-钠盐(化合物VIIb)的制备
化合物VIc(0.01mol)，四氢呋喃10～20ml，搅拌，0～5℃，加入60％氢化钠(0.01mol)，反应1～3小时，得化合物VIIb，备用。
(4)取代的苯甲酸酰氯(化合物VIII)的制备
取代的苯甲酸(0.022mol)，氯化亚砜15.7g(0.132mol)，DMF 1～3滴，搅拌，回流1～3小时，回收过量氯化亚砜，残留物减压蒸馏，收集液状物馏份，得化合物VIII。
(5)1-取代-吲唑-3-甲酰甲胺类目标化合物(化合物A2)的制备。
化合物VIIb 0.01mol，四氢呋喃10～20ml，0～5℃，搅拌，滴加化合物VIII 0.011mol与四氢呋喃5～10ml的混合液，加毕，继续反应2～6小时，常压蒸去四氢呋喃，残留物中加入冰水10～20ml，搅拌，过滤，得粗品，粗品以甲醇重结晶得纯品。
(iii)其中化合物V的合成步骤
操作步骤：
(1)N-乙酰苯肼(II)的制备
取苯肼(1mol)，水150～300ml，乙酸(0.931mol)，搅拌，加热回流5～7小时，加毕，放冷，慢慢析出固体，过滤，固体以水重结晶，得化合物II，收率76.6％，mp：128～130℃。
(2)N-乙酰氨基异亚硝基乙酰苯胺(化合物III)的制备
取化合物II(0.50mol)，盐酸羟胺(1.5mol)，硫酸钠500g与水1650ml的溶液，1N盐酸250ml搅拌，加热至95℃，30分钟内加入水合氯醛(0.65mol)与水220ml的溶液，加毕后搅拌反应3小时，稍放冷后，加入活性炭5～10g，再加热至100℃，趁热抽滤。滤液放冷，慢慢析出结晶，过滤，固体以适量水洗，抽干，干燥，得化合物III，收率77.8％，mp：132～135℃。[参考J.Heterocyclic Chem，26，531(1989)报道的方法合成]
(3)1H-吲唑-3-羧酸(V)的制备
取化合物III 55.3g(0.25mol)，部分地加入至55℃的98％的硫酸250ml中，加毕后，将反应温度升至80～90℃，搅拌反应10～20分钟，放冷后，将反应物慢慢倾入600～800g碎冰中，所得悬浮物回流2～5小时，放冷，析出结晶，过滤，水洗，干燥后得粗品42g，粗品以冰乙酸重结晶得化合物V 29g，收率71.5％，mp：265～267℃。[参考J.Heterocyclic chem，26，531(1989)报道的方法合成]
本发明人通过核磁氢谱检测证明了1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酯与酰胺类化合物A的化学结构。其核磁共振谱数据见表1。
表1化合物结构及其核磁共振谱数据
表2化合物熔点
| 化合物编号 | 化合物熔点(℃) | 化合物编号 | 化合物熔点(℃) |
| 1 | 88～90 | 24 | 156～158 |
| 2 | 128～130 | 25 | 190～192 |
| 3 | 130～132 | 26 | 137～139 |
| 4 | 94～96 | 27 | 133-135 |
| 5 | 91～93 | 28 | 129～131 |
| 6 | 122～124 | 29 | 281～283 |
| 7 | 138～140 | 30 | 136～138 |
| 8 | 120～122 | 31 | 174～176 |
| 9 | 128～130 | 32 | 181～183 |
| 10 | 194～196 | 33 | 144～147 |
| 11 | 167～169 | 34 | 175～177 |
| 12 | 168～170 | 35 | 136～138 |
| 13 | 116～118 | 36 | 264～266 |
| 14 | 135～137 | 37 | 159～161 |
| 15 | 112～114 | 38 | 169～171 |
| 16 | 111～113 | 39 | 138～140 |
| 17 | 124～126 | 40 | 191～193 |
| 18 | 150～152 | 41 | 181～183 |
| 19 | 158～160 | 42 | 201～203 |
| 20 | 149～151 | 43 | 149～151 |
| 21 | 116～118 | 44 | 208～210 |
| 22 | 136～138 | 45 | 268～270 |
| 23 | 139～141 | 46 | 105～107 |
注：温度计未经校正
本发明的又一目的是提供了上述1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酯或其酰胺类化合物A在制备抗生育药物中的应用。
本发明人通过测试各个目标化合物体外抑制人精子顶体酶活性，结果表明，与公认的顶体酶抑制剂TLCK相比，所有目标化合物对人精子顶体酶均具有抑制活性，其中化合物1，3，10，13，15，17，18，19，21，22，26，30，31，32，38，39，44，45，46对人精子顶体酶具有较强的抑制活性。
通过测试7个目标化合物对SD雄性大鼠的实验，表明化合物26对SD雄性大鼠具有抗生育作用。
本发明还有一个目的是提供了上述1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酯或其酰胺类化合物A在制备抗病毒药物中的应用。本发明人通过化合物26体外抗HIV-1活性初筛，结果表明化合物26对C8166细胞的毒性较大，CC50为43.77-9.43μg/ml，对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体抑制的EC50为2.69μg/ml，治疗指数(TI值)为16.27，对HIV-1急性感染上清中P24产生抑制的EC50为0.95μg/ml，治疗指数(TI值)为9.93。
本发明首次公开和合成了1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸酯或其酰胺类化合物A，并提供了化合物A在制备抗生育和抗病毒药物中的应用。为临床提供新的男性避孕药及抗病毒药，有较大的应用价值。
具体实施方式
实施例1、N-乙酰苯肼(化合物II)的制备
取苯肼108.14g(1mol)，水200ml，乙酸55.9g(0.931mol)，搅拌，加热回流5～7小时，加毕，放冷，慢慢析出固体，过滤，固体以水重结晶，得化合物II 115g，收率76.6％，mp：128～130℃。
实施例2、N-乙酰氨基异亚硝基乙酰苯胺(化合物III)的制备
取化合物II 75.1g(0.50mol)，盐酸羟胺104.2g(1.5mol)，硫酸钠500g与水1650ml的溶液，1N盐酸250ml搅拌，加热至95℃，30分钟内加入水合氯醛107.5g(0.65mol)与水220ml的溶液，加毕后搅拌反应3小时，稍放冷后，加入活性炭5～10g，再加热至100℃，趁热抽滤。滤液放冷，慢慢析出结晶，过滤，固体以适量水洗，抽干，干燥，得化合物(III)86g，收率77.8％，mp：132～135℃。
实施例3、1H-吲唑-3-羧酸(中间体V)的制备
化合物III 55.3g(0.25mol)，部分地加入至55℃的98％的硫酸250ml中，加毕后，将反应温度升至85℃，搅拌反应15分钟，放冷后，将反应物慢慢倾入700g碎冰中，所得悬浮物回流3小时，放冷，析出结晶，过滤，水洗，干燥后得粗品42g，粗品以冰乙酸重结晶得化合物V29g，收率71.5％，mp：265～267℃。[核磁H谱：7.33(q，1H)，8.36(s，1H)，8.37(t，1H)，8.45(t，1H)，10.07(宽峰，N-H)，12.76(s，-COOH)]
实施例4、1H-吲唑-3-羧酸乙酯(化合物VIa)的制备
取化合物V 81.1g(0.5mol)，无水乙醇800ml，EDC.HCl 95.9g(0.5mol)，0～5℃搅拌反应5小时，回收乙醇至干，残余物加冰水适量，得粗品后，以二氯甲烷重结晶，得化合物VIa 69g，产率72.6％，mp：127～128℃。[核磁H谱：1.48(t，3H，-CH3)，4.58(q，2H，-CH2-)，7.27～8.24(m，4H，Ar-H)，12.97(宽峰，1H，-NH)]
实施例5、1-(4-甲基苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(化合物编号1)的制备
取4-甲基苯甲酸3g(0.022mol)，氯化亚砜15.7g(9.5ml，0.132mol)，DMF3滴，搅拌，回流1.5小时，回收过量氯化亚砜，残留物减压蒸馏，收集bp：225～227℃馏份得淡黄色液状物2.8g，产率82.4％。
化合物VIa 1.9g(0.01mol)，四氢呋喃15ml，搅拌，0～5℃，加入60％氢化钠0.4g(0.01mol)，反应1小时，保持反应温度0～5℃，滴加4-甲基苯甲酰氯1.6g(0.01mol)与四氢呋喃10ml的混合液，加毕，继续反应2小时。常压蒸去四氢呋喃，残留物加入冰水20ml搅拌，过滤，得粗品。粗品以甲醇重结晶得纯品2.5g，产率80.6％。
下列化合物均按实施例5的方法制备：由1H-吲唑-3-羧酸乙酯与不同取代的苯甲酰氯反应，生成不同的目标化合物。
当取代的苯甲酰氯为2-甲基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2-甲基苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号2)；
当取代的苯甲酰氯为2，4-二甲基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2，4-二甲基苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号3)；
当取代的苯甲酰氯为3，5-二甲基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(3，5-二甲基苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号4)；
当取代的苯甲酰氯为4-甲氧基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-甲氧基苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号5)；
当取代的苯甲酰氯为2-甲氧基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2-甲氧基苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号6)；
当取代的苯甲酰氯为3，4-二甲氧基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(3，4-二甲氧基苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号7)；
当取代的苯甲酰氯为2，4-二甲氧基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2，4-二甲氧基苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号8)；
当取代的苯甲酰氯为4-三氟甲基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-三氟甲基苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号9)；
当取代的苯甲酰氯为2-硝基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2-硝基苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号10)；
当取代的苯甲酰氯为3-硝基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(3-硝基苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号11)；
当取代的苯甲酰氯为4-硝基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-硝基苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号12)；
当取代的苯甲酰氯为4-氟苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-氟苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号13)；
当取代的苯甲酰氯为2-氟苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2-氟苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号14)；
当取代的苯甲酰氯为4-氯苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-氯苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号15)；
当取代的苯甲酰氯为3-氯苯甲酰氯时，目标化合物为1-(3-氯苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号16)；
当取代的苯甲酰氯为2-氯苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2-氯苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号17)；
当取代的苯甲酰氯为3，4-二氯苯甲酰氯时，目标化合物为1-(3，4-二氯苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号18)；
当取代的苯甲酰氯为2，4-二氯苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2，4-二氯苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号19)；
当取代的苯甲酰氯为2，6-二氯苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2，6-二氯苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号20)；
当取代的苯甲酰氯为4-溴苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-溴苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号21)；
当取代的苯甲酰氯为2-溴-4-氟苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2-溴-4-氟苯甲酰基)-吲唑-3-羧酸乙酯(表1中化合物编号22)。
实施例6、1H-吲唑-3-甲酰甲胺(化合物VIc)的制备
取化合物V 50g(0.308mol)，氯化亚砜219.9g(1.848mol)，DMF 3滴，搅拌，回流2.5小时，常压回收过量氯化亚砜，得化合物VIb。放冷，加入二氯甲烷250ml，0～5℃，加入三乙胺31.2g(0.308mol)，滴加甲胺醇14.3g(0.462mol)，加毕，0～5℃继续反应3小时。反应液移至分液漏斗，适量冰水洗涤，常压蒸干二氯甲烷。粗品以丙酮重结晶，活性炭脱色，得化合物VIc纯品36.5g，产率67.6％，mp：202～203℃。[核磁H谱：2.80(d，3H，-CH3)；7.19～8.36(m，5H，杂环-H)；13.53(s，1H，-NH)。
实施例7、1-(苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(化合物编号23)的制备
取苯甲酸2g(0.016mol)，氯化亚砜11.4g(0.096mol)，DMF 2滴，搅拌回流1.5小时，回收过量氯化亚砜，残留物蒸馏，收集bp197.2℃无色液体，得化合物VIb1.8g，产率80％。
取化合物VIc 1.75g(0.01mol)，四氢呋喃15ml，搅拌0～5℃，加入60％氢化钠0.4g(0.01mol)，反应1小时，保持反应温度0～5℃，滴加苯甲酰氯1.4g(0.01mol)与四氢呋喃5ml的混合液，加毕，继续反应2小时，常压蒸去四氢呋喃，残留物加入冰水20ml搅拌，过滤，得粗品，粗品以甲醇重结晶得纯品2.5g(目标化合物23)，产率89.3％。
下列化合物均按实施例7的方法制备，由1H-吲唑-3-甲酰甲胺与不同取代的苯甲酰氯反应，生成不同的目标化合物。
当取代的苯甲酰氯为3-甲基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(3-甲基苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号为24)；
当取代的苯甲酰氯为4-甲基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-甲基苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号为25)；
当取代的苯甲酰氯为2，4-二甲基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2，4-二甲基苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号为26)；
当取代的苯甲酰氯为2-甲氧基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2-甲氧基苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号为27)；
当取代的苯甲酰氯为3-甲氧基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(3-甲氧基苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号28)；
当取代的苯甲酰氯为4-甲氧基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-甲氧基苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号29)；
当取代的苯甲酰氯为2，4-二甲氧基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2，4-二甲氧基苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号30)；
当取代的苯甲酰氯为4-氟苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-氟苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号31)；
当取代的苯甲酰氯为2-氟苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2-氟苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号32)；
当取代的苯甲酰氯为3-氟苯甲酰氯时，目标化合物为1-(3-氟苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号33)；
当取代的苯甲酰氯为2-硝基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2-硝基苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号34)；
当取代的苯甲酰氯为3-硝基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(3-硝基苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号35)；
当取代的苯甲酰氯为4-硝基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-硝基苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号36)；
当取代的苯甲酰氯为2-氯-4-氟苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2-氯-4-氟苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号37)；
当取代的苯甲酰氯为2-氯苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2-氯苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号38)；
当取代的苯甲酰氯为3-氯苯甲酰氯时，目标化合物为1-(3-氯苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号39)；
当取代的苯甲酰氯为4-氯苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-氯苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号40)；
当取代的苯甲酰氯为3，4-二氯苯甲酰氯时，目标化合物为1-(3，4-二氯苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号41)；
当取代的苯甲酰氯为2，4-二氯苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2，4-二氯苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号42)；
当取代的苯甲酰氯为2，6-二氯苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2，6-二氯苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号43)；
当取代的苯甲酰氯为4-溴苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-溴苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号44)；
当取代的苯甲酰氯为4-腈基苯甲酰氯时，目标化合物为1-(4-腈基苯甲酰基)-吲唑-3-甲酰甲胺(表1中化合物编号45)；
当取代的苯甲酰氯为2-氯-4-氟苯甲酰氯时，目标化合物为1-(2-氯-4-氟苯甲酰基)-吲唑-3-丙酰甲胺(表1中化合物编号46)。
实施例8抗生育活性试验
1、试验目的：测试各个目标化合物体外抑制人精子顶体酶活性。
2、检测原理
人精子顶体酶是受精过程中必不可少的蛋白水解酶，抑制该酶活性可达到避孕目的。
四十六个不同浓度的待测目标化合物与具有生育活性人精子作用，以N-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯甲酰胺盐酸盐(BAPNA)为底物，与去精子释放的顶体酶反应，显色，得到与不同浓度化合物作用后的顶体酶的活性值。并与公认的顶体酶抑制剂TLCK(N-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone)进行比较评价。
3、检测材料与仪器
精子顶体酶试剂盒购自江苏省南京欣迪生物药业工程有限公司。
试剂盒包括：分离剂、顶体酶激活剂、抑制剂、反应底物剂；
N-甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)购自Fluka公司；
人精子经医学伦理委员会讨论通过，在知情同意情况下，采自健康已生育男性。由长海医院生殖医学中心提供，并提供分析检测报告；
精子、微生物动(静)态图像分析系统(荧光版5.0)，清华同方；
BB16UV/BB5060UV CO2培养箱，Heraeus；
XW-80A漩涡混合器；
Lambda 25 UV/VIS分光光度计；
BIORAD smartSpecTM 3000分光光度计；
Hettich Uni 32R冷冻高速离心机；
THZ-C恒温振荡器。
4、检测步骤
4.1精子计数
新鲜精液液化后用精子、微生物动(静)态图像分析系统计数，以X百万/ml表示密度，计数后，按每管7.5×106精子数计算每管所需精液量。
4.2化合物与精子作用
目标化合物以5％DMSO配成不同浓度梯度。将标为实验管(T1～Tn管)的试管中加入7.5×106个精子的精液后，加入一定摩尔数化合物，以生理盐水调整总量为1ml。(注：几乎所有化合物以5％DMSO配制时未完全溶解，部分化合物的溶液为乳白色，有些试管中见絮状物)
另配两管含7.5×106个精子的5％DMSO/生理盐水溶液，标为对照管(C1、C2管)。其中C1为试剂盒空白对照，C2为无抑制的正常精子顶体酶活性值对照。
将T1～Tn管，C1、C2管震荡混匀，置于培养箱25～37℃孵育5分钟。
4.3提取精子
将T1～Tn管，C1、C2管1000G/5min离心，小心吸除上清，保留沉淀精子。用1ml 5％DMSO/生理盐水加入后震荡洗涤，1000G/5min再次离心，小心吸除上清，保留约200μl溶液。
5、测顶体酶活性
5.1取两组1.5ml eppondoff离心管，分别标记为TT1～TTn管；CC1、CC2管。各管加入分离剂0.5ml，将对应T1～Tn、C1、C2管内约200μl溶液吹打混匀后贴壁小心加到对应的TT1～TL、CC1、CC2管内的分离剂液面上，离心1500G/20min，仔细吸除上层液体，保留沉淀精子。
5.2 TT1～TTn、CC1、CC2管先加顶体酶激活剂各900μl，后加反应底物剂100μl，C1管再加抑制剂100μl。充分混匀，置于培养箱25～37℃孵育90min，期间取出震荡1～2次。90分钟后，各TT1～TL管和C2管加抑制剂100μl，终止反应，震荡混匀，离心1500g/5min。
5.3顶体酶活性计算
每管取上清700μl，分光光度计测λ＝410nm时OD值，以蒸馏水调零。
公式：精子顶体酶活性(IU/106精子)＝(T管OD值-C1管OD值)×329
正常对照组的酶活性参考值：
正常精子顶体酶活性(IU/106精子)＝(C2管OD值-C1管OD值)×329
抑酶比值＝(精子正常对照酶活性值-样品酶活性值)÷精子正常对照酶活性值。
6、正常参考值
当计算值＞36(IU/106精子)时认为所测精子活性在可生育正常范围。
7、实验结果见表3
表3化合物抑酶活性结果
8、结论
采用体外试验，检验了46个不同浓度的化合物与具有生育活性的人精子顶体酶作用，通过改良的Kennedy法检测残余酶活性。并与经典的顶体酶抑制剂TLCK作比较。结果表明：所有测试的化合物对人精子顶体酶均具有抑制活性，且都比阳性对照品TLCK抑制活性强，其中化合物1，3，10，13，15，17，18，19，21，22，26，30，31，32，38，39，44，45，46具有较强抑制人精子顶体酶活性。
化合物26体外抗HIV-1活性初筛结果
I材料和方法
1.0测定药物和化合物
待测样品为化合物26。阳性对照化合物叠氮胸苷(AZT，3′-Azido-3′-deoxythymidine)购自Sigma公司。待测样品溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，4℃保存；AZT溶解于RPMI-1640完全培养基中0.22μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存。
2.0试剂和溶液
2.0.1试剂
HEPES(N-2(2-Hydroxyothyl)piperazine-N′-(2-ethanesufonic acid)、MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)、DMF(N，N’-Dimethyl formamine)、青霉素(Penicillin)、硫酸链霉素(Streptomycin sulfate)、谷氨酰胺(Glutamine)均购自Sigma公司；2-巯基乙醇(2-ME，2-Mercaptoethanol)为Bio-Rad公司产品。RPMI-1640和新生小牛血清为Gibco公司产品。
2.0.2培养基
RPMI-1640完全培养基，含有10％新生小牛血清，2mM L-谷氨酰胺，10mMHEPES，50μM 2-巯基乙醇，100,000IU青霉素，100μg/ml链霉素。
3.0细胞和病毒
人T淋巴细胞系C8166、MT-4(P)、慢性感染细胞HIV-1IIIB/H9以及HIV-1实验株HIV-1IIIB均由英国Medical Research Council，AIDS Reagent Project惠赠。所有细胞和病毒均以含10％小牛血清的RPMI-1640完全培养基进行培养。按常规方法制备HIV-1IIIB，滴定并计算出病毒的TCID50。病毒贮存液分装后，置-70℃保存。细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。
4.0 HIV-1感染性滴定
HIV-1IIIB按Johnson&Byington(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下：将HIV-1贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，同时设置对照孔6孔。每孔加入C8166细胞50μl(4×105/ml)，每孔终体积为200μl。37℃，5％CO2培养。第三天补加新鲜RPMI-1640完全培养基100μl，第七天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1诱导的细胞病变效应(Cytopathic Effect，CPE)，以每孔是否有合胞体(Syncytium)的形成确定；按Reed&Muench方法计算病毒的TCID50(50％Tissue Culture Infection Dose)。
5.0对C8166细胞的毒性实验
4×105/ml C8166细胞悬液100ul与不同的待测药物溶液混合，设三个重复孔。同时设置不含药物的对照孔，37℃，5％CO2培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800酶标仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CC50值(50％Cytotoxic Concentration)，即对50％的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的药物浓度。
6.0对HIV-1IIIB致细胞病变(CPE)的抑制实验
将8×105/ml C8166细胞50ul/孔接种到含有100μl/孔梯度倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后加入50μl的HIV-1IIIB稀释上清，1300TCID50/孔。设3个重复孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔。AZT为阳性药物对照。37℃，5％CO2培养3天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。EC50(50％EffectiveConcentration)为抑制合胞体形成50％时的药物浓度。
7.0对HIV-1IIIB感染MT-4细胞死亡的保护作用实验
96孔细胞培养板上，将8×105/ml MT-4细胞悬液50μl与100μl不同浓度的药物溶液混合，培养板的一半孔加入50μl培养基，另一半孔加入50μl HIV-1IIIB稀释上清，26000TCID50/孔，同时设置不含药物的未感染或感染HIV-1的细胞对照孔及空白对照孔，设置阳性药物AZT对照，37℃，5％CO2培养5天，采用MTT法检测细胞存活率。ELx800ELISA Reader测定OD595/630nm值。计算药物对正常细胞的存活率和HIV-1感染细胞的保护率。
8.0捕捉p24抗原ELISA方法测定HIV-1p24抗原
1μg/孔Fc抗体4℃铺板过夜；5％脱脂奶粉37℃封板2小时；加入100μl/孔鼠抗p24单抗(自制)，37℃，1小时；加入100μl/孔合胞体实验裂解上清，37℃，2小时；加入100μl/孔 1∶4000稀释的兔抗p24多抗(自制)，37℃，1小时；加入100μl/孔1∶3000稀释的羊抗兔IgG-HRP(华美)，37℃，1小时；加入OPD底物反应液。10分钟后，2M硫酸终止反应。Elx800ELISA仪测定OD值，测定波长490nm，参考波长630nm。计算出化合物对HIV-1复制表达p24抗原的抑制率和EC50，即抑制50％HIV-1p24抗原表达的化合物浓度。
9.0计算公式
根据实验结果绘制剂量反应曲线，按Reed&Muench法计算出化合物抑制病毒的50％有效浓度(EC50)，50％抑制细胞生长浓度(CC50)及抗HIV-1活性的治疗指数TI值(Therapeutic index)为：TI＝CC50/EC50。
9.1细胞生长存活率(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值×100
9.2HIV-1致细胞病变的抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100
9.3化合物对HIV-1感染细胞的保护率(％)＝(实验孔OD值-HIV感染细胞对照孔OD值)/正常细胞对照孔OD值-HIV感染细胞对照孔OD值×100
9.4HIV-1 p24抗原表达的抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100
II结果
1.0化合物26的细胞毒性作用
表4化合物26对C8166细胞的毒性作用的实验数据
CC50(化合物26)：43.77μg/ml；CC50(AZT)为1288.24μg/ml
2.0化合物26对HIV-1IIIB诱导C8166细胞病变的抑制作用
表5化合物26对HIV-1IIIB诱导C8166细胞病变的抑制作用实验数据
化合物26(A)、和AZT(B)对HIV-1IIIB诱导C8166细胞病变的抑制作用。EC50(化合物26)：2.69μg/ml；
EC50(AZT)：4.00ng/ml
3.0化合物26对HIV-1IIIB感染MT-4(P)细胞死亡的保护作用
表6化合物26对HIV-1IIIB感染MT-4(P)细胞死亡的保护实验数据
化合物26(E)和AZT(F)对HIV-1IIIB感染MT-4(P)细胞死亡的保护作用。CC50(化合物26)：4.68μg/ml，EC50(化合物26)：＞200μg/ml；CC50(AZT)：＞1000ng/ml，EC50(AZT)：1.5ng/ml
4.0化合物26对急性感染中实验株HIV-1IIIB复制的抑制实验
表7化合物26对急性感染中实验株HIV-1IIIB复制的抑制实验数据
化合物26(A)、和AZT(B)对急性感染中实验株HIV-1IIIB复制的抑制。EC50(化合物26)：0.85μg/ml；
EC50(AZT)：0.038μg/ml
III实验结果汇总表
表8化合物26细胞毒性和抗HIV-1活性结果汇总表
IV结论
化合物26对C8166细胞的毒性较大，CC50为43.77-9.43μg/ml，对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体抑制的EC50为2.69μg/ml，治疗指数(TI值)为16.27，对HIV-1急性感染上清中P24产生抑制的EC50为0.95μg/ml，治疗指数(TI值)为9.93；样品对HIV-1感染的MT-4细胞没有保护作用。
Claims (14)
1.一种1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-取代化合物，其特征在于具有式A所示的结构：
其中R1为CH3O、CH3CH2O、CH3NH、CH3CH2NH；R2、R3、R5和R6各为H；R4为CH3、CH3O、CF3、NO2、CN或X，所述X为F、Cl、Br或I；条件是化合物A不为1-(4-氟-苯甲酰基)-吲唑-3-甲酸乙酯和1-(4-氯-苯甲酰基)-吲唑-3-甲酸乙酯。
2.一种1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-取代化合物，其特征在于具有式A所示的结构：
其中R1为CH3O、CH3CH2O、CH3NH、CH3CH2NH；R2、R4、R5和R6各为H；
R3为OH、CH3、CH3O、NO2或X；所述X为F、Cl、Br或I。
3.一种1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-取代化合物，其特征在于具有式A所示的结构：
其中R1为CH3O、CH3CH2O、CH3NH、CH3CH2NH；R3、R4、R5和R6各为H；
R2为CH3、NO2或X，所述X为F、Cl、Br或I；条件是化合物A不为1-(2-硝基-苯甲酰基)-吲唑-3-甲酸乙酯和1-(2-硝基-苯甲酰基)-吲唑-3-甲酸甲酯。
4.一种下式表示的1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-取代化合物，其特征在于具有式A所示的结构：
其中R1为CH3O、CH3CH2O、CH3NH、CH3CH2NH；R3、R5和R6各为H；R2和R4各为CH3、CH3O、NO2或X，所述X为F、Cl、Br或I。
5.一种式A1的化合物：
其中R2、R3、R5、R5和R6同权利要求1定义；条件是化合物A1不为1-(4-氟-苯甲酰基)-吲唑-3-甲酸乙酯和1-(4-氯-苯甲酰基)-吲唑-3-甲酸乙酯。
6.权利要求5所述的式A1的化合物的合成方法，包括下列步骤：
(1)1H-吲唑-3-甲酸乙酯化合物VIa的制备
取1H-吲唑-3-甲酸0.5mol，无水乙醇700～900ml，EDC.HCl 0.5mol，0～5℃搅拌反应4～6小时，回收乙醇至干，残余物加冰水适量，得粗品后，以二氯甲烷重结晶，得化合物VIa，产率72.6％，mp127～128℃；
(2)吲唑-3甲酸乙酯-1-钠盐化合物VIIa的制备
取化合物VIa 0.01mol，四氢呋喃10～20ml，搅拌，0～5℃，加入60％氢化钠0.01mol，反应1～3小时，得化合物VIIa，备用；
(3)取代的苯甲酰氯化合物VIII的制备
取代的苯甲酸0.022mol，氯化亚砜0.132mol，DMF 1～3滴，搅拌，回流1～3小时，回收过量氯化亚砜，残留物减压蒸馏，收集液状物馏份，得化合物VIII，取代基R2、R3、R4、R5和R6同权利要求5定义；
(4)1-取代-吲唑-3-甲酸乙酯化合物的制备
化合物VIIa 0.01mol，本操作过程中第二步反应的备用反应物，滴加化合物VIII0.01mol与四氢呋喃10～15ml的混合液，加毕，继续反应2小时，常压蒸去四氢呋喃，残留物加入冰水20ml，搅拌，过滤，得粗品，粗品以甲醇重结晶得纯品化合物A1。
7.一种式A2的化合物：
其中R2、R3、R4、R5和R6同权利要求1定义。
8.一种如权利要求7所述A2的化合物的合成方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)1H-吲唑-3-甲酰氯化合物VIb的制备
化合物V 0.308mol，氯化亚砜0.308mol～3.00mol，DMF 1～5滴，搅拌回流1～3小时，常压回收过量氯化亚砜，得化合物VIb，产率85％～95％；
(2)1H-吲唑-3-甲酰甲胺化合物VIc的制备
化合物VIb 0.277mol，二氯甲烷200～300ml，-5℃～10℃，加入三乙胺0.277mol～0.554mol，滴加甲胺乙醇溶液0.277mol～0.554mol，加毕，0～10℃继续反应2～6小时，粗品以丙酮重结晶，得化合物VIc产率70～81％；
(3)吲唑-3-甲酰甲胺-1-钠盐化合物VIIb的制备
化合物VIc 0.01mol，四氢呋喃10～20ml，搅拌，0～5℃，加入60％氢化钠0.01mol，反应1～3小时，得化合物VIIb，备用；
(4)取代的苯甲酰氯化合物VIII的制备
取代的苯甲酸0.022mol，氯化亚砜0.132mol，DMF 1～3滴，搅拌，回流1～3小时，回收过量氯化亚砜，残留物减压蒸馏，收集液状物馏份，得化合物VIII，取代基R2、R3、R4、R5和R6同权利要求7定义；
(5)1-取代-吲唑-3-甲酰甲胺化合物化合物A2的制备
化合物VIIb 0.01mol，四氢呋喃10～20ml，0～5℃，搅拌，滴加化合物VIII0.011mol
与四氢呋喃5～10ml的混合液，加毕，继续反应2～6小时，常压蒸去四氢呋喃，残留物中加入冰水10～20ml，搅拌，过滤，得粗品，粗品以甲醇重结晶得纯品化合物A2。
9.一种如权利要求1-4中任一项所述的1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-取代化合物在制备抗生育药物中的应用。
10.一种如权利要求5所述的式A1的化合物在制备抗生育药物中的应用。
11.一种如权利要求7所述的式A2的化合物在制备抗生育药物中的应用。
12.一种如权利要求1-4中任一项所述的1-(取代苯甲酰基)-吲唑-3-取代化合物在制备抗病毒药物中的应用。
13.一种如权利要求5所述的式A1的化合物在制备抗病毒药物中的应用。
14.一种如权利要求7所述的式A2的化合物在制备抗病毒药物中的应用。
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