CN101237876A - 动物寄养系统中的细菌控制 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于减少动物体内或饲育场中的靶病原体数量的方法。所述方法包括给予所述动物一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合，使得所述一种或多种噬菌体菌株得以在体内释放并吸附所述一种或多种靶病原体，从而从所述动物体内减少所述一种或多种病原体。所述控释的噬菌体菌株或噬菌体组件可以在进一步动物处理前以治疗剂量给药接着以维持剂量的形式给药，或者以一直维持剂量的形式给药，以控制饲育场中的靶病原体。

Description

动物寄养系统中的细菌控制
技术领域
本发明涉及用于减少动物寄养系统(holding system)中细菌的方法。更具体而言，本发明提供了用于控制动物、动物生产系统(如饲育场、饲养圈等)或其组合中病原细菌的方法。
背景技术
供人消费的肉和肉产品的污染是食品工业中一直存在的问题。人们特别担心的是大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella spp.)和弯曲杆菌(Campylobacter spp.)病原体，所有这些都能在人体内导致经食物传播的疾病。这些病原体所致的人类疾病通常是由吃了污染的肉产品(包括鸡、火鸡、牛肉和猪肉)引起的。这类病原体也可以通过侵入动物生产而直接对人造成健康危害。此外，动物胃肠道中携带的其它病原体也可以直接或间接地对人造成健康危害。
猪、家禽和牛类的细菌污染源很多，包括不洁净的垫料和饲料。用于猪、家禽、牛类和其他生产动物的干饲料会被细菌(包括沙门氏菌和大肠杆菌(E.coli))所污染。这类污染可能会在加工、储藏或运输过程中发生。例如，肉牛的肉和肉产品的常见污染源头是屠宰场，在这里发生兽皮上、毛发上或排泄物内的细菌对动物尸体的污染。
为减少人的经食物传播的疾病，研究已经转向了在活动物体内进行屠宰前干涉。益生菌、日粮和抗病原体方法都被用于设法实现这一目标。
例如，流水号为5,965,128的美国专利(Doyle等人；也可参见Zhao等人(1998)J Clin Microbiol，36，641-647)教导了在实验性接种过的牛类体内使用益生菌来减少或预防E.coli 0157:H7的携带。但是，5,965,128号美国专利所教导的方法具有高度的侵入性并且包括使用瘤胃套管插入术进行牛类的接种。这种方法无法提供方便的益生菌给药方法。其他的研究(Brashears等人(2003)J Food Prot，66，748-754；Younts-Dahl等人(2004)J Food Prot，67，889-893)已经证明乳酸菌(Lactobacillus)、丙酸杆菌(Propionibacterium)或两者均有的补充给药都能在牛类中减少E.coli 0157:H7的排放，但是不能清除所述病原体。Garner和Ware公开了类似的结果(US2003/0175305、US 2003/0175306、US 2003/0175307和WO 2004/030624)。
也进行了改变日粮疗法以减少牛类中病原体排放的研究。Allen等(美国专利No.6,270,812)教导了在饲育场的肥育日粮中使用海藻添加剂来减少屠宰后排泄物样品中病原性大肠杆菌。其他研究人员(Braeden等人(2004)JFood Prot，67，1824-1828)发现补充给予含Tasco-14的饲料会降低牛类中大肠杆菌0157:H7的患病率。另有其他研究人员(Diez-Gonzalez等人(1998)Science，281，1666-1668)证明了突然给谷饲牛类提供干草日粮会减少大肠杆菌数量。但是，日粮对牛类体内大肠杆菌0157:H7水平的作用大小是不稳定的，并且结果仍然有争议。
特异性靶向并清除牛类、家禽和猪中的病原体是另一种治疗经食物传播疾病的方法。例如，抗生素如新霉素会显著降低牛类中大肠杆菌0157:H7的排泄物排放(Ransom等人(2003)Research Fact Sheet，National Cattleman′sBeef Association，Centennial CO)。虽然新霉素不用于人类医学中，但是这种抗生素的广泛使用可能会导致产生对通常用于人类医学中的相关抗生素(如庆大霉素、卡那霉素等)的抗性。禁止在食物中预防性使用抗生素的欧洲禁令和抗生素抗性广泛散播的可能性阻碍了这类化合物的使用。
也考虑过用噬菌体来处理动物废物。噬菌体是可以特异性感染并杀死细菌的细菌病毒，并且在自然界中分布广泛。噬菌体识别细菌表面的受体，吸附到其上并且将它们的遗传物质注入到宿主细胞中。它们降解宿主细胞的DNA并且合成它们自身的遗传物质及所需的壳衣蛋白，然后在裂解所述细胞前重新组装噬菌体颗粒的多个拷贝。然后所释放的噬菌体将感染病破坏周围环境中的其他细菌。这一过程会持续到所有细菌都被从所述体系中清除。
US 6,656,463公开了使用Felix 0-1噬菌体来减少猪体内的沙门氏菌的数量。Smith等(J Gen Microbiol(1987)133，1111-1126)已经证明噬菌体可被用于控制家畜中肠产毒性大肠杆菌的感染。该研究显示菌株特异性噬菌体可以通过单次口服剂量或通过用噬菌体对动物房中的垫草喷雾来治愈或预防大肠杆菌所致腹泻。但是所述噬菌体只有在给予大肠杆菌之前或与大肠杆菌同时给予时才有效。此外，Smith等所用的病原体不同于大肠杆菌0157:H7，且该研究中有效的噬菌体不能识别大肠杆菌0157:H7。
Kudva等(Appl Env Microbiol(1999)65，3767-3773)证明噬菌体可有效减少培养物中大肠杆菌0157:H7数量或从培养物中有效地清除大肠杆菌0157:H7。具体地，单独一种噬菌体不能清除大肠杆菌0157:H7培养物，然而三种0-157特异性噬菌体的混合物能够从培养物中清除所述细菌。但是，Kudva等(1999)的体外实验不能说明这类噬菌体在控制家畜体内的大肠杆菌0157:H7时会有效。已经报导过了其他的体外研究；但是，当在体内测试这些噬菌体时，没有观察到效力或观察到很低的效力(参见Callaway T.R.等人(2004)J Animal Sci.82(E.Suppl)：E93-99的综述)。需要进行进一步的改进以有效地使用噬菌体来减少牛类的大肠杆菌0157感染。
流水号为6,485,902的美国专利(Waddell等人)教导了使用特异性噬菌体来减少牛类肠胃道中的大肠杆菌0157:H7水平。在用大肠杆菌0157:H7攻击之前和之后，以高剂量经口给予小牛六种噬菌体的混合物。该研究表明与未接受噬菌体的小牛相比，大肠杆菌0157:H7在排泄物中的排放减少。但是，该方法所要求的高剂量表明噬菌体会在肠胃道中失活。
虽然改善了屠宰后的卫生条件，但是受污染的肉和肉产品导致的在人体内经食物传播的疾病仍是食品工业中一直存在的问题。通常，这些疾病可以归咎于大肠杆菌、沙门氏菌和/或弯曲杆菌。已经对减少家禽、猪和牛类中病原体发病率的各种方法进行了研究，包括用益生菌补充给药、日粮添加剂、日粮变化、抗生素和噬菌体。但是，大多数方法都是经济上不可行的、有争议的或未经证实的。此外，大多数研究使用实验性感染的动物，这不能真实地反映抗病原体治疗对自然感染的动物的作用。
发明内容
本发明涉及一种用于减少动物寄养系统中病原体细菌的方法。
本发明的一个目的是提供一种用于减少动物寄养系统中细菌的方法。
本发明提供了—种用于减少动物体内存在的靶病原体数量的方法(A)，包括给予所述动物一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或其组合，使得所述一种或多种控释的噬菌体菌株得以在体内释放，吸附所述一种或多种靶病原体，并从所述动物体内减少所述一种或多种靶病原体的数量。
在上述方法中，所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或其组合以每天每只动物约107至1013pfu的治疗剂量给予约1至12天。或者，所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件以每天每只动物约105至1010pfu的维持剂量再给予30至90天。又或者，所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件开始以每天每只动物约107至1013pfu的治疗剂量给予约1至12天，之后以每天每只动物约105至1010pfu的维持剂量给予30至90天。
上述控释的噬菌体菌株或噬菌体组件可以通过加到动物饲料或饮用水中、通过吸入或注射(肌内、腹膜内或鞘内)或通过直肠给药、局部给药或者这些方法的组合来给予。
本发明还提供了一种用于减少存在于寄养系统中的一种或多种靶病原体数量的方法(B)，包括给予动物饲料、饮用水、动物或其组合—种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件，使得所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件得以在所述饲料、饮用水、动物消化道、粪便或其组合中释放，吸附并杀死周围环境中的所述靶病原体，从而减少所述寄养系统中所述一种或多种病原体的数量。上述控释的噬菌体菌株或噬菌体组件可以通过加到动物饲料或饮用水中、通过吸入或注射(肌内、腹膜内或鞘内)或通过直肠给药、局部给药或者这些方法的组合来给予。所述寄养系统包括但不限于饲育场、屠宰前的寄养栏、饲养圈(包括例如饲养棚或饲养栏)、宠物动物园、开放式或封闭式水产养殖系统以及其他动物饲养区等等。
当把来自具有各种病原体控制状况的不同畜牧场的动物放入到寄养系统(例如寄养或饲养圈，如饲育场)中时，可以将噬菌体给予所述动物。以每天每只动物约107至1013pfu的剂量给予所述动物噬菌体约1至12天。然后可以每天每只动物约105至1010pfu的维持剂量给予30至90天。使用这一方案有助于减少该病原体对所述畜牧场的整体污染。
本发明还提供了一种用于预防由一种或多种靶病原体导致的感染传播的方法。所述方法包括给予所述动物一种或多种噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合，使得所述一种或多种噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合得以在所述动物的消化道内释放，吸附并杀死所述靶病原体，从而减少动物废物中所述一种或多种病原体的数量。所述靶病原体可为大肠杆菌0157:H7、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、密螺旋体(Treponema)或其他胃肠道中携带的病原体或者它们的组合。所述一种或多种噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合都可以以控释的噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合的形式提供。
本发明还提供了用于减少动物体内的病原体的处理方案，所述病原体例如，但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌和葡萄球菌。将要被运输或被屠宰的动物可以在运输的5-7天前用—种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合来处理。使用这一方法，可到治疗的第3-5天时将所述动物的病原体水平降低到低水平，因此使得从治疗的大约第4天起，动物可以被安全运输。这样就提供了一个“安全运输和加工”的区间，在此期间来自于所述寄养系统(例如但不限于寄养或饲养圈，如饲育场)的动物可以被安全地运输和加工。
此外，本发明提供了一种或多种控释的噬菌体、噬菌体组件或两者的组合在用于送递到动物废物中以预防细菌感染通过所述废物传播中的用途。所述一种或多种控释的噬菌体、噬菌体组件或两者的组合可以以未包封的形式直接被送递到所述废物(离体)中或者可以以控释形式给予所述动物以通过动物肠道被送递到所述废物。
使用噬菌体来减少动物体内或动物和动物寄养系统中的病原细菌将有助于增加食品来源的安全性并且大体上有助于减少农业生产、水源水、宠物和环境的病原体污染，所述动物寄养系统包括宠物动物园和寄养或饲养圈如饲育场。例如，除减少大肠杆菌0157:H7传播之外，噬菌体也能减少金黄色葡萄球菌的计数，大肠杆菌0157:H7会在人类中导致严重的健康问题，金黄色葡萄球菌会感染牛类的乳头和乳房并导致乳腺炎。此外，当动物在圈栏中走动时通过足浴的方式可以治疗导致蹄病的密螺旋体感染。靶病原体特异性噬菌体、噬菌体组件或两者的组合都可以被安全地给予动物，而不影响天然存在于动物或环境中的非病原性菌群。
该方法通过用有效送递系统中的安全噬菌体来处理动物克服了现有技术的缺陷。此外，通过给予控释的噬菌体或噬菌体组件，可以调整所述噬菌体或噬菌体组件的体内停留时间以确保在所要求时段内所述动物的消化道和肠道中噬菌体群或噬菌体组件的存活和持续水平，并且如果需要的话确保在所要求时段内动物废物中噬菌体群或噬菌体组件的存活和持续水平以控制动物或动物寄养系统(包括寄养或饲养圈，如饲育场)或前述两者中的靶向病原体群。所述噬菌体或噬菌体组件不含毒素或其它潜在的对环境有害的化合物。这些高效噬菌体提供了一种用于控制家畜、宠物和其它动物以及所述动物寄养系统(包括寄养或饲养圈，如饲育场)、其它动物饲养区(特别是高强度畜牧)和周围环境中细菌菌群的经济可行和安全的方法
上述发明内容部分未必描述了本发明的所有特征。
附图说明
参照下述关于附图的说明，本发明的上述特征和其他特征将会更加显而易见。
图1示出了加到脱脂奶粉中的噬菌体效价(前)与固定和重悬后获得的噬菌体效价(后)。
图2示出了加到大豆蛋白粉中的噬菌体效价(前)与固定和重悬后获得的噬菌体效价(后)
图3示出了包封对于噬菌体活性的作用。示出了包封前后噬菌体的效价。
图4A示出了低pH对于包封的噬菌体的稳定性的作用。在研磨前后测定包封的噬菌体的效价。所有的噬菌体浓度已经按照包封物质的重量进行了修正。图4B示出了低pH对噬菌体侵染性的作用，所述噬菌体既未被固定也未被包封。
图5示出了当在室温(RT)或在4℃下分别储存时，经过4.5个月(131天)和10个月(311天)后包封固定的噬菌体的稳定性。
图6示出了在10天的研究期间内，与对照动物相比，噬菌体处理的动物大肠杆菌0157:H7排放的减少。
图7示出了在10天的研究期间内，与对照组相比，噬菌体处理组中大肠杆菌0157:H7阳性动物数量减少。
图8示出了在10天的研究期间内，在处理过的动物的粪便中排放的游离噬菌体的水平。
图9示出了通过所述动物(牛类)之前或之后，所给予的噬菌体的代表性的RFLP模式。所述模式是使用三种不同的酶获得的。
图10示出了送去屠宰前用于处理牛类的建议方案。也鉴定了所建议的安全运输和加工的时段。
具体实施方式
本发明涉及一种用于减少动物寄养系统中病原性细菌的方法。更具体地说，本发明提供了用于控制动物、动物生产系统(如饲育场、饲养圈等)或其组合中病原细菌的方法。
下文描述的是优选的实施方案。本发明提供了一种用于减少存在于动物体内的一种或多种靶病原体数量的方法，包括给予所述动物一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件，使得所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件得以在体内和肠道内释放并且从所述动物体内清除所述一种或多种病原体。
还提供了一种用于减少存在于动物寄养系统(例如但不限于寄养或饲养圈，如饲育场)中的一种或多种靶病原体数量的方法，包括给动物饲料、饮用水、动物或其组合提供一种或多种控释的噬菌体菌株和/或噬菌体组件，使得所述一种或多种控释的噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合都得以在所述饲料、饮用水、动物消化道、粪便或其组合中释放，吸附所述靶病原体，从而杀死或减少所述动物寄养系统中所述一种或多种靶病原体的数量。动物寄养系统可以包括但不限于饲育场、屠宰前的寄养栏或圈、饲养圈(包括例如饲养棚或饲养栏)、宠物动物园、开放式或封闭式水产养殖系统、其他动物饲养区等等。
术语“动物”或“动物们”是指任何会受病原体影响或携带病原体的动物。例如但非意在以任何方式限制，动物可以包括用于农业用途的动物；非限制性实例包括家禽如鸡或火鸡等；猪；家畜，该术语包括所有的有蹄类动物如马、山羊、绵羊和牛类(包括肉牛、乳牛和野牛)等。动物还包括驯养动物，例如但不限于家庭宠物如猫、狗等。另一个动物的非限制性实例包括各种水产养殖物种，如鱼和贝壳类。
术语“噬菌体(bacteriophage)”或“噬菌体(phage)”是本领域中众所周知的并且通常表示感染细菌的病毒。噬菌体是通过使用部分或全部的宿主的生物合成机制在细菌细胞内繁殖的寄生病毒，并且可以是裂解性或溶源性的。本发明所用的噬菌体可以是任何的噬菌体，对所要研究的靶病原体有效的裂解性或溶源性噬菌体。但是，本发明所用的噬菌体优选非溶源性的，这意味着噬菌体感染后所述噬菌体DNA不整合到宿主的基因组DNA中。特异性针对一种或多种靶病原体的噬菌体可以使用本领域的标准技术来分离，例如Maniatis等人(1982，Molecular cloning：a laboratory manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；该文献通过引用的方式纳入本说明书)。如果需要的话，可以使用不同噬菌体的混合物来靶向本文所述的一种或多种病原体。
类似地，“噬菌体组件”或“多个噬菌体组件”可以包括任何的噬菌体组件，这些噬菌体组件包括但不限于噬菌体尾、噬菌体蛋白或其它在杀死一种或多种靶细菌和减缓一种或多种靶细菌生长或复制方面有效的组成分子或分子构建体。
如果需要的话，噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的混合物(也称为“噬菌体和/或噬菌体组件”)可被用于对抗单个细菌靶标或多个细菌靶标。术语“靶病原体”或“靶细菌”是指可能导致人、动物、鱼、鸟或植物疾病的病原性细菌。所述靶细菌可以是任何类型的细菌，例如但不限于下列细菌种类和菌株：大肠杆菌、链球菌(Streptococci)、腐质霉(Humicola)、沙门氏菌、弯曲杆菌、李斯特菌(Listeria)、劳森氏菌(Lawsonia)、葡萄球菌、巴斯德氏菌(Pasteurella)、分枝杆菌(Mycobacterium)、嗜血杆菌(Hemophilius)、缠绕杆菌(Helicobacter)、分枝杆菌(Mycobacterium)、霉浆菌(Mycoplasmi)、奈瑟(氏)菌(Nesseria)、克雷白(氏)杆菌(Klebsiella)、肠道细菌(Enterobacter)、变形菌(Proteus)、类杆菌(Bactercides)、假单胞菌(Pseudomas)、疏螺旋体菌(Borrelius)、柠檬酸细菌(Citrobacter)、丙酸杆菌(Propionobacter)、密螺旋体、志贺氏菌(Shigella)、肠球菌(Enterococcus)、细螺旋体(Leptospirex)、包括炭疽杆菌(Bacillusanthracis)的杆菌(Bacillii)和其它入或动物的病原性细菌。所要研究的细菌是已知会污染动物饲料、液体动物饲料或动物寄养系统的细菌，其中所述动物寄养系统通常包括但不限于寄养或饲养圈，如饲育场。特别要研究的细菌是还会感染家畜(包括猪和供人消费的家禽)的细菌，例如但不限于沙门氏菌、弯曲杆菌和大肠杆菌0157:H7或其任何组合。在一个非限制性实例中，所述靶病原体可以是大肠杆菌、葡萄球菌、密螺旋体或其任何组合。
所述噬菌体和/或噬菌体组件可以在水性溶液中提供。所述水性溶液可以是任何适用于本发明目的的溶液。例如，所述噬菌体和/或噬菌体组件可以在水中或在本领域已知的适当的培养基中提供，所述培养基例如LB培养基、SM、TM、PBS、TBS或其它常见缓冲液。例如但非意在限制，所述噬菌体可以被储存在LB培养基中。
所述噬菌体和/或噬菌体组件也可以以固体(dry)形式提供，以与液体动物饲料或动物饲料混合。固体形式的噬菌体和/或噬菌体组件的实例包括但不限于冻干的噬菌体和/或噬菌体组件、固定在基质上的噬菌体和/或噬菌体组件、按下文所述包封的噬菌体和/或噬菌体组件、按下文所述以胶囊形式提供的噬菌体和/或噬菌体组件、按下文所述以片剂形式提供的噬菌体和/或噬菌体组件，或其组合。
“控释”是指给予所述动物的试剂，例如一种或多种噬菌体和/或噬菌体组件是以一种包括所述一种或多种噬菌体和/或噬菌体组件的各种制剂的组合物的形式存在的。例如所述一种和/或多种噬菌体和/或噬菌体组件可以以液体或固体形式存在，所述形式包括：一种或多种噬菌体和/或噬菌体组件，冻干的噬菌体和/或噬菌体组件，固定在基质上的噬菌体和/或噬菌体组件，包封的噬菌体和/或噬菌体组件，以胶囊形式提供的噬菌体和/或噬菌体组件，以片剂形式提供的噬菌体和/或噬菌体组件，包封的、胶囊形式、片剂形式或其组合形式的噬菌体和/或噬菌体组件，其中所述噬菌体和/或噬菌体组件的包封的、胶囊或片剂形式包括在动物消化道的不同区域或动物废物中以不同速率释放所述噬菌体和/或噬菌体组件的组合物。所述包封的、胶囊或片剂形式的组合物可以包括聚合物、蜡、凝胶、吸水化合物、排水化合物、或同时含有吸水和排水化合物、脂肪酸、糖、蛋白质或合成材料，以可控方式影响组合物中的试剂的释放。可以使用包括噬菌体或噬菌体组件的各种控释组合物，使得所述噬菌体和/或噬菌体组件可以在给予动物前、通过所述动物消化道的过程中或离开所述动物之后被释放。
本发明的固定的噬菌体组合物表现出所需的储藏性质并且可以与动物饲料混合以帮助减少靶细菌的排放，所述动物包括但不限于家畜、鸟、家禽、驯养动物、鱼和贝壳类。以液体、固定的、包封的、包有胶囊的、片剂形式或其组合形式存在的控释的噬菌体和/或噬菌体组件可根据需要与作为日粮疗法的一部分施加到动物饲料中其他的添加剂或补充剂混合或被掺入到颗粒饲料中。因此可以防止所述噬菌体和/或噬菌体组件在饲料中沉降。或者，可以增强所述饲料或包封的噬菌体和/或两者的组合的粘性以提供改进的混合和递送性质。所述控释的噬菌体和/或噬菌体组件也可以与饮用水混合。此外，可以使用备选的给药形式来给予本发明的所述控释的噬菌体、噬菌体组件或两者的组合，所述给药形式包括但不限于：吸入给药、注射给药、肌内给药、腹膜内给药、鞘内给药、阴道给药、直肠给药、局部给药或以上给药方式的组合。
噬菌体和/或噬菌体组件的冻干可以使用任何已知的冻干步骤来进行，例如但不限于Clark and Geary(1973，Preservation of bacteriophages byfreezing and freeze-drying，Cryobiology，10，351-360；Ackermann等人2004，Long term bacteriophage preservation，World Federation CultureCollections Newsletter，38，35(在此通过引用的方式纳入本说明书)中公开的方法。
所述噬菌体或噬菌体组件或者两者的组合也可以以固定在基质上的形式提供。术语“基质”是指任何适合的可溶于水、可摄取或能够被动物吸收、或适合与液体动物饲料共用的固体基质。此外，如果任何所吸收的噬菌体都可以在水性环境中从基质中被释放出来，那么所述基质可以是非水溶性。所述基质应该能将所述噬菌体和/或噬菌体组件吸收到其表面上并且在适当的环境中释放所述噬菌体和/或噬菌体组件。所述噬菌体和/或噬菌体组件不应当与基质过于强烈地粘着以致于在培养基中适当重悬时不能将它们释放出来。优选地，所述吸收的、固定的噬菌体和/或噬菌体组件与基质非共价地结合，使得在需要的时候可以将它们从基质中释放出来。可用于本发明的基质的非限制性实例包括脱脂奶粉、大豆蛋白粉、白蛋白粉、单细胞蛋白、海藻糖、甘露醇或其它粉末状的糖或糖醇、药用碳、乳胶微球、合成的植物源塑料例如但不限于大豆塑料或玉米塑料、或者其它的惰性表面、水溶性碳水化合物基材料或其组合。优选地，所述基质通常被认为是安全的(GRAS)。
如果基质的量超过水性噬菌体和/或噬菌体组件溶液的量，则可通过任何本领域已知的方法将水性溶液中的所述噬菌体或噬菌体组件或者两者的组合施加到基质上，例如滴或喷。优选地，所述基质处于固体或半固体状态且噬菌体(和/或噬菌体组件)与基质未形成液态悬浮液。一旦将噬菌体溶液加到基质中，就可以用机械设备混合所述基质并且允许其风干。也可以使用市售的流床造粒机和干燥机将噬菌体固定在固体基质上。这些方法中，优选将所述噬菌体溶液喷在基质上。
所述抗细菌组合物包括固定的噬菌体或噬菌体组件或两者的组合，且基质可以在约0℃至50℃或其间的任何温度下干燥，例如在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50℃或者其间的任何温度下。例如，所述抗细菌组合物可以在约10℃至30℃或其间任何温度下或者在约15℃至25℃或其间任何温度下干燥。干燥过程还可通过提供在所述抗细菌组合物上方或穿过所述抗细菌组合物的气流来加速。或者，干燥也可以通过在真空下加热所述固定的材料来进行。
干燥一段时间之后，如果需要的话可以向基质施加额外的水性溶液，并且再次干燥所述基质。可根据需要重复这一过程以在基质上获得所需量的噬菌体。使用标准技术能够容易地确定基质上噬菌体的效价。
固定的或冻干的噬菌体和/或噬菌体组件也可以在作为饲料添加剂来给予动物前被包封起来。术语“包封”是指给固定的噬菌体或噬菌体组件或者两者的组合包被上可以增加噬菌体对其环境的物理化学压力的抗性的物质。所述固定的噬菌体和/或噬菌体组件可以用任何本领域已知的物质通过任何本领域已知的适合方法来包被，例如但不限于美国公开文本2003/0109025(Durand等人，在此通过引用的方式纳入本说明书)中所公开的。在该方法中，将包被物质的微滴注入含有本发明的一种或多种固定的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合的腔室(chamber)中并且快速冷却。或者，可以将包被组合物与所述的本发明的一种或多种固定的噬菌体和/或噬菌体组件混合，持续搅拌并且根据需要进行冷却或干燥。
所述包被物质可以是任何本领域已知的适合的包被物质。例如非意在限制，所述包被物质可以包括熔化温度在约20℃至100℃之间的物质，例如在约30℃至80℃之间或其间的任何温度；例如，熔化温度可以是20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98或100℃或其间的任何温度。如果所述包被物质是要被摄入的或用于口服的，那么优选的物质是食品级的物质。这类物质的非限制性实例包括植物脂肪酸；如棕榈酸和硬脂酸的脂肪酸，例如StéarineTM；动物蜡、植物蜡，例如巴西棕榈(Carnauba)蜡和蜡衍生物。其它可以加到所述包被物质中的添加剂分子；这类添加剂可以包括抗氧化剂、糖、蛋白质或其它合成材料。
也可以使用其它的包被物质，例如基于非脂质的材料(例如，参见美国专利No.6,723,358和No.4,230,687，在此通过引用的方式纳入本说明书)，例如糖或其它水溶性的碳水化合物基成分。所述本发明组合物中的噬菌体或噬菌体组件或者两者的组合也可以用其它的非食品级的物质来包被。其它的添加剂分子可被加到所述包被物质中；这类添加剂可以包括抗氧化剂、糖、蛋白质或其它合成材料。
脂质基包封的方法某种程度上保护所述噬菌体、噬菌体组件或两者的组合免受其可能要面临的恶劣环境的影响，例如液体饲料发酵条件范围内的低pH环境或动物的消化系统。所选择的用于包封的脂质基材料也应该具有会在所需环境中崩解以释放噬菌体和/或噬菌体组件的性质。例如，消化酶可以降解包封材料并且有助于动物肠道内噬菌体和/或噬菌体组件的释放，或者所述发酵液体饲料中的酶可以帮助一些噬菌体和/或噬菌体组件从包封中释放。所以，如果需要的话，可以使用多种用于包封所述噬菌体和/或噬菌体组件的材料以使得在发酵液水饲料中有所选择的释放并且在动物肠道中释放，同时保护噬菌体、噬菌体组件或两者的组合。此外，用基于非脂质的材料包封的噬菌体和/或噬菌体组件会溶于水，立即释放噬菌体或噬菌体组件；或者稍后与液体饲料介质混合。根据所选的制剂，或者所述制品是以胶囊形式还是片剂形式提供的，噬菌体和/或噬菌体组件也可以时间控制的方式释放。所述胶囊或片剂制剂可有助于液体饲料介质中噬菌体和/或噬菌体组件的定时释放。因此，用不同材料混合或包封的控释的噬菌体、噬菌体组件或两者的组合的混合物可以与动物饲料、液体动物饲料组合和混合，或者以其他方式给予动物。
也可以胶囊形式提供固定的、冻干的和/或包封的噬菌体和/或噬菌体组件。“胶囊形式”是指所述固定的、冻干的和/或包封的噬菌体或噬菌体组件或者两者的组合都是以可溶于水性环境的胶囊提供的，例如软胶囊。所述胶囊可以用本领域已知的任何适合的物质来制备，例如但不限于凝胶、虫胶、蜡、合成的或其他化合物。
也可以片剂形式提供固定的、冻干的和/或包封的噬菌体和/或噬菌体组件。“片剂形式”是指所述固定的、冻干的和/或包封的噬菌体或噬菌体组件或者两者的组合都是以可溶于水性环境的压缩片剂提供的。所述片剂可以用本领域已知的任何适合的物质通过本领域已知的任何适合的方法来制备。例如，如本领域技术人员已知的，所述片剂可以包括粘合剂和其它片剂生产中所需组分。片剂可以是即释片剂，其中所述噬菌体和/或噬菌体组件根据其溶出度被释放到液体饲料中；或者可以包括定时释放的组合物，其中所述噬菌体和/或噬菌体组件以时间依赖性方式被释放到水性环境中，包括液体饲料、动物肠道或两者的组合。参见WO 02/45695；US 4,601,894；US 4,687,757、US 4,680,323、US 4,994,276、US 3,538,214、US(在此通过引用的方式纳入本说明书)中几个可被用于帮助水性环境中噬菌体或噬菌体组件的时间控制释放的定时释放试剂的实例。
包括噬菌体和/或噬菌体组件的液体形式、固体形式的本发明的抗细菌组合物可与动物饲料或液体动物饲料混合以产生处理过的动物饲料或处理过的液体动物饲料，并且帮助减少所述饲料中细菌的量，所述噬菌体和/或噬菌体组件是冻干的或吸收到基质上的、包封的或者胶囊或片剂形式，或其组合。这种液体或固体形式的处理过的饲料可被用于饲养任何家畜包括猪或家禽。如果控释的噬菌体和/或噬菌体组件被单独用来或与未包封的噬菌体和/或噬菌体组件—起用来处理饲料，那么除减少所述饲料的细菌含量外，还可以进一步减少动物或动物废物中的细菌污染。使用控释的噬菌体、噬菌体组件或其组合有助于在进一步加工动物前从所述动物体内清除肠道中已经存在的细菌。
术语“动物饲料”是指干的或含水量少于25％w/w的动物饲料。优选地，所述含水量为约5至20％w/w，或者约10至15％w/w。动物饲料通常可包括谷类成分和非谷类成分，所述谷类成分可以包括小麦、大麦、大豆、麸皮和其它谷类，所述非谷类成分可以包括维生素、矿物质、蛋白质、脂肪和其它补充剂。但是，所述动物饲料中也可以存在其它组分。动物饲料组合物的定义并非意在以任何方式进行限制。
所述动物饲料也可以是液体动物饲料。术语“液体动物饲料”是指水和饲料的混合物并且包含未发酵液体饲料(NFLF)和发酵液体饲料(FLF)的动物饲料。液体动物饲料通常含有谷类成分和非谷类成分，所述谷类成分可以包括小麦、大麦、大豆、麸皮和其它谷类，所述非谷类成分可以包括维生素、矿物质、蛋白质、脂肪和其它补充剂。有两种液体饲料：未发酵液体饲料和发酵液体饲料。未发酵液体饲料是在临喂食前制备的饲料和水的混合物。发酵液体饲料是在喂给动物前，在给定的温度下储存一段给定的时间以使其开始发酵的饲料和水的混合物。全部的饲料或只有谷类饲料能够被发酵。由饲料中存在的天然菌丛所引发的饲料的天然发酵能够产生足够的乳酸来具有有益效果。或者，也可以通过加入乳酸菌(LAB)来将其移植到所述液体饲料中(如美国专利6,326,037；6,699,514；和公开的美国专利申请2001/0055633所述，在此通过引用的方式纳入本说明书)。本发明的方法可以使用任何类型的液体饲料，例如NFLF、FLF、包括LAB的FLF。此外，所述液体动物饲料也可以含有其它成分。液体动物饲料的组合物的定义并非意在以任何方式进行限制。
液体饲料的发酵可以通过任何本领域已知的方法来实现。例如，并非意在以任何方式进行限制，所述液体饲料可以通过以约1.5∶1至4∶1的比例或其之间的任何量混合粉(meal)和水来制备，并且在约15℃至30℃的温度范围内，在搅拌的密闭罐中存储约24小时至10天或其间的任何量。在Canibe和Jensen((2003)J.Anim.Sci.，81，2019-2031；在此通过引用的方式纳入本说明书)所教导的一个备选的非限制性实例中，粉(meal)与水按1∶2.5混合并且在20℃下，在搅拌的密闭罐中存储4天。
处理过的动物饲料是与有效量的抗细菌组合物混合的动物饲料，所述组合物含有一种或多种噬菌体菌株、一种或多种噬菌体菌株的一种或多种噬菌体组件或其组合。所述动物饲料可以与固体或液体形式的抗细菌组合物混合。所述处理过的动物饲料或处理过的液体动物饲料包括有效量的抗细菌组合物。所述处理过的动物饲料可以通过任何本领域已知的方法来制备。例如，抗细菌组合物可以与固体形式的动物饲料(例如但不限于粉末)混合；或者冻干制品可以与动物饲料混合；或者抗细菌组合物可以被施加到液体形式(例如喷雾、浸液或滴液)的动物饲料中以产生处理过的动物饲料。然后可以干燥所述处理过的动物饲料。含有一种或多种噬菌体菌株、一种或多种噬菌体菌株的一种或多种噬菌体组件或其组合的抗细菌组合物的有效量为动物饲料干重的约103pfu/g至1013pfu/g；例如，动物饲料干重的约105pfu/g至109pfu/g。在另一个实例中，含有一种或多种噬菌体菌株、一种或多种噬菌体菌株的一种或多种噬菌体组件或其组合的量为约动物饲料干重的约106pfu/g至108pfu/g。
液体动物饲料可以是发酵的液体饲料(FLF)或未发酵的液体饲料(NFLF)。当使用NFLF时，在用水混合前或混合后可以向所述饲料中加入噬菌体和/或噬菌体组件。当使用FLF时，可以在发酵前、发酵过程中或发酵后加入噬菌体或噬菌体组件。例如，可以在饲料发酵前加入噬菌体或噬菌体组件或者两者的组合。在更具体的实例中，可以在发酵前加入噬菌体和/或噬菌体组件。可以使用约103pfu/ml至1013pfu/ml或其间的任何量的液体饲料；例如，每ml液体饲料可以加入103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013pfu的噬菌体和/或噬菌体组件。在一个非限制性实例中，液体动物饲料的约105pfu/ml至109pfu/ml。在另一个实例中，噬菌体、噬菌体组件或其组合的量可以是液体动物饲料的约106pfu/ml至108pfu/ml。由于噬菌体通常在pH大于2.5的环境中是有活性的，所以噬菌体可以被加到FLF中(pH通常在约3至9之间或其间的任何值，例如pH大约为5)并仍然具有生物活性。如果在FLF中观察到较低的pH值，例如如果在将乳杆菌引入到液体饲料中，那么噬菌体、包封的噬菌体或其组合可以被用于处理所述FLF，在加入乳杆菌之前加入噬菌体。当在发酵前加入噬菌体或噬菌体组件时，则可以在用水混合饲料之前或之后加入所述噬菌体或噬菌体组件。
本发明可被用于任何类型动物的动物饲料或液体动物饲料，包括但不限于用于农业用途的动物。例如但非意在以任何方式限制，根据本发明制备的处理过的动物饲料或处理过的液体动物饲料可被用于饲养用于农业用途的动物，包括但不限于家禽，如鸡或火鸡等；猪；家畜，如马、山羊、绵羊、肉牛、乳牛和野牛等；驯养动物，例如包括猫、狗等的家庭宠物；鱼和贝壳类；以及宠物动物园或其它动物寄养系统中的动物。但是，应该理解的是所述控释的噬菌体、噬菌体组件或两者的组合都可以通过其他途径被给予动物，所述途径根据需要包括但不限于口腔、浸润、吸入、注射、肌内、腹膜内、鞘内、阴道、直肠、局部或其组合。
动物应该接受任何有效减少动物体内靶病原体数量的量的一种或多种控释的噬菌体或噬菌体组件。例如，所述控释的噬菌体可以每天每只动物约105至1013pfu或其间任何量的剂量给药，例如每天每只动物约105、106、107、108、109、1010、1011、1012或1013pfu，持续所需的一段时间。例如且并非意在限制，噬菌体可以每天每只动物约109至1013pfu的治疗剂量给药、或者每天约108至1011pfu、或者每天约109至1011pfu。所述处理时段可以是约1至12天或其间的任何量，例如对动物进一步处理前的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天。或者，可以使用每天约105至1010pfu或其间任何量的维持剂量。例如，维持剂量可以是每天约105、106、107、108、109或1010pfu，持续所需的一段时间。例如且并非意在限制，所需的维持时段可以是约10至180天或其间的任何天数；例如，维持时段可以是10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180天或其间的任何天数。在一个非限制性实例中，维持时段可以是约30至90天或约30至60天。或者，可以每天约109至1013或其间的任何量的治疗剂量来给予控释的噬菌体或噬菌体组件，持续约1至12天或其间的任何量，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天，然后是约105至1010pfu或其间的任何量的维持剂量，持续所需的一段时间，例如但不限于在对动物进一步处理前的约10至180天、约30至90天、或约30至60天或者其间的任何量。
因此，本发明提供了一种用于减少动物体内一种或多种靶病原体数量的方法，包括给予所述动物一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合，使得所述一种或多种噬菌体菌株得以在体内释放并吸附所述一种或多种靶病原体，从而从所述动物体内减少所述一种或多种病原体。此外，在所述给药步骤中，一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合都可以被给予所述动物，例如持续约1至12天、或约5至7天或者其间的任何天数，之后所述动物可以被送出(例如送去屠宰)。在该实施例中，由于经过了处理期，动物体内的病原体载量(load)(例如但不限于大肠杆菌0157)在另外的48-72小时内会被减少或清除，在此期间所述动物会被屠宰。该方法确保将要屠宰的动物含有减少的病原体载量(load)且较清洁的动物将会在加工厂中被加工。
本发明还提供了一种用于减少动物体内一种或多种靶病原体数量的方法，包括以每天每只动物约105至1013pfu的剂量给予所述动物一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合，持续一段所需的时间，使得所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件得以在体内释放并从所述动物体内清除所述一种或多种病原体。
通过使用如上所述的治疗疗法、维持疗法或这两种疗法的组合来给予动物控释的噬菌体或噬菌体组件，通常动物体内、动物废物中和寄养或饲养圈(如饲育场)中靶细菌菌群的量会下降。使用本发明的方法可以减少靶病原体，从而增加给人消耗的食品供应的安全性。
因此，本发明还提供了—种用于减少存在于动物寄养系统中(例如但不限于寄养圈如饲育场、饲养圈如棚或栏、宠物动物园等)的一种或多种靶病原体数量的方法。所述方法包括给予动物饲料、饮用水、动物或其组合一种或多种控释的噬菌体菌株或能够吸附并杀死所述靶病原体的噬菌体组件，使得所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合得以在所述饲料、饮用水、动物消化道、动物废物或其组合中释放，并减少所述动物寄养系统中所述一种或多种靶病原体的数量。
本发明还提供了一种用于减少动物体内的病原体的治疗方案，所述病原体例如但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌和葡萄球菌。并非意在限制，要被运输或被屠宰的动物可以在要被运输的5-7天前用一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合来处理。当使用这一方法时，到治疗的第3-5天时所述动物的病原体水平将会降低到低水平，因此使得从治疗的大约笫4天起，动物可以被安全运输。这提供了一个“安全运输和加工”的区间，在此期间来自于所述寄养系统(例如但不限于寄养或饲养圈，如饲育场)的动物可以被安全地运输和加工。
此外，本发明提供了一种或多种控释的噬菌体、噬菌体组件或两者的组合在用于递送到动物粪便中以预防细菌感染通过所述粪便传播中的用途。所述一种或多种噬菌体和/或噬菌体组件可以是以未包封的形式直接被递送到所述粪便(离体)中或者可以以包封的或控释形式给予所述动物以通过动物肠道被递送到所述粪便。
在粪便中存在的抗靶病原体的噬菌体有助于预防由各种病原体引起的细菌感染的传播。除减少大肠杆菌0157:H7传播之外，噬菌体也能减少金黄色葡萄球菌的计数，大肠杆菌0157:H7会在人类中导致严重的健康问题，金黄色葡萄球菌会感染牛类的乳头和乳房并导致乳腺炎。此外，当动物在栏中走动时通过足浴的方式可以治疗导致蹄病的密螺旋体感染。
本发明将在下述实施例中被一步说明。
实施例
实施例1：噬菌体的分离、扩增和滴定
噬菌体分离自从加拿大的乳牛和肉牛农场获得的粪便样品。使粪便样品与大肠杆菌0157:H7反应并置于琼脂平板上。分离任何获得的噬菌体斑并按标准的噬菌体纯化方案(Maniatis等人(1981)Molecular cloning：alaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)进行纯化。
使用大肠杆菌0157:H7的分离菌株来扩增按上述方法分离纯化的噬菌体。将纯化的噬菌体与细菌混合在一起，在室温下放置10分钟并按本领域常用的标准方案(Maniatis等人(1981)Molecular cloning：a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)进行扩增。过滤灭菌并使用LB培养基中的扩增样品。
噬菌体溶液的浓度使用标准的噬菌体滴定方案(Maniatis等人(1981)Molecular cloning：a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)来确定。用LB稀释含有噬菌体的制品，混合并与大肠杆菌0157:H7孵育10分钟，置于琼脂平板上。根据在不同稀释度下获得的菌斑数量并乘以适当的稀释系数来确定噬菌体的浓度。
实施例2：噬菌体的固定
按实施例1所述制备的大肠杆菌0157:H7特异性噬菌体P10和R4被固定在两种不同的基质上：奶粉(不含脂肪)和大豆蛋白。奶粉(Carnation)和大豆蛋白(Supro)为本地食品商店的现货。两种材料使用相同的方案。
将50g的粉末(奶粉或大豆蛋白)撒在玻璃盘中。将溶液中的噬菌体均匀地喷到每种粉末状基质上。对奶粉使用不同效价的噬菌体，范围从105pfu/g至109pfu/g，每种都产生类似的结果。将噬菌体粉混合并在37℃下干燥2小时，或者直至完全干燥。将所得的噬菌体组合物研磨成细粉，颗粒大小在50-600μm且平均颗粒大小为200μm。将0.5g的每种粉末状噬菌体组合物重悬于10ml反渗透(RO)水中并测试噬菌体的回收率。将不含噬菌体的奶粉或粉末状大豆蛋白用作对照。使用固体奶粉作为基质制备的噬菌体组合物的结果在图1中出示。使用大豆蛋白作为基质制备的噬菌体组合物的结果在图2中出示。
对于固定在奶粉上的噬菌体，结果表明噬菌体可以从所述噬菌体组合物中被回收且未观察到活性丧失。图1表明固定后获得的噬菌体效价(“后”)类似于加入到粉末中的噬菌体的量(“前”)。对于包括大豆蛋白的噬菌体组合物观察到了类似的结果(图2；“后”：固定的噬菌体；“前”加到基质中的噬菌体的量)。
这些结果也表明当引入到水性培养基中时，固定的噬菌体可以容易地从基质中释放出来。图1和2中示出的结果是关于针对大肠杆菌的噬菌体的，对于针对沙门氏菌和弯曲杆菌的噬菌体得到了同样的结果。
实施例3：噬菌体组合物的包封
噬菌体组合物是按实施例2所述来制备的，且包封一般是按流水号为2003/0109025的美国专利(在此通过引用的方式纳入本说明书)所述进行的，同时进行了一些修改以保持噬菌体活性。简言之，使用400g的固定噬菌体和1.2kg的植物脂肪酸进行包封。包封的噬菌体制品所能达到的最大温度为39℃。也可以使用标准方法来将噬菌体组合物制备为片剂，所述方法例如WO02/45695；US 4,601,894；US 4,687,757，US 4,680,323，US 4,994,276，US3,538,214中所述，其中所述药物制剂被按实施例2制备的固定噬菌体所代替。
一旦所述包被操作完成，则收集包封的固定噬菌体颗粒并存储于密封容器中。平均颗粒大小在100至1000μm之间。包括噬菌体的片剂也存储于密闭容器中。
通过确定固定噬菌体制品在包封前(“前”，图3)后(“后”，图3)的活性来确定包封对于固定在奶粉上的噬菌体组合物的效价的作用。为进行这一分析，将包封的噬菌体重悬并用捣碎器研磨。将重悬的包封噬菌体混合以破裂包封的颗粒并释放所述噬菌体。将0.5g包封的固定噬菌体与45.5ml重悬介质(LB培养基或RO水)混合，并加入250μl消泡剂以防止在研磨时起泡。这一分析的结果在图3中示出。
使用片剂化的噬菌体得到了类似的结果。
这些结果证明可以将噬菌体从包封的或片剂化的噬菌体组合物中回收，且包封或片剂化不会使固定的噬菌体失活。图3中示出的结果是关于针对大肠杆菌的噬菌体的；对于针对沙门氏菌和弯曲杆菌的噬菌体得到了类似的结果。
实施例4：包封噬菌体的稳定性和释放
按实施例3所述将固定、包封并片剂化。按下述方式测试当物理或化学破裂时包封的固定噬菌体的释放：将0.5g包封的固定噬菌体与45.5ml重悬介质(LB培养基或RO水)混合。加入250μl消泡剂以防止在研磨时起泡。如上所述制备包封的固定噬菌体的对照样品，但不进行研磨，以确定重悬培养基中包封噬菌体的非特异性浸取(leaching)。以类似的方式处理片剂化的噬菌体。
还检测了低pH下包封的噬菌体的稳定性。重悬后(如上所述)，将所述包封的固定噬菌体在pH 2.15下孵育30或60分钟，用NaOH中和到pH 7.0，然后用捣碎器研磨；将另一个样品(对照)重悬并立即研磨。在使用前用0.45μm的针筒滤器将对照和测试样品过滤灭菌。以类似的方式处理片剂化的噬菌体。
图4A示出了这些分析的结果。数据表明重悬包封的固定噬菌体会产生约1×107pfu/g的噬菌体浓度。类似地，在pH 2.15下单独孵育所述噬菌体不会造成噬菌体的显著释放(30分钟后噬菌体浓度约为1×106pfu/g，或60分钟后噬菌体浓度约为3×107pfu/g)。但是，研磨并破裂所述包封噬菌体颗粒后，释放的噬菌体的量与固定时加载到奶粉上的量(约5×109pfu/g)大致相同。但是，在pH 2.15下孵育未包封和未固定噬菌体30和60分钟会导致噬菌体的感染性基本上完全丧失(图4B)。使用片剂化的噬菌体得到了类似的结果。
这些结果证明破裂包封噬菌体颗粒后噬菌体可以被释放出来。此外，这些结果表明包封噬菌体可以被长时间暴露于2.15的pH下而没有或几乎没有活性(效价)丧失。未包封和未固定的噬菌体的结果与Jepson和March(2004，Vaccine，22：2413-2419)的结果一致，其中在低于2.2的pH下仅经过5分钟后就观察到了噬菌体生存能力的剧烈降低。本发明的包封排除了这种活性缺失。使用片剂化的噬菌体得到了类似的结果。
图4A中示出的结果是关于针对大肠杆菌的噬菌体的；对于针对沙门氏菌和弯曲杆菌的噬菌体得到了类似的结果。
实施例5：固定噬菌体的稳定性
将噬菌体固定于基质上，在该实施例中奶粉如实施例2所述且所述材料存储于室温(RT)或4℃(4C)下的密封容器中。在10个月中，在不同时间点取样并且确定噬菌体效价。初始时噬菌体浓度为3×106pfu/g。
图5表明所述固定噬菌体(噬菌体组合物)在室温或4℃下稳定了至少131天(4.5个月)，且在4℃下稳定了至少311天(10个月)。加入干燥剂或将噬菌体存储于干燥环境中可以进一步增加噬菌体组合物的生存能力。
实施例6：用包封噬菌体处理被大肠杆菌0157:H7天然污染的牛类
在该剂量范围研究中，所有阶段均使用从拍卖市场得到的外来杂交品种的饲育场小牛。研究动物的单个动物重量在200kg和250kg之间(4411bs和551 1bs)。在第4天，从每只动物取50至100g排泄物样品并且鉴定了40个动物大肠杆菌0157:H7阳性培养物以在本研究中使用。
使用计算机生成的随机分配到三个实验组之一的表格将选定用于本研究的动物分为不同的组：一个对照组或噬菌体处理组(1010pfu/动物/天）。每组中有20只动物，每个栏住10只动物。
所述饲料被配制成满足或超出饲育场动物的营养需求，并且在所述研究前进行了测试以确保它不含大肠杆菌0157:H7和大肠杆菌0157:H7噬菌体。在整个饲养期间允许所述动物随意地消耗饲料和水。
对于对照组中的动物，按每只动物10g对照包封材料(不含噬菌体)分别将其充分混合到它们的日配给中。将所述包封材料加入到饲料中，持续5天。
对于噬菌体处理组中的动物，使用了3种固定(参见实施例2)和包封(参见实施例3)的噬菌体混合物。按每只动物10g包封噬菌体制品(等价于1010pfu/动物/天)以适当剂量与日配给饲料充分混合，使得所述噬菌体在24小时内被递送到动物体内。将所述包封材料加入到饲料中，持续5天。
将所述动物放入封闭的1级研究室中。
在该研究的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10天收集双份的50至100g排泄物样品。一份样品用于确定噬菌体计数，另一份用于确定大肠杆菌0157:H7排放和总大肠菌计数。对于每只动物均使用新的触诊套筒来收集排泄物样品，然后将其转移到适合的容器中并在运输前储存在4℃下。
除血液外，在处死时从下述特定组织中取样10至20g：肝脏、脾脏、肾、三头肌、半腱肌和膈。
用适当的描述和分析统计学方法来比较实验组之间的大肠杆菌0157:H7排放、总大肠杆菌和大肠菌排泄物计数和总噬菌体计数，由于所述测量代表了对每只动物的重复测量，所以要进行检验。
天然携带所述病原体的牛类中大肠杆菌0157:H7计数的减少
与对照组相比，用第2至4天给予的噬菌体处理测试组的牛类会造成大肠杆菌0157:H7排放的显著下降(参见图6)。与噬菌体处理组相比，对照组中细菌载量(load)一直较高。与噬菌体处理组相比，即使是在治疗的最后一天，对照组中细菌排放仍然较高，表明栏中较高病原体载量(load)导致了再污染。
除大肠杆菌0157:H7排放水平外，与对照组目比，噬菌体处理组中每个治疗期(第1-6天)和治疗后期(第7-10天)中的动物排放总量较低(参见图7)。这证明了包封噬菌体在降低农场动物病原体载量(load)方面以及在减少携带病原体的动物的数量方面的作用。
在使用109pfu/动物/天和1011pfu/动物/天的噬菌体剂量的研究中得到了类似的结果。
大肠杆菌0157:H7噬菌体从动物身上的排放
在整个研究过程中一直跟踪上述治疗方案中使用的三种噬菌体的排放。
在给药后观察到噬菌体处理组中大肠杆菌0157:H7特异性排放数量的增加，在第1天达到高数值并且在接下来的4天里持续处在该数值(参见图8)。到第6天时，噬菌体排放水平达到100pfu/g以下，这恰好处于在许多饲育场动物中观察到的噬菌体排放的本底水平内。
该数据表明给予牛类的噬菌体被有效的递送到肠内，经受了皱胃的酸度并且在整个噬菌体给药期间维持在所需的水平。但是，在最后一次噬菌体剂量后，噬菌体在大约1-2天内就被从系统中清除了，表明由于非特异性结合使得动物体内没有噬菌体存留。在筛选饲育场动物的过程中，观察到许多动物体内有低水平的天然噬菌体，因此在治疗结束时可以不必使噬菌体计数处于本底水平之下。
噬菌体的RFLP分析
用RFLP分析研究过程中回收的所有噬菌体以确定从噬菌体处理过的动物身上分离的噬菌体是否与那些用于该治疗的噬菌体相同。从噬菌斑中纯化噬菌体DNA并用于分析。用分离好的噬菌斑进行扩增并从溶解产物中分离出DNA。
从分离自排泄物样品的噬菌体DNA获得的RFLP模式说明用于治疗的全部三种噬菌体在通过皱胃后存活了下来并到达了小肠。单个噬菌体的RFLP模式还表明通过牛类的GI道后所给予的噬菌体在基因组水平没有变化。图9中显示了使用三种不同的酶的对所给予的噬菌体进行实验得到的—种代表性RFLP模式。
这些数据进一步表明这些噬菌体可用作有效的抗感染试剂。
噬菌体的组织吸收
在研究结束时(第10天)处死动物并且在尸检时收集组织。收集下述组织：肝脏、脾脏、肾脏、三头肌、半肌腱和膈。将组织样品匀浆并进行噬菌体测试。在所分析的组织和血液中均未检测到噬菌体。
在使用109pfu/动物/天和1011 pfu/动物/天的噬菌体剂量的研究中得到了类似的结果。
治疗方案
建议的用于在屠宰前减少牛类中大肠杆菌0157:H7的治疗方案如下：在运输前一周用噬菌体混合物处理所有将要屠宰的动物。当使用这种方法时，到治疗的第3-5天，所有动物的病原体水平都将会被降低到极低的水平(如本研究中所见，接近于或低于检测水平)，因此使得从治疗的第4天起，动物可以被安全运输。这提供了一个一周的“安全运输和加工”的区间，在此期间来自于饲育场的动物可以被安全地运输和加工(参见图10)。这也给了农夫一个在运输期前后±3天的区间。
所有引文通过引用的方式纳入本说明书。
已经参照一个或多个实施方案描述了本发明。但是，对本领域技术人员来说显而易见的是，可对本发明进行各种修改和变动而不背离权利要求书所限定的本发明的范围。

Claims (27)

1.一种用于减少动物体内靶病原体数量的方法，包括给予所述动物一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合，使得所述一种或多种噬菌体菌株得以在体内释放并吸附所述一种或多种靶病原体，从而从所述动物体内减少所述一种或多种病原体。
2.权利要求1的方法，其中所述—种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合都以每只动物约105至1013pfu的治疗剂量给予约1至12天。
3.权利要求1的方法，其中所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件以每天每只动物约105至1010pfu的维持剂量给予。
4.权利要求1的方法，其中所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合都以每天每只动物约105至1013pfu的治疗剂量给予约1至12天，之后再以约105至1010pfu的维持剂量给予。
5.权利要求1的方法，其中所述给药步骤包括口服给药、吸入给药、注射给药、肌内给药、腹膜内给药、鞘内给药、直肠给药、局部给药或上述给药方式的组合。
6.权利要求5的方法，其中所述口服给药包括在动物饲料、饮用水或者两者的组合中提供所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合。
7.权利要求1的方法，其中所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合都是被固定在基质上、被冻干、被固定在基质上并被包封、被冻干并被包封、以胶囊形式提供、以片剂形式提供或以上述形式的组合形式提供。
8.权利要求7的方法，其中所述基质选自脱脂奶粉、大豆蛋白、白蛋白粉、单细胞蛋白、海藻糖、甘露醇、糖、糖醇、其他基于水溶性碳水化合物的材料、合成的植物源塑料，以及它们的组合。
9.权利要求8的方法，其中所述一种或多种控释的噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合都是用选自植物脂肪酸、脂肪酸、硬脂酸、棕榈酸、动物蜡、植物蜡、巴西棕榈蜡和蜡衍生物的材料来包封的。
10.权利要求8的方法，其中所述一种或多种控释的噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合都是用选自糖和基于可溶性非脂质的材料的材料来包封的。
11.权利要求1的方法，其中所述噬菌体组件选自噬菌体尾、噬菌体蛋白以及它们的组合。
12.一种用于减少存在于寄养系统中的靶病原体数量的方法，包括给予动物饲料、饮用水、动物或它们的组合一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件，使得所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件得以在所述饲料、饮用水、动物消化道、粪便或它们的组合中释放，吸附并杀死所述靶病原体，从而减少所述寄养系统中所述一种或多种病原体的数量。
13.权利要求12的方法，其中所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合都以每只动物约105至1013pfu的治疗剂量给予约1至12天。
14.权利要求12的方法，其中所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件是以每天每只动物约105至1010pfu的维持剂量给予的。
15.权利要求12的方法，其中所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合都以每天每只动物约105至1013pfu的治疗剂量给予约1至12天，之后再以约105至1010pfu的维持剂量给予。
16.权利要求12的方法，其中所述给药步骤包括口服给药、吸入给药、注射给药、肌内给药、腹膜内给药、鞘内给药、直肠给药、局部给药或上述给药方式的组合。
17.权利要求16的方法，其中所述口服给药包括在动物饲料、饮用水或者两者的组合中提供所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合。
18.权利要求12的方法，其中所述一种或多种控释的噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合都是被固定在基质上、被冻干、被固定在基质上并被包封、被冻干并被包封、以胶囊形式提供、以片剂形式提供或以上述形式的组合形式提供。
19.权利要求18的方法，其中所述基质选自脱脂奶粉、大豆蛋白、白蛋白粉、单细胞蛋白、海藻糖、甘露醇、糖、糖醇、其他基于水溶性碳水化合物的材料、合成的植物源塑料，以及它们的组合。
20.权利要求19的方法，其中所述一种或多种控释的噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合都是用选自植物脂肪酸、脂肪酸、硬脂酸、棕榈酸、动物蜡、植物蜡、巴西棕榈蜡和蜡衍生物的材料来包封的。
21.权利要求19的方法，其中所述—种或多种控释的噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合都是用选自糖和基于可溶性非脂质的材料的材料来包封的。
22.权利要求12的方法，其中所述噬菌体组件选自噬菌体尾、噬菌体分子、分子构建体或噬菌体蛋白以及它们的组合。
23.权利要求1的方法，其中在所述给药步骤中，所述一种或多种控释的噬菌体菌株或噬菌体组件或者两者的组合都被持续给予至所述动物5-7天的时间。
24.权利要求23的方法，其中在给药步骤后，所述动物被屠宰。
25.一种用于预防由一种或多种靶病原体导致的动物体内感染的传播的方法，所述方法包括给予所述动物一种或多种噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合，使得所述一种或多种噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合得以在所述动物的消化道内释放，吸附并杀死所述靶病原体，从而减少动物废物中所述一种或多种病原体的数量。
26.权利要求25的方法，其中所述靶病原体为大肠杆菌0157:H7、金黄色葡萄球菌、密螺旋体或其他胃肠道中携带的病原体或者它们的组合。
27.权利要求25或26的方法，其中所述一种或多种噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合都是以控释的噬菌体菌株、噬菌体组件或两者的组合的形式提供的。
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