CN101228148A - 可用于改进血管健康的热处理可可产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有多酚如黄烷醇、原花青素和其衍生物的组合物，该组合物可通过在水溶液中热处理多酚得到，和包含黄烷醇、原花青素和其衍生物的差向立体异构体，和使用其治疗或预防性治疗NO反应的疾病或病症的方法。本发明还涉及热处理的可可粉和可可萃取物，其特征在于单体和低聚物的图谱发生改变，其中表儿茶素和儿茶素的总量无变化，其中存在新的二聚体，和其中缺乏比三聚体更高的低聚物。

Description

可用于改进血管健康的热处理可可产品
交叉参考的发明申请
本申请是PCT申请，要求临时申请序列号60/695,361，2005年6月29日提交，题目是“改进血管健康的制剂”的申请的优先权。
发明领域
本发明涉及含多酚，如黄烷-3-醇、原花青素和其衍生物的组合物，该组合物可通过热处理含多酚产物、包含黄烷-3-醇和原花青素差向立体异构体的组合物得到，和涉及使用它们治疗或预防性治疗NO响应的疾病或病症的方法。
发明背景
多酚是一种多基团的化合物(Ferriera等，Tetrahedron，48：10，1743-1803，1992)。它们广泛地存在各种植物中，其中一些进入食物链。有时它们代表人类饮食中一类重要的化合物。例如，黄烷醇和原花青素已经显示对氧化氮(NO)有影响(例如美国专利6,670,390)。NO已知可防止血小板凝聚、单核细胞粘附和趋药性以及血管平滑肌组织的增生过程，这些都是动脉粥样化形成过程的决定性因素。当NO的循环浓度降低，或者因为被抑制剂产生阻滞，或者处于病理状态，如动脉粥样硬化，血管肌肉不能适度松弛。结果是血管收缩血压增加，并可以引起某种形式的高血压。高血压是血管的疾病，包括中风、心脏病、心力衰竭和肾衰竭的主要原因。
由于许多人患有NO响应的疾病或病症，所以对发现各种各样治疗方法去预防和治疗这些疾病有着相当大的兴趣。申请人已经发现本文描述的某些化合物可以使用于这种应用领域。
发明简述
本发明涉及热处理黄烷醇(单体)和原花青素(低聚物)，和/或黄烷醇和原花青素差向立体异构体，包含这些化合物的组合物，并且治疗和预防NO反应的疾病或病症的方法。
在一个方面，本发明涉及一种组合物，如一种包含本发明的化合物或其衍生物的药物、食物、食品添加剂或营养增补剂，其量对于治疗或预防性治疗NO反应的疾病或病症是有效的。该组合物可任选地含有另外的治疗剂或有利于健康的药剂，或可以是与另一种治疗剂或有利于健康的药剂联合给药。含有上述组合物和标签和/或治疗或预防NO反应的疾病/病症的使用说明书的包装产品，也在本发明的范畴内。
在一个方面，本发明提供一种治疗或预防血管疾病或病症的方法，让需要的受治疗对象给药一种含(-)-儿茶素的饮料，其中，受治疗对象是人类或牲畜。(-)-儿茶素可以存在于饮料中，作为单体的化合物，或如本文所定义分子式En的低聚化合物的一种组成单体单元，和/或热处理如本文所定义的分子式An低聚化合物得到的化合物。通常，该饮料是含有可可或巧克力的饮料，或可可或巧克力风味的饮料。
另一方面，本发明涉及预防或治疗哺乳动物，如人类或牲畜，NO反应的疾病或病症的方法，即给药有效量的本发明的化合物。
又一个方面，本发明提供制备本文所述化合物的方法。
又一个方面，本发明涉及热处理部分脱脂或完全脱脂的包含(±)-儿茶素和(±)-表儿茶素和其原花青素低聚物的高可可多酚(CP)的可可粉，其总CP含量为每一克脱脂粉末至少为15毫克，而且与没有热处理的高CP可可粉相比，其单体和低聚的HPLC图谱发生了变化。
也涉及热处理高CP可可萃取物，干的或液体，其总CP含量每一克干可可萃取物至少为175毫克，与没有热处理的可可粉萃取物相比，图谱也发生变化。
又一个方面，本发明涉及热处理的可可制品如可可饮料，与没有热处理的可可制品相比，图谱已经发生变化。该产品包括高CP可可成分，如可可粉、液体的或干的可可粉萃取物，和/或可可浆。当该产品是一种低水分的产品时，每一克该产品含有至少大约6毫克的总可可多酚。优选地，该产品表儿茶素与儿茶素的比率为1到大于1。当该产品是高水分产品如饮料时，每一克该产品含有至少约0.2毫克的总可可多酚。
制备高CP可可粉、高CP可可萃取物和具有改变图谱的高CP可可制品，是通过加热部分或完全脱脂的可可粉的水分散体，或由未发酵的或发酵不足的可可豆制备的干可可萃取物的方法。优选地，可可成分在大约37℃～大约200℃和足以差向立体异构化(-)-表儿茶素的pH和时间下加热，例如大约0.5分钟到几天。优选地，在大约72℃～大约160℃下加热大约1分钟～大约6.0小时。更优选地，它们在大约100℃～大约140℃下加热大约1分钟～大约4小时。
附图简述
图1代表可可饮料A和用于制备饮料的可可粉的NP-HPLC-MS数据。
图2代表可可饮料B和用于制备饮料的可可粉的NP-HPLC-MS数据。
图3代表用于制备可可饮料A的可可粉的RP-HPLC-MS数据和单体、二聚体和三聚体的EIC。
图4代表可可饮料A的RP-HPLC-MS数据和单体、二聚体和三聚体的EIC。
图5代表用于制备可可饮料B的可可粉的RP-HPLC-MS数据和单体、二聚体和三聚体的EIC。
图6代表可可饮料B的RP-HPLC-MS数据和单体、二聚体和三聚体的EIC。
图7代表可可饮料A的一种生物检验引导分级的流程图。
图8代表试验化合物在预收缩主动脉环里介导的与剂量相关的松弛。
图9代表可可饮料A分数对预收缩主动脉环的影响。
图10代表未蒸煮的高CP可可粉的NP-HPLC/FLD数据。
图11代表蒸煮的高CP可可粉的NP-HPLC/FLD数据。
图12A～D代表蒸煮30分钟、7.75小时和24小时的高CP可可粉的NP-HPLC/FLD数据。
图13代表由蒸煮的高CP可可粉分离的单体级分的HPLC数据。
图14A～D代表合成差向立体异构B2二聚体(A)、未蒸煮的高CP可可粉(B)、蒸煮的高CP可可粉(C)和掺料的蒸煮的高CP可可粉(D)的RP-HPLC数据。
发明详述
本申请引用的所有专利、专利申请和参考文献均在此引入作为参考。在任何不一致情况下，以本公开为准。
本发明涉及热处理黄烷醇(单体)和原花青素(低聚物)，和/或黄烷醇和原花青素的差向立体异构体，包含这些化合物的组合物，和治疗和预防NO反应的疾病或病症的方法。
根据最近的命名法，并且如本文采用，术语“黄烷醇”是指单体，例如儿茶素和表儿茶素。儿茶素和表儿茶素的低聚物称为原花青素。但是，对本公开目的来说，这些术语可互换地使用。此外，本文论及的多酚，应该了解，也适用于黄烷醇和原花青素(联合或单独)。
本发明涉及第一化合物，和包含有效量第一化合物的组合物，该第一化合物是通过热处理一种具有下列分子式An的第二化合物，或其药物上可接受的盐或其衍生物(例如氧化产物、甲基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物)得到的，或可由此得到的：
其中n是2～18的整数；
R和X各自具有或者α或者β的立体化学构型；
R是OH、O-糖或O-没食子酸盐；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8；
当任何C-4、C-6或C-8不键合到另一个单体单元，则各自的X、Y或Z是氢或糖；
该糖任选地由酚类基团在任何位置取代，例如经由酯键。
本文中，字句“通过热处理得到的化合物”，“可通过热处理得到的化合物”或“化合物进行热处理”，意思指该化合物在水的存在下，暴露于足够时段的足够加热，使化合物的化学结构和/或功能发生变化。温度越低，引起变化要求的暴露时间越长。例如，升高加热温度从室温直至140℃，增加pH由大约3.8直至大约7，和/或增加加热时间，都可以使变化最佳化。为了到达平衡，必须增加温度和/或pH。这种温度和时间可以至少为40℃，更优选至少为50℃，以及至少为10小时，更优选至少为24小时，或更优选至少为48小时；或至少为60℃，至少为70℃，至少为80℃，至少为90℃，至少为100℃，至少为110℃，或至少为120℃，且各自至少为5、或至少为10、15或20分钟。例如，该化合物可以在120℃处理10分钟，或120℃处理20分钟。另一个热处理的例子描述在实施例1里。其它的温度/时间/pH的组合也是有效的，技术人员采用本文提供的指导不需过度的实验就可确定。已知的一些技术，如HPLC/MS分析可用来监控化合物的变化，如例如实施例1所述。
上述式子的单体单元可以是经由4→6和4→8链键合。只有(4→8)链结的低聚物是线性的；而当存在至少一个(4→6)键则产生支化的低聚物。在本发明范畴内，包括热处理包含至少一个非天然的链结(6→6)、(6→8)和(8→8)的低聚物。具有这种链结的低聚物可以如美国专利6,156,912所述方法制备，该专利在此引入作为参考。
糖可以选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿拉伯糖。糖优选是单糖或二糖类。酚类基团是选自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、没食子酸、羟基苯甲酸和芥子酸。
衍生物的例子包括酯类、氧化产物、甲基化衍生物和葡糖醛酸化(glucuronidated)产物。氧化产物可以是如公开在美国专利5,554,645里的方法制备，该专利的有关的部分在此引入作为参考。酯类，例如，没食子酸的酯类，可以采用已知的酯化反应制备，例如美国专利6,420,572所述的方法，该专利公开在此引入作为参考。甲基化衍生物，如3’O甲基-、4’O-甲基和3’O、4’O-二甲基-衍生物，可以通过例如，Cren-Olive等在2002，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，821～830，所述的方法制备。葡糖醛酸化产物可以通过如下文献所述的方法制备，Yu等，“制备葡糖醛酸新的和有效的方法”，Organic Letters，2(16)(2000)2539-41，和Spencer等，2001，Free Radical Biol.Med.31(9)，1139-46。
上述有关链结、糖、酚类部分、和衍生物的公开内容适用于此处公开的所有化合物，为了简便起见，不再重复。
关于此处所述的分子式An或En的任何化合物，诸如，其中n是3～18；2～12；3～12；2～5；4～12；5～12；3～10；4～10或5～10的化合物。其中n是2的An或En化合物也在本发明的范畴内。
在一个实施方案中，本发明涉及一种第一化合物，和包含有效量第一化合物的组合物，该第一化合物是通过热处理具有下式An的第二化合物，或其药物上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物、甲基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物)得到的，或可由此得到的：
Figure S2006800236662D00061
其中n是2～18的整数；
R和X各自具有或者α或者β的立体化学构型；R是OH；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8；
当任何C-4、C-6和C-8不键合另一个单体单元，则X、Y和Z是氢。
在某些实施方案中，该化合物是热处理的原花青素二聚体或三聚体，即在式An里n＝2或n＝3。这种二聚体或三聚体的单体单元，在热处理之前可能都是(-)-表儿茶素。这种二聚体的例子是(-)表儿茶素-(4β→8)-(-)-表儿茶素和(-)-表儿茶素-(4β→6)-(-)-表儿茶素。
被用来热处理的二聚体或三聚体或其它的低聚物，可以是分离和纯化的或照本领域已知的方法合成制备的，或可以是与，例如黄烷醇和/或其它的原花青素的混合物进行处理。这种混合物可以是，例如，一种植物浸出液(例如可可萃取物)，由植物源(例如可可)分离出的二聚体或其它的低聚物级分，或可可成分如可可粉。可可萃取物可以通过，例如，美国专利5,554,645所述的方法制备，可可粉可以照本领域已知的方法制备，具有黄烷醇/原花青素保存水平的可可粉可以通过，例如，美国专利6,015,913所述的方法制备。当纯化的单独二聚体、二聚体混合物或合成的化合物用于热处理时，它们的纯度可以是，例如，至少大约50％，或至少大约60％，或至少大约70％，或至少大约80％，或至少大约90％，或至少大约92％，或至少大约95％，或至少大约98％，或至少大约99％。上述纯度可以适用于分子式An的任何化合物，它的盐和此处描述的衍生物。
实施例1公开的二聚体，参见例如图4，和包含二聚体的组合物，例如，一种饮料，如可可或巧克力饮料，也在本发明的范畴内。关于图4，假分子离子577m/z的分离离子色谱(EIC)代表处理饮料中检测到的二聚体。新的二聚体的洗脱时间是12.6、14.5(最大的峰)、16.9、18.8和22.6分钟。用于实行上述分离的高效液体色谱法如下：
固定相：Hypersil ODS 100×4.6mm 5μm粒径
流动相A：0.1％HOAc的水溶液
流动相B：0.1％HOAc的甲醇溶液
流动速率：1.0ml/min
梯度        时间     ％B
             0       15
             20      25
             30      75
             45      100
热处理(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素和它们的衍生物(除了没食子酸盐衍生物)，和包含这种黄烷醇的组合物，例如，一种饮料如可可或巧克力饮料，也在本发明范畴内。
本发明还涉及一种化合物，和包含有效量该化合物(该化合物具有下列分子式En)或其药物上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物、甲基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物)的组合物：
其中n是2～18的整数；
R和X各自具有或者α或者β的立体化学构型；
R是OH，O-糖或者O-没食子酸盐；
C-4、C-6或C-8的取代基分别是X、Z或Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8；
当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元键合时，则各自的X、Y或Z是氢或一种糖；
糖任选地用一种酚类基团在任何位置取代，例如经由一种酯键；和至少一种该单体单元具有以下的分子式：
Figure S2006800236662D00082
上述分子式的单体单元可以经由如上分子式An的化合物所述的链结键合。糖，酚类基团，和衍生物同如上分子式An的化合物所述。
在另一个实施方案中，本发明还涉及一种化合物，和包含有效量该化合物，该化合物具有下列分子式En，或其药物上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物、甲基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物)的组合物：
Figure S2006800236662D00091
其中n是2～18的整数；
R和X各自具有或者α或者β的立体化学构型；
R是OH；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8；
当任何C-4、C-6和C-8不与另一个单体单元键合时，则X、Y和Z是氢；和
至少一个该单体单元具有下列的分子式：
Figure S2006800236662D00092
分子式En化合物的例子是其中整数n是3～18；2～12；3～12；2～5；4～12；5～12；4～10或5～10的那些化合物。在某些实施方案中，该化合物是原花青素的二聚体或三聚体，其中至少一个单体单元以差向立体异构体形式。在某些实施方案中，化合物En是热处理的原花青素二聚体或三聚体，即n＝2或n＝3。
例如，本发明涉及一种化合物，和包含有效量该化合物，(该化合物具有下列分子式En)，或其药物上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物、甲基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物)的组合物：
Figure S2006800236662D00101
其中n是2；
R和X各自具有或者α或者β的立体化学构型；
R是OH、O-糖或者O-没食子酸盐；
C-4、C-6或C-8的取代基分别是X、Z或Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8；
当任何C-4、C-6或C-8不能键合到另一个单体单元时，则各自的X、Y或Z是氢或糖；
糖是任选地由一种酚类基团在任何位置取代，例如经由一种酯键；和
至少一个单体单元是(-)-儿茶素。
在另一个例子中，本发明涉及一种化合物，和包含有效量该化合物，该化合物具有下列分子式En，或一种药物上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物、甲基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物)的组合物：
其中n是2；
R和X各自具有或者α或者β的立体化学结构构型；
R是OH；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8；
当任何C-4、C-6和C-8不与另一个单体单元键合时，则X、Y和Z是氢；和
至少一个单体单元是(-)-儿茶素。
本领域众所周知，差向立体异构体(epimer)是非对映异构体，其仅仅在两个或更多四面体立体中心的一个，例如两个或更多不对称碳原子的一个上，具有相反的构型。至于本文描述的化合物的类型，差向立体异构体在不对称碳中心C-2和C-3中的一个上已经转化了立体化学的构型。
此处使用的术语差向立体异构体适用的化合物是，其C-2环碳原子已经反转，以致该C-2碳原子的立体化学构型是β。天然存在的黄烷醇和原花青素通常其C-2碳原子是α立体化学构型。
本发明也包括黄烷醇(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素，即(+)-表儿茶素和(-)-儿茶素，和它们的衍生物(例如除没食子酸盐衍生物外的甲基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物和氧化产物)和包含这些化合物的组合物，的碳2(C-2)差向立体异构体。
使用方法
此处描述的任何化合物和/或组合物可用来实践本申请所述的方法。
术语“血管疾病或病症”是指影响血管系统，包括心和脑的任何疾病或病症。诸如此类的例子包括动脉粥样硬化、血栓形成、高血压(例如原发性、继发性和肺动脉高血压)、心血管疾病(CVD)、冠状动脉病(CAD)(包括心肌缺血、心肌梗死、稳定和非稳定心绞痛、急性的闭塞或再狭窄)、糖尿病(I型和II型)(例如糖尿病的血管并发症)、认知机能障碍或异常和/或血管循环异常(包括脑血管)、心脏病、脑血管疾病(包括中风、起始和/或再发的短暂性缺血性发作，或局部缺血的并发症，例如在冠状血管成形术或经皮冠状介入之后)、充血性心力衰竭、肾衰竭、肾病；与周边血管(例如位于臂腿处血管)收缩有关的疾病和/或病症，如末梢血管病和更具体地说Raynaud病、周边动脉病(PAD)、间歇性跛行、脉管炎(例如小血管的)、血管痉挛、静脉血栓形成、静脉机能不全、淋巴腺闭锁不全、临界肢局部缺血、急性肢局部缺血、动脉粥样栓塞和下肢局部缺血
“NO反应的疾病或病症”是指响应于NO治疗的健康状况。这种状况的例子包括，但是不限于，NO介导或NO-依赖的疾病和病症，其中该疾病/病症的病理学是起因于NO途径的异常功能。诸如此类的例子包括高血压(例如原发性、继发性和肺动脉高血压)、心血管疾病、冠状动脉病、糖尿病(I型和II型)(例如糖尿病的血管并发症)、镰刀形红细胞贫血病、认知机能障碍或异常和/或血管循环病症(包括脑血管)、心脏病、中风、充血性心力衰竭、肾衰竭和肾病。因为高血压增加了心脏病、中风、充血性心力衰竭和肾衰竭的危险，致血管舒张的上述化合物可以单独或与其它的血管(包括心血管)保护剂联合使用，预防这些状况发生。特别适合的受治疗者包括有高血压伴糖尿病、肥胖症、有害的脂肪外形(例如高胆固醇含量)和/或吸烟者，这些病人心脏病和中风的危险增加几倍。通常，至少具有一个心血管疾病风险系数(美国心脏协会认可)的患者可以如此处所述方法治疗。
本文所用的术语“治疗”意思是改善现有的医学状况，如心血管疾病，例如减缓疾病进展，延长存活期，降低死亡的危险和/或提供一种可测量的改善疾病的指标。
术语“预防”意思是降低与疾病发展有关的危险，包括减少该疾病的发作。
本文所用的术语“血管保护或治疗药剂”是指除了本发明的化合物外能有效的治疗或保护血管系统的药剂。这种药剂的例子是抗血小板治疗药剂(例如COX抑制剂，如阿斯匹林)；NO调整药剂、胆固醇还原剂(例如甾醇、stanol)。
因此，本发明涉及(i)一种治疗或预防血管疾病或病症的方法，或(ii)一种治疗或预防NO反应的疾病或病症的方法，或(iii)一种抗血小板治疗的方法，给需要受治疗者给药有效量的本文描述的任意化合物(例如分子式An或En的化合物或其药物上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物、甲基化衍生物和葡糖醛酸化衍生物)。
例如，上述方法可以是通过给药分子式An(其中n是2)的任意化合物实施。
所述化合物也适用与其它的心血管保护的和/或NO-调整的药剂联合治疗。这种药剂的例子对本领域的技术人员是显而易见的，可以包括B型原花青素以及A型原花青素。这种化合物可以与本发明的化合物混合服用，或分别服用。
A型原花青素可以是天然来源的或合成制备的。例如，A型原花青素可以由花生皮分离得到，如Lou等，Phytochemistry，51：297-308(1999)，或Karchesy和Hemingway，J.Agric.Food Chem.34：966 970(1986)等文献所述，文献的各自的有关部分在此引入作为参考。上述化合物的其它来源是大果越橘，如见述于，例如Foo等，J.Nat.Prod.63：1225-1228，和Prior等，J.Agricultural Food Chem.49(3)：1270-76(2001)，各文献相关的部分在此引入作为参考，和Ecdysantherautilis(Lie-Chwen等，J.Nat.Prod.65：505 8(2002))和马果树(Aesculushippocastanum)(美国专利4,863,956)，各文献相关的部分在此引入作为参考。A型化合物也可从B型原花青素经由氧化作用得到，采用1，1-二苯基-2 pycrylhydrazyl(DPPH)自由基，在中性条件下反应，参见Kondo等，Tetrahedron Lett.41：485(2000)所述，文献的相关部分在此引入作为参考。
得到天然的和合成的B型原花青素的方法为本领域所熟知，见述于，例如，Romanczyk等的美国专利6,670,390；Romanczyk等的6,207,842；Romanczyk等的6,420,572；和Romanczyk等的6,156,912。
本发明方法可以用于人类或牲畜，如狗、猫和马。
因此，以下的应用在本发明范畴之内。本文描述的所有化合物，或其药物上可接受的盐或其衍生物，在制备用于(i)治疗或预防血管疾病或病症；(ii)治疗或预防NO反应的疾病；或(iii)作为抗血小板治疗的药剂、食物、营养或食物增补剂中的应用。本文所述的所有特定状况都在这种应用的范畴之内。
上述方法中应用的有效量，可以通过本领域的技术人员采用此处提供的指导和本领域的一般知识确定。例如，有效量可以达到在哺乳动物体内(例如血)生理学上相应的浓度。这种生理学上相应的浓度可以至少大约20纳摩尔(nM)，优选至少大约100nM，更优选至少为500nM。在一个实施方案中，哺乳动物，如人类的血中的浓度达到至少大约1微摩尔。此处所定义的分子式An的化合物服用的剂量为约50mg/天～大约1000mg/天，优选为大约100～150mg/天～大约900mg/天，最优选为大约300mg/天～大约500mg/天。但是，也可应用比上述更高的剂量。
该化合物可以是急性给药，或作为给药方案(regimen)，在一段有效时间，例如，每日、每月、每两月、每半年、每年，持续地治疗/预防性给药，或在其它给药方案中，通过有经验的执业医生确定必需的服用时间。给药可以至少持续一段时间，以显示出治疗/预防的效果。优选地，该组合物每天服用，最优选一天两或三次，例如，早晚服用，以在哺乳动物体内保持有效的化合物水平。为得到最佳的效果，该组合物可以服用至少大约30天，或至少大约60天。这些给药方案(regimen)可以周期性地重复。基于本文提供的指导和本领域的一般知识，本领域的技术人员可以选择适合于急性和/或长期给药的化合物。例如，在单剂量给药之后，和/或在给药之后不久(例如给药两个小时后)就显效的化合物，可以应用作为快速、急性起效的药物。在重复给药之后有显效的化合物可以据此应用。从而，适合于这种给药(例如急性的、长期的)的剂型在本发明的范畴之内。
确定治疗需要的最小剂量，或使用上述治疗方法的最佳剂量也在本发明的范畴内。可以应用实施例描述的方法或任何所知的其它剂量反应方法，预测化合物治疗此处所述的疾病或病症的有效性。适合于提供至少一种最小治疗有效量，或最佳剂量的剂型在本发明的范畴之内。
组分和配方
本发明涉及此处描述的可以配制作为药物、食物、食品添加剂或营养增补剂的组合物。
本文所用的术语“药品”是一种医学的药。参见Merriam Webster′sCollegiate Dictionary，10th Edition，1993。药品可以同时称为药物。本文所用的术语“营养增补剂”是一种产品(除了烟草制品)，其目的是补充日常饮食，带有或含有一种或多种以下饮食的成分：维生素、矿物质、草本的或其它的植物、氨基酸、膳食物质，人服用后可增加日摄入营养物质总量，它们或是一种提浓物、代谢物、组成物、提取物或这些成分的组合。“食物”是一种含有蛋白质、碳水化合物和/或脂肪的物质，用于生物体支持发育、修复和生命过程并供给能量。食物也可能含有辅助的物质如矿物质、维生素和调味品。参见Merriam Webster′s CollegiateDictionary，10th Edition，1993。术语食物包括适合于人或动物消费的饮料。“食品添加剂”如FDA在21 C.F.R.170.3(e)(1)所定义，包括直接和间接添加剂。
组合物可以含有载体、稀释剂或赋形剂。取决于应用目的，载体、稀释剂或赋形剂可以选择适合于人或牲畜应用，食品、添加剂、增补剂或药品的应用。组合物可以任选地含有另外的治癌药剂和/或台心脏血管病的药剂。组合物可以与另外的药剂共同给药或顺序给药，同时考虑这些因素，诸如年龄、性别、体重、遗传学和特殊受治疗者或病人的状况，以及给药途径。
本发明适合于人或牲畜应用的组合物例子包括口服的可食组合物，诸如固体或液剂，例如胶丸、片剂、丸片等等，可咀嚼的固体或饮料制剂(例如可可或巧克力调味的固体或液体成分)；适合于孔口，例如口部、鼻部、肛门、阴道等给药的液体制剂，如悬浮液、糖浆、酏剂(包括可可或巧克力调味的组合物)；和适合于不经肠的、皮下、皮内、肌内或静脉内给药(例如注射给药)如消毒的悬浮液或乳液。但是，组合物中的活性成分可以与蛋白质络合，以致当进入血流后，由于血蛋白的沉积而发生凝结；技术人员应该注意到这些情况。这种组合物中，活性可可萃取物可以与适合的载体、稀释剂或赋形剂，如无菌水、生理盐水、葡萄糖、二甲基亚砜、乙醇等等混合。
本发明的化合物可以通过热处理不同来源的化合物制备，例如天然来源的原花青素(例如可可属、genus Herrania)或合成制备的那些。
本发明所用的原料(黄烷醇和原花青素)的制备方法是本领域众所周知的(例如，美国专利5,554,645、6,420,572、6,156,912、6,476,241、和6,864,377)，其中相关的部分在此引入作为参考。多酚可以是天然来源的，例如，来自可可豆或另一个多酚天然来源，或来自合成制备的多酚。本领域技术人员可以基于供应情况或成本选择天然的或合成的多酚。
黄烷醇和/或原花青素衍生物也可作为一种有用的原材料。这些包括酯类的单体和低聚物，如没食子酸酯类(例如表儿茶素没食子酸酯和儿茶素没食子酸酯)；衍生自糖类物如单或二糖类物(例如β-右旋葡萄糖)，例如在上述分子式中X、Y和/或Z的位置上的化合物；糖基化的单体和低聚物，以及其混合物；原花青素单体和低聚物的代谢物，如硫酸盐化、葡糖醛酸化和甲基化形式，通过结肠微生物群落新陈代谢产生原花青素的酶分裂产物除外。该衍生物可以来自天然源或合成制备。
本发明的化合物可以通过热处理(在水溶液中)黄烷醇、原花青素或其衍生物，所述衍生物在C-2原子具有α立体化学构型，使其围绕C2原子转动，在C-2原子产生β立体化学构型而制备。这种方法特别适合于制备黄烷醇差向立体异构体，例如，(-)-表儿茶素和(+)-儿茶素的差向立体异构体。
黄烷醇差向立体异构体的制备可以根据以下原理图1进行(并见述于Freudenberg，K.and Purrmann，L.(1924)。Raumisomere Catechin IV.Liebig’s Annalen 437，472-85；Fredenberg，K.Bohme，L.and Purrmann，L.1922)。Raumisomere Catechin II.Ber.Dscht.Chem.Ges.55，1734-47，其中的公开内容在此引入作为参考)：
原理图1.水性介质中黄烷-3醇在C-2位的差向立体异构作用(Freudenberg et al.1922；Freunberg and Purmann，1924)。
Figure S2006800236662D00171
*已知存在于可可中
温度越低，引起差向异构作用要求的时间越长。例如，这种温度和时间可以是至少40℃，更优选至少50℃，时间至少10小时，更优选至少24小时，或更优选至少48小时；或至少60℃，至少70℃，至少80℃，至少90℃，至少100℃，至少110℃，或至少120℃，各自的时间至少5，或至少10、15或20分钟。例如该化合物可以在120℃处理10分钟，或120℃处理20分钟。其它的温度/时间的组合也是有效的，技术人员采用本领域的一般知识和此处提供的指导不需过度的实验就可确定。已知的技术，如高效液相色谱/质谱分析法可用来监控反应的完成。
差向立体异构的化合物可以通过热处理不同的来源的化合物制备，例如天然来源的原花青素(例如可可属、genus Herrania)或合成制备的那些(用本领域众所周知的方法得到，参见例如美国专利5,554,645、6,420,572、6,156,912、6,476,241、6,864,377)或通过购买工业来源的黄烷醇。
原花青素的差向立体异构体可以根据美国专利6,420,572、6,156,912、6,476,241和6,864,377和国际申请出版物WO04/030440描述的方法制备(其中的公开内容在此引入作为参考)，采用黄烷醇差向立体异构体作为起始结构单元。
例如，下列结构单元可以用于原花青素差向立体异构体的合成：
Figure S2006800236662D00181
具有4β-8链接的原花青素差向立体异构体(如表1所述)，可根据以下路线制备(苯甲基化、羟乙氧基化、偶合和脱苯甲基化的步骤如上述美国专利所述)。依起始结构单元的不同，该方法可以制备各种各样差向立体异构原花青素的结合。
步骤1
Figure S2006800236662D00182
步骤2
步骤3
Figure S2006800236662D00192
步骤4
Figure S2006800236662D00201
四-O-苯甲基-(+)-表儿茶素-(4β，8)-     (+)-表儿茶素-(4β，8)-(-)-表儿茶素
四-O-苯甲基-(-)-表儿茶素
本领域的技术人员利用本领域的知识和本文的指导，便会想象出制备本发明的化合物的其它方法。
包含本文所述化合物的食品，和任选地另一个心血管保护剂可以适合于人或牲畜使用，并包括宠物食品。
该食品可以是一种低水分的食品如糕饼，或一种高水分的食品如可可饮料。通常，该食品包含直至25％的蛋白质，优选5～20％，最优选1～15％；直至60％的脂肪，优选1～50％，最优选5-45％；和直至70％的碳水化合物，优选1～60％，最优选5-50％。某些食品不能总是含有蛋白质、脂肪和碳水化合物。食品的水分活度大约0.2～0.95，优选0.4～大约0.85。
该食品可以是糕饼，如同一性的标准物(SOI)和非SOI的巧克力，如牛乳、糖果和低甜度的巧克力，包括深色巧克力、低脂肪巧克力和巧克力浇盖的糖果。其它的例子包括焙烤产品(例如果仁巧克力饼、烘烤小吃、糕点、饼干)调味品、格兰诺拉燕麦片条、乳脂糖、粗粉置换条、涂抹食品、糖浆、粉末饮料混合物、可可或巧克力调味的饮料、布丁、米粉糕、大米混合物、关味酱油等等。如果需要，食品可以是巧克力或可可调味的。食品可以是含有坚果，例如花生、胡桃、杏仁和榛子的巧克力和棒糖，如格兰诺拉棒。
包含此处所述的(-)-儿茶素和/或二聚体的饮料，如可可饮料，也在本发明范畴内。例如，饮料可以含(-)-儿茶素比(-)-表儿茶素更多，例如(-)-表儿茶素与(-)-儿茶素的比率可以至少1∶2或至少1∶3。
可可成分
热处理的可可成分用于高CP食品。当该产品是低水分的含量产品时，每一克产品含有至少大约6毫克，优选大约8，和更优选大约10毫克的可可多酚，而且产品中表儿茶素与儿茶素的比率为1到大于1。它们每一克产品优选含有至少大约10毫克，更优选大约12，和最优选大约14毫克的可可多酚，而且产品中表儿茶素与儿茶素的比率为1.0到大于0.66。它们每一克产品优选含有至少大约12毫克，更优选大约14，和最优选大约16毫克的可可多酚，而且产品中表儿茶素与儿茶素的比率为1.0到大于0.54。甚至更优选，它们每一克产品含有至少大约13毫克，更优选大约15，和最优选大约17毫克的可可多酚，和产品中表儿茶素与儿茶素的比率是1.0到大于0.42。
高CP可可组分包括热处理加工的部分脱脂或完全脱脂的CP可可粉，该可可粉包含(±)-儿茶素和(±)-表儿茶素，和其原花青素低聚物，每一克脱脂可可粉的总CP含量为至少大约25毫克，优选大约12～大约25毫克的可可多酚。
当产品是高水分含量食品如饮料时，每一克的产品含有至少大约0.2，优选0.2～0.4，或更优选0.4～0.8，或最优选0.8～1.2毫克的总可可多酚。
如同低水分的食品一样，高水分食品的表儿茶素比儿茶素的比例取决于产品的可可多酚含量。通常，含有大约0.2～0.4毫克的产品，其比例为1～大于1；含有大约0.4～大约0.8毫克的产品，其比例为1～0.42；含有大约0.8～大约1.2毫克的产品，其比例为大约1～大约0.54；含有大约1～大于1.2毫克的产品，其比例为大约1～大约0.66。
组分中也包含热处理的高CP可可萃取物，干的或液体的，每一克的干的可可萃取物的总CP含量至少大约200毫克，优选大约250～大约500，最优选大约350～大约500毫克。与没有热处理的可可萃取物相比，该萃取物图谱也发生变化。该组分也包含热处理的可可制品，如可可饮料，该热处理可可制品与没有热处理的相比，图谱发生了变化。该产品含有高CP可可成分，如可可粉和/或液体的或干的可可萃取物，和/或可可浆。当该产品是一种高水分含量产品如饮料时，每一克该产品含有至少为大约0.2毫克的总可可多酚。该可可多酚含量优选是0.2～5毫克，更优选大约0.6～大约2.0毫克，最优选大约0.6～大约2.0毫克。
在这种高CP可可粉、可可萃取物和可可制品里，经过热处理的表儿茶素和儿茶素的总量基本上是不变的，但是(+)-儿茶素与(-)-儿茶素的比例是变化的，可可固体从90∶10到4∶96，可可萃取物从90∶10到34∶66。有趣地，通过热处理后，(-)-表儿茶素与(+)-表儿茶素的比例是不变的，或仅仅轻微地变化。
图谱发生变化的高CP可可粉、高CP可可萃取物和高CP可可制品，是通过加热部分或完全脱脂的可可粉或干的可可的水分散体制备，优选由未发酵的或发酵不足的可可豆制备。可可组分或可可制品在足以差向立体异构(-)-表儿茶素的pH和温度条件下加热一段时间。通常，该组分或产品在pH大约3.8～大约8，和大约37℃～大约200℃下，加热大约0.5分钟～几天。优选地，它们在pH大约5～大约7.5，和大约72℃～大约160℃下，加热大约1分钟～大约6小时。最优选地，它们在pH大约6～大约7.4，和大约100℃～大约140℃下，加热大约1～大约4小时。
该组分也包含热处理的巧克力浆。巧克力浆含有至少大约10毫克的可可多酚(每一克脱脂可可浆)，优选大约20～大约50毫克，更优选大约13～大约17毫克。
含有本发明化合物的药品，任选地与另一个NO调整药剂，或心/血管的治疗剂联用，通过各种方法给药，如经口、经颊、经舌下、经鼻、直肠、静脉内、肠外和局部给药。本领域技术人员将能确定一种适合的给药方式，最大化地输送分子式An的化合物，和任选地另一个心/血管的保护剂。从而，适合于每一种给药的剂型都在本发明的范畴之内，包含固体、液体的和半固体剂型，如片剂、胶丸、胶囊(gelcaps)、散装或单一剂量的粉末或颗粒、乳液、悬浮液、糊剂、乳膏、凝胶剂、泡沫体或胶状物。缓释剂型也在本发明的范畴内。适合的药物上可接受的载体、稀释剂或赋形剂通常是本领域已知的，通过本领域的技术人员可以容易地确定。该片剂，例如，可以包含含有效量多酚的组合物，和任选地一种载体如山梨糖醇、乳糖、纤维素或磷酸二钙。
含有可可黄烷醇和/或原花青素，和(任选地另一种NO调节剂或心/血管治疗剂)的营养增补剂，可以利用本领域已知的方法制备，可以包含，例如，营养物如磷酸二钙、硬脂酸镁、硝酸钙、维生素和无机物。
还在本发明范畴内是一种生产制品，如包含本发明组合物的包装产品(例如食品、营养增补剂、药品)，和标明存在本发明的化合物，和/或直接使用该组合物治疗心/血管问题，或作为此处所述的预防的治疗的标签。该标签和/或使用说明书可以涉及本申请所述的任何使用方法。
本发明也涉及生产包含任何此处所述组合物的生产制品的方法，包装该组合物得到生产制品的方法，和指示、引导或推动该组合物/生产制品得到本文所述的任何应用的方法。这种指示，引导或推动包括登广告。
也在本发明范畴内是一种生产制品(如包装的产品或套装)，该生产制品适合于联合治疗使用，包含至少一种本发明的化合物和至少一种另外的化学疗法的和/或心/血管的药剂(即，除了本发明的化合物)，所述化学疗法和/或心/血管的药剂可以是在单独的容器里作为一种单独的组合物提供，或是以与本发明的化合物的混合物形式提供。
以下的方法是用于制备和检验高CP的产品。
样品制备
在实施例1里，将饮料冷冻干燥并用丙酮/水/醋酸混合物(CH3COCH3∶H2O∶HOAc，79.5∶20∶0.51)萃取两次，在50℃超声处理15分钟，在35000rpm离心分离6分钟。溶剂由收集的上层清液在减压或真空下回收，并冷冻干燥。得到的材料用于相HPLC分析。
在实施例3和4中，用于可可饮料的样品制备要进行改动，以更好适应高水分产品分析。样品制备包括取32～35克饮料，定量地转移到100mL量瓶中，加入0.5mL冰醋酸，然后加入丙酮。这个方法产生一种溶液，可与使用另一可可样品的抽提溶剂相当，包含丙酮∶水∶醋酸为70∶29.5∶0.5(v/v/v)。饮料样品不能在分析之前脱脂。该饮料的水是用于组成抽提溶剂的含水部分。
正相色谱-HPLC/MS分析-Adamson等人的方法
实施例1采用Adamson等发表的正相HPLC方法(J.Agric.FoodChem.1999，47pp.4184-4186)。条件如下：
a)柱：
Phenomenex Lichrosphere二氧化硅
尺寸：25cm×4.6mm
粒径：5微米
孔径大小：100A
b)流动相：
A.二氯甲烷
B.甲醇
C.水∶醋酸(1∶1)
梯度条件：
起始：            82％A/14％B/4％C
时间＝30mins.     67.6％A/28.4％B/4％C
时间＝50mins.     53.2％A/42.8％B/4％C
时间＝51mins.     10％A/86％B/4％C
时间＝56mins.     82％A/14％B/4％C
再平衡-7分钟
c)流速：1.0ml/min
d)柱温：37℃
e)注射体积：5.0微米
f)检测：荧光：激发波长276nm：发射波长316nm
正相色谱法-Diol方法
其它实施例采用的正相色谱法是一种无卤素方法，通常称为DIOL法。该方法公开在M.A.Kelm等的论文“根据聚合度采用Diol固定相实施可可(Theobroma cacao L.)原花青素的高性能液相色谱的分离和提纯”“High Performance Liquid Chromatography Separation and Purificationof Cacao(Theobroma cacao L.)Procyanidins According to Degree ofPolymerization Using a Diol Stationary Phase”by M.A.Kelm，et al.(J.Agr.& Food Chem.2006 Mar 8；54(5)：1571-6)。
条件如下：
正相高压液相色谱法分析方法
名称：CPDIOL-3.M
柱：Intersil Diol 250×4.6mm
流动相A乙腈∶醋酸98∶2
流动相B甲醇∶水∶醋酸95∶3∶2
流速：
梯度  时间(分钟)  ％B
           0       0
           35      40
           45      40
           46      100
           50      100
所用的柱为250×4.6-mm，内径5μm Develosil diol(Phenomenex，Torrance，CA)。双流动相由(A)CH3CN∶HOAc，(98∶2，v/v)和(B)CH3OH∶H2O∶HOAc(95∶3∶2)组成。分离是在30℃采用1.0/min的流速，通过线性梯度洗脱法实施，具体如下：0-35分钟，0-40％B；35-45分钟，40％B等浓度的；45～46分钟40～0％B，在0％B保持4分钟。洗脱液通过荧光检测监控，荧光的激发在276nm，发射在316nm。
反相高压液相色谱-C18方法
一种Agilent1100 LC仪器，联同光电二极管阵列、荧光检测器和四极质谱仪用于单体和原花青素的分离和检测，以及测定表儿茶素与儿茶素在未发酵的可可豆、可可萃取物、未蒸煮的和蒸煮的可可粉和可可饮料中的比例。采用Hypersil ODS(C18 100×4.6mm，5μm)柱。流动相由A(1％醋酸水溶液)和B(0.1％醋酸甲醇溶液)组成，采用10-25％B(v/v)20min，随后增加到100％B10min和直至100％B10min的线性梯度洗脱法。流速设置到1.0mL/min。柱温定在20℃。UV检测器设置在280nm记录峰强度，紫外谱记录从200～600nm。离子化方法是电喷射(ESI)，质谱数据全部以负离子模式获得。为了定量操作，标定曲线是采用这种色谱法和FLD检测确定。洗脱液通过荧光检测监控，荧光的激发在276nm，发射在316nm。
制备高压液相色谱法(HPLC)Diol法
制备高压液相色谱法用于实施例5的单体和二聚体级分的物理分离。分离和洗脱单独的黄烷-3-醇单体和/或原花青素低聚物的改进方法包括步骤：(A)将含有该单体和/或低聚物的液体样品引入极性键合的二醇固定相充填的液相色谱柱；(B)双流动相A和B流经柱子后，基于聚合度的不同，使单独的单体和/或低聚物分离；和(C)洗脱含有单体和二聚体级分的单独级分。固定相的粒径为大约3～大约10μm。使用一种制备diol柱，其条件稍微变动如下：
流动相A：乙腈∶醋酸99∶1
流动相B甲醇∶水∶醋酸95∶4∶1
柱：Devosil 100DIOL-10
流速：55mL/min
梯度组成：
时间(分钟)  ％B
    0        0
    35       30
    40       80
    41       0
    50       0
实施例
实施例1：可可饮料的原花青素化学的LCMS研究，和在主动脉环试验时饮料级分的检测
实施例描述两种可可饮料(根据不同的方法制备)和其相应的可可粉的液相色谱质谱分析(LCMS)。特别注意检测各种样品中的单体、二聚体和三聚体的定性差别。主动脉环的试验用来鉴别功能级分/化合物，使用饮料萃取物作为原料。
两种饮料根据以下的方法制备。
根据Kealey等的美国专利6,015,913所述方法制备的高多酚可可粉用于制备两者饮料。
该可可粉和其单体、二聚体和三聚体级分的典型HPLC谱图如图1、2、3和5所示。
可可饮料A制备方法如下：(i)可可粉与水在80℃混合20分钟(这个步骤是再生任何粉末里残留的孢子，和使它们在超高温(UHT)时破坏)；(ii)混合物在140℃经受超高温处理，时间6～7秒；(iii)混合物装入一85ml容器，在最高水温115℃和最大压力2.6巴下蒸馏10分钟(完全处理19分钟)。施加转动帮助传热。只要可以达到此处所述的功能和/或结构效应，可以使用任何变动的方法。
可可饮料B制备如下。在室温下，将高多酚可可粉、奶粉、糖、增稠剂、乳化剂、维生素混合物、香草精调料和瓶装水(在22℃)掺混并混合，使用高压泵匀化，超高温处理(160℃15秒)，并无菌包装。用于制备这种饮料的示范性装置，包括Breddo Likwifier(美国配料公司(American Ingredients Co.)的部门，Kansas City，Missouri)，带有连接管线连通的Waukesha容积式泵和Silverson 275/混合器(SilversonMachines Ltd.Waterside，Chesham Bucks，England)。得到的饮料含有大约170mg的黄烷醇和原花青素。
两种饮料和其相应的可可粉的萃取物如图7所示方法制备。总括地说，该饮料被冷冻干燥和采用丙酮/水/醋酸混合物(CH3COCH3∶H2O∶HOAc，79.5∶20∶0.5)萃取两次，在50℃超声处理15分钟，在3500rpm下离心分离6分钟，在减压或真空下从收集的上层清液中去掉溶剂，并冷冻干燥。得到的材料用于HPLC分析。
LCMS结果
每一种饮料和其相应的可可粉的萃取物都进行正相(NP)和反相(RP)的LCMS研究。测试样品的NP-HPLC色谱图参见图1和2。
参照图1，可可饮料A的NP-HPLC色谱图与从制备该饮料的可可粉观察到的有很大的差别。尽管可可粉含有单体到十聚体的离散基团(图1，上图)，但可可饮料A的NP-HPLC色谱图含有大部分单体到三聚体(图1，下图)。
因此，可可饮料A与它的可可粉相比，表儿茶素和儿茶素的峰区域发生了转化，即可可饮料A含有比表儿茶素更多的儿茶素，相反可可粉含有比儿茶素更多的表儿茶素。通常在可可粉里，(-)表儿茶素与(+)儿茶素的比例为大约9∶1。相反，在可可饮料A里观察到表儿茶素与儿茶素的比例大约是1∶3，手性分离表明，大部分儿茶素是(-)儿茶素形式，(+)儿茶素与(-)儿茶素的比例大约在1∶44。没有观察到(+)表儿茶素。
参照图2，可可饮料B也比制备它的可可粉含有更多的儿茶素，但是，在可可饮料里观察到表儿茶素与儿茶素的比例大约是1∶1。
二聚体的差别也相当明显。图1和2所示的萃取离子色谱图(EIC)证明了这种峰作为二聚体(m/z 577)的同一性。用于制备可可饮料A和B的可可粉的EIC(图3和5)显示可可中存在典型的二聚体(B2和B5二聚体)。由图4和6可见，在饮料里二聚体B5的峰都几乎消失。但是，最重要地，可可饮料A含有的大量二聚体(～4-5)在起始可可材料里未发现(图4)。最值得注意的是，14.5min的大峰，其分裂方式(不存在)与其它的B型二聚体一致。可可饮料B也含有另外的二聚体峰(虽然较小)。
主动脉环(Aortic Ring)试验的结果
可可饮料A萃取物进行生物试验引导的分级，如流程1所图示。级分96A～96E如下所述试验。五个级分(9A～9E)是从生理活性级分96E使用制备RP HPLC得到并待试。级分9A、9B、9C、9D和9E已经通过LCMS试验性地表征，证实分别由非原花青素/B型三聚体/A型二聚体，B型三聚体(主要)/B型四聚体(痕量)，B型二聚体(主要)/B型三聚体(痕量)，B型二聚体/B型三聚体，和B型三聚体组成。
主动脉环培养物的制备，如早先Karim，McCormick K.KappagodaCT.“可可原花青素对内皮相关的松弛的影响”，Journal of Nutrition2000；130：2105S-2108S所述。在将环插在10mL氧化的Krebs’缓冲液之后，让其稳定，环首先采用去甲肾上素(10-6M)预收缩，然后使用乙酰胆碱(10-6M)试验内皮成活力。然后冲洗环和让其恢复到基本的张力。一旦环在基本张力，再采用去甲肾上素(10-6M)收缩。当收缩到达稳态，给予环过氧化氢酶(400U/mL)，在附加时间的稳定之后，增添试验化合物的累积浓度(10μg/ml～500μg/ml)。两种单独的环也进行时间参照试验(乙酰胆碱10-9M～10-4M)和媒介参照(乙醇或二甲基亚砜)试验。适当的时候，在过氧化氢酶和试验化合物加入之前，加入(10-5M)-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，一种NOS的抑制剂。此外，在加入试验化合物之前，将选择环的内皮剥去，以便检验内皮相关的松弛。
主动脉环的松弛是按张力(g)减少测定，并可以对去甲肾上素收缩响应的百分数表示。所有的药物浓度以在组织浴缓冲液里的最后浓度表示。组数据以平均值±n次试验的SEM来表示。
乙酰胆碱10-6M达到最大的松弛。二甲基亚砜在更高的浓度(800～1000ml的50％或100％二甲基亚砜)松驰响应；这浓度也就是说与试验化合物400Mg/ml和500Mg/ml的剂量有关。所有的试验化合物在500Mg/ml(n＝1)产生松驰响应，也就是说，与相应的媒介参照具有类似的或较小的程度，因此采用试验化合物在这剂量下观察到的松弛被认为是不产生响应。在10Mg/ml～300Mg/ml的浓度范围内，采用50％或者100％的DMSO(n＝2)的媒介参照，没有观察到显著的松弛响应。在剩余的实验(n＝2)里，试验化合物在50％乙醇中。当容器以50％乙醇同等物作为媒介参照，没有观察到松驰反应。
以下的结果包括由在50％二甲基亚砜中的试验化合物的一个试验，和50％乙醇的两个试验。仅仅MK-1312-96E在200Mg/ml的最终浴浓度产生显著的最大松驰响应(33.6％±3.0，n＝3；p＜0.05，ANOVA，用Bonferroni校正)。MK-1312-96E的最大松驰响应和乙酰胆碱的最大松驰响应之间也没有显著差异(学生t检验)。MK-1312-96D在200Mg/ml浴浓度看来似乎产生松驰响应(20.3％±8.7，n＝3)，但是这个效果在统计学上没有显著意义。MK 1312 96A(是溶于100％二甲基亚砜的化合物)、MK-1312-96B和MK-1312-96C没有响应。当该容器或者将内皮剥去，或者在加入试验化合物之前给予L-NAME，这些化合物的所有松弛响应都消失或明显地被抑制。
结论是，MK-1312-96E在这个急性内皮功能(也就是说通过氧化氮调节)的体外模式里，能产生内皮相关的松弛响应。
上述生物试验和分级方法重复进行直到纯活性化合物或化合物被分离。核磁共振和质谱仪可用来阐明生物活性化合物的结构。
实施例2：高CP的部分脱脂可可粉中原花青素化学的LCMS研究
高CP可可粉(50g)悬浮在装备有水冷式冷凝器的1L圆底烧瓶内500mL去离子水(pH5.3)中。用加热套作热源，回流混合物。分别在30分钟、7.75小时和24小时取样。原始的未蒸煮过的高CP可可粉的正相HPLC/FLD谱图如图10所示。用diol法分离。图11显示蒸煮过的高CP可可粉(Adamson等的方法)的正相HPLC谱图。图12A～D显示蒸煮前和蒸煮后30分钟、7.75小时和24小时的谱图。
在任何加工之前高CP可可粉的总CP含量是～57mg/g或～6％。CP含量使用机构内部的标准物色谱测量系统测定。测定的多酚包括单体到十聚体。蒸煮后总CP含量减少到30mg/g。单体含量由此数据确定，显示未蒸煮的高CP可可粉单体是13.79mg/g(1.4％单体，按质量计)，而且该单体量蒸煮之后未改变，其量为15.8mg/g(1.6％，按质量计)。
也使用反相RP HPLC(C18)进行定量。标定曲线周可靠的标准物确定。未蒸煮过的高CP可可粉单体的量与在正相条件下确定的量相当符合。作为对照物，使用制备的二醇柱将单体级分由蒸煮过的高CP可可粉中分离出来。由蒸煮过的高CP可可粉分离的纯化级分的反相分析，显示表儿茶素和儿茶素清楚的谱图。儿茶素和表儿茶素在未蒸煮的和蒸煮过的高CP可可粉中的含量如表1所示。
表1
  儿茶素(mg/mL)     表儿茶素(mg/mL)   总单体量(mg/mL) 基于样品质量的单体量(％)
高CP可可粉蒸煮过的高CP可可粉从蒸煮过的高CP可可粉分离的单体份数   1.70×10-33.13×10-39.86×10-38.18×10-30.323     1.01×10-21.21×10-23.12×10-34.8×10-30.176   1.18×10-21.52×10-21.30×10-21.30×10-20.500     1.14％1.52％1.27％1.27％50％
实施例3：表儿茶素与儿茶素比例的研究
表儿茶素与儿茶素的比例使用C18 HPLC方法测定。试验的各种可可制品包括未发酵的可可豆、两种高CP可可粉萃取物、未蒸煮和蒸煮过的高CP可可粉和可可饮料A。可可粉萃取物A是通过用含水乙醇(25％水/75％乙醇，v/v)萃取未发酵的可可豆制备。可可粉萃取物B是通过用含水丙酮(20％水/80％丙酮，v/v)萃取未发酵的可可豆制备。比例如表2所示。
表2
  可可产品   表儿茶素∶儿茶素基于100
  未发酵的可可豆可可萃取物A可可萃取物B未蒸煮过的高CP可可粉蒸煮过的高CP可可粉可可饮料A     95∶596∶490∶1079∶2133∶6735∶65
在没有热处理的产品里，例如可可粉萃取物，表儿茶素含量是大于儿茶素含量，这与未发酵的可可豆的观察情况一致。对于高CP可可粉，表儿茶素与儿茶素的比例是79∶21。对于深度加工的样品，如可可饮料A和蒸煮过的高CP可可粉，表儿茶素与儿茶素的比例为～35∶65。可可饮料A在它制备的时候要经受几个高温步骤(参见实施例1)。这个～35∶65的表儿茶素对儿茶素的比例，是这两个差向立体异构化反应非对映体的热力学平衡(儿茶素是天然产品，具有更稳定的构型)。从而，加工深度对表儿茶素与儿茶素的转化度提供了某些参照。如稍有或没有加工，表儿茶素对于儿茶素的比例是～95∶5。如进一步进行加工，特别是高温处理，该比例转变到～80∶20，如同未蒸煮过的高CP可可粉一样。对于深度加工，该比例达到平衡点。
实施例4：手性含量的研究
为了确定差向立体异构体的比例，进行手性色谱法研究。在一组色谱分析条件下得到(+/-)-儿茶素的比例，在另一组色谱分析条件下得到(+/-)-表儿茶素的比例。
对各种可可样品中观察到的表儿茶素和儿茶素，还进行立体化学组成分析。T手性含量提供于表3。
表3
可可产品   (-)/(+)-表儿茶素   (+)/(-)-儿茶素
未发酵的可可豆可可萃取物A可可萃取物B未蒸煮过的高CP可可粉蒸煮过的高CP可可粉可可饮料A(冷冻干燥)     100∶0100∶0100∶0100∶095∶594∶6     90∶1039∶6134∶6613∶874∶963∶97
儿茶素在可可豆里是一种微量组分，天然存在的(+)-儿茶素对(-)-儿茶素的比例是90∶10。对于儿茶素，在可可豆里主要的形式是(+)-儿茶素。在两种可可提取物里，(+/-)-儿茶素的比例变为大约40∶60，这与可可豆的数据不同，(-)-差向立体异构体的量增大。大概，(-)-儿茶素的来源是(～)-表儿茶素转化为(-)-儿茶素，因为该转化是立体特异的。更进一步的加工提高了转化率，直到主要的结构是(-)-儿茶素。在深度加工的可可样品如可可饮料A里，加工提高了(-)-儿茶素的含量，直到它变成主要的立体异构体。这与期待的转化反应一致，因为(-)-儿茶素是通过(-)～表儿茶素在用于制备可可饮料A的热处理条件下转化产生的。(-)～表儿茶素是在轻度加工的材料中观察到的仅有异构体。在深度加工的可可样品里，观察到的(+)-表儿茶素立体异构体的量非常小。这与预计(+)-表儿茶素是从(+)-儿茶素产生的事实一致，而且(+)～表儿茶素是稳定性更小的立体异构体。为了确定立体异构体的比例，进行了手性色谱法研究。在一组色谱分析条件下得到(+/-)-儿茶素的比例，在另一组色谱分析条件下得到(+/-)-表儿茶素的比例。
结果表明，在已加工材料，即蒸煮过的高CP可可粉和可可饮料A里，所有四个立体异构体存在有不同的量。
实施例5：单体和二聚体的分离
将总共1.02g的高CP可可粉溶于15mL的75∶25(99∶1的乙腈∶醋酸)：(95∶4∶1的甲醇∶水∶醋酸)中，在3500rpm离心分离5分钟，用0.45μm过滤器过滤。进行几批次HPLC试验以纯化蒸煮过的可可粉(批次1∶2.0mL注射，批次2∶5.0mL注射，批次3∶5.0mL注射和批次4∶4.0mL注射)。在～12.4分钟洗脱的所有单体峰和在～27.5分钟洗脱的二聚体峰合并，在减压下蒸发，和冷冻干燥。得到的单体和二聚体分别是6毫克和4毫克。样品溶于适当的流动相以便随后的分析分离。图13显示由蒸煮过的高CP可可粉分离的单体级分的谱图。
实施例6：未蒸煮过的高CP可可粉、蒸煮过的高CP可可粉和合成的(-)-表儿茶素(4β，8)-(-)-儿茶素二聚体的对比
小于1毫克的合成的(-)-表儿茶素-(4β，8)-(-)-儿茶素二聚体，溶于含有10％乙醇和0.1％醋酸在去离子水中的混合物中。该二聚体是一种天然存在的B2二聚体的差向立体异构体二聚体，即(-)-表儿茶素-(4β，8)-(-)-表儿茶素。
总共0.3g的蒸煮过的高CP可可粉溶于2mL的含有10％乙醇和0.1％醋酸在去离子水里的混合物中，超声处理5分钟，在4500rpm离心分离5分钟，用45μm过滤器过滤。然后取200μl样品进行LC/MS分析。
总共0.3g的蒸煮过高CP可可粉溶于2mL的含有10％乙醇和0.1％醋酸在去离子水里的混合物中，在4500rpm离心分离5分钟，用45μm过滤器过滤。取200μ1样品并加入＜1毫克的合成的(-)-表儿茶素-(4β，8)-(-)-儿茶素。
总共0.33g的未蒸煮过的高CP可可粉溶于2mL的含有10％乙醇和0.1％醋酸在去离子水里的混合物中，超声处理5分钟，在4500rpm离心分离5分钟，用45μm过滤器过滤。取200μl样品进行LC/MS分析。
MSD设置是离子模式：API-ES，模式：扫描，极性：负性，质量范围：100～1500，Fragmetnor：70，阈值：150，步长：0.20，毛细管电压：3000，干气10l/min，喷雾器压力50磅/平方英寸(psig)，干气温度：345℃。
HPLC分析表明，二聚体发生显著变化。参见图14A到14D。B2二聚体在这个条件下的保留时间是12.7分钟，B5二聚体是24.5分钟，差向立体异构的B2二聚体是6.8分钟。图14A～D显示合成的差向立体异构B2二聚体(A)、未蒸煮过的高CP可可粉(B)、蒸煮过的高CP可可粉(C)和掺料的蒸煮过高的CP可可粉(D)的反相分离谱图。蒸煮过的高可可粉表明，其二聚体B5几乎没有，二聚体B2仍然存在，而且存在一种保留时间为～6.8分钟的新二聚体。用合成的差向立体异构的B2二聚体掺料的样品显示，前述峰的区域增大(参见图14D)。
二聚体级分使用制备二醇(diol)柱由蒸煮过的高CP可可粉中分离出来。这个纯化级分的RP-HPLC/FLD和质谱仪(单一的离子监控器模式m/z＝577)谱图显示，正如所料，不存在单体。但是清楚地显示新的二聚体。新的二聚体在此色谱分析条件之下的保留时间与B2、B5和差向立体异构B2的二聚体不同。考虑到B2和B5二聚体可能的差向立体异构体包括总共六个另外的异构体，新的二聚体可能是通常存在于可可中的B2和B5二聚体的差向立体异构体。
尽管本发明已经通过某些特定的实施方案进行描述，应当理解，本领域技术人员可以实施许多不偏离本发明的修改和变动。所以附加的权利要求打算覆盖所有这类修改和变动，并可属于本发明的真实精神和范围之内。

Claims (20)

1.一种热处理的部分脱脂或完全脱脂的可可粉，其每一克脱脂可可粉具有总可可多酚的含量为至少大约25毫克，其中该可可多酚包含(±)-儿茶素、(±)-表儿茶素和其原花青Z素的低聚物，其特征在于单体的图谱发生改变，其中表儿茶素对儿茶素的比例为大约1～大于大约1。
2.权利要求1的可可粉，其中总可可多酚含量为大约20～大约50毫克每克，和其中所述比例是大于大约1～大约0.42。
3.一种热处理的巧克力浆，其每克具有总可可多酚含量为至少大约10毫克，基于脱脂的可可固体，其中所述可可多酚包含(±)-儿茶素、(±)-表儿茶素和其原花青素低聚物，其特征在于，单体的图谱发生改变，其中表儿茶素对儿茶素的比例为大约1～大于大约1。
4.权利要求3的巧克力浆，其中总可可多酚含量为大约12～大约25，和其中所述比例为大约1～大于大约0.42。
5.一种热处理的可可萃取物，其中该萃取物的总多酚含量是每克干萃取物至少大约200毫克的可可多酚；其中该可可多酚包含(±)-儿茶素、(±)-表儿茶素和其原花青素低聚物，其特征在于单体的图谱发生改变，其中表儿茶素对儿茶素的比例为大约1～大于大约1。
6.权利要求5的萃取物，其中总可可多酚含量为大约250～大约500，和所述比例大约1～大约0.42。
7.一种热处理的低水分含量的可可制品，其含有选自高CP可可粉、液体的或干的高CP可可萃取物、高CP巧克力浆和其混合物的可可组分，所述产品具有的总可可多酚含量为每克产品至少大约6.0毫克，其中可可多酚包含(±)-儿茶素、(±)-表儿茶素和其原花青素低聚物，其特征在于单体的图谱发生改变，其中表儿茶素对儿茶素的比例是1～大于1。
8.权利要求7的可可制品，其中该制品具有的总可可多酚含量为至多49毫克。
9.一种热处理的高水分含量可可制品，其含有选自高CP可可粉、液体的或干的高CP可可萃取物、高CP巧克力浆和其混合物，该产品具有总可可多酚含量为每克产品至少大约0.2毫克，其中该可可多酚包含(±)-儿茶素、(±)-表儿茶素和其原花青素低聚物，其特征在于单体的图谱发生改变，其中表儿茶素对儿茶素的比例是1～大于1。
10.权利要求9的产品，其中该产品具有的总可可多酚含量为至多大约5毫克。
11.权利要求1的可可粉，权利要求3的巧克力浆，权利要求5的可可萃取物，或权利要求7或9的可可制品，其中表儿茶素和儿茶素的总量与最初存在于该可可粉、可可萃取物、巧克力浆或可可制品中的总量基本上未改变。
12.权利要求1的可可粉、权利要求3的巧克力浆、权利要求5的可可萃取物或权利要求7或9的可可制品，其特征在于，存在的四个另外的二聚体，在同样的色谱分析条件下，具有与已知的二聚体B2和B5不同的洗脱时间。
13.权利要求1的可可粉，它是在大约37°～大约190℃和在足以差向立体异构(-)表儿茶素的时间和pH下，通过加热从未发酵或发酵不足的可可豆制备的可可粉而得到。
14.权利要求3的巧克力浆，它是在大约37°～大约190℃和足以差向立体异构(-)表儿茶素的时间和pH下，通过加热从未发酵或发酵不足的可可豆制备的巧克力浆而得到。
15.权利要求5的可可萃取物，它是通过溶解干的可可萃取物在水或含水有机溶剂中，并在大约37°～大约190℃和pH大约4.0～大约8.0下，加热溶液大约0.5分钟～几天制备。
16.一种基本上由水和可可粉组成的可可饮料，所述饮料与制备它的可可粉对比，含有比表儿茶素更多的儿茶素，和其中表儿茶素对儿茶素的比例在饮料里大约是1∶3。
17.权利要求16的可可饮料，其中在饮料里大部分儿茶素是(-)-儿茶素。
18.一种治疗或预防血管疾病或病症的方法，该方法是通过给人或牲畜给药包含(-)-儿茶素和在同样的色谱分析条件下洗脱时间不同于二聚体B2和B5的二聚体的可可饮料，和其中该血管的疾病或病症是选自动脉粥样硬化、血栓形成、高血压(例如原发性、继发性和肺动脉高血压)、心血管疾病(CVD)、冠状动脉病(CAD)(包括心肌缺血、心肌梗死、稳定和非稳定心绞痛、急性的闭塞或再狭窄)、糖尿病(I型和II型)(例如糖尿病的血管并发症)、认知机能障碍或异常和/或血管循环异常(包括脑血管)、心脏病、脑血管疾病(包括中风、起始和/或再发的短暂性缺血性发作，或局部缺血的并发症，例如在冠状血管成形术或经皮冠状介入之后)、充血性心力衰竭、肾衰竭、肾病；与周边血管(例如位于臂腿处血管)收缩有关的疾病和/或病症，如末梢血管病和更具体地说Raynaud病、周边动脉病(PAD)、间歇性跛行、脉管炎(例如小血管的)、血管痉挛、静脉血栓形成、静脉机能不全、临界肢局部缺血、急性肢局部缺血、动脉粥样栓塞和下肢局部缺血。
19.权利要求18的方法，其中饮料是可可饮料。
20.权利要求19的方法，其中该饮料是可可饮料，和其中该血管的疾病或病症是选自动脉粥样硬化、血栓形成、高血压(例如原发性、继发性和肺动脉高血压)、心血管疾病(CVD)、冠状动脉病(CAD)(包括心肌缺血、心肌梗死、稳定和非稳定心绞痛、急性的闭塞或再狭窄)、糖尿病(I型和II型)(例如糖尿病的血管并发症)、认知机能障碍或异常和/或血管循环异常(包括脑血管)、心脏病、脑血管疾病(包括中风、起始和/或再发的短暂性缺血性发作，或局部缺血的并发症，例如在冠状血管成形术或经皮冠状介入之后)、充血性心力衰竭、肾衰竭、肾病；与周边血管(例如位于臂腿处血管)收缩有关的疾病和/或病症，如末梢血管病和更具体地说Raynaud病、周边动脉病(PAD)、间歇性跛行、脉管炎(例如小血管的)、血管痉挛、静脉血栓形成、静脉机能不全、临界肢局部缺血、急性肢局部缺血、动脉粥样栓塞和下肢局部缺血。
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