ES2426162T3 - Composiciones y métodos para inhibir el crecimiento de patógenos - Google Patents
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Abstract
Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una bacteria productora de ácido láctico para la fabricación de unmedicamento para el tratamiento o la prevención de una infección patógena intestinal en un rumiante, siendo dichabacteria productora de ácido láctico una cepa LA51 de Lactobacillus acidophilus
Description
Composiciones y métodos para inhibir el crecimiento de patógenos
La presente invención se refiere a composiciones y usos para inhibir el crecimiento de patógenos. De forma más específica, la invención se refiere a composiciones y usos para inhibir el crecimiento de patógenos mediante el uso de microorganismos productores de ácido láctico tanto solos y en combinación con microorganismos que utilizan
10 lactato.
La ingestión de patógenos, especialmente patógenos bacterianos, pero que incluyen virus y otros microorganismos
15 productores de enfermedades, es un problema común de la mayoría de animales. Se sabe que los patógenos producen enfermedades en animales que tienen una amplia gama de efectos perjudiciales que incluyen pérdida de peso, diarrea, calambres abdominales, e insuficiencia renal. Para animales que están inmunosuprimidos o desnutridos, incluso hasta los efectos de la diarrea pueden ser fatales. Los patógenos se transfieren a menudo entre animales cuando existen malas condiciones higiénicas, y algunas veces no se puede evitar la comunicabilidad
20 incluso aunque se tenga el mayor cuidado. La solución más común a este problema ha sido proporcionar antibióticos a los animales; sin embargo, la solución no solamente es muy costosa, sino que también puede dar como resultado la generación de cepas de bacterias resistentes a antibióticos.
Se originan riesgos para la salud extremadamente importantes cuando los seres humanos consumen patógenos en
25 productos alimenticios contaminados tales como, por ejemplo, brotes, lechuga, productos cárnicos, leche y zumos sin pasteurizar, y agua contaminada con aguas residuales. El problema es particularmente prevalente en la industria de la carne de ternera y en la industria láctea. Los patógenos presentes en la ubre de la vaca o en un equipo de ordeño pueden abrirse camino hasta llegar a la leche cruda. La carne puede quedar contaminada durante la matanza, y los organismos patógenos se pueden mezclar con grandes cantidades de la carne cuando esta se pica.
30 Cuando los seres humanos comen carne, especialmente ternera picada, que no se ha cocinado suficientemente para matar cualquiera de los patógenos presentes en la ternera, se pueden ocasionar graves infecciones con riesgo para la vida. Esto es un problema difícil de resolver debido a que la carne contaminada tiene frecuentemente un aspecto y un olor perfectamente normales. Además, el número de organismos patógenos necesarios para producir la patología es extremadamente pequeños haciendo de esta manera la detección extraordinariamente difícil.
35 Los patógenos que producen enfermedades en el tracto intestinal se conocen como enteropatógenos. Los ejemplos de bacterias enteropatogénicas, o enterobacterias incluyen Staphylococcus aureus, cepas concretas de Escherichia coli (E. coli) y Salmonella spp. Mientras que la mayoría de los cientos de cepas de E. coli no son perjudiciales y viven en los intestinos de los animales, incluyendo los seres humanos, algunas cepas, tales como E. coli 0157:H7,
40 O111:H8, y O104:H21 producen grandes cantidades de poderosas toxinas del tipo shiga, que están estrechamente relacionadas o son idénticas a la toxina producida por Shigella dysenteriae. Estas toxinas pueden producir perturbaciones graves en el intestino delgado, produciendo a menudo lesiones en el revestimiento del intestino y dando como resultado casos extremos de diarrea. E. coli 0157:H7 puede producir también colitis hemorrágica aguda, caracterizada por calambres abdominales graves y sangrado abdominal. En niños, esto puede progresar
45 hasta el raro pero fatal trastorno denominado síndrome urémico hemolítico (“HUS”, por sus siglas en inglés), caracterizado por insuficiencia renal y anemia hemolítica. En adultos, esto puede progresar a una dolencia denominada púrpura trombocitopénica trombótica (“TTP”), que incluye HUS más fiebre y síntomas neurológicos y puede tener un índice de mortalidad tan alto como un cincuenta por ciento en las personas mayores.
50 La reducción del riesgo por enfermedad debido a los patógenos que se transmiten a través de los alimentos se puede conseguir mediante el control de los puntos de potencial contaminación. La industria productora de carne de ternera ha reconocido la necesidad de investigar el control de los patógenos previo a la obtención de la carne, particularmente E. coli O157:H7, debido a la potencial contaminación por escorrentías, el contacto con seres humanos, y la transferencia de patógenos durante el procesamiento de la carne. En particular, se ha implicado a la
55 hamburguesa cruda o poco cocinada (ternera picada) en muchos brotes documentados que contenían E. coli 0157:H7.
De acuerdo con esto, existe una reconocida necesidad de composiciones y métodos para reducir o eliminar el crecimiento de enteropatógenos tales como E. coli O157:H7 para conseguir beneficios sanitarios en animales. 60 Además, existe una importante necesidad de reducir o eliminar el crecimiento de enteropatógenos en los animales productores de carne y leche antes de su recogida para el beneficio de los consumidores. Mediante dicha reducción
o eliminación en los animales destinados para alimentación, los consumidores de carne de ternera, leche y otros productos alimentarios estarán mejor protegidos del riesgo de consumir dichos patógenos.
Puesto que se sabe que los patógenos habitan muchas zonas distintas de los tractos digestivos de los animales, se ha encontrado que lo más beneficioso es suministrar y potenciar aquellos organismos que se producen naturalmente
5 en aquellas zonas en que son eficaces para inhibir el crecimiento patogénico a través del tracto digestivo, tal como el rumen, el intestino delgado, y el intestino grueso. La presente invención identifica dichos organismos que se producen naturalmente que son adecuados para servir a este fin y demuestra métodos para potenciar sus poblaciones y eficacia. Los microorganismos incluidos en las formulaciones y métodos de los presente inventores pueden producir individual y colectivamente compuestos que inhiben el crecimiento de patógenos en el tracto gastrointestinal (“TGI”) de los animales. Inhibiendo el crecimiento de los patógenos, los métodos y compuestos de la invención proporcionan una probabilidad reducida de productos alimenticios contaminados resultantes de los animales tratados.
La invención aprovecha la competición natural de determinados microorganismos con los organismos patógenos
15 cuya reducción o destrucción es el objeto de la invención. Los microorganismos incluidos en las formulaciones de la invención pueden presentar modos multifacetados de acción. Esta gama de acciones proceden de acciones complejas tales como actuar como o producir bactericidas a la mera competición con el patógeno utilizando más nutrientes y espacios de unión que los patógenos, evitando de esta manera que lleguen a establecerse en el TGI. Estos modos de acción ventajosos pueden compararse con técnicas menos ventajosas conocidas convencionalmente por conseguir dichos efectos utilizando una estabulación aséptica acompañada por la adición de antibióticos y sustancias similares para la alimentación animal.
En el modo de acción competitivo, particularmente de Lactobacillus acidophilus, que incluye la cepa 381-IL-28 (también conocida como y denominada en todas partes como la cepa LA51 y NPC747), los microorganismos
25 recrecen y sobrepasan la población de E. coli O157:H7, actuando por tanto como un inhibidor de este patógeno. Se entiende que E. coli O157:H7 y Lactobacillus acidophilus utilizan al menos parcialmente el mismo suministro limitado de nutrientes in vitro tales como azúcar. Además, estos microorganismos compiten por el mismo espacio de unión: sobre el revestimiento del TGI. Con un inhibidor de proliferación rápida tal como Lactobacillus acidophilus, el modo primario de acción contra E. coli 0157:H7 es superarla utilizando el alimento disponible y los espacios de unión adecuados.
La invención incluye el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una bacteria productora de ácido láctico que es una cepa de Lactobacillus acidophilus, para la fabricación de un medicamento para tratar o evitar una infección patógena intestinal en un rumiante.
35 La cepa de Lactobacillus acidophilus es LSA51. La bacteria productora de ácido láctico se puede administrar a un nivel de al menos 1 X 108 UFC/día. Alternativamente, la bacteria productora de ácido láctico se puede administrar a un nivel de aproximadamente 1 X 109 UFC/día. El patógeno se puede seleccionar entre el grupo que consiste en E. coli, Salmonella spp, que incluye Salmonella typhimurium y alternativamente, el patógeno puede ser E. coli O157:H7.
Otro aspecto de la invención incluye una composición para tratar o evitar una infección patógena en un rumiante que comprende una cepa de Lactobacillus acidophilus en combinación con un alimento animal o agua. La cepa de Lactobacillus acidophilus es LA51. El Lactobacillus acidophilus puede estar presente en el alimento animal en una 45 cantidad de más de 1 x 108 UFC para cada cantidad de alimento igual a la cantidad ingerida por un animal en un día,
o el Lactobacillus acidophilus puede estar presente en el alimento animal en una cantidad de aproximadamente 1 x 109 UFC para cada cantidad de alimento igual a la cantidad ingerida por un animal en un día.
Como se ha mencionado ya, la cepa LA51 es también conocida como 381-IL-28, y está disponible con el número de acceso de la colección de la Universidad del Estado de Oklahoma. Aunque los inventores han caracterizado LA51 como un Lactobacillus acidophilus, otros medios de caracterización la han identificado como Lactobacillus animalis, y Lactobacillus murinus. LA45 está depositado en la American Type Culture Collection con el número de acceso ATCC 53545. M35 y L411 son los números de acceso de las bacterias disponibles de la Universidad de Nebraska.
55 El uso puede comprender administrar al rumiante una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una bacteria productora de ácido láctico y una bacteria utilizadora de lactato, donde la bacteria productora de ácido láctico reduce la cantidad de un patógeno en el intestino del rumiante. La bacteria utilizadora de lactato se puede seleccionar entre el grupo que consiste en Megasphaerae eilsdenii, Peptostreptococcus asaccharolyticus, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium acid-propionici, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium globosum, Propionibacterium jensenii, Propionibacterium shermanii, Propionibacterium spp., Selenomonas ruminantium, y sus combinaciones. La bacteria productora de ácido láctico es Lactobacillus acidophilus. El Lactobacillus acidophilus es la cepa LA51. En una realización, la bacteria utilizadora de lactato es Propionibacterium freudenreichii. En otra realización, la cepa de Propionibacterium freudenreichii se selecciona entre el grupo que consiste en P9, PF24, P42, P93 y P99. En otra realización, la cepa de Propionibacterium freudenreichii
65 es PF24, disponible de la ATCC con el número de acceso ATCC 9615. La bacteria utilizadora de lactato y la bacteria productora de ácido láctico pueden cada una administrarse en una cantidad mayor de aproximadamente 1 x 108 UFC/día, o en una cantidad de aproximadamente 1 x 109 UFC/día. Alternativamente, la bacteria utilizadora de lactato se puede administrar en una cantidad de más de 1 x 106 UFC/día, preferentemente en una cantidad de más de 1 x 108 UFC/día, y lo más preferible, en una cantidad de aproximadamente 1 x 109 UFC/día.
5 La composición para tratar o evitar una infección patógena en un rumiante que comprende una cepa de Lactobacillus acidophilus que es LA51, puede estar en combinación con una cepa de Propionibacterium freudenreichii seleccionada entre el grupo que consiste en P9, PF24, P42, P93, P99, y sus combinaciones. En una realización, la composición comprende además alimento animal. En otra realización, el Lactobacillus acidophilus y el Propionibacterium freudenreichii están cada una presentes en el alimento animal en una cantidad de aproximadamente 1 x 108 UFC para cada cantidad de alimento igual a la cantidad ingerida por un animal en un día. En otra realización la cepa LA51 de Lactobacillus acidophilus y la cepa PF24 de Propionibacterium freudenreichii están cada una presentes en el alimento animal en una cantidad de aproximadamente 1 x 109 UFC para cada cantidad de alimento igual a la cantidad ingerida por un animal en un día. La composición puede comprender además la cepa LA45 de Lactobacillus acidophilus, que puede estar presente en el alimento animal en una cantidad
15 de aproximadamente 1 x 106 UFC para cada cantidad de alimento igual a la cantidad ingerida por un animal en un día.
La presente invención proporciona métodos y composiciones para reducir o eliminar el crecimiento de patógenos en el intestino de un animal. Se han llevado a cabo ensayos in vitro e in vivo utilizando determinadas cepas de microorganismos, que se ha encontrado que son particularmente eficaces en la inhibición del crecimiento de muchos patógenos, incluyendo E. coli 0157:H7. Tal como se usa en el presente documento, el término “patógenos” se refiere a cualquier bacteria que produce un efecto perjudicial en un animal hospedador, y especialmente aquellas bacterias
25 que infectan los animales productores de carne y de leche y posteriormente infectan el suministro de alimentos para los seres humanos, produciendo de esta manera enfermedades en los seres humanos. Se considera que la invención es útil para evitar el crecimiento de una amplia variedad de organismos patógenos tal como se demuestra en el presente documento mediante diferentes ensayos que muestran la inhibición del crecimiento de las bacterias patógenas, incluyendo E. coli, Salmonella spp, que incluye Salmonella typhimurium, y Staphylococcus aureus.
Las formulaciones y métodos descritos en el presente documento son aplicables a una amplia variedad de especies animales y prácticas comerciales, Se puede considerar la inhibición de patógenos en el TGI de animales, en aquellos animales utilizados en la producción comercial de carne, leche, aves de corral, y peces. En un aspecto, la invención incluye un método para tratar un animal para inhibir la incidencia y el crecimiento de E. coli O157:H7. El
35 método de tratamiento incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un Lactobacillus acidophilus seleccionado en un animal que inhibe el crecimiento in vivo de E. coli O157:H7. Tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de bacterias administradas a un animal que da como resultado un efecto terapéutico creando un entorno no hospitalario para los patógenos. Se ha encontrado que una cantidad terapéuticamente eficaz de Lactobacillus acidophilus puede ser tan pequeña como de 1 x 106 UFC/día cuando se administra en combinación con otros componentes, aunque es preferible que la bacteria productora de ácido láctico de la invención se administre en una cantidad de más de 1 x 108 UFC/día. Se ha encontrado que es particularmente eficaz cuando el Lactobacillus acidophilus seleccionado se administra a un nivel de aproximadamente 1 x 109 UFC/día.
45 Entre las cepas de Lactobacillus acidophilus que se han encontrado como particularmente eficaces como inhibidores de E. coli O157:H7 se encuentra la 381-IL-28, o la cepa LA51. En un aspecto, la invención incluye cepas de Lactobacillus acidophilus que son composiciones eficaces en los métodos anteriormente descritos cuando se proporcionan como un producto para el consumo animal en las concentraciones prescritas como inhibidores de E. coli O157:H7. Antes de la presente invención, los microorganismos de Lactobacillus acidophilus se han administrado como aditivos de alimentos animales para fines diferentes tal como una mejor utilización de los comestibles. Por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.534.271 y 5.529.793, notifican que determinadas combinaciones de bacterias productoras de ácido láctico y bacterias utilizadoras de lactato podrían utilizarse en un método para mejorar la utilización de comestibles por los rumiantes. La presente invención, en contraste, define métodos para inhibir el crecimiento de patógenos en animales y para mejorar la calidad y la cantidad de productos lácteos. Sin
55 embargo, un aspecto de la presente invención incluye el descubrimiento de que determinadas formulaciones novedosas para inhibir el crecimiento de patógenos dadas a conocer en el presente documento son también útiles para mejorar la utilización de comestibles. En la medida que estas formulaciones eran anteriormente desconocidas para mejorar la utilización de los alimentos, forman parte de la presente invención a este fin.
En una realización, la presente invención incluye un método para proporcionar un producto como inhibidor del crecimiento de E. coli O157:H7 en animales. El método incluye seleccionar un microorganismo terapéuticamente eficaz como inhibidor de E. coli O157:H7 en animales y producir un producto que contiene este microorganismo. En general, dichos productos requieren una homologación gubernamental de que están certificados como inhibidores de patógenos, específicamente, se necesita normalmente la certificación del Departamento de Agricultura de los 65 Estados Unidos (USDA). Si el producto es para consumo humano, por ejemplo, para contrarrestar una infección de
E. coli en un ser humano, se necesita la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA).
Un ejemplo de un microorganismo que se ha descubierto que es terapéuticamente eficaz es Lactobacillus acidophilus, preferentemente la cepa LA51, que inhibe el crecimiento in vivo de E. coli O157:H7 y otros
5 microorganismos patógenos cuando se administra a animales a una dosis de aproximadamente 1 x 109 UFC/día. Alternativamente, se puede considerar que un nivel suficiente es al menos como mucho de 1 x 108 UFC/día. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente los niveles de dosificación exactos evaluando la tolerancia biliar de las bacterias que se van a administrar a fin de verificar que los organismos viables se administran al tracto intestinal para competir e inhibir el crecimiento de bacterias patógenas tales como E. coli O157:H7.
La presente divulgación identifica algunos organismos que se producen naturalmente que son capaces de inhibir el crecimiento de patógenos en el TGI de un animal. Debido a que muchos patógenos son acidoresistentes y habitan muchas zonas distintas del tracto digestivo de un animal, los organismos de la invención que se producen naturalmente son, de forma preferible, capaces de inhibir el crecimiento de patógenos a un pH inferior y en varias
15 zonas del TGI; por ejemplo, el rumen, el intestino delgado y el intestino grueso. Las investigaciones iniciales han mostrado que se puede conseguir la disminución de las poblaciones de E. coli O157:H7 en ganado alimentado con raciones de heno, que ya de por sí aumentan el pH del rumen a 7,0. Sin embargo, esto tiene una aplicación limitada en las industrias de acabado o de cebo de ganado debido a que los animales en esta fase del procedimiento de producción se alimentan normalmente con una dieta que tiene una mayor proporción de grano a fin de reforzar mejor las características de la carcasa.
Los microorganismos que son útiles en las formulaciones y métodos para producir ácido láctico en el TGI incluyen, por ejemplo, los géneros Lactobacillus o Enterococcus. Se pueden utilizar cualquiera o ambos géneros. Se distinguen por su capacidad de utilizar azúcares tales como glucosa o lactosa o, en el caso de Enterococcus, de
25 utilizar almidón, para producir ácido láctico y de esta manera reducir el nivel del pH local. La elección del microorganismo puede depender del locus en el cual se va a administrar el efecto deseado. Por ejemplo, el género Lactobacillus es capaz de reducir el pH local más que los microorganismos Enterococcus.
Los organismos productores de ácido láctico que se pueden usar incluyen: Bacillus subtilis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium thermophilum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus galactosus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorans, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus batatas, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchnerii, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus casei, Lactobacillus 35 cellobiosus, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus confusus, Lactobacillus coprophilus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus corynoides, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus desidiosus, Lactobacillus divergens, Lactobacillus enterii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus frigidus, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus hordniae, Lactobacillus inulinus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus jugurti, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus kefir, Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus minor, Lactobacillus minutus, Lactobacillus mobilis, Lactobacillus murinus, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pseudoplantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus tolerans, Lactobacillus torquens, Lactobacillus
45 ruminis, Lactobacillus sake, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sanfrancisco, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus trichodes, Lactobacillus vaccirrostercus, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus xylosus, Lactobacillus yamanashiensis, Lactobacillus zeae, Pediococcus acidlactici, Pediococcus pentosaceus, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetylactis, Streptococcus faecium, Streptococcus intermedius, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus.
Los microorganismos productores de ácido láctico anteriormente relacionados se pueden usar para inhibir o tratar las infecciones de patógenos en un hospedador, particularmente los patógenos bacterianos que incluyen bacterias patógenas tales como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, y Salmonella spp., incluyendo Salmonella typhimurium. Estos microorganismos productores de ácido láctico son particularmente útiles para inhibir o tratar
55 infecciones de E. coli O157: H7. Se ha encontrado también que estos organismos se pueden utilizar para mejorar el rendimiento de los animales con fines alimentarios aumentando el peso de la carcasa, la calidad de la carcasa, reducción de los patógenos de la carcasa y aumento de la ganancia de peso diario promedio y la relación de eficacia alimentaria. Se puede utilizar uno cualquiera de estos microorganismos para cualquiera de estos fines, o se puede utilizar cualquier combinación de estos microorganismos. La invención se refiere al uso y a las composiciones de la cepa LA51 de Lactobacillus acidophilus, tal como se describe en el presente documento.
En otro aspecto, la invención incluye una formulación de una combinación de una cepa LA51 productora de ácido láctico con un segundo microorganismo que potencia la eficacia de los microorganismos productores de ácido láctico en competencia con microorganismos patógenos. Los microorganismos potenciadores que se pueden usar en las 65 formulaciones de la presente invención son preferentemente microorganismos utilizadores de lactato. Los ejemplos de microorganismos utilizadores de lactato útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a:
Megasphaerae eilsdenii, Peptostreptococcus asaccharolyticus, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium acid-propionici, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium globosum, Propionibacterium jensenii, Propionibacterium shermanii, Propionibacterium spp., and Selenomonas ruminantium. Una cantidad terapéuticamente eficaz de estos microorganismos potenciadores es una cantidad que produce un efecto terapéutico
5 beneficioso en el animal al cual se administra, por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de estos microorganismos potenciadores puede ser mayor de 1 x 106 UFC/día, preferentemente 1 x 108 UFC/día, o incluso de forma más preferible aproximadamente 1 x 109 UFC/día.
El uso de microorganismos específicos asegura que el efecto deseado se produce localmente. Los diferentes
10 microorganismos usados en la formulación deben ser compatibles entre sí, por ejemplo, capaces de crecer conjuntamente, y preferentemente, potenciar al otro. Adicionalmente, los microorganismos crecen preferentemente rápidos en el lugar de la acción. Los microorganismos se pueden seleccionar para diversas características, tales como resistencia a los ácidos biliares y/o antibióticos comerciales que los hacen más adecuados para el uso previsto.
15 Las formulaciones de la invención incluyen la cepa LA51 de Lactobacillus acidophilus, y puede incluir adicionalmente Propionibacterium freudenreichii o Propionibacterium shermanii o ambos. Preferentemente, las formulaciones de la invención se aplican al alimento diario de la ternera o de la vaca lechera en un suplemento seco, o en una pulverización líquida aplicada al alimento diario de los animales. Las formulaciones se pueden administrar una vez al
20 día o durante el curso del día, tanto en una comida, como dividido entre las comidas, o de cualquier otra manera adecuada.
ENSAYOS IN VITRO: EJEMPLOS 1 Y 2
25 Se han llevado a cabo algunos ensayos in vitro para demostrar la capacidad de una bacteria concreta de competir eficazmente con e interferir con el crecimiento de bacterias patógenas tales como E. coli O157:H7 y otras.
EJEMPLO 1
30 Cultivos liofilizados de organismos utilizadores de lactato y productores de ácido láctico se seleccionaron por su capacidad de inhibir el crecimiento de patógenos tales como E. coli O157:H7, Streptococcus aureus y Salmonella. Se seleccionaron adicionalmente combinaciones de los organismos productores de ácido láctico y de los organismos utilizadores de lactato para su capacidad de maximizar la inhibición del crecimiento de diversos patógenos.
35 A fin de identificar aquellos microorganismos que se podrían utilizar en el método y la formulación de la invención, se llevaron a cabo ensayos in vitro para identificar las cepas individuales particularmente eficaces. Se sometieron a criba siete cepas de Propionibacterium y seis cepas de Lactobacillus por su capacidad de producir bacteriocinas capaces de crear zonas de inhibición en placas de agar que se hicieron crecer con E. coli O157:H7. Los resultados de dichos ensayos se tabulan a continuación
40 Tabla 1. Actividad inhibidora de cepas de Propionibacterium que crecen en medio selectivo
- P9 P42 P79 P88 P93 P99 PF24
- PATÓGENO
- Gram +
- B. cereus
- No No No No No No No
- S. aureus
- Si Si Si No No No No
- Gram-
- E. coli O157:H7
- Si Si No No Si Si Si
- Sal. typhimurium
- No Si No Si Si Si Si
Tabla 2. Actividad inhibitoria de cepas de Lactobacillus que crecen en medio selectivo
- 30SC
- 53545 381IL28 C28 FR3 R2
- PATÓGENO
- E. coli 43985 0157:H7
- -4,1 16,8 91,8 89,7 88,7 64,9
- E. coli 933 0157:H7
- 28,1 -3,4 92,7 93,5 91 89,4
- S. aureus 305
- -15,6 -22,1 82,6 80,6 84,8 23,3
Con respecto a las anteriores tablas, se puede apreciar que tres cepas de organismos productores de ácido láctico de Lactobacillus -381IL28, C28 y FR3– y cuatro cepas de organismos utilizadores de lactato de Propionibacterium – P9, P42, P93 y P99– demuestran la capacidad de inhibir el crecimiento de patógenos, en particular, E coli O157:H7. Debe reconocerse que las combinaciones de microorganismos productores de ácido láctico y utilizadores de lactato
5 se pueden seleccionar por su capacidad de maximizar la inhibición del crecimiento de diversos patógenos.
EJEMPLO 2
Se hicieron crecer bacterias de cepas seleccionadas de Lactobacillus acidophilus y Propionibacterium freudenreichii,
10 en una comparación in vitro con medio semianaeróbico rico en E. coli a 38º C para determinar qué cepas podrían competir eficazmente con E. coli en crecimiento en condiciones de crecimiento in vivo. Se encontró que las cepas LA51 y LA45 podrían sustancialmente sobrepasar la población de E. coli.
Tabla 3. Crecimiento (densidad óptica) de las cepas seleccionadas de bacterias comparado con el de E. coli 15 O157:H7 a en un medio semianaeróbico rico en 38º C
- MINUTOS
- E. coli 0157:H7 LA45 LA51 PF24
- 0
- 0,2 0,2 0,2 0,2
- 50
- 0,3 0,38 0,55 0,3
- 90
- 0,45 0,65 0,84 0,35
- 120
- 0,6 0,85 1 0,36
- 200
- 0,8 1,2 1,28 0,38
- 230
- 0,85 1,25 1,28 0,39
- 365
- 0,9 1,25 1,28 0,5
- 440
- 0,9 1,25 1,28 0,58
ENSAYOS IN VIVO: EJEMPLOS 3-9
En los siguientes estudios in vivo, se inocularon rumiantes proporcionando una cantidad suficiente de las cepas
20 bacterianas ensayadas junto con los componentes necesarios del medio de crecimiento a los intestinos de los rumiantes mediante la ingestión normal. Se observó inhibición del crecimiento de patógenos tales como E. coli O157:H7 en instalaciones para cebo de ganado y ganado para producción láctea, así como otros rumiantes tales como ovejas, cabras y caza. Se utilizaron diversos métodos de inoculación. Los ejemplos de estos métodos de inoculación incluyen:
25 ! Colocar cultivos liofilizados en agua, y a continuación pulverizar o combinar la mezcla sobre el alimento del animal. La mezcla puede estar en forma seca, junto con los vehículos adicionales que se añaden a la dieta del animal. La dieta puede incluir uno o más ingredientes tales como maíz, granos de cereal, subproductos del maíz, subproductos del grano de cereal, heno de alfalfa, ensilado de maíz, ensilado de grano pequeño, heno
30 de hierba, tallos de plantas, subproductos de semillas oleaginosas, harinas proteicas, urea, minerales, melazas y diversas grasas y productos oleosos.
! Cultivos liofilizados suspendidos en diversos aceites, agua y/o compuestos para proporcionar una porción que se va a suministrar directamente al animal y al tracto digestivo del animal. 35 ! Añadir los cultivos liofilizados al agua de bebida de los animales.
EJEMPLO 3
Se llevaron a cabo ensayos in vivo con combinaciones de microorganismos productores de ácido láctico y
40 microorganismos utilizadores de lactato para la inhibición del patógeno E. coli O157:H7. Los resultados de aquellos ensayos se tabulan por debajo en las Tablas 4 y 5.
Tabla 4. Inhibición de E. coli O157:H7 en estiércol a 37º C
- TRATAMIENTO
- 0 Horas 24 Horas
- Control
- 5,74 6,56
- Combinación de PF24, LA45, LA51
- 5,74 4,48
Tabla 5. Inhibición de E. coli O157:H7 en fluido de rumen a 37° C
- TRATAMIENTO
- 0 Horas 24 Horas 48 Horas
- Control
- 6,64 6,7 6,79
- Combinación de PF24, LA45, LA51
- 5,56 5,04 5,00
Los datos se notifican como log10 UFC de E. coli O157:H7 ml. Todos los organismos PF24, LA45 y LA51 son capaces de funcionar a un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0 hasta por encima de un pH de 5 aproximadamente 7,0. En la producción de carne de ternera, la preocupación principal es inhibir los patógenos del ganado en una dieta terminada que contenga elevados niveles de concentrado que tienda a disminuir el pH del rumen desde aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente valores comprendidos en el intervalo de 5,0 a 6,9 intervalo donde funciona preferentemente la formulación de la presente invención. Aunque los anteriores ensayos in vivo ilustran el uso del organismo PF24 utilizador de lactato y de los organismos LA45 y LA51 productores de ácido
10 láctico, debe entenderse que la presente invención no está limitada a estos organismos ya que existen muchas cepas que se pueden adaptar para la formulación y el método de la invención.
Se ha llevado a cabo también el ensayo in vivo con cepas individuales para evaluar su eficacia de inhibición del crecimiento de patógenos, incluyendo E. coli O157:H7. En particular, M35 y LA51 demuestran cada uno la
15 capacidad de inhibir la siembra de E. coli O157:H7 en aproximadamente un cincuenta por ciento por encima del nivel de los animales del control.
EJEMPLO 4
20 Se clasificaron ciento ocho cabezas de ganado en función del peso en corrales de cinco (5) animales por corral. Durante el pesado, se tomó una muestra fecal directamente del recto de cada animal. Inicialmente, solo 3 de los 180 animales ensayados dieron positivo para E. coli O157:H7. Los animales se vigilaron bisemanalmente para siembra tomando una muestra de material compuesto a partir de cinco boñigas recientes sobre el suelo de cada corral. Dos semanas después del periodo de clasificación, veinticinco (25) de los treinta y seis (36) corrales, o el 69%, dieron
25 positivo para E. coli O157:H7. Cuatro semanas después de la clasificación, la prevalencia había disminuido hasta siete corrales que dieron positivo, o un 19,4%.
Transcurridos aproximadamente sesenta días en el periodo de alimentación, se pesó el ganado, se volvió a clasificar, y se ensayaron de nuevo los animales individuales para la siembra del patógeno. En un total de veintiséis
30 (26) animales, o el 14,4%, se llevó a cabo la siembra del patógeno. Los animales se volvieron a clasificar basándose en el peso y en el modelo de siembra. El tratamiento de los animales comenzó en este momento.
Se administraron dos tratamientos diferentes utilizando dos tipos diferentes de bacterias productoras de ácido láctico (NPC 747 y NPC 750) para ensayar su capacidad para reducir E. coli O157:H7 en los animales del estudio.
35 Las muestras tomadas de los corrales una semana después del comienzo del periodo de tratamiento indicaron que el 25% de los corrales que no recibieron tratamiento dieron positivo para E. coli O157:H7, mientras que el 8% de los corrales que recibieron el tratamiento de NPC 750 dieron positivo y un 0% de los corrales que recibieron tratamientos de NPC 747 dieron positivo. Dos semanas después de los tratamientos, el 50% de las muestras
40 tomadas de los animales control (no tratados), fueron positivas, mientras que solo un 30% y un 20% de las muestras de los animales que recibieron los tratamientos de NPC 750 y NPC 747, respectivamente, fueron positivas para E. coli O157:H7. Los ensayos indican una reducción en la tasa de siembra de aproximadamente la mitad que la del control en aquellos animales que recibieron el tratamiento de NPC 747, que fue una reducción mayor que en aquellos que recibieron el tratamiento de NPC 750. Todos los animales que fueron sembrados con E. coli O157:H7
45 antes de recibir el tratamiento con NPC 747 dieron negativo tras recibir el tratamiento. Además, el patógeno no se diseminó a otros animales en el mismo corral. La mayoría de los animales del control que dieron positivo al comienzo de la administración del tratamiento continuaron dando positivo, comenzando con otros animales en el mismo corral a diseminar el patógeno.
50 En el día 42, hubo diferencias significativas (P<0,05) entre los tratamientos de las muestras animales individuales. Un diez por ciento (10%) de los animales alimentados con la cepa NPC 747 dieron positivo, mientras que un 20% de los animales alimentados con NPC 750 dieron positivo. En contraste, el 58% de los animales del control dieron positivo.
55 Los animales se muestrearon antes del sacrificio. Los animales que recibieron el tratamiento con NPC 747 tuvieron
E. coli O157:H7 significativamente (P<0,05) menos detectable, dando positivo solamente un 3,3% de los animales. Los animales que recibieron la cepa NPC 750 y los incluidos en el grupo del control no fueron significativamente diferentes con una siembra del 15% y del 20%, respectivamente.
60 Las muestras fecales tomadas en el matadero indicaron que el 3,3% de los animales tratados con NPC 747 dieron positivo, un 6,6% de los animales tratados con NPC 750 dieron positivo y un 10% de los animales del control dieron positivo. Todas las muestras se promediaron para todos los tiempos de muestreo, se sembró el patógeno en un 61,7% de los animales del control durante el periodo de alimentación, se sembró el patógeno en un 51,7% de los animales alimentados con NPC 750, y se sembró el patógeno en solo un 35% de los animales tratados con NPC
747.
Se colocaron cien (100) bueyes en corrales de diez (10) animales por corral. Inicialmente, se tomó una muestra fecal directamente del recto de dos bueyes por corral. Se tomó otra muestra 170 días después. Los mismos animales se
10 muestrearon durante ambos tiempos de muestreo. Un grupo control que no recibió tratamiento se incluyó en el estudio. Los animales que fueron trataron, se trataron con la cepa LA51 de Lactobacillus acidophilus (adquirida con el nombre comercial NPC2000) Todos los grupos se alimentaron con Rumensin y Tylan. Los resultados de los ensayos se tabulan a continuación.
15 Tabla 6. Inhibición de E. coli tratada con NPC 2000
- TRATAMIENTO
- E. coli + inicial % + E. coli + secundaria % + E. coli + final % +
- Control
- 2 de 20 10 4 de 20 20 3 de 20 15
- LA51
- 5 de 20 25 0 de 20 0 0 de 20 0
Tabla 7. Datos de rendimiento animal después de 198 días (Resultados finales)
- TRATAMIENTO
- Peso vivo inicial, kg.(lbs) Peso vivo final, Kg (lbs.) Peso de la carcasa en caliente, Kg. (lbs) Promedio de ganancia de peso diario, Kg. (lbs)
- Control
- 350,18 Kg (772 lbs) 707,61 Kg (1560 lbs) 428,65 Kg (945 lbs) 1,81 Kg (3,98 lbs)
- LA 51
- 350,18 KG (772 lbs) 737,55 Kg (1626 lbs) 446,34 Kg (984 lbs) 1,96 Kg (4,31 lbs)
- Respuesta, Kg. (lbs)
- 29,94 kg (66 lbs) 17,69 Kg (39 lbs) 0,15 Kg (0,33 lbs)
- % de Respuesta
- 1,92 Kg (4,23 lbs) 1,87 Kg (4,12 lbs) 3,76 Kg (8,30 lbs)
EJEMPLO 6
20 Se llevó a cabo un estudio para determinar si las bacterias probióticas de calidad alimentaria podrían reducir la siembra fecal de E. coli O157: H7 en terneros de razas de carne destetados infectados experimentalmente. Las bacterias probióticas del estudio incluyeron diversos aislados de Lactobacillus spp fecales bovinos que se seleccionaron sobre la base de un elevado nivel de toxicidad in vitro frente a E. coli O157:H7.
25 Cinco terneros de razas de carne de 7 meses de edad se sometieron a cirugía de canulación del rumen y, tras la recuperación, se alojaron en estancias de aislamiento con un nivel 3 de bioseguridad. Los terneros se inocularon intrarruminalmente una vez al día durante un periodo de sesenta días con 1 x 109 UFC de una de las cepas bacterianas probióticas relacionadas en la siguiente Tabla 8.
30 Dos semanas después del inicio de la administración probiótica, se estimuló a los terneros mediante inoculación intrarruminal con E. coli O157:H7 (C1). Quince (C2) y veintisiete (C3) días después de la primera inoculación (C1) se estimuló a los terneros de nuevo. La primera inoculación C1 comprendió un total de aproximadamente 1 x 109 UFC de una combinación de las cepas 920, 922, 944 y 966. La segunda inoculación C2 fue con un total de
35 aproximadamente 1,63 x 1011 UFC de estas cepas. La tercera inoculación C3 incluyó aproximadamente 1 x 109 UFC de la cepa 86-24.
Antes y después de cada estímulo, los terneros se ensayaron diariamente para determinar la siembra fecal de las cepas del inóculo. Cada dos semanas, los animales se ensayaron para establecer la evidencia de la inmunidad
40 evaluada mediante los títulos de anticuerpo en suero para la proteína Tir y el antígeno del lipopolisacárido (LPS) O157. En la Tabla 8 a continuación se muestran los resultados. Todos los terneros tuvieron antes del estímulo un título de anticuerpo dirigido contra Tir relativamente elevado que proporcionó a los terneros un significativo nivel de inmunidad frente a las cepas del estímulo, ya que todos los terneros, incluyendo el control, tuvieron una relación S:C de menos de uno tras el primer tratamiento C1 y el segundo tratamiento C2.
Tabla 8. Comparación del efecto de la alimentación diferente de las cepas probióticas de Lactobacillus spp. Sobre la siembra de E. coli O157:H7 en terneros de raza de carne destetados
- Cepa probiótica y tiempo de estímulo
- Títulos de anticuerpo Nº de días de siembra Siembra total Relación Siembra: Estímulo
- M35
- Tir 157
- C1
- 1:12,800 1:12,800 3 1,45x106 (S1) 0.00145 (S1/C1)
- C2
- 1:12,800 1:12,800 2 3,59x106 (S2) 0.000022 (S2/C2)
- C3
- 1:12,800 1:12,800 3 3,14x108 (S3) 0.314469 (S3/C3)
- Total
- 1:51,200 1:51,200 8 3,2x108 (S) 0.001936 (S/C)
- LA45
- C1
- 1:6,400 1:12,800 3 1,8x106 (S1) 0.0017955 (S1/C1)
- C2
- 1:6,400 1:12,800 2 5,13x106 (S2) 0.0000031 (S2/C2)
- C3
- 1:6,400 1:12,800 19 1,84x1011 (S3) 184.4 (S3/C3)
- Total
- 1:12,800 1:51,200 24 1,84x1011 (S) 1.1759 (S/C)
- PBS
- C1
- 1:25,600 1:12,800 2 1,0x104 (S1) 0.001 (S1/C1)
- C2
- 1:25,600 1:12,800 1 1,47x109 (S2) 0.009 (S2/C2)
- C3
- 1:25,600 1:12,800 8 2,07x108 (S3) 0.207 (S3/C3)
- Total
- ND 1:51,200 11 1,87x109 (S) 0.01 (S/C)
- LA51
- C1
- 1:6,400 1:12,800 2 9,41x106 (S1) 0.0009405 (S1/C1)
- C2
- 1:6,400 1:12,800 1 5,13x106 (S2) 0.0000031 (S2/C2)
- C3
- ND 1:12,800 9 2,62x108 (S3) 0.26163 (S3/C3)
- Total
- 1:6,400 1:51,200 12 2,63x108 (S) 0.0015944 (S/C)
- L411
- C1
- 1:12,800 1:6,400 2 1,03x104 (S1) 0.001026 (S1/C1)
- C2
- 1:12,800 1:6,400 8 6,44x108 (S2) 0.0039529 (S2/C2)
- C3
- 1:12,800 1:6,400 4 5,13x109 (S3) 0.0513 (S3/C3)
- Total
- 1:51,200 1:25,600 14 6,97x109 (S) 0.0042221 (S/C)
La relación de siembra/estímulo en la anterior tabla representa la cantidad total de E. coli O157:H7 sembrada
5 después de la inoculación. Este número normaliza los valores que permiten una comparación más precisa de los animales y que proporciona más información significativa que la mera revisión del número total de días en que el ganado estuvo sembrado el ganado con el organismo. M35, LA45, LA51 y L411 representan las diversas cepas de Lactobacillus ensayadas. PBS representa el animal control La siembra total es la UFC por gramo en las heces multiplicado por la producción fecal en gramos en un día de siembra positivo multiplicado por el número total de días
10 de siembra positivos.
Como los títulos anti-Tir no fueron significativamente diferentes entre los terneros, tres de los cuatro probióticos tienen un efecto basado en la siguiente reducción de la relación S:C en comparación con el control –80% para el ternero alimentado con M35%, 84% para el ternero alimentado con LA51, y 58% para el ternero alimentado con 15 L411-. Además, los animales alimentados con M35 experimentaron una reducción del 27% en el número de días en que estuvo sembrado en comparación con el control J3. Sin embargo, en el animal alimentado con LA51, hubo un
9% de aumento en el número de días en que estuvo sembrado en comparación con el control J3. De acuerdo con esto, la alimentación de probióticos es eficaz en la reducción de la siembra fecal de E. coli O157:H7 en terneros.
EJEMPLO 7
5 Se llevó a cabo un estudio para determinar si las combinaciones de bacterias que utilizan lactato y bacterias productoras de ácido láctico añadidas al alimento de las vacas lecheras podrían reducir los patógenos y mejorar la producción de leche de las vacas lecheras. Se ensayaron tres conjuntos de vacas lecheras. El primer conjunto de vacas lecheras fue el grupo control (Grupo 1). Al segundo conjunto de vacas lecheras se le administró la bacteria
10 utilizadora de lactato Propionibacterium freudenreichii cepa PF24 en combinación con la bacteria productora de ácido láctico Lactobacillus acidophilus cepa NPC 747 de acuerdo con los métodos que se han definido en las secciones anteriores (Grupo 2). Al tercer conjunto de vacas lecheras se le administró la bacteria utilizadora de lactato Propionibacterium freudenreichii cepa PF24 en combinación con dos cepas de la bacteria productora de ácido láctico Lactobacillus acidophilus, LA51 (NPC747) y LA45, de acuerdo con los métodos que se han definido en
15 las secciones anteriores (Grupo 3). En la tabla 9 se muestran los resultados de este estudio.
La tabla 9 demuestra los efectos de cada uno de los regímenes de tratamiento sobre la producción de leche, el peso corporal, y el consumo de alimento de las vacas lecheras. Los datos demuestran que los tratamientos que implican la alimentación de las vacas lecheras con bacterias que utilizan lactato en combinación con bacterias productoras de
20 ácido láctico dieron como resultado mejoras estadísticamente significativas en la cantidad de leche producida, la cantidad de leche corregida por la grasa (es decir, se pesó más leche con un alto contenido de grasa), la relación de la leche corregida por la grasa por cantidad de alimento consumido, la cantidad de leche corregida por la energía producida (es decir, se pesó leche con un mayor contenido calórico), la cantidad de leche corregida por energía producida por cantidad de alimento consumido, la cantidad de grasa láctea en la leche producida, y el contenido de
25 urea del suero sanguíneo de las vacas. La adición de la cepa LA45 en el Grupo 3 dio como resultado un aumento en el contenido de urea del suero sanguíneo de las vacas.
Tabla 9: El efecto de la adición de cultivos bacterianos sobre las variables de rendimiento de las vacas lecheras lactantes.
- Tratamientos
- Contrastes del tratamiento (P<0,10)
- Variable
- Grupo11 Grupo2 Grupo3 Error estándar Grupo 1 vs. Grupos 2 y 3 Grupo 2 vs. Grupo 3
- DMI2, kg/día
- 25,5 26,2 26,3 0,5 NS1 NS
- Leche, kg/día
- 37,7 39,6 38,5 0,7 0,08 NS
- FCM3, kg/día
- 34,9 37,8 37,6 0,8 0,007 NS
- Leche/DMI, kg/kg
- 1,45 1,53 1,48 0,04 NS NS
- FCM/DMI, kg/kg
- 1,35 1,45 1,44 0,03 0,03 NS
- ECM4, kg/día
- 34,5 36,8 37 0,8 0,03 NS
- ECM/DMI, kg/kg
- 1,34 1,42 1,41 0,04 0,03 NS
- Grasa láctea, %
- 3,19 3,23 3,4 0,1 NS NS
- Grasa láctea, kg/día
- 1,15 1,27 1,29 0,04 0,02 NS
- Proteína láctea, %
- 2,95 2,94 3 0,05 NS NS
- Proteína láctea, kg/día
- 1,09 1,13 1,12 0,03 NS NS
- Células somáticas/ml, x1000
- 259 198 257 111 NS NS
- Peso corporal final, kg
- 667,6 658,3 664,1 6,5 NS NS
- Glucosa en suero, mg/dl
- 64,73 67,55 65,52 1,19 NS NS
- Cambio en el peso corporal, kg
- 28,9 20,8 21,2 7,3 NS NS
- N de urea en suero, mg/dl
- 22,62 20,43 21,66 0,48 0,01 0,08
- 1 Sin significación estadística para P>0.10 2 Captación de materia seca3 Leche corregida con grasa al 3.5% 4 Leche corregida con energía para comparación sobre una base calórica equivalente
La tabla 10 muestra una marcada reducción en la incidencia del patógeno E. coli O157:H7 en muestras fecales procedentes de cada uno de los conjuntos de vacas lecheras a los cuales se administró la combinación de bacterias utilizadoras de lactato y bacterias productoras de ácido láctico. El efecto fue particularmente pronunciado en las vacas lecheras a las que se administró las cepas LA51 (NPC747) y LA45 de L. acidophilus en combinación con la cepa PF24 de P. freudenreichii. En este conjunto de vacas no se detectó E. coli O157:H7 en ninguna de las muestras fecales
Tabla 10. Incidencia de E. coli O157:H7 en muestras fecales procedentes de vacas lecheras
- Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
- Incidencia de E. coli O157:H7
- 19% 12% 0%
10 EJEMPLO 8
Se llevó a cabo un estudio para determinar si combinaciones novedosas particulares de bacterias podrían reducir la incidencia de bacterias patógenas. Se ha encontrado también que estas combinaciones mejoraron la eficacia de la alimentación del ganado. Se asignaron doscientos cuarenta bueyes (240) a 48 corrales de cinco bueyes cada uno. 15 El peso promedio de los bueyes era de 780 libras (338,84 kg). Cada corral se asignó a uno de cuatro tratamientos:
(1) grupo 1, fue el grupo control y se alimentó sin microorganismos, (2) grupo 2, se alimentó con dos cepas: Propionibacterium freudenreichii cepa PF24 y Lactobacillus acidophilus cepa LA51 (NPC747), cada cepa en una cantidad de 1 x 109 UFC/día, (3) grupo 3, se alimentó con tres cepas; PF24 en una cantidad de 1 x109 UFC/día, LA51 (NPC747) en una cantidad de 1x109 UFC/día, y Lactobacillus acidophilus cepa LA45 en una cantidad de 1x106
20 CFU/día, y (4) grupo 4, se alimentó con tres cepas: PF24 en una cantidad de 1 x 109 UFC/día, LA51 (NPC747) en una cantidad de 1x106 UFC/día, y Lactobacillus acidophilus cepa LA45 en una cantidad de 1x106 UFC/día.
La Tabla 11 demuestra una mejora en las eficacias de alimentación de los grupos a los que se administraron las combinaciones novedosas de bacterias. Todos los grupos a los que se administraron las combinaciones novedosas 25 de bacterias presentaron una mayor promedio de ganancia de peso diario durante el curso de 56 y 140 días con respecto al grupo del control
Tabla 11: Eficacias de alimentación
- Promedio durante los días 0-56 Promedio durante los días 0-140
- Promedio de ganancia diaria
- Captación de alimento Promedio de ganancia diaria Captación de alimento
- Grupo 1 (control)
- 2,002 kg (4,42 lbs.) 8,67 kg (19,16 lbs.) 1,63 kg (3,62 lbs.) 8,52 kg (18,82 lbs.)
- Grupo 2
- 2,04 kg (4,52 lbs.) 8,88 kg (19,62 lbs.) 1,67 kg (3,70 lbs.) 8,75 kg. (19,32 lbs)
- Grupo 3
- 2,05 kg (4,54 lbs.) 8,71 kg. (19,24 lbs) 1,68 kg (3,72 lbs.) 8,51 kg (18,79 lbs)
- Grupo 4
- 2,08 kg (4,61 lbs.) 8,88 kg. (19,61 lbs) 1,67 kg (3,69 lbs.) 8,74 kg (19,31 lbs.)
30 La Tabla 12 demuestra una mejora sustancial en la cantidad de E. coli O157:H7 encontrada en las carcasas y piel de los bueyes tras el sacrificio. De forma notable, las carcasas de los bueyes en el Grupo 2 presentaron menos de la mitad de este patógeno que el grupo control, y las carcasas de los bueyes en los otros dos grupos presentaron también una sustancial reducción en la cantidad de este patógeno. Particularmente notable es la drástica reducción
35 en la cantidad de E. coli en las pieles de todos los bueyes a los que se administraron las formulaciones de la invención.
Tabla 12; incidencia de E. coli O157:H7
- Carcasa Piel
- Grupo 1 (control)
- 33,3% 20%
- Grupo 2
- 13,3% 0%
- Grupo 3
- 26,6% 0%
- Grupo 4
- 20% 0%
Se llevó a cabo un estudio para determinar cuáles de los diversos métodos de controlar el crecimiento patogénico en ganado esa superior. El primer método implicó alimentar al ganado con las bacterias NPC 747 y NPC 750 (conocida también como M35, disponible con este nombre procedente de la Universidad de Nebraska). El segundo método implicó eliminar el almidón de la dieta del ganado. El tercer método implicó la limpieza del corral. El diseño del estudio fue 3 H 2 H 2 factorial. Se alimentó al ganado con una dieta de acabado (33% de maíz con humedad elevada, 20% de maíz enrollado seco, 40% de alimento de gluten de maíz húmedo, y 7% de alfalfa, con vitaminas, minerales, Rumensin, y Tylan) a 432 bueyes (peso promedio 340 kg) en 54 corrales, con 8 bueyes en cada corral.
5 Las bacterias NPC 747 y NPC 750 se alimentaron diariamente al ganado de 18 corrales. La mitad de los corrales se limpió mensualmente, y la otra mitad se limpió solo al final del estudio. Dos semanas antes del sacrificio, se cambió la dieta para la mitad del ganado sustituyendo de maíz por salvado de maíz en la alimentación del ganado.
Ninguno del primer ni el tercer métodos afectó el rendimiento de los bueyes (P>0,39), pero el cambio de dieta redujo
10 la DMI (P<0,001, 12,8 kg/d frente a 11,5 kg/d) durante las dos últimas semanas, y redujo la ADG y la eficacia durante el periodo de alimentación completo (P<0,001). El peso de la carcasa se redujo 8,4 kg debido al cambio de la dieta.
Se obtuvieron muestras fecales individuales mensualmente y 0, 1, y 2 semanas antes del sacrificio y se analizaron
15 para E. coli O157:H7. Un corral completo fue la unidad de detección experimental, y un corral se consideró positivo para E. coli O157:H7 si cualquiera de los 8 bueyes dio positivo. La detección global de E. coli O157:H7 fue baja (145/3024 animales/semanas). El segundo y el tercer métodos no tuvieron efecto sobre la prevalencia de E. coli O157:H7. El primer método redujo numéricamente los corrales positivos para E. coli O157durante la semana de comercialización (44% frente a 17%; P=0,10)
20 Aunque se han descrito anteriormente diversas realizaciones de la invención, debe entenderse que se han presentado solo a modo de ejemplo, y no de limitación. De esta manera, la amplitud y el alcance de la presente invención no deben limitarse por ninguna de las realizaciones a modo de ejemplo anteriormente descritas, sino que deben definirse solamente de acuerdo con las siguientes reivindicaciones.
Claims (14)
- REIVINDICACIONES1. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una bacteria productora de ácido láctico para la fabricación de unmedicamento para el tratamiento o la prevención de una infección patógena intestinal en un rumiante, siendo dicha 5 bacteria productora de ácido láctico una cepa LA51 de Lactobacillus acidophilus.
- 2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la bacteria productora de ácido láctico se administra a un nivel de al menos 1 x 106 UFC/día.10 3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, donde la bacteria productora de ácido láctico se administra a un nivel de aproximadamente 1 x 109 UFC/día.
- 4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la infección patógena está producida por unpatógeno seleccionado entre el grupo que consiste en E. coli, Salmonella spp., y Staphylococcus aureus. 15
-
- 5.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 4, donde el patógeno es E. coli O157:H7.
-
- 6.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el medicamento comprende además una
cantidad terapéuticamente eficaz de una bacteria utilizadora de lactato. 20 - 7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde la bacteria utilizadora de lactato se selecciona entre el grupo que consiste en Megasphaerae eilsdenii, Peptostreptococcus asaccharolyticus, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium acidpropionici, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium globosum, Propionibacterium jensenii, Propionibacterium shermanii, Propionibacterium spp., Selenomonas ruminantium, y sus combinaciones.
- 8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde la bacteria utilizadora de lactato es Propionibacterium freudenreichii.
- 9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, donde la cepa de Propionibacterium freudenreichii se selecciona entre el 30 grupo que consiste en P9, PF24, P42, P93 y P99.
- 10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, donde la bacteria utilizadora de lactato y la bacteria productora de ácido láctico se administran cada una en una cantidad de más de 1 x 108 UFC/día.35 11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde la bacteria utilizadora de lactato y la bacteria productora de ácido láctico se administran cada una en una cantidad de aproximadamente 1 x 109 UFC/día.
- 12. Una composición para tratar o evitar una infección de patógenos en un rumiante, comprendiendo dichacomposición una bacteria productora de ácido láctico, Lactobacillus acidophilus cepa LA51, comprendiendo además 40 dicha composición alimento animal o agua.
- 13. La composición de acuerdo con la reivindicación 12, donde el Lactobacillus acidophilus está presente en el alimento animal en una cantidad de más de 1 x 108 UFC para cada cantidad de alimento o agua igual a la cantidad ingerida o bebida por un animal en un día.
- 14. La composición de acuerdo con la reivindicación 12, donde está presente Lactobacillus acidophilus en el alimento animal en una cantidad de aproximadamente 1 x 109 UFC para cada cantidad de alimento o agua igual a la cantidad ingerida o bebida por un animal en un día50 15. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-14, donde la composición comprende además una bacteria utilizadora de lactato, donde dicha bacteria utilizadora de lactato es una cepa de Propionibacterium freudenreichii seleccionada entre el grupo que consiste en P9, PF24, P42, P93, P99, y sus combinaciones.55 16. La composición de acuerdo con la reivindicación 15, donde el Lactobacillus acidophilus y el Propionibacterium freudenreichii están cada uno presentes en la alimentación animal o el agua en una cantidad de más de 1 x 108 UFC para cada cantidad de alimento o agua igual a la cantidad ingerida o bebida por un animal en un día.
- 17. La composición de acuerdo con la reivindicación 16, donde el Lactobacillus acidophilus y el Propionibacterium60 freudenreichii están cada uno presentes en la alimentación animal o el agua en una cantidad de aproximadamente 1 x 109 UFC para cada cantidad de alimento o agua igual a la cantidad ingerida o bebida por un animal en un día.
- 18. La composición de acuerdo con la reivindicación 17, donde la cepa de Propionibacterium freudenreichii es PF24.
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| Publication number | Publication date |
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