发明内容
本发明的技术特征,使用氨基全氢化喹唑啉类化合物及其衍生物的可药用盐或酯,即河豚毒素(tetrodotoxin,简称TTX)及其药学上可接受的盐或酯,将其制备成一种或多种组合物用在养殖动物、水生生物中的药用制剂或者是兽用药品。使用本发明制备的氨基全氢化喹唑啉类化合物,给即将出栏的或者是即将屠宰的养殖动物、水生生物使用(注射或口服或贴敷或喷雾或栓剂),优选注射或贴敷。在24-72小时内,可快速将养殖动物或水生物体内含有的盐酸克伦特罗(瘦肉精)类药物及其残留物排泄到体外。
本发明中所述的氨基全氢化喹唑啉类化合物,是以河豚毒素为主的化合物及其衍生物或者是药学上可接受的盐或酯。其化学约结构为:
河豚毒素平面结构(I) 河豚毒素立体结构(II)
式中:R1=R2=R4=R5=OH,R3=CH2OH;河豚毒素(tetrodotoxin)
或 R1=R3=R4=R5=OH,R2=CH2OH;
河豚毒素分子式为:C11H17N3O8,分子量319.27,外观:白色粉末或结晶,无臭,无味,有引湿性,mp:220℃不熔,不分解,温度升高逐步变黑炭化,溶解度:易溶于酸性水溶液,极微溶于水,不溶甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等有机溶剂,比旋光度:[α]15 D-8.64(C 1.0,稀醋酸中),化学名称:八氢-12-(羟甲基)-2-亚氨基-5,9:7,10a-二甲撑基-10a氢-[1,3]-二氧桥-[6,5-d]-嘧啶-4,7,10,11,12-五醇,英文名:
Octahydro-12-(hydroxymethyl)-2-imino-5,9:7,10a-dimethano-10aH-[1,3]-dioxocino-[6,5-d]-
pyrimidine-4,7,10,11,12-pentol,
1、元素分析:
1.1测试仪器,FZASH 1112SERIES EA元素分析仪,0.2MP H2,0.25MP He2(室温)。
元素分析结果
2、红外吸收光谱(IR)见附图1
2.1测试仪器及方法
采用Bio-Rad Win-IR红外谱仪,采用KBr压片法录制光谱图。
2.2仪器校正
按照中国药典2005版二部附录IV C的红外分光光度法校正和检定方法,录制聚苯乙烯薄膜(厚度为0.05mm)的光谱。
聚苯乙烯薄膜的IR谱数据
2.3数据表及解析
河豚毒素的红外光谱测定结果见表。
河豚毒素的IR图谱
2.4红外光谱解析:见附图2
(1)3417、3356、3236cm-1处是胍基的N-H伸缩振动的吸收峰。
(2)3091cm-1处是羟基O-H伸缩振动的吸收峰。
(3)2982、2945、2918cm-1处是亚甲基、次甲基的伸缩振动吸收峰。
(4)1671、1613cm-1处是胍基的C=N伸缩振动特征吸收峰。
(5)1475cm-1处是甲基上C-H面外弯曲振动吸收峰。
(6)1336、1200、1168、1139cm-1处分别是醚键C-O及C-C-O-C伸缩振动吸收峰。
(7)1077cm-1处是环状C-O-C伸缩振动吸收峰。
(8)941、753cm-1处弱峰是次甲基的弯曲振动吸收峰
3、紫外吸收光谱见附图3
3.1测试仪器及方法
HITACHI U-2001 Spectrophotometer紫外分光光度计,用0.1%HCl水溶液溶解河豚毒素,配成100μg/ml浓度的溶液。按分光光度法(中国药典2005版二部附录IV A)在200~340nm的波长范围内扫描,由朗伯比尔定律(E=ε·c·l)计算出摩尔吸收系数ε。
3.2仪器校正
按照中国药典2005版二部附录紫外—可见光光度测定法进行仪器校正,校正测定波长和检定吸光度的准确度。
3.3数据表及解析
河豚毒素及对照品的紫外光谱测定结果见表。
河豚毒素的紫外光谱测定数据
3.4紫外光谱解析:
从吸收带的λmax值可知,190nm为发色团C=N吸收特征带,与其结构相符。
4、核磁共振1H谱见附图4
4.1注明质子顺序编号的结构式
4.2测试仪器及方法
Varian 600MHz型核磁共振仪,D2O+CD3COOD为溶剂,分析方法1H-NMR。
4.3数据表及解析
河豚毒素的1H NMR谱数据
河豚毒素及文献河豚毒素的1H NMR谱的比较
1H NMR谱数据及其解析:见附图4
在1H NMR谱中,δ5.420(d,J=9.6Hz)为H-4质子,它与H-4a显邻位反式偶合;δ2.278(d,J=9.6Hz)为H-4a质子,由于其与H-5(e键)为约90°键角,故偶合常数趋于0Hz。δ4.181(s)为H-5质子,它与H-4a显弱偶合。H-7(δ4.009)和H-8(δ4.224)显弱偶合是由a-e质子偶合所致;δ3.885(s)单峰为H-9质子,CH2-11的2质子δ3.970(d,J=12.0Hz)和3.946(d,J=12.0Hz)显偕二偶合。经解析,本发明的河豚毒素与文献报道 [1,2]一致。
5、核磁共振13C谱见附图5
5.1注明质子顺序编号的结构式
5.2测试仪器及方法
Varian 600MHz型核磁共振仪,D2O+CD3COOD为溶剂,分析方法13C-NMR。
5.3数据表及解析
河豚毒素品的13C NMR谱数据
本发明的河豚毒素及文献河豚毒素13C-NMR谱的比较
13C NMR数据及解析:见附图5--7
(1)本发明中的河豚毒素的13C-NMR谱图中,除去δ181.395ppm处溶剂峰(CD3COOD) 外,出现样品峰11个,分子结构中共有11个碳,与谱图峰数相符。
(2)13C NMR(DAc-D2O)谱中,δ156.193处于化合物碳谱最低场且为季碳,故为胍基碳信号。
(3)δ74.709为C-4信号,4-OH处于e键,δ40.283为C-4a信号,δ73.444为C-5信号,δ71.049为6-OH处于a键的C-6信号;δ79.262为C-7信号,δ70.461为C-9信号;δ72.366和δ59.306分别为C-8及C-8a碳谱峰。
(4)δ110.415为半缩醛碳C-10信号,它与C-5和C-7以C-O键形成笼状结构。
(5)DEPT谱(附图5-7)显示δ65.101处为仲碳,应为C-11的羟甲基信号。
经解析本发明中的河豚毒素的13C-NMR图谱数据,同时结合河豚毒素gHMQC和gHMBC谱图进一步验证与文献报道[1,2]结果一致。以D2O-DAc为溶剂,测定NMR谱时,河豚毒素存在半缩醛(I)和内酯(II)互变异构体的动态平衡[1,2]。
6、质谱见附图8
6.1测试仪器及方法
Apex Bruker质谱分析仪,ESI阳离子法,Bruker Daltonics DataAnaysis 3.4软件分析。
6.2数据图
河豚毒素的高分辨ESI谱图见附图8。
6.3图谱解析
河豚毒素的分子量为319.10,分子式为C11H17N3O8。于质谱分析时采用阳离子法加上了一个质子,所以测试出来结果应该为320.1,测试结果与理论推算结果一致,质谱测试推算分子式为C11H18N3O8,测试结果与之相符。
7、综合解析及结论
7.1分子式推断
元素分析结果(%):C 40.35;H 5.52;N 12.81。
质谱结果:320.1(M+)
假设其分子式为CnHnNnOn,按公式:
化合物原子个数=化合物分子量×元素含量/原子量
可计算出nC=11,nH=17,nN=3,nO=8。
7.2结构式推断
(1)红外吸收图谱分析表明红外光谱在波数1671,1613cm-1处提示为胍基等特征吸收峰;在波数3091cm-1处的宽带吸收峰提示为羟基特征吸收峰,1077cm-1处的吸收峰提示为环状醚键特征吸收峰。
(2)紫外光谱分析结果表明:含有-C=N基团。
(3)核磁共振氢谱:δ5.420(d,J=9.6Hz)为H-4质子,它与H-4a显邻位反式偶合;δ2.278(d,J=9.6Hz)为H-4a质子,由于其与H-5(e键)为约90°键角,故偶合常数趋于0Hz。δ4.181(s)为H-5质子,它与H-4a显弱偶合。H-7(δ4.009)和H-8(δ4.224)显弱偶合是由a-e质子偶合所致;δ3.885(s)单峰为H-9质子,CH2-11的2质子δ3.970(d,J=12.0Hz)和3.946(d,J=12.0Hz)显偕二偶合。
(4)核磁共振碳谱:由DEPT谱可知有4个季碳,6个叔碳,1个仲碳。δ156.193处于化合物碳谱最低场且为季碳,故为胍基碳信号。δ74.709为C-4信号,4-OH处于e键,δ40.283为C-4a信号,δ73.444为C-5信号,δ71.049为6-OH处于a键的C-6信号;δ79.262为C-7信号,δ70.461为C-9信号;δ72.366和δ59.306分别为C-8及C-8a碳谱峰。δ110.415为半缩醛碳C-10信号,它与C-5和C-7以C-O键形成笼状结构。DEPT显示δ65.101处为仲碳,应为C-11的羟甲基信号。
(5)质谱分子量320.1(M++H)。
本发明制备氨基全氢化喹唑啉类衍生物及其药学上可接受的盐或酯新用途的技术特征,以河豚毒素为母体结构的天然提取物或者人工合成的产物,其中:
R1选自:氢;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;R3=R4=R5=OH,R2=CH2OH。
当R1=H,或OH时,R2选自:CH2OH;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;C1-C6烷醛基;R3=R4=R5=OH。
当R1=H,或OH;;R2=CH2OH时,R3选自:氢;羟基;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;R4=R5=OH。
当R1=H,或OH时,R2=CH2OH;R3=OH时;R4选自氢;羟基;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;R5=OH。
当R1=H,或OH时,R2=CH2OH;R3=R4=OH;R5选自:氢;羟基;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;
可用于实施本发明所述新用途优选的河豚毒素的主要衍生物及其药学上可接受的盐有:
R1=H,R3=R4=R5=OH,R2=CH2OH; (去氧河豚毒素)
R1=OCH3,R3=R4=R5=OH;R2=CH2OH; (甲氧河豚毒素)
R1=OCH2CH3,R3=R4=R5OH;R2=CH2OH; (乙氧河豚毒素)
R1=NH2,R3=R4=R5OH;R2=CH2OH; (氨基河豚毒素)
本发明制备新用途技术特征的河豚毒素(I)在弱酸水溶液或盐溶液中,是以酯和半缩醛基的互变异构体形式存在(II),
式中:
R1=R3=R4=R5=OH,R2=CH2OH;碳7-酯基或者半缩醛基异构体
R1=R2=R4=R5=OH,R3=CH2OH;异碳7-酯基或者半缩醛基异构体
式中:R1=R2=R4=R5=OH,R3=CH2OH;异碳5-酯基或者半缩醛基异构体
R1=R3=R4=R5=OH,R2=CH2OH;碳5-酯基或者半缩醛基异构体
本发明制备新用途技术特征的河豚毒素(I)在弱酸性和盐溶液条件下,易转化为C-4互变异构体(III),
式中:
R1=R3=R4=R5=OH,R2=CH2OH;4-表河豚毒素
R1=R2=R4=R5=OH,R3=CH2OH;异4-表河豚毒素
以C-4表河豚毒素为代表的一类天然提取或者人工合成化合物及其药学上可接受的盐,其中:
R1选自氢;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;R3=R4=R5=OH,R2=CH2OH。
当R1=H,或OH时,R2自:CH2OH;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;C1-C6烷醛基,R3=R4=R5=OH。
当R1=H,或OH;;R2=CH2OH时,R3选自:氢;羟基;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;R4=R5=OH。
当R1=H,或OH时,R2=CH2OH;R3=OH时;R4选自氢;羟基;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;R5=OH。
当R1=H,或OH时,R2=CH2OH;R3=OH时;R4=OH;R5选自:氢;羟基;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;
本发明制备新用途的技术特征的河豚毒素(I)在室温,酸性和盐溶液条件下,易变成脱水(脱羟基)河豚毒素(IV),
式中:R2=R4=R5=OH,R3=CH2OH;R1=H 碳4-脱水异河豚毒素
R3=R4=R5=OH,R2=CH2OH;R1=H 碳4-脱水河豚毒素
R1=R4=R5=OH,R3=CH2OH;R2=H 碳6-异脱水河豚毒素
R1=R4=R5=OH,R2=CH2OH;R3=H 碳6-脱水河豚毒素
R1=R2=R5=OH,R3=CH2OH;R4=H 碳8-异脱水河豚毒素
R1=R3=R5=OH,R2=CH2OH;R4=H 碳8-脱水河豚毒素
R1=R2=R4=OH,R3=CH2OH;R5=H 碳9-异脱水河豚毒素
R1=R3=R4=OH,R2=CH2OH;R5=H 碳9-脱水河豚毒素
本发明制备新用途的河豚毒素(I)在室温,强酸性和盐溶液条件下,(I)易变成双脱水(脱 羟基)河豚毒素醚(V或VI或VII),
式中:R2=R4=R5=OH,R3=O=R1 碳4,碳11-脱水成醚异河豚毒素
R3=R4=R5=OH,R2=CH2O=R1 碳4,碳11-脱水成醚河豚毒素
式中:R3=R5=OH,R2=CH2OH R4=O=R1 碳4,碳8-脱水成醚河豚毒素
式中:R3=R4=OH,R2=CH2OH,R5=O=R1 碳4,碳9-脱水成醚河豚毒素
式中优选4,9-脱水河豚毒素,4,9脱水6-表河豚毒素
在室温,强碱性条件下,(I)容易转变成河豚毒素酸(VIII)类衍生物及其酯,
式中:
R1=R3=R4=R5=OH,R2=CH2OH;R=H 河豚酸
R1=R2=R4=R5=OH,R3=CH2OH;R=H 异河豚酸
以河豚毒素酸类为代表的天然提取或者人工合成化合物,其中:
R1选自氢;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;R2=R4=R5=OH,R3=CH2OH;R=C1-C8烷基或芳环。
当R1=H,或OH时,R2选自:CH2OH;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;C1-C6烷醛基;R3=R4=R5=OH,R=C1-C8烷基,烷氨基,C1-C5烷羟基;卤素或芳环。
当R1=H,或OH;;R2=CH2OH时,R3选自:氢;羟基;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;R4=R5=OH;R=C1-C8烷基,烷氨基,C1-C5烷羟基;卤素或芳环。
当R1=H,或OH时,R2=CH2OH;R3=OH时;R4选自氢;羟基;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;R5=OH;R=C1-C8烷基,烷氨基,C1-C5烷羟基;卤素或芳环。
当R1=H,或OH时,R2=CH2OH;R3=OH时;R4=OH;R5选自:氢;羟基;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;R=C1-C8烷基,烷氨基,C1-C5烷羟基;卤素或芳环。
当R1=R3=R4=R5=H,或OH时,R2=CH2OH,R选自;C1-C5烷羟基;卤素;C1-C5烷氧基;C1-C5卤代烷氧基;C3-C6环烷氧基;C3-C6环烷基;C2-C6链烯基;C2-C6链炔基;C5-C10 芳基部分和C1-C6烷基部分的芳烷基或C5-C10芳基;氨基;C1-C6烷氨基;酰基;C1-C6烷酰基;R5=OH;R=C1-C8烷基,烷氨基,C1-C5烷羟基;卤素或芳环。
其中优选的河豚酸及其酯有:
R1=R3=R4=R5=OH,R2=CH2OH;R=C1-C8烷基或芳环, 河豚酸酯
R1=H,R2=R4=R5=OH,R3=CH2OH;R=C1-C8烷基或芳环, 去氧河豚酸酯
R1=OCH3,R2=R4=R5OH;R3=CH2OH;R=C1-C8烷基或芳环, 甲氧河豚酸酯
R1=OCH2CH3,R2=R4=R5OH;R3=CH2OH,R=C1-C8烷基或芳环,乙氧河豚酸酯
R1=NH2,R2=R4=R5OH;R3=CH2OH;R=C1-C8烷基或芳环 氨基河豚酸酯
本发明中制备的氨基全氢化喹唑啉类化合物以及在药学上可接受的盐或酯制备清除养殖动物(猪、牛、羊、鸡)、水生生物体内含的盐酸克伦特罗(瘦肉精)类药物残留物的新用途,所指的盐酸克伦特罗(瘦肉精)是指化学名为“2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇盐酸盐”类化合物,结构式为:
式中, R1=R2=H 盐酸克伦特罗及其盐
分子式:C12H18ClN2O.HCl.
R1=R2=CH3 氨甲基盐酸克伦特罗甲酯及其盐
R1=H R2=CH3 盐酸克伦特罗甲酯及其盐
R1=CH3 R2=CH2CH3 氨甲基盐酸克伦特罗乙酯及其盐
河豚毒素类化合物是一种生理活性极强的钠离子通道阻断剂,可专一的阻止Na+进入细胞内,阻止神经细胞、肌肉细胞产生兴奋活动。科学研究人为,细胞膜对不同物质具有不同的通透性。膜内外的离子浓度不同,膜内主要为K+,膜外主要为Na+。细胞膜内外侧通常保持50-100mv的负静息电位。神经一兴奋,电位差就起变化,即产生去极化。这种电位变化增加了Na+对细胞膜的通透性,Na+一流入神经细胞膜内,膜电位就起变化,K+接着就流出。这样一系列的变化,使与膜表面相邻的部分之间造成了局部回路,造成的局部回路导致相邻部位去极化,由于去极化,再次造成细胞膜兴奋,增加Na+内流,此种形式,向邻近部位一一传递。传递的速度为0.1-100米/秒。兴奋一旦消失,流入的Na+又回到细胞膜外侧,K+流入膜的内侧,产生去极化。这也是细胞膜的信息通道,河豚毒素就是控制细胞膜的电位极差变化,阻止Na离子的流通,使其与Na相关的信息受阻。在机体中Na离子通道被阻断后,机体的神经系统、心血管系统、机体代谢功能都会产生重要变化。但是河豚毒素及其衍生物和药学上可接受的盐或酯类在生物体内如何排除瘦肉精这一类机理还未能清析阐述,我们仍然在继续研究,但是这并不限制本发明的实际用途及其使用的效果。
本发明制备的氨基全氢化喹哇琳类化合物及其衍生物和它药学上可接受的盐(包括无机酸盐,如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、次氯酸、硫酸、亚硫酸、硫代硫酸、磷酸、氢磷酸、二氢磷酸、碳酸、次碳酸、硝酸、亚硝酸和有机酸盐,如醋酸、草酸、枸橼酸、苹果酸、酒石酸、马来 酸、琥珀酸、半琥珀酸、水杨酸、甲磺酸、烷基苯磺酸等)形成的盐类或酯类,可根据现有制药技术使用药物学上的载体、赋形剂或其他添加剂,制成各种剂型,如将其制成皮下、肌肉、穴位或静脉注射剂,口服制剂、皮肤贴敷、渗透、泵渗透、肛门栓剂、喷雾剂。优选注射剂和皮肤贴剂。制剂含氨基全氢化喹唑啉(河豚毒素)纯度为80--100%,最优选为,90-95%。其制剂含河豚毒素为标示量的80-120%。最优选为,90-110%。使用氨基全氢化喹唑啉类化合物的用药剂量为:每公斤动物或水生生物体重0.01--100μg/kg。最优选为,0.1--30μg/kg。
本发明的显著技术进步特征是:
1、将氨基全氢化喹唑啉类化合物(以河豚毒素结构为代表的一类天然或者人工合成化学成分)及其衍生物和它的药用盐或酯类,用于养殖动物和水生生物体内的瘦肉精类化学成分的清除,是本发明人经过大量实验发现的最具有实用价值的新用途,是首次披露该类化合物所具有的新用途。
2、用本发明的氨基全氢化喹喹啉类化合物及其衍生物和它药用的盐或酯类在清除养殖动物、水生生物体内的瘦肉精类毒素,快速,有效,而且本发明制备的氨基全氢化喹唑啉类化合物(河豚毒素及其衍生物)不会残留在养殖动物和水生生物体内,从而保证了本发明的实用价值。
3、将氨基全氢化喹唑啉类化合物及其衍生物和它的盐或酯类用于养殖动物和水生物清除瘦肉精类化学成分的新用途,其中使用剂量(剂量:体重)0.01--100μg/kg,制剂的组合物也是本发明的技术组成部分。
实施方案
一、河豚毒素的配制方法:
1、河豚毒素及其盐类(95-99%)
A、河豚毒素 5.0μg B、河豚毒素 10.0μg
枸橼酸 1.4μg 水杨酸酸 0.15μg
乳糖 25.0μg 乳糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
C、河豚毒素 10.0μg D、河豚毒素 15.0μg
酒石酸 0.15μg 磷酸 0.15μg
乳糖 50.0μg 蔗糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
2、4-表河豚毒素(85-95%)
E、4-表河豚毒素 5.0μg F、4-表河豚毒素 10.0μg
枸橼酸 0.14μg 醋酸 0.15μg
麦芽糖 25.0μg 蔗糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
G、4-表河豚毒素 5.0μg H、4-表河豚毒素 10.0μg
盐酸 0.14μg 硝酸 0.15μg
麦芽糖 25.0μg 蔗糖 50.0μg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
3、脱水河豚毒素
a、脱水河豚毒素 5.0μg b、脱水河豚毒素 10.0μg
枸橼酸 0.14μg 苹果酸 0.15μg
乳糖 25.0μg 乳糖 50.0μg
甘露醇 7.5mg 甘露醇 7.5mg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 0-2.0ml
c、脱水河豚毒素 5.0μg d、脱水河豚毒素 10.0μg
醋酸 0.14μg 酒石酸 0.15μg
乳糖 25.0μg 乳糖 50.0μg
甘露醇 7.5mg 甘露醇 7.5mg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 0-2.0ml
4、河豚酸
e、河豚毒素酸 10.0μg 河豚毒素酸酯 15.0μg
磷酸钠 1.5μg 枸橼酸钠 0.15μg
枸橼酸钠 0.01μg 蔗糖 50.0μg
乳糖 50.0μg 甘露醇 15.0mg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
5、氨基河豚毒素
g、氨基河豚毒素 5.0μg h、乙氨基河豚毒素 10.0μg
盐酸酸 0.14μg 硫酸 0.15μg
麦芽糖 25.0μg 蔗糖 50.0μg
甘露醇 25.0mg 甘露醇 20.0mg
注射用水 1.0-2.0ml 注射用水 1.0-2.0ml
二、河豚毒素盐的制备
例1、取河豚毒素(TTX),含量(95-99%)10mg,用柠檬酸150μg,配制成PH=5.0-7.0的溶液,按每2ml含10ug计算,制成1000支注射液,用HPLC检测,含量合格后,灌装,灭菌,符合医用卫生标准或者兽用标准,即可使用,简称:河豚毒素盐A。
例2、取脱氧河豚毒素,含量(85-98%)1mg,用草酸150μg,g配制成PH=5.0-7.0的溶液,按每2ml含10ug计算,制成1000支注射液,用PLC检测,含量合格后,灌装,灭菌,符合医用卫生标准或者兽用标准,即可使用,简称:河豚毒素B。
例3、取河豚毒素酸,含量(85-95%)1mg,用苹果酸150μg,配制成PH=5.0-7.0的溶液,按每2ml含10ug计算,制成1000支注射液,用PLC检测,含量合格后,灌装,灭菌,符合医用卫生标准或者兽用标准,即可使用,简称:河豚毒素C。
例4、取4-表河豚毒素,含量(95-98%)1mg,用甲磺酸150μg,配制成PH=5.0-7.0的溶液,按每2ml含10ug计算,制成1000支注射液,用PLC检测,含量合格后,灌装,灭菌,符合医用卫生标准或者兽用标准,即可使用,简称:河豚毒素D。
例5、取氨基河豚毒素酸,含量(85-95%)1mg,用酒石酸150μg,配制成PH=5.0-7.0的溶液,按每2ml含10ug计算,制成1000支注射液,用PLC检测,含量合格后,灌装,灭菌,符合医用卫生标准或者兽用标准,即可使用,简称:河豚毒素E。
三、检测盐酸克伦特罗仪器和试剂
A、Waters-515型LC-MS仪,带UV检测及色谱工作站,C8柱或C18柱,离心机,超声波震荡提取器。
B、盐酸克伦特罗,标准品,含量(99.5%)中央药检所购买。所用试剂均为分析纯,所用水符合GB。
C、试剂:甲醇(色谱纯),正己烷,氢氧化钠溶液(5mol/l),盐酸溶液(0.1mol/l).
D、分析柱,C-18,250nm×4nm;流动相,甲醇,水(65∶35)检测波长,UV-243nm;流速,0.85ml/min;灵敏度,0.01.
1、标准曲线及最低检出瘦肉精浓度
称取盐酸克伦特罗对照品10mg于100ml量瓶中,用0.1mol/l盐酸溶解并定容至刻度,摇匀,为对照品贮备液。取对照品贮备液1.0ml至100ml量瓶中,用盐酸定容,摇匀,为对照品工作液。从工作液中取1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml于10ml量瓶中,用盐酸稀释至刻度,摇匀,浓度分别为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml、1.0μg/ml,分别进样20μl测定相应的峰面积。当盐酸克伦特罗浓度在0.1μg/ml~1.0μg/ml范围时,浓度与相应的峰面积线性关系良好,回归方程为Y=4484531X+0.005579,相关系数为0.9995。在本文实验条件下,最低检测浓度为0.01μg/ml。
2、回收率试验
采用标准加入法。取未检测出含盐酸克伦特罗的血液样品,定量添加盐酸克伦特罗后再进行检测,将检测值除以实际添加值,计算回收率。具体操作如下:取阴性血液样品0.20g,精密称定,置100ml量瓶中,准确加入一定量的对照品工作液,混匀,加入盐酸溶液约70ml,浸泡过夜,置超声波摇荡器上20min,用盐酸溶液定容至刻度,摇匀,静置。取上清液离心10min(4000r/min),准确吸取上清液10.0ml,置分液漏斗,滴加氢氧化钠溶液碱化,振摇5min,用正己烷提取二次,每次20ml,合并正己烷层,定容至50ml。从中吸取5.0ml,置水浴蒸干,向残渣中准确加入甲醇适量,使克伦特罗充分溶解,并使其浓度约为0.2μg/ml~0.8μg/ml,经0.45μ微孔滤膜过滤,注入高压液相色谱仪测定。测得回收率为89.5%~97.2%,结果参见表1。
表1回收率测定结果(n=5)
样品 |
添加盐酸克伦特罗的量 μg/g |
测得盐酸克伦特罗的量 μg/g |
回收率/ % |
变异系数 CV |
血液 |
2 |
1.73 |
89.5 |
2.5 |
血液 |
5 |
4.70 |
96.1 |
2.4 |
血液 |
8 |
7.46 |
97.2 |
2.3 |
分别取未添加和已添加盐酸克伦特罗的饲料饲养猪的血各2.0g,精密称定,置100ml量瓶中,加盐酸溶液70ml浸泡过夜,以下按回收率项目方法操作,各测定5次。测定结果是未添加盐酸克伦特罗的血液全为阴性,添加了盐酸克伦特罗的血液测定平均结果为3.56ug/kg。CV为2.4%。以上证明实验仪器可靠。
三、检测盐酸克伦特罗实验结果:
1、取添加盐酸克伦特罗(1ppm)的饲料饲养90天后的阉猪,用河豚毒素A、B、C、分别给猪肌肉或者是耳部静脉注射,平均用量50kg的猪注射10ug的TTX,每天三次,然后间各2-5小时取猪血和尿,测其盐酸克伦特罗的含量。并用未添加盐酸克伦特罗的饲料饲养90天以上的猪作对照。结果见表1。
表1:使用TTX-A.B.C、D.平均用量10ug/50kg 检测量瘦肉精含量ppm P>0.01
2、取添加盐酸克伦特罗(1ppm)饲料饲养90天以上的猪,连续3天用河豚毒素A、B、C、D、E分别排毒后1-5天内,取其不同天和时间屠宰猪的内脏(肝、肾、肺、脾、胃肠道、皮肤、脑、眼睛、心、胆汁、脂肪、肌肉、骨头)各100克。冷冻保存,然后对样品进行分析处理。提取后测其盐酸克伦特罗的含量。结果见表2。
四、河豚毒素的残留量检测
1、测试仪器,
A、美国ABI公司API3000LC-MS-MS型色谱仪,配Turbo louspray离子源。系统控制软件是LC2tune及Sample Control、采用Multiview及Macpuan进行数据分析计算。
B、色谱柱,Sulpleco Discovery RP C16 Amide column(150×2.1mm i.d,4.6μm)
C、流动相,10mmol/L甲酸胺—甲醇(含有0.5%乙酸)体积比45∶55组成,检测波长,UV-2200nm;流速,0.3ml/min;进样量为20μl。
D、质谱条件:采用Turbo lonspray离子源,正电电离,电离电压3300V,离子源温度350℃,雾化气12units,气帘气10units,碰撞气6units。质谱扫描方式为多离子反应检测(MRM),测定河豚毒素m/z 320.1-161.0.
2、测试方法
A、注射河豚毒素第3天后,取猪血、肉各50克。
B、注射河豚毒素第5天后,取猪血、肉各50克。
加入150ml甲醇(含0.5%乙酸),振荡均匀后,5000r/min离心15min,收集上清液。向试管中再加入甲醇,重复以上操作,得到上清液。合并溶液,在50℃用N2吹干,并用0.25ml 1%乙酸复溶,然后加入等体积的氯仿,涡流振荡30min,静置分层。取上清液,以微型过滤(0.2μm尼龙),再10000r/min过滤离心10min,收集滤液。备用。
3、数据处理:
以TTX峰面积为纵坐标,血药浓度为横坐标,进行直线回归(外标法)。将数据代入标准曲方程,计算血药浓度。式中选取m/z162作为河豚毒素的特征离子,在MRM离子扫描方式可测定TTX的浓度到30pg/ml。结果见表3
表3:检测猪体内河豚毒素(TTX)A、B、C、D的残留量
注射TTX第5天后 停止用TTX |
清除盐酸克伦特罗猪 血 |
清除盐酸克伦特罗猪 肉 |
未含盐酸克伦特罗 猪血(对照组) |
第1天A B C D |
m/z162(100pg/100ml) m/z144(110pg/100ml) m/z122(160pg/100ml) m/z176(80pg/100ml) |
m/z162(85pg/100ml) m/z144(90pg/100ml) m/z122(100pg/100ml) m/z176(55pg/100ml) |
m/z162(0pg/100ml) m/z144(0pg/100ml) m/z122(0pg/100ml) m/z176(0pg/100ml) |
第2天A B C D |
m/z162(30pg/100ml) m/z144(20pg/100ml) m/z122(50pg/100ml) m/z176(8pg/100ml) |
m/z162(25pg/100ml) m/z144(10pg/100ml) m/z122(20pg/100ml) m/z176(5pg/100ml) |
|
第3天 A B C D |
m/z162(2pg/100ml) m/z144(5pg/100ml) m/z122(2pg/100ml) m/z176(0pg/100ml) |
m/z162(0pg/100ml) m/z144(0pg/100ml) m/z122(0pg/100ml) m/z176(0pg/100ml) |
|
第5天 A B C D |
m/z162(0pg/100ml) m/z144(0pg/100ml) m/z122(0pg/100ml) m/z176(0pg/100ml) |
m/z162(0pg/100ml) m/z144(0pg/100ml) m/z122(0pg/100ml) m/z176(opg/100ml) |
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第8天 |
m/z162(0pg/100ml |
m/z162(0pg/100ml |
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实验结果证实,使用本发明的药品和方法,可以有效和快速的清除猪体内的盐酸克伦特罗残留化学成分。而且屠宰的猪肉体内不会残留任何河豚毒素类的化学成分。有文献报道,在用添加盐酸克特罗伦饲料饲养的猪,虽然在停止喂养添加盐酸克伦特罗饲料3天后,屠宰猪的肉体内盐酸克伦特罗含量可以下降到总给药量的2%。但其残留量仍然可以维持在15-20天。此时屠宰肉体中含有的瘦肉精量仍然会对人体产生毒害作用,实验研究发现一个成年人按平均60kg的体重计算,盐酸克伦特罗在人体内剂量为0.042μg/kg体重或42ng/kg体重时,就会出现中毒症状。考虑到食品安全性,所以能找到一种安全有效的清除盐酸克伦特罗残留物药品和方法,也是对人类食用肉品安全的重大贡献,正是本项发明的实用意义。