CN101235038A - 一种新颖的免疫抑制剂甘草醇 - Google Patents
一种新颖的免疫抑制剂甘草醇 Download PDFInfo
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Abstract
一种新颖的免疫抑制剂甘草醇,具有显著的免疫抑制活性,可以作为免疫抑制剂来治疗相关的疾病。所述甘草醇为一种从甘草中提取的考迈斯托醇类化合物,是一种化学结构新颖的小分子量化合物。通过实验发现其能抑制刀豆蛋白A诱导的T淋巴细胞增殖,并且对单向混合淋巴细胞反应也表现出明显的抑制作用。此外,甘草醇能缓解迟发型超敏反应的炎性症状,并且可以抑制同种异体器官移植排斥反应。甘草醇作为一种高效、低毒的免疫抑制剂,因其分子量小,结构简单,易于改造修饰,可以制成不同的药物制剂。因此本化合物能成为新一代免疫抑制剂。
Description
背景技术
甘草(Glyoyrrhiza uralensis)系豆科(Leguminame)甘草属(Glycyrrhiza Linn)多种植物的根和根茎。甘草的化学组成极为复杂,主要为三萜皂苷类、黄酮类、香豆素类以及多糖类等成分。而甘草的多种化学成分都是非常重要的天然活性物质,因此国内外学者先后对甘草提取物及其中一些单体的药理活性进行了深入的研究,并取得了一些可喜的成绩。
甘草醇(glycyrol)是甘草中的一类香豆素类化合物,国内也有报道称该化合物为新甘草酚(王彩兰,张如意等,乌拉尔甘草中新香豆素的化学研究,药学学报,1991:26(2):147-151),国内外学者对该化合物及其类似物的药理活性研究已取得很多有价值的成果。Hattori,Masao报道甘草醇及其它一些香豆素类化合物可以有效地抵抗造成龋齿的细菌-转糖链球菌(Studies on dental caries prevention by traditionalmedicines(IX).Potent antibacterial action of coumarin derivatives from licorice rootsagainst Streptococcus mutans,Shoyakugaku Zasshi,1986,40(4):406-412);同时甘草醇还可以抑制黑色素的生成,一些美白肌肤用的化妆品中都含有这类单体(Skin-lightening agents and cosmetics containing coumestrol derivatives,Patent,Application:JP 93-114904 19930517),Saki,Tokimasa等又指出包括glycyrol在内多种成分均表现出对α-葡萄糖苷酶的抑制作用(Glycyrrhiza extracts asα-glucoSidase inhibitors,Patent,Application:JP 2002-51909 20020227),而α-葡萄糖苷酶活性又与高血糖相关,由此可见甘草醇及其类似物具有多种生物活性。但目前单独对该单体药理活性的研究很少,并且鲜有报道这个成分在免疫抑制方面的作用,本发明发现该化合物具有免疫抑制活性,可作为一种新颖的免疫抑制剂。
免疫抑制剂是一类具有免疫抑制作用的药物,主要功能为抑制机体异常的免疫反应,应用于自身免疫性疾病和过敏反应及器官移植(如心、肝、肾、肺和骨髓移植等)后排斥反应的治疗。自身免疫性疾病是由于自身免疫应答过强或持续时间过长以至破坏自身正常组织结构并引起的相应临床症状;过敏反应即为机体抗原持续刺激或同一抗原再次刺激后产生的一种以生理功能紊乱和组织损伤为主要表现的病理性免疫反应;临床器官移植手术后,受者免疫系统可识别移植物抗原并产生应答,移植物中免疫细胞也可以识别受者组织抗原并产生免疫应答,此为移植排斥反应。这些症状都是机体“不适当”的免疫应答引起的,而免疫抑制剂在一定程度上能够起到治疗这些疾病的作用,尤其是在器官移植后排斥反应的治疗中能够起到很明显的疗效,在临床上得到了广泛的应用。
目前所有的免疫抑制剂可分为以下几种:(1)抗代谢类:硫唑嘌呤、氨甲蝶呤等;(2)烃化剂:环磷酰胺等;(3)皮质固醇类:强的松、地赛米松等;(4)抗生素类:环孢菌素A(CsA)、他克莫司(FK506)、雷帕霉素等;(5)抗体类:抗淋巴细胞球蛋白等;(6)中草药:雷公藤多苷、冬虫夏草等。临床常用的免疫抑制药物如激素、环磷酰胺、环抱菌素A等,疗效虽已被证实,但只能改善症状,不能有效地从根本上控制疾病的发生和发展,且毒副作用大,不能长期持续应用。但与化药免疫抑制剂相比,中药免疫抑制剂有以下特点:(1)成分多样化、药理作用广泛且复合,除免疫抑制作用外,还有抗炎、抗过敏及免疫双向调节等作用;(2)毒性小、副作用少,有的虽有毒副作用,但减量或停药即消失;(3)与其它免疫抑制剂合用,能提高疗效,降低后者毒副作用。因此,应用中药免疫抑制剂治疗免疫性疾病,越来越受到药学工作者的青睐。本发明化合物甘草醇即为一种高效、低毒的免疫抑制剂。
发明内容
本发明目的在于克服现有免疫抑制剂的各种缺点,找到一种低毒、高效的免疫抑制剂,并提供甘草醇作为免疫抑制剂治疗相关的疾病上的应用。
所述甘草醇为考迈斯托醇类化合物,含有α,β-不饱和六元环内酯和两个芳环,其结构式为:5一甲氧基一6一异戍烯基一7,12-二羟基香豆苯醚,结构式如下:
所述甘草醇分子量小、化学结构新颖,有别于迄今所有的免疫抑制剂,并且甘草醇对细胞毒性很低。
所述甘草醇能抑制刀豆蛋白A(ConA)诱导的T淋巴细胞增殖,并且对单向混合淋巴细胞反应也表现出明显的抑制作用。此外其能缓解迟发型超敏反应的炎性症状,并且可以抑制同种异体器官移植排斥反应。
所述甘草醇已经在动物实验模型上证实具有显著的免疫抑制作用,因此可作为一种新颖的免疫抑制剂,用于预防和治疗自身免疫性疾病、过敏反应和器官移植后的排斥反应,以及与机体免疫系统功能及反应状态异常相关的疾病。
本发明的优点在于:所述甘草醇为一种中草药免疫抑制剂,其免疫抑制作用与当今临床上广泛使用的免疫抑制剂-环孢菌素A相似或稍弱,但其非特异性淋巴细胞毒性比环胞菌素A低很多,即其作用剂量远远低于毒性剂量,是一种高效、低毒的免疫抑制剂;同时其分子量小,结构简单,易于改造修饰,可以制成不同的药物制剂。因此本化合物有可能成为更有特点的新一代免疫抑制剂。
附图说明:
图1是甘草醇抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖及单向混合淋巴细胞反应示意图
图2是甘草醇和CsA的非特异性淋巴细胞毒性示意图
具体实施方式
实施例1:甘草醇的纯化
将干燥的甘草粉碎至10~20目颗粒大小,放入渗漉装置中后,用乙醇渗漉提取,收集渗漉液。渗漉液经减压浓缩后用乙酸乙酯萃取,萃取液浓缩后制样,然后进行硅胶柱层析,以石油醚-乙酸乙酯系统进行梯度洗脱,收集馏分,保留有固体析出的馏分。这些馏分采用高速逆流色谱(HSCCC)进行纯化,得到白色针状晶体,经核磁共振光谱(NMR)的氢谱、碳谱、氢-氢相关谱、碳-氢相关谱等谱图以及质谱谱图分析该化合物为甘草醇。
实施例2:甘草醇对ConA诱导小鼠T淋巴细胞增殖的抑制作用
将近交系BALB/c小鼠处死,取脾脏,用培养液制成细胞悬液。然后将100μl细胞悬液植入96孔培养板中,加入90μl不同浓度的甘草醇,同时还加入10μl有丝分裂原ConA,对照组加90μl含10%血清的培养液,于37℃,5%二氧化碳条件下培养72小时。待培养结束时,从各孔小心吸出上清,再加入10μl MTT,继续放入培养箱中孵育。4小时后,各孔再加入100μl甲臜裂解液,放回培养箱中孵育过夜,酶标仪上读取OD570。
分析实验数据可知:甘草醇对ConA诱导的T细胞增殖能起到明显的抑制作用(见图1),且抑制作用和剂量有依赖性关系,即剂量越高,抑制越明显。
实施例3:甘草醇对单向混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用:
将近交系BALB/c和C57BL小鼠处死,取脾脏,用培养液制成细胞悬液。其中近交系C57BL小鼠脾细胞经丝裂霉素C处理,作为反应细胞,近交系BALB/c小鼠脾细胞为刺激细胞,两种细胞悬液等体积混合。然后于96孔培养板中加入100μl混合细胞悬液,药物溶液100μl,对照组加100μl含10%血清的培养液,并设两种细胞的单独培养作为对照。于37℃,5%二氧化碳条件下培养72小时。待培养结束时,从各孔小心吸出上清,再加入10μl MTT,继续放入培养箱中孵育。4小时后,各孔再加入100μl甲臜裂解液,放回培养箱中孵育过夜,酶标仪上读取OD570。
分析实验数据可知:甘草醇能明显地抑制单向混合淋巴细胞的增殖作用,且这种抑制作用与剂量呈依赖关系(见图1),且高剂量时抑制作用最强。
实施例4:非特异性淋巴细胞毒性试验
将近交系BALB/c小鼠处死,取脾脏,用培养液制成细胞悬液。然后将100μl细胞悬液加入96孔培养板中,加入100μl不同浓度的甘草醇和CsA,对照组加100μl含10%血清的培养液,于37℃,5%二氧化碳条件下培养72小时。待培养结束时,从各孔小心吸出上清,再加入10μl MTT,继续放入培养箱中孵育。4小时后,各孔再加入100μl甲臜裂解液,放回培养箱中孵育过夜,酶标仪上读取OD570。
分析实验数据可知:甘草醇只有在高浓度时对正常小鼠的淋巴细胞有一定的毒性,在12.5μg/ml的浓度以下对淋巴细胞的毒性就很弱(见图2),而CsA在同浓度范围内对淋巴细胞的毒性就强得多,故甘草醇一定浓度范围内对淋巴细胞的毒性很低。
实施例5:甘草醇对迟发型超敏反应(DTH)的抑制:
将近交系BALB/c小鼠随机分组,分别用绵羊红细胞(SRBC)进行皮下免疫,同天腹腔注射不同浓度的药品溶液,对照组给予等量的生理盐水或者CSA溶液。注射5天后,右足垫皮下再次注射SRBC,左足垫皮下注射等量生理盐水作为对照。24小时后,用游标卡尺测量每只小鼠左右足足垫的厚度,并处死小鼠,检测脾细胞中活细胞的数目。
比较每只小鼠左右足足垫的厚度,经过分析得出甘草醇对SRBC诱导小鼠DTH的抑制率,如Table 1。
Table 1甘草醇对SRBC诱导小鼠DTH的抑制作用
组别 | 剂量(mg/kg) | 足垫厚度(mm) | 抑制率(%) |
对照 | 0 | 0.68±0.19 | 0 |
甘草醇 | 10 | 0.41±0.16 | 39.7 |
甘草醇 | 20 | 0.32±0.02 | 52.9 |
甘草醇 | 40 | 0.26±0.09 | 61.7 |
CsA | 50 | 0.20±0.08 | 70.6 |
与对照组相比,不同浓度甘草醇和CsA均可以抑制迟发型超敏反应的发生,且甘草醇40mg/kg与CsA50mg/kg同样有显著的免疫抑制效应。
比较对照组和实验组小鼠脾细胞数目,统计分析数据,结果如Table 2。
Table 2不同浓度甘草醇对DTH小鼠脾细胞的抑制
组别 | 剂量(mg/kg) | 脾细胞数目(×104) | 存活率(%) |
对照 | 0 | 203±23 | 100 |
甘草醇 | 10 | 171±41 | 84.2 |
甘草醇 | 20 | 133±21 | 65.5 |
甘草醇 | 40 | 97±12 | 47.8 |
CsA | 50 | 118±11 | 57.6 |
与对照组相比,不同浓度甘草醇和CsA在体内均可以抑制小鼠脾细胞数目,且甘草醇40mg/kg比CsA 50mg/kg的抑制作用更强。
实施例6:在小鼠同种异型皮肤移植中的作用
将近交系BALB/c和C57BL小鼠麻醉后,无菌环境下同时剪去左侧背部皮肤(1cm×1cm)。然后BALB/c小鼠和C57BL小鼠皮片互换,平铺于背部左边的植床上,缝合、包扎和固定。而每只小鼠背部右侧皮肤进行自体移植,以验证实验人的技术误差。在皮肤移植手术结束24小时后,给药10天,分为CsA阳性对照组和实验组,均为腹腔注射。观察7-14天,记录皮片存活时间,移植皮片以发生完全损伤干燥为发生排斥标准。
观察小鼠移植皮片生长情况,并记录实验组和对照组小鼠同种异体移植皮片存活时间,初步实验结果如Table 3。
Table 3甘草醇对同种异体皮肤移植的延缓作用
组别 | 剂量(mg/kg) | 皮片存活天数 |
空白组 | 0 | 7.4±0.55 |
CsA | 20 | 10.4±0.55 |
甘草醇 | 20 | 11.8±0.45 |
初步实验结果揭示本发明化合物可以延缓BALB/c小鼠对同种异体C57BL小鼠皮肤移植的排斥反应,同时也可以延缓C57BL小鼠对同种异体BALB/c小鼠皮肤移植的排斥反应,这显示了本发明化合物有希望应用于临床预防器官移植排斥反应。
上述实施例仅供说明本发明之用,而并非是对本发明的限制,有关技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,还可以作出各种变化和变型,因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴,本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。
Claims (7)
1. 一种从甘草中提取的醇类化合物,其特征在于:具有显著的免疫抑制活性;其可以作为免疫抑制剂来治疗相关的疾病。
2. 根据权利要求1所述的从甘草中提取的醇类化合物,其特征在于:所述醇类化合物为甘草醇。
3. 根据权利要求2所述的从甘草中提取的醇类化合物,其特征在于:所述甘草醇为考迈斯托醇类化合物。
4. 根据权利要求2或3所述的从甘草中提取的醇类化合物,其特征在于:所述甘草醇对细胞毒性低。
5. 根据权利要求1所述的从甘草中提取的醇类化合物,其特征在于:所述免疫抑制活性为其能抑制刀豆蛋白A诱导的T淋巴细胞增殖,并且对单向混合淋巴细胞反应也表现出明显的抑制作用。
6. 根据权利要求1所述的从甘草中提取的醇类化合物,其特征在于:所述免疫抑制活性为其能缓解迟发型超敏反应的炎性症状,并且可以抑制同种异体器官移植排斥反应。
7. 根据权利要求1所述的从甘草中提取的醇类化合物,其特征在于:所述相关的疾病是指自身免疫性疾病、过敏反应和器官移植后的排斥反应,以及与机体免疫系统功能及反应状态异常相关的疾病。
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