发明内容
由于已知病原体在动物的消化道的许多特定的区域繁殖,已经发现,提供并加强那些自然出现在相应区域里并能有效抑制消化道(例如瘤胃、小肠和大肠内)病原体生长的生物体是非常有利的。本发明验明这些自然出现的生物体适于应用在上述目的,并且证实增加数量以及功效的方法。本发明制剂和方法中的微生物可以独自或者联合产生抑制动物胃肠道(GIT)中病原体生长的化合物。通过抑制病原体的生长,本发明的方法以及化合物提供了减少经治疗动物所制成食品受污染的可能性。
本发明利用特定微生物与病原体生物体之间的自然竞争,而该病原体生物是本发明所要减少或者破坏的目标。本发明制剂中的微生物表现出多层面的行为模式。这些行为的范围包括从例如担当或者产生杀菌剂的复杂的行为,到通过利用比病原体更多的营养以及更大的附着空间与病原体进行简单竞争,来防止病原体在GIT中定居。这些有利的行为模式与缺少先进性的在动物的饲料中添加抗生素以及类似物的传统无菌饲养方式具有可比性。
在竞争行为模式中,特别是嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),包括菌株381-IL-28(也是已知的并请参照菌株LA51以及NPC747),这些微生物生长以及繁殖的比大肠杆菌O157:H7快,因此作为病原体的抑制物。大肠杆菌O157:H7和嗜酸乳杆菌被认为至少部分地利用了相同的有限的外部营养,例如糖。此外,这些微生物竞争在GIT内膜上相同的附着空间。对于快速增殖的抑制物,例如嗜酸乳杆菌,对抗大肠杆菌O157:H7的最初行为模式是通过利用营养以及适合的附着空间来压制它。
本发明包括一种治疗或预防反刍动物肠内病原体感染的方法,包括给该反刍动物服用含有治疗有效量的产乳酸细菌(lactic acid producing bacterium),其中产乳酸细菌减少反刍动物肠内的病原体的数量。在一实施方案中,该产乳酸细菌选自:枯草杆菌(Bacillus subtilis)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双岐杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifudum)、婴儿双岐杆菌(Biffidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)、阿里卡乳杆菌(Lactobacillus alactosus)、食品乳杆菌(Lactobacillusalinaentarius)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorans)、安洛淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、甜薯乳杆菌(Lactobacillus batatas)、巴伐利亚乳杆菌(Lactobacillus bavaricus)、倍发酵乳杆菌(Lactobacillusbifermentans)、双歧乳杆菌(Lactobacillusbifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchnerii)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、链状乳杆菌(Lactobacillus catenafornae)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、丘状菌落乳杆菌(Lactobacillus colliizoides)、混乱乳杆菌(Lactobacillus confuses)、嗜粪乳杆菌(Lactobacillus coprophilus)、棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)、克氏乳杆菌(Lactobacillus corynoides)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、卡氏乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、落叶乳杆菌(Lactobacillusdesidiosus)、分歧乳杆菌(Lactobacillus divergens)、恩氏乳杆菌(Lactobacillus enterii)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、感冒乳杆菌(Lactobacillusfrigidus)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、果糖乳杆菌(Lactobacillus fructosus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、耐盐乳杆菌(Lactobacillus halotoeraans)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、荷氏乳杆菌(Lactobacillus heterohiochii)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、霍氏乳杆菌(Lactobacillus hordniae)、因氏乳杆菌(Lactobacillus inulinus)、詹氏乳杆菌(Lactoba cillusjensenii)、尤氏乳杆菌(Lactobacillus jugurti)、坎氏乳杆菌(Lactobacillus kandleri)、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、雷氏乳杆菌(Lactobacillusleichmannii)、林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、雄性骚动乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、麦芽香乳杆菌(Lactobacillus maltaromicus)、稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)、小小乳杆菌(Lactobacillus minutus)、移动乳杆菌(Lactobacillus mobilis)、鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、假植物乳杆菌(Lactobacillus pseudoplantarum)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、多噻嗪乳杆菌(Lactobacillustolerans)、扭动乳杆菌(Lactobacillus torquens)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillussanfrancisco)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、发状乳杆菌(Lactobacillus trichodes)、牛痘乳杆菌(Lactobacillusvaccinostercus)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、犊乳杆菌(Lactobacillus vitulinus)、木糖乳杆菌(Lactobacillus xylosus)、山梨乳杆菌(Lactobacillus yamanashiensis)、玉蜀乳杆菌(Lactobacilluszeae)、乳酸片球菌(pediococcus acidlactici)、戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)、乳脂链球菌(streptococcus cremoris)、链锁状球菌(streptococcus discetylactis)、链锁状球菌(streptococcus faecium)、中间链球菌(streptococcus intermedius)、乳链球菌(streptococcuslactis)、嗜热链球菌(streptococcus thermophilius)及它们的组合。在一实施方案中,产乳酸细菌是嗜酸乳杆菌。在另一实施方案中,该嗜酸乳杆菌菌株包括:M35、LA45、LA51以及L411菌株。在另一实施例中,该嗜酸乳杆菌菌株是LA51。该乳杆菌产生的细菌可以被给予的水平至少是1×108CFU/天。作为选择,乳杆菌产生的细菌可以被给予的水平大约是1×109CFU/天。病原体可以是选自:大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella spp),包括盲肠沙门氏菌(Salmonella typhirium),以及金黄色葡萄球菌。作为选择,该病原体可以是大肠杆菌O157:H7。
本发明的另一方面包括用于治疗或预防反刍动物病原体感染的组合物,包括结合于动物的饲料的嗜酸乳杆菌菌株,其选自于:M35、LA45、LA51以及L411。在一实施方案中,嗜酸乳杆菌菌株是LA45或者LA51。嗜酸乳杆菌在动物一天的饲料中的含量大于1×108CFU,或者嗜酸乳杆菌在动物一天的饲料中的含量大约为1×109CFU。
如已经提及的,菌株LA51也已知为381-IL-28,其根据Oklahoma StateUniversity collection的入藏编号可以得到。同时本发明人已经确定了LA51作为嗜酸乳杆菌的特性,已经由其他的手段来表征其作为动物乳杆菌和鼠乳杆菌。LA45保藏在美国模式菌种收集中心(ATCC),入藏编号ATCC53545。M35和L411入藏编号的细菌可以从内布拉斯加州大学(University of Nebraska)得到。
本发明的另一方面包括一种用于治疗或预防反刍动物肠内病原体感染的方法,该方法包括给反刍动物服用组合物,其包括治疗有效量的一产乳酸细菌(lactic acid producing bacterium)和利用乳酸盐细菌(lactateutilizing bacterium),其中所述的产乳酸细菌减少反刍动物肠内病原体的数量。产乳酸细菌选自:枯草杆菌、青春双岐杆菌、动物双岐杆菌、两岐双岐杆菌、婴儿双岐杆菌、长双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、敏捷乳杆菌、阿里卡乳杆菌、食品乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌、淀粉乳杆菌、安洛淀粉乳杆菌、动物乳杆菌、甜薯乳杆菌、巴伐利亚乳杆菌、倍发酵乳杆菌、双歧乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、链状乳杆菌、干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、丘状菌落乳杆菌、混乱乳杆菌、嗜粪乳杆菌、棒状乳杆菌、克氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、卡氏乳杆菌、德氏乳杆菌、落叶乳杆菌、分歧乳杆菌、恩氏乳杆菌、香肠乳杆菌、发酵乳杆菌、感冒乳杆菌、食果糖乳杆菌、果糖乳杆菌、加氏乳杆菌、耐盐乳杆菌、瑞士乳杆菌、荷氏乳杆菌、希氏乳杆菌、霍氏乳杆菌、因氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、尤氏乳杆菌、坎氏乳杆菌、高加索酸奶乳杆菌、乳酸乳杆菌、雷氏乳杆菌、林氏乳杆菌、雄性骚动乳杆菌、马里乳杆菌、麦芽香乳杆菌、稍小乳杆菌、小小乳杆菌、移动乳杆菌、鼠乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、假植物乳杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李乳杆菌、罗氏乳杆菌、多噻嗪乳杆菌、扭动乳杆菌、瘤胃乳杆菌、清酒乳杆菌、唾液乳杆菌旧金山乳杆菌、沙氏乳杆菌、发状乳杆菌、牛痘乳杆菌、绿色乳杆菌、犊乳杆菌、木糖乳杆菌、山梨乳杆菌、玉蜀乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、乳脂链球菌、链锁状球菌、链锁状球菌、中间链球菌、乳链球菌、嗜热链球菌,及其组合。利用乳酸盐细菌可选自:埃氏巨球形菌(Megasphaerae eilsdenii)、不解糖消化链球菌(Peptostreptococcus asaccharolyticus)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、丙酸丙酸杆菌(Propionibacteriumacid-propionici)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、球状丙酸杆菌(Propionibacterizcm globosuna)、詹氏丙酸杆菌(Propionibacterium jensenii)、谢曼(氏)丙酸杆菌(Propionibacteirumshermanii)、丙酸菌属(Propionibacterium spp)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)及其组合。在一实施方案中,该产乳酸细菌是嗜酸乳杆菌。在另一实施方案中,该嗜酸乳杆菌选自:M35,LA45,LA51和L411。在一实施方案中,该嗜酸乳杆菌是LA51。在一实施方案中,利用乳酸盐细菌是费氏丙酸杆菌。在另一实施方案中,该费氏丙酸杆菌选自:P9、PF24、 P42、P93和P99。在另一实施方案中,该费氏丙酸杆菌是PF24,可以从ATCC中获得,其入藏编号是ATCC9615。该利用乳酸盐细菌(lactate utilizingbacterium)和产乳酸细菌每次分别被服用的量可以大于1×108CFU/天,或者大约是1×109CFU/天。作为选择,利用乳酸盐细菌被服用的量可以是1×106CFU/天。在另一个实施方案中,利用乳酸盐细菌被服用的量大于1×106CFU/天,优选大于1×108CFU/天,最优选大约1×109CFU/天。
本发明的另一方面包括用于治疗或预防反刍动物体内病原体感染的组合物,其包含选自M35、LA45、LA51L411以及他们的组合的嗜酸乳杆菌,与选自P9,PF24,P42,P93,P99的费氏丙酸杆菌及其组合的组合。在一实施方案中,该组分进一步包括动物饲料。在另一实施方案中,嗜酸乳杆菌和费氏丙酸杆菌菌株均以超过1×108CFU的含量存在于一个动物一天的饲料中。在另一实施方案中,嗜酸乳杆菌LA51以及费氏丙酸杆菌菌株PF24均大约以1×109CFU的含量存在于一个动物一天的饲料中。在另一实施方案中,该组合物进一步包括嗜酸乳杆菌菌株LA45,1×106CFU的含量存在于一个动物一天的饲料中。
本发明实施方式
本发明提供用于减少或消灭动物消化道内病原体生长的方法和组合物。已经利用特定的微生物菌株进行了体内和体外试验,其在抑制众多病原体生长上,包括大肠杆菌O157:H7,具有显著的效果。如本文所用的术语“病原体”是指任何能在宿主动物体内产生有害影响的细菌,尤其是那些能感染产肉和产奶动物,随后感染人们的食品供应,因此导致人体发病的细菌。本发明被认为在广泛阻止各种病原体生物体的生长方面是有用的,例如通过一些试验表明包括大肠杆菌、盲肠沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的沙门氏菌的一些细菌的生长会受到抑制。
在此描述的制剂和方法可以应用于许多动物品种和商业实践。对动物体内GIT病原体的抑制可考虑用于肉、奶、禽以及鱼类制品的商业生产。一方面,本发明包括治疗动物以抑制大肠杆菌O157:H7发生和生长的方法。该治疗方法包括给动物服用治疗有效量的经过选择的嗜酸乳杆菌,以抑制其体内大肠杆菌O157:H7的生长。如此处所用的术语“治疗有效量”是指给动物服用的细菌量,其能够通过产生病原体不适合生存的环境来达到治疗的效果。已发现,与其他组分组合施用时,嗜酸乳杆菌的治疗有效量可低至1×106CFU/天,虽然优选本发明产乳酸细菌服用量是高于1×108CFU/天。当所选用的嗜酸乳杆菌的服用量为大约1×109CFU/天时,会发现有显著的疗效。
在嗜酸乳杆菌菌株中,发现作为大肠杆菌O157:H7抑制物具有显著效 果的的是菌株381-IL-28或者菌株LA51。一方面,当其作为大肠杆菌O157:H7抑制物以处方浓度的产品给动物使用时,本发明包括嗜酸乳杆菌,该菌株是上述方法中的有效组合物。在本发明之前,嗜酸乳杆菌微生物已经作为动物饲料添加剂以不同的目的给动物服用,如使饲料被更好的利用。例如,在美国专利5,534,271以及5,529,793(在此引入作为参考)中,报道了产乳酸细菌和利用乳酸盐细菌的特定组合能够用于一种提高反刍动物的饲料利用率的方法中。相比之下本发明阐明用于抑制动物体内病原体生长的方法以及用于提高牛奶制品的产量和质量的方法。然而,本发明的一方面包括在此公开的抑制病原体生长的新制剂的发现也可用于提高饲料的利用率。至于这些制剂在提高饲料利用率方面先前所达到未知的程度,出于该目的也构成本发明的一部分。
在一实施方案中,本发明包括了提供作为动物体内大肠杆菌O157:H7生长抑制物的产品的方法。该方法包括:选择具有疗效的微生物作为动物体大肠杆菌O157:H7生长抑制物,并且制造含有该微生物的产品。通常,这些产品作为病原体抑制物需要得到政府的认证许可;尤其是,通常需要美国农业部(USDA)的认证。如果该产品由人使用,例如消除人体中大肠杆菌的感染,还需要得到美国食品和药品管理局(FDA)的许可。
具有疗效的微生物的实例是嗜酸乳杆菌,优选LA51菌株,当以约1×109CFU/天的剂量给动物服用时,其能够在体内抑制大肠杆菌O157:H7以及其他病原体的生长。作为选择,可以考虑充足水平应该至少为1×108CFU/天。通过本领域技术人员评估被服用的细菌的胆汁允许量,以便验证活性生物体被传送到肠道与病原体竞争并抑制病原体的生长,例如大肠杆菌O157:H7,精确的剂量水平易于确定。
本发明确定一些天然存在的生物体,其能够抑制动物体的GIT内病原体的生长。由于许多的病原体具有抗酸性并且生存在动物消化道的特定区域内,优选本发明的天然存在生物体在较低的PH值条件下在动物体内GIT的一些区域里,例如瘤胃、小肠和大肠,抑制病原体的生长。较早的研究表明,大肠杆菌O157:H7种群可以通过给牛定量供应干草而减少,其能够使瘤胃中的PH值为7.0。然而,由于为了培养更好的胴体特征,生产期的动物通常以含有更高谷物比例的食物来喂养,这限制了该方法在育肥或饲养场中的应用。本发明制剂和方法所用的微生物可以在GIT内产乳酸。这些微生物包括:例如,单一的乳杆菌或者肠球菌。可以择一或者两个联合使用。根据利用糖的能力,如葡萄糖或者乳糖,可将它们区别,对于肠球菌利用淀粉以产乳酸,因此降低局部PH水平,可将它们区别。可以根据其所要产生作用的位置来选择微生物。例如,乳杆菌类比肠球菌微生物更具有降低局部PH值水平的能力。
用于本发明方法和组合物中的产乳酸生物体包括但不限于:枯草杆菌,青春双岐杆菌,动物双岐杆菌,两岐双岐杆菌,婴儿双岐杆菌,长双歧杆菌,嗜热双歧杆菌,嗜酸乳杆菌,敏捷乳杆菌,阿里卡乳杆菌,食品乳杆菌,嗜淀粉乳杆菌,淀粉乳杆菌,安洛淀粉乳杆菌,动物乳杆菌,甜薯乳杆菌,巴伐利亚乳杆菌,倍发酵乳杆菌,双歧乳杆菌,短乳杆菌,布氏乳杆菌,保加利亚乳杆菌,链状乳杆菌,干酪乳杆菌,纤维二糖乳杆菌,丘状菌落乳杆菌,混乱乳杆菌,嗜粪乳杆菌,棒状乳杆菌,克氏乳杆菌,卷曲乳杆菌,卡氏乳杆菌,德氏乳杆菌,落叶乳杆菌,分歧乳杆菌,恩氏乳杆菌,香肠乳杆菌,发酵乳杆菌,感冒乳杆菌,食果糖乳杆菌,果糖乳杆菌,加氏乳杆菌,耐盐乳杆菌,瑞士乳杆菌,荷氏乳杆菌,希氏乳杆菌,霍氏乳杆菌,因氏乳杆菌,詹氏乳杆菌,尤氏乳杆菌,坎氏乳杆菌,高加索酸奶乳杆菌,乳酸乳杆菌,雷氏乳杆菌,林氏乳杆菌,雄性骚动乳杆菌,马里乳杆菌,麦芽香乳杆菌,稍小乳杆菌,小小乳杆菌,移动乳杆菌,鼠乳杆菌,戊糖乳杆菌,植物乳杆菌,假植物乳杆菌,罗伊乳杆菌,鼠李乳杆菌,罗氏乳杆菌,多噻嗪乳杆菌,扭动乳杆菌,瘤胃乳杆菌,清酒乳杆菌,唾液乳杆菌旧金山乳杆菌,沙氏乳杆菌,发状乳杆菌,牛痘乳杆菌,绿色乳杆菌,犊乳杆菌,木糖乳杆菌,山梨乳杆菌,玉蜀乳杆菌,乳酸片球菌,戊糖片球菌,乳脂链球菌,链锁状球菌,链锁状球菌,中间链球菌,乳链球菌,嗜热链球菌。
本发明的一个方面,上述提到的任何一种产乳酸微生物可用于抑制或者治疗病原体宿主的感染,尤其是细菌性病原体,其包括例如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,以及包括盲肠沙门氏菌(Salmonella typhirium)的沙门氏菌属的致病细菌。这些产乳酸的微生物尤其适用于抑制或者治疗大肠杆菌O157:H7感染。已发现,这些生物体能够用于改善食用动物的胴体重量、胴体质量,减少胴体病原体以及提高平均体重日增重以及食物的有效率。其中的任何一种微生物可以被用于上述的任何一目的,或者也可以使用上述微生物的任意组合。
另一方面,本发明包括产乳酸微生物(例如前述的那些微生物)与能够增强产乳酸与病原体微生物竞争的第二微生物组合的制剂。优选本发明制剂中增强微生物是利用乳酸盐的微生物。本发明中的利用乳酸盐微生物的实例包括但不限于:埃氏巨球形菌,不解糖消化链球菌,费氏丙酸杆菌,丙酸丙酸杆菌,费氏丙酸杆菌,球状丙酸杆菌,詹氏丙酸杆菌;谢曼(氏)丙酸杆菌;丙酸菌属以及反刍动物月形单胞菌。这些增强微生物的治疗有效量是服用后在动物体内产生有益的治疗效果的量,例如,增强微生物的治疗有效量是大于1×106CFU/天,优选1×108CFU/天,或者甚至更优选约1×109CFU/天。
使用特定微生物确保局部产生预期的效果。制剂中不同的微生物相互之间应该具有相容性,例如,能够一起生长,优选能够使对方更有效力。 另外,优选微生物在作用部位快速生长。微生物可以由于不同的特性而被选择,例如对胆汁酸和/或商业抗生素的抵抗性,这使它们最适于它们预定的作用。
在优选模式中,本发明制剂包括嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、或者鼠乳杆菌其中的一个或者他们的任意组合。在另一优选模式中,本发明的制剂包括嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、或者鼠乳杆菌其中的一个或者他们之间的任意组合,以及另外地包括费氏丙酸杆菌和谢曼(氏)丙酸杆菌其中之一或两者都包括。优选,本发明制剂以干燥补充物方式应用于肉牛或者奶牛的饲料中,或者以流体喷洒方式应用于动物的饲料中。本制剂可以一天一次服用或者一天中在一个流程中服用,可以在一餐中服用或者分散于几餐中服用,或者以其他适合的方式服用。
体外试验:实施例1和2
进行一些体外试验来证明,特定的细菌有能力进行有效的竞争或者干扰例如大肠杆菌O157:H7以及其他病原体细菌的生长。
实施例1
根据抑制例如大肠杆菌O157:H7、金黄色链球菌以及沙门氏菌病原体生长的能力,选择产乳酸和利用乳酸盐的微生物的冻干培养物。根据抑制多种病原体生长的最大能力,进一步选择产乳酸和利用乳酸盐的微生物的组合。
为了确定那些可以在本发明方法以及制剂中利用的微生物,进行了体外试验以确定具有显著效果的单体菌株。7个丙酸菌株和6个乳杆菌株根据他们产生细菌素的能力进行筛选试验,细菌素在生长大肠杆菌O157:H7的琼脂盘上具有产生抑制区的能力。试验结果见下表:
表1在选择性培养基上生长的丙酸菌菌株的抑制活性
表2在选择性培养基上生长的乳杆菌菌株的抑制活性
|
30SC |
53545 |
381IL28 |
C28 |
FR3 |
R2 |
病原体 |
|
|
|
|
|
|
大肠杆菌43985 O157:H7 |
-4.1 |
16.8 |
91.8 |
89.7 |
88.7 |
64.9 |
大肠杆菌933 O157:H7 |
28.1 |
-3.4 |
92.7 |
93.5 |
91 |
89.4 |
金黄色葡萄球菌305 (S.aureus 305) |
-15.6 |
-22.1 |
82.6 |
80.6 |
84.8 |
23.3 |
从上述表中,可以理解的是产乳酸生物体三株乳杆菌乳酸381IL28、C28和FR3-,利用乳酸盐生物体四株丙酸菌-P9,P42,P93和P99-证明了抑制病原体生长的能力,尤其是大肠杆菌O157:H7。可以认识到,产乳酸微生物和利用乳酸微生物的组合可根据它们对多种病原体最大抑制能力进行选择。
实施例2
在38℃下丰富的半厌氧培养基中,所选择的嗜酸乳杆菌和费氏丙酸杆菌与大肠杆菌进行体外生长比较,以确定能更有效地与在体内生长条件下与大肠杆菌竞争的菌株。发现菌株LA51和LA45比大肠杆菌生长的快。
表3在38℃下,在丰富的半厌氧培养基中所选择的细菌菌株与大肠杆菌O157:H7的生长(吸光度)对比
分钟 |
大肠杆菌O157:H7 |
LA45 |
LA51 |
PF24 |
0 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
50 |
0.3 |
0.38 |
0.55 |
0.3 |
90 |
0.45 |
0.65 |
0.84 |
0.35 |
120 |
0.60 |
0.85 |
1.0 |
0.36 |
200 |
0.80 |
1.2 |
1.28 |
0.38 |
230 |
0.85 |
1.25 |
1.28 |
0.39 |
365 |
0.90 |
1.25 |
1.28 |
0.50 |
440 |
0.90 |
1.25 |
1.28 |
0.58 |
体内试验:实施例3-9
在下面的体内研究中,通过借助正常进食将足量测试细菌株连同必要的生长基组分提供给动物肠道,使得反刍动物受到接种。在饲养场以及奶牛中观察到例如大肠杆菌O157:H7的病原体的生长受到抑制,以及其他的反刍动物例如绵羊、山羊和猎物。可使用多种接种方法。这些接种方法的实例包括:
·将冻干培养物放入水中,然后将混合物喷洒或掺和于动物饲料中。混合物以干燥形式,与其他载体一起添加到动物的饲料中。动物饲料包括一种或更多种成分,例如玉米,谷物,玉米副产品,谷物副产品,苜蓿干草,玉米青贮饲料,小粒谷类青贮饲料,禾本科干草,庄稼杆,油料副产品,蛋白质食物,尿素,矿物质,糖蜜,以及各种脂肪和油性产品。
·将冻干培养物悬浮于各种油、水和/或化合物中,用于提供可直接应用于动物服和动物的消化道的兽用顿服药,。
·将冻干培养物加入到动物饮用水中。
实施例3
用于抑制病原体大肠杆菌O157:H7生长的产乳酸微生物和利用乳酸盐微生物的组合进行了体内试验。其试验结果列于下面的表4和表5中:
表4在37℃下在粪便中对大肠杆菌O157:H7的抑制
治疗 |
0小时 |
24小时 |
对照 |
5.74 |
6.56 |
PF24,LA45,LA51的组合 |
5.74 |
4.48 |
表5在37℃下在瘤胃液中对大肠杆菌O157:H7的抑制
治疗 |
0小时 |
24小时 |
48小时 |
对照 |
6.64 |
6.70 |
6.79 |
PF24,LA45,LA51的组合 |
5.56 |
5.04 |
5.00 |
数据以log10CFU大肠杆菌O157:H7/ml记录。生物PF24,LA45和LA51在PH值约4.0到5.0最高是约7.0的条件下都具有功能。在牛肉生产中,主要关注的是在含有高水平浓缩物的精制食物中抑制牛体内病原体,该浓缩物倾向于使瘤胃中PH值从约7.0下降到5.0-6.9范围内,而在该范围内,本发明制剂具有较佳的性能。而上述的体内试验证明利用乳酸盐生物PF24和产乳酸生物LA45和LA51的用途,可以理解的是本发明不仅仅限于这些生物,因为许多菌株适用于本发明的制剂和方法。
也进行了单株菌株的体内试验,以评估它们的抑制病原体生长的效果,包括大肠杆菌O157:H7。尤其是,M35和LA51以高于对照动物约50%的水平,证明其抑制大肠杆菌O157:H7脱落的能力。
实施例4
180只牛以重量分类,并以每栏5只放入围栏中。在称重过程中,直接从每只动物的直肠中取得粪便样品。首先,在180只中只有3只的大肠杆菌O157:H7试验是阳性。以两个星期为基准,通过从每栏地板上提取5份 新鲜滴下物的样本组合物,监测这些动物。在分类两星期后,36栏中的25栏,或者69%,是大肠杆菌O157:H7阳性。分类后4星期后,患病率下降到7栏是阳性,或者是19.4%。
在饲养期内的大约60天后,这些牛被称重,分类,并且每只牛都再次测试病原体脱落物。共有26只或者说14.1%脱落物含有病原体。这些动物根据重量和脱落物式样被重新分类。此时开始进行动物治疗。
使用两种不同类型的产乳酸细菌(NPC747和NPC750),采用两种不同的治疗方案来测试它们减少受研究动物大肠杆菌O157:H7的能力。
在开始治疗一个星期后的围栏试验表明,没有接受治疗的围栏中有25%为大肠杆菌O157:H7阳性,而经NPC750治疗的栏中8%为阳性,经过NPC747治疗的0%为阳性。治疗后的两个星期,来自于对照(未治疗)动物的样品50%呈大肠杆菌O157:H7阳性,而经过NPC750和NPC747治疗的动物的样品的阳性分别是30%和20%。这个试验表明经过NPC747治疗与对照组相比脱落率(shedding rate)可以减少大约一半,比经过NPC750治疗的有更多的减少。在接受NPC747治疗之前所有脱落大肠杆菌O157:H7的动物在治疗后都呈阴性。进而,病原体不会传播给同栏中的其他动物。在初期呈阳性的大多数的对照动物还是呈阳性,其他同栏的动物开始脱落病原体。
在第42天,在单个动物样品治疗之间具有显著(P<0.05)性差异。进食NPC747菌株的动物有10%是阳性,而进食NPC750菌株的动物有20%是阳性。相反,58%的对照动物呈阳性。
宰杀前这些动物被抽样调查。接受NPC747治疗的动物的大肠杆菌O157:H7可检测率显著较低(P<0.05),只有3.3%的动物测试呈阳性。接受NPC750菌株的动物和对照动物没有显著差异,分别脱落15%和20%。
从屠宰场取得的粪便样品表明经过NPC747治疗的动物3.3%呈阳性,经过NPC750治疗的动物6.6%呈阳性,对照动物10%呈阳性。将所有取样时间得所有样品平均,对照动物61.7%在饲养期间脱落病原体,NPC750治疗的动物51.7%脱落病原体,NPC747治疗的动物只有35%的脱落病原体。
实施例5
100只公牛被放入围栏中,每栏10只。首先,从每栏中两只公牛的直肠中直接取粪便样品。在170天后取另一样品。在每次取样时,要从同一动物取样。在本次研究中,还包括不接受治疗的对照组。该些动物用嗜酸乳杆菌菌株LA51(以商品名NPC2000购买)治疗。所有的组都给予莫能菌酸钠(Rumensin)和泰乐霉素(Tylan)。这些试验的结果列于下表中
表6经NPC2000治疗对大肠杆菌的抑制
治疗 |
初始大肠杆菌+ |
%+ |
第二次大肠杆菌 + |
%+ |
最后大肠杆菌+ |
%+ |
对照 |
2/20 |
100 |
44/20 |
200 |
33/20 |
15 |
LA51 |
55/20 |
25 |
0/20 |
0 |
0/20 |
0 |
表7198天后动物性能数据(最终结果)
治疗 |
初始活体 重量,lbs |
最后活体 重量,lbs |
热胴体重量, lbs |
平均日增 重,lbs |
对照 |
772 |
1560 |
945 |
3.98 |
LA51 |
772 |
1626 |
984 |
4.31 |
反应,1b |
|
66 |
39 |
0.33 |
%反应 |
|
4.23 |
4.12 |
8.30 |
实例6
进行研究以确定是否食品级前生命学细菌(probiotic bacteria)能够减少试验中受感染的断奶小牛崽粪便中大肠杆菌O157:H7的脱落。研究中的前生命学细菌包括各种分离的牛粪便乳杆菌,其基于体外高水平的对抗大肠杆菌O157:H7有毒活性而被选择。
对5只7个月大小牛的瘤胃进行插管手术,随后进行恢复,在生物安全水平为3的隔离室中圈养。这些小牛每天一次进行瘤胃内接种1×109CFU的下表8中所列的前生命学细菌菌株中的一种,一个周期为60天。
在开始服用前生命学细菌2星期后,这些小牛受到大肠杆菌O157:H7(C1)内瘤胃接种的激发。在首次接种(C1)后15天(C2)和27天(C3),这些小牛再次受到激发。首次接种C1包括总量为1×109CFU的菌株920、922、944和966的组分。第二次接种C2的是总量为1.63×1011CFU的上述菌株。第三次接种的是总量为1×109CFU的菌株86-24。
在每次刺激的前后,这些小牛每天都进行接种菌株的粪便脱落测试。每两个星期,这些动物都通过评估对Tir蛋白和O157脂多糖(LPS)抗原的血清抗体滴度进行免疫迹象的测试。结果列于表8。激发前所有的小牛具有相对较高的抗-Tir抗体滴度,其使小牛具有显著的对抗刺激菌株的免疫水平,包括对照组在内的所有小牛具有小于随后的第一C1和第二C2治疗的S∶C比率。
表8根据脱落的大肠杆菌O157:H7,喂给断奶小牛不同的乳杆菌属前生命学菌株的效果的对比
上表中提到的脱落/刺激比率代表接种后脱落的大肠杆菌O157:H7的总量。这个数字将数值规范化,允许更准确的动物比较和提供比仅仅回顾小牛脱落生物的全部天数更有意义的信息。M35、LA45、LA51和L411代表被测试的不同的乳杆菌菌株。PBS代表对照组动物。总脱落代表每克粪便中的CFU乘以脱落呈阳性的一天粪便的克数乘以脱落呈阳性的总天数。
因为抗-Tir滴度在小牛中没有显著区别,相较于喂M35的对照牛的80%,喂LA51的牛的84%,和喂411的牛的58%,四个前生命学细菌中的3个具有基于下列S∶C比率减少的效果。进而,喂M35的动物与对照组J3相比,在脱落天数上减少27%。但是,喂LA51的动物与对照组J3相比,在 脱落天数上增加9%。因此,给牛喂前生命学细菌在减少大肠杆菌O157:H7脱落方面是有效果的。
实施例7
进行研究以确定是否利用乳酸盐和产乳酸细菌的组合加入到奶牛的日常饲料中可以减少奶牛的病原体并提高奶牛的牛奶产量。有三组奶牛进行试验。第一组奶牛是对照组(组1)。根据前面部分列出的方法,第二组的奶牛服用利用乳酸盐细菌费氏丙酸杆菌菌株PF24和产乳酸细菌嗜酸乳杆菌菌株NPC747的组合(组2)。根据前面部分列出的方法,第三组奶牛服用乳酸盐利用费氏丙酸杆菌菌株PF24与两株乳酸产生嗜酸乳杆菌LA51(NPC747)和LA45的组合(组3)。其研究结果列于表9中。
表9表示了在每一治疗期间奶牛的奶产量、体重、食物消耗的影响。数据表明涉及给奶牛喂养利用乳酸盐细菌与产乳酸细菌的组合的疗法,导致奶产量、折合的奶产生的脂肪产量(即含有高脂肪量的奶产量更高)、单位重量的饲料消耗与折合的奶产生的脂肪产量的比率、折合的奶产生的能量的量(即具有高卡路里含量的奶产量更高)、单位重量的饲料消耗产生的折合的奶产生的能量的量、牛奶产生的奶脂肪的量,以及牛血清中尿含量在统计上具有显著的提高。在组3中的填加的LA45菌株导致牛血清中尿素含量提高。
表9其它的细菌培养物的对泌乳奶牛性能变量的作用
最后体重,kg |
667.6 |
658.3 |
664.1 |
6.5 |
NS |
NS |
体重变化,kg |
28.9 |
20.8 |
21.2 |
7.3 |
NS |
NS |
血清尿N,mg/dl |
22.62 |
20.43 |
21.66 |
0.48 |
0.01 |
0.08 |
血清葡萄糖,mg/dl |
64.73 |
67.55 |
65.52 |
1.19 |
NS |
NS |
1由于P>0.10,统计学上无显著性
2摄入干燥物质33.5%折合脂肪的奶
4用于和等值的卡路里基础比较的折合能量的奶
表10表明每一组服用利用乳酸盐细菌和产乳酸细菌组合的奶牛的粪便样品中病原体大肠杆菌O157:H7的出现率显著降低。服用嗜酸乳杆菌菌株LA51(NPC747)和LA45与费氏丙酸杆菌菌株PF24的组合效果尤其显著。在该组奶牛任意粪便样品中没有检测到大肠杆菌O157:H7。
表10奶牛粪便样品中大肠杆菌O157:H7的出现率
|
组1 |
组2 |
组3 |
大肠杆菌O157:H7 的出现率 |
19% |
12% |
0% |
实施例8
进行研究以确定是否特定新的细菌组合能够降低病原体细菌的出现率。已发现,这些细菌组合也能够提高牛的饲养效率。240只公牛被分配到48个围栏中,每栏5只。这些公牛的平均体重是780lbs。每一栏被指定4中治疗方案中的一种:(1)组1是对照组,不喂微生物;(2)组2喂两种菌株:费氏丙酸杆菌菌株PF24和嗜酸乳杆菌菌株LA51(NPC747),每一菌株的量是1×109CFU/天;(3)组3喂三种菌株:PF24:1×109CFU/天,LA51(NPC747):1×109CFU/天,嗜酸乳杆菌菌株LA45:1×106CFU/天;(4)组4喂三种菌株:PF24:1×109CFU/天,LA51(NPC747):1×106CFU/天,嗜酸乳杆菌菌株LA45:1×106CFU/天。
表11表明了服用新的细菌组合的组的饲养效率得到提高。相比较对照组,经过56天和140天后,所有的服用新的细菌组合的组表现更高的平均日增重。
表11喂养效率
表12说明在将被宰杀的公牛的皮和胴体中发现的大肠杆菌O157:H7的量有基本改善。值得注意的是,组2中的公牛的胴体中的病原体比对照组少一半,并且其他两组公牛的胴体中的病原体的量也基本表现出减少。尤其值得注意的是,服用本发明制剂的所有公牛的皮中的大肠杆菌量有惊人的降低。
表12:大肠杆菌O157:H7的发病率
|
胴体 |
皮 |
组1(对照组) |
33.3% |
20% |
组2 |
13.3% |
0% |
组3 |
26.6% |
0% |
组4 |
20% |
0% |
实施例9
进行研究以确定较佳的用于控制牛体内病原体生长的方法。第一个方法包括给牛喂食细菌NPC747和NPC750(也被认为是M35,可以从内布拉斯加州大学得到)。第二个方法包括:去掉牛的饲料中的淀粉。第三个方法包括清洁围栏。该研究设计是3H2H2阶乘。给在54个围栏中的432只公牛(平均体重是340kg)喂食育肥饲料(33%高含水玉米,20%干燥的碾压过的玉米,40%湿的玉米黄浆饲料,和7%紫花苜蓿,其具有维生素,矿物质,莫能菌酸钠,和泰乐霉素),每栏8只公牛。有18栏的公牛每天喂食细菌NPC747和NPC750。一半的围栏每月进行清洁,另一半围栏只在研究结束时清洁。在宰杀前两星期,一半的牛改变饲料,用玉米糠代替牛饲料中的玉米。
第一和第三个方法都没有影响到公牛的性能(performance)(P>0.39),但是在最后两周的饲料的改变降低了DMI(P<0.001;12.8kg/d比11.5kg/d),并减少了ADG和全部饲养期间内的效率(P<0.001)。改变饲料使胴体体重减少8.4kg。
每月以及在宰杀前的0、1、2星期获取个体的粪便样品,并进行大肠杆菌O157:H7分析。全部围栏作为试验检测单元,并且任何8只公牛中的一只被检测为大肠杆菌O157:H7阳性,则整个围栏被认为是阳性。全部大肠杆菌O157:H7检测是低的(145/3024动物-星期)。第二和第三个方法对大肠杆菌O157:H7患病率上没有效果。在上市的那个星期,第一方法在数字上减少了大肠杆菌O157阳性的栏数(44%对17%;P=0.10)
上面已经描述了本发明的多种实施方案,应当理解的是它们仅以实施例出现,并不作为限制。因此,本发明的宽度和范围不应被任意上述典型实施例所限制,但只应当根据下面的权利要求书和它们的等同体来定义。