MX2007016272A - Productos de cacao procesados termicamente utiles para mejorar la saluda vascular. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a composiciones que contienen polifenoles tales como falvanoles, procianidinas, y derivados de los mismos que pueden obtenerse tratando termicamente los polifenoles en un a solucion acuosa y a composiciones que comprenden epimeros de flavanoles, procianidinas, y derivados de los mismos, y metodos de tratamiento terapeutico o profilactico de enfermedades que responden a NO o trastornos que usan el mismo. La invencion tambien se refiere a polvos de cacao procesados termicamente y extractos de cacao caracterizados por un perfil monomerico o oligomerico alterado en donde la cantidad total de epicatequina y catequina no cambia, en donde estan presentes nuevos dimeros, y en donde esta ausentes los oligomeros superiores superiores a los trimeros.

Description

PRODUCTOS DE CACAO PROCESADOS TÉRMICAMENTE ÚTILES MEJORAR LA SALUD VASCULAR REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una solicitud de PCT que reclama prioridad a la solicitud provisional Serie No. 60/695,361 presentada el 29 de junio de 2005 para "Formulations for Vascular Health Improvement" .

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a composiciones que contienen polifenoles tales como flavan-3-oles, procianidinas y derivados de los mismos que se obtienen por tratamiento térmico de los productos que contienen polifenol, composiciones que comprenden - epímeros de flavan-3-oles, y procianidinas y a métodos de tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades que responden a NO o trastornos que usan los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los polifenoles son un grupo diverso de compuestos (Ferreira y otros, Tetrahedron, 48:10, 1743-1803, 1992).

Ellos se presentan ampliamente en una variedad de plantas, algunas de las cuales entran en la cadena alimenticia. En algunos casos representan una clase importante de compuestos para la dieta humana. Por ejemplo, se ha mostrado los flavanoles y procianidinas tienen un efecto sobre el óxido nítrico (NO) (v.gr., Pat. de E.U.A. No. 6,670,390). Se sabe que NO inhibe agregación de plaquetas, adhesión de monocitos y quimiotaxis, y la proliferación de tejido de músculo liso que está implicado críticamente en el proceso de aterogenésis . Cuando se reducen . las concentraciones circulantes de NO, tanto debido a que la producción de bloquea por un inhibidor o porque está en estado patológico, tal como aterosclerosis, los músculos vasculares no se relajan al grado apropiado. La vasoconstricción resultante incrementa la presión sanguínea y puede ser responsable de algunas formas de hipertensión. La hipertensión es una causa principal de enfermedades vasculares, incluyendo apoplejía, ataque cardíaco, falla cardiaca y falla renal. Dado el gran número de personas que sufren de enfermedades o trastornos que responde a NO, es de interés considerable encontrar varias vías terapéuticas para evitar y tratar estas condiciones. Los solicitantes han descubierto que ciertos compuestos descritos en la presente pueden usarse para dichas aplicaciones.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a flavanoles (monómeros) y procianidinas (oligómeros) , y/o epímeros de flavanoles y procianidinas tratados térmicamente composiciones que comprenden dichos compuestos y métodos para tratamiento y profilaxis de enfermedades o trastornos que responde a NO. En un aspecto, la invención se refiere a una composición, tal como un fármaco, un alimento, un aditivo de alimentos y un suplemento dietético que comprende los compuestos de la invención o derivados del mismo en la cantidad efectiva para tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades o trastornos que responden a NO. La composición opcionalmente puede contener un agente terapéutico o benéfico para la saludo adicional o puede administrarse en combinación con otro agente terapéutico o benéfico para la salud. Los productos empacados que contienen las composiciones mencionadas antes y una etiqueta y/o instrucciones de uso para el tratamiento o profilaxis de enfermedades/trastornos que no responden a NO también están dentro del alcance de la invención. En un aspecto, la invención provee un método para tratar o prevenir la enfermedad o trastorno vascular administrando a un sujeto que necesita del mismo una bebida que comprende (-) -catequina, en donde el sujeto es un ser humano o un animal veterinario. La (-) -catequina puede estar presente en la bebida como un compuesto monomérico o como una unidad monomérico constituyente de un compuesto oligomérico de la fórmula En como se definió en la presente y/o de un compuesto obtenido mediante tratamiento térmico un compuesto oligomérico de la fórmula An como se definió en la presente. Normalmente, la bebida es una bebida que contiene cacao o chocolate o una bebida con sabor a cacao o chocolate. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno que responde a NO en un mamífero, tal como un ser humano o un animal veterinario, administrando una cantidad efectiva del compuesto de la invención. En aún otro aspecto, se proveen los métodos para formar los compuestos descritos en la presente. En otro aspecto, la invención se refiere a un polvo de cacao con alto CP parcialmente desgrasado o completamente desgrasado, procesado térmicamente el cual comprende oligómeros de (±) -catequina y (±) -epicatequina y procianidina de los mismos, que tiene un contenido de CP total de por lo menos 15 miligramos por gramo del polvo desgrasado, y que tiene un perfil de CLAR monomérico y oligomérico alterado comparado con un polvo de cacao con alto contenido de CP que no se ha procesado térmicamente. También se refiere a extractos de cacao con alto contenido de CP térmicamente procesado, secos o líquidos que tienen un contenido de CP total de por lo menos 175 miligramos por gramo del extracto de cacao seco y también tiene perfiles alterados comparado con los extractos de cacao que no se han procesado térmicamente. En aún otro aspecto, la invención se refiere a productos de cacao térmicamente procesados tales como bebidas de cacao que tiene un perfil alterado comparado con los productos de cacao que no se han procesado térmicamente. Los productos contienen ingredientes de cacao con alto contenido de CP tal como polvo de cacao, extracto de cacao líquido o seco, y/o licor de chocolate. Cuando el producto es un producto con baja humedad, el producto contiene por lo menos aproximadamente 6 miligramos de polifenoles de cacao total por gramo del producto contiene por lo menos aproximadamente 6 miligramos de polifenoles de cacao total por gramo del producto. Preferiblemente, el producto tiene una relación de epicatequina a catequina de 1 a más de 1. Cuando el producto es un producto con alto contenido de humedad tal como una bebida, el producto contiene por lo menos aproximadamente 0.2 miligramos de polifenoles de cacao total por gramo del producto . El polvo de cacao con alto contenido de CP, los extractos de cacao con alto contenido de CP, y productos de cacao con alto contenido de CP con los perfiles alterados se prepararon calentando una dispersión acuosa de polvo de cacao parcial o completamente desgrasado o un extracto de cacao seco preparado de los granos de cacao no fermentados o sub-fermentado. Preferiblemente los ingredientes de cacao se calientan aproximadamente de 30° a alrededor de 200 °C durante un tiempo y a u pH suficiente para epimerizar la (-)-epicatequina, v.gr., de aproximadamente 0.5 minutos a varios días. Preferiblemente se calientan de aproximadamente 72 °C a alrededor de 160 °C durante aproximadamente 1 minuto a alrededor de 6.0 horas. Más preferiblemente, se calientan a alrededor de 100° a aproximadamente 140°C durante aproximadamente 1 minuto a alrededor de 4 horas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 represente datos de NP-CLAR-MS para Bebida de Cacao A y el polvo de cacao usado para preparar la bebida. La Figura 2 representa datos de NP-CLAR-MS para.

Bebida de Cacao B y el polvo de cacao usado para preparar la bebida. La Figura 3 representa los datos de RP-CLAR-MS para polvo de cacao usado para preparar la Bebida de Cacao A, y EIC para monómeros, dímeros y trímeros. La Figura 4 representa datos de RP-CLAR-MS para Bebida de Cacao A y EIC para monómeros, dímeros, y trímeros. La Figura 5 representa datos de RP-CLAR-MS para polvo de cacao usados para preparar Bebida de Cacao B y EIC para monómeros, dímeros y trímeros.

La Figura 6 representa datos de RP-CLAR-MS para polvo de cacao usado para preparar la Bebida de Cacao B y EIC para monómeros, dímeros y trímeros. La Figura 7 representa un esquema de una fraccionación guiada por bioensayos de Bebida de Cacao A. La Figura 8 representa un relajamiento dependiente de dosis mediada por los compuestos de prueba en los anillos aórticos previamente contraidos. La Figura 9 representa un efecto de fracciones de Bebida de Cacao A en anillos aórticos contraídos. La Figura 10 representa datos de NP-CLAR/FDL para el polvo de cacao con alto CP no cocido. La Figura 11 representa datos de NP-CLAR/FLD para el polvo de cacao con alto contenido de CP cocido. Las Figuras 12 A a D representan datos de NP- CLAR/FLD para polvo de cacao con alto contenido de CP durante 30 minutos, 7.75 horas, y 24 horas. La Figura 13 representa datos de CLAR para la fracción monomérica aislada del polvo de cacao con alto contenido de CP cocidos. Las Figuras 14 A a D representan datos de RP-CLAR para dímero de B2 epimerizado sintético (A) , polvo de cacao con alto Contenido de CP no cocido (B) , polvo de cacao con alto contenido de CP cocido (C) , y polvo de cacao con alto contenido de CP cocido en espigas (D) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las patentes, solicitudes de patentes y referencias citadas en esta solicitud se incorporan aquí por referencia. En el caso de cualquier inconsistencia, dirige la presente descripción. La invención se refiere a flavanoles tratados térmicamente (monómeros) y procianidinas (oligómeros), y/o epímeros de flavanoles y procianidina, composiciones que comprenden dichos compuestos y métodos de tratamiento y profilaxis de enfermedades o trastornos que no responden a NO. De acuerdo con la nomenclatura más reciente y como se usa en la presente, el término "flavanol" se refiere a monómeros, v.gr., catequina y epicatequina. Los oligómeros de catequina y epicatequina se denominan como procianidinas. Sin embargo, para los fines de la presente descripción, estos términos pueden usarse intercambiablemene. Además, ninguna referencia a polifenol en la presente deberá entenderse de aplicarse también a flavanoles y procianidinas, en combinación o individualmente. La presente invención se refiere a un primer compuesto, y una composición que comprende una cantidad efectiva del primer compuesto obtenido por, o que puede obtenerse por, tratamiento térmico de un segundo compuesto que tiene la siguiente fórmula An, o una sal farmacéuticamente aceptable o un derivado el mismo (v.gr., productos de oxidación, derivados metilados, derivados glucuronidados) : en donde N es un número entero de 2 a 18; R y X tiene cada uno estereoquímica a o ß; R es OH, O-azúcar o O-galato; los sustituyentes de C-4, C-6 y C-8 son X, Z, e Y, respectivamente y unión de unidades monoméricas se presenta en C-4, C-6 o C-8; en donde cualquiera de C-4, C-6 o C-8 no se unen a otra unidad monomérica, cada X, Y, o Z es un hidrógeno o un azúcar; el azúcar es sustituido opcionalmente con una porción fenólica en cualquier posición, por ejemplo, vía una unión de ester.

Como se usa en la presente, las frases "compuesto obtenido por tratamiento térmico", "compuesto obtenible por tratamiento térmico", o "compuesto tratado térmicamente" significa que el compuesto fue/se expone a calor suficiente durante un período suficiente en presencia de agua para ocasionar alteraciones en la estructura y/o función química del compuesto. Mientras es inferior la temperatura, mayor es la exposición requerida para ocasionar los cambios. Por ejemplo, los cambios pueden aumentarse al máximo incrementando la temperatura de calentamiento de la temperatura ambiente hasta 140 °C, incrementando el pH de aproximadamente 3.8 hasta aproximadamente 7, y/o incrementando el tiempo de calor. Con el fin de alcanzar el equilibrio se deberá incrementar la temperatura y/o el pH. Dichas temperaturas y tiempos pueden ser por lo menos a 40°C, más preferiblemente a por lo menos 50°C, durante por lo menos 10 horas, más preferiblemente por lo menos 24 horas, o más preferiblemente por lo menos 48 horas; o por lo menos 60°C, por lo menos 70°C, por lo menos 80°C, por lo menos 90°C, por lo menos 100°C, por lo menos 110°C, o por lo menos 120°C, cada uno de por lo menos cinco, o or lo menos 10, 15 o 20 minutos. Otro ejemplo de tratamiento térmico se describió en el Ejemplo 1. Otras combinaciones de temperatura/tiempo/pH también son efectivos y el artesano experto puede determinar los mismos sin la experimentación indebida usando la guía provista en la presente. Técnica conocidas, dichos análisis de CLAR/MS pueden usarse para monitorear los cambios del compuesto como se describió por ejemplo en el Ejemplo 1. Las unidades monoméricas en la fórmula anterior pueden unirse vía 4?6 y las ligaduras de 4?8. Los oligómeros con ligaduras exclusivas (4?8) son lineales; mientras la presencia de por lo menos una unión (4?6) da como resultado un oligómero ramificado. También dentro del alcance de la invención hay oligómeros tratados térmicamente que comprenden por lo menos una ligadura no natural (6?6) , (6?8) y (8?8). Los oligómeros que tienen dichas ligaduras pueden prepararse como se describió en la Patente de E.U.A. No. 6,156,912, incorporada aquí por referencia. El azúcar puede seleccionarse del grupo que consiste de glucosa, galactosa, ramnosa, xilosa, y arabinosa. El azúcar preferiblemente es un monosacárido o disacárido. La porción fenólica se selecciona del grupo que consiste de ácidos cafeico, cinámico, cumárico, ferúlico, gálico, hidroxibenzoico y sinapico. Ejemplos de derivados incluyen esteres, productos de oxidación, derivados metilados y producto sglucuronidados . Los productos de oxidación pueden prepararse como se describió en la Pat. de E.U.A. No. 5,554,645, las porciones relevantes de la cual se incorporan aquí por referencia. Los esteres, por ejemplo esteres con ácido gálico, pueden prepararse usando reacciones de esterificación conocidas y por ejemplo como se describió en la Patente de E.U.A. No. 6,420,572, la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia. Los derivados metilados tales como derivados de 3 O-metilo, O-metilo 3' O, 4'0-dimetilo pueden prepararse por ejemplo, como se describió en Cren-Olive y otros, 2002, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 821-830. Los productos glucuronidados pueden prepararse como se describió en Yu y otros, "A novel and efective procedure for the preparation of glucuronides" . Organic Letters, 2(16) (2000) 2539-41 and Spencer, y otros, 2001, Free Radical Biol. Med. 31(9), 1139-46. La descripción anterior que se refiere a ligaduras, azúcares, porciones fenólicas, y derivados, se aplica a todos los compuestos descritos en la presente y para brevedad, no se repite. Haciendo referencia a cualquier compuesto de la fórmula An o En descrito en la presente, los ejemplos de dichos compuestos son aquellos en donde el número entero n es de 3 a 18; de 2 a 12; de 3 a 12; de 2 a 5; de 4 a 12; de 5 a 12; de 3 a 10; de 4 a 10; o de 5 a 10. También dentro del alcance de la invención es el compuesto An o En en donde n es 2. En una modalidad, la invención se refiere a un primer compuesto y la composición que comprende una cantidad efectiva del primer compuesto, obtenido por, u que puede obtenerse por, tratamiento térmico de un segundo compuesto que tiene la fórmula An, o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma (incluyendo productos de oxidación, derivados metilados, derivados glucuronidados) : en donde n es un número entero de 2 a 18; R y X tiene cada uno OÍ O ß estereoquímica; R es OH; los sustituyentes de C-4, C-6 y C-8 son X, Z, e Y, respectivamente y la unión de unidades monoméricas se presenta en C-4, C-6 y C-8. en donde cada C-4, C-6 o C-8 no se unen a otra unidad monomérica X, Y, y Z son hidrógeno. En ciertas modalidades, el compuesto es un dímero o trímero de procianidina es decir, n=2, o n=3, en la fórmula An„ Las unidades monoméricas de dicho dímero o trímero antes del tratamiento térmico puede ser (-) -epicatequina. Los ejemplos de dichos dímeros son (-) -epicatequina- (4ß?8) -(-) -epicatequina y (-) -epicatequina- (4ß?6) -(-) -epicatequina. El dímero trímero u otros oligómeros usados para el tratamiento térmico pueden aislarse y purificarse o prepararse sintéticamente como se sabe en la materia, o puede tratarse como una mezcla con, por ejemplo, flavanoles y/u otras procianidas. Dicha mezcla, por ejemplo, puede ser un extracto de plantas (v.gr., extracto de cacao), un dímero y otra fracción de oligómeros aislada de una fuente de planta (v.gr., cacao), un ingrediente de cacao tal como polvo de cacao. El extracto de cacao se preparar, por ejemplo, como se describió en la Patente de E.U.A. No. 5,554,645, los polvos de cacao pueden prepararse como se sabe en la materia, y Ios-polvos de cacao que tienen niveles conservados de flavanoles/procianidinas, pueden prepararse como se describió en la Patente de E.U.A. No. 6,015,913. Cuando los dímeros individuales purificados, mezclas de dímeros o compuestos sintéticos se usan para tratamiento térmico, el grado de su pureza puede ser, por ejemplo, por lo menos de aproximadamente 50%, o por lo menos de aproximadamente 60%, o por lo menos de aproximadamente 70%, o por lo menos de aproximadamente 80%, o por lo menos de 90%, o por lo menos de 92% o por lo menos aproximadamente de 95%, o por lo menos aproximadamente de 98%, o por lo menos aproximadamente de 99%. Los grados de pureza anteriores pueden usarse para cualquier compuesto de la fórmula An, sus sales y derivados descritos en la presente. También dentro del alcance de la invención están los dímeros descritos en el Ejemplo 1, véase v.gr., Figura 4, y composiciones que comprenden dichos dímeros, por ejemplo, una bebida tal como bebida de cacao o chocolate. Haciendo referencia a la Figura 4, el Cromatograma de Iones Extraídos (CIÉ) para el ion pseudo molecular de 5877 m/z representa dímeros detectados en la bebida procesada. Los tiempos de elusión para los nuevos dímeros son 12.6, 14.5 (pico más grande), 16.9, 18.8 y 22.6 minutos. El método de CLAR usado para efectuar la separación anterior fue el siguiente: Fase estacionaria: Hypersil ODS 100 x 4.6 mm tamaño de partícula 5µm Fase móvil A: 0.1% HOAc en agua Fase móvil B: 0.1% HOAc en MeOH Régimen de flujo: 1.9 ml/min Gradiente Tiempo %B 0 15 20 25 30 75 45 100 También dentro del alcance de la invención hay (+)-catequinas y (-) -epicatequinas tratadas térmicamente y sus derivados (excepto derivados galados) , y composiciones que comprenden dichos flavanoles, por ejemplo, una bebida tal como una bebida de cacao o chocolate. La presente invención se refiere a un compuesto, y una composición que comprende una cantidad efectiva del compuesto, que tiene la siguiente fórmula En, o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma (incluyendo productos de oxidación, derivados metilados, derivados glucuronidados) : n es un número entero de 2 a 18; R y X tiene cada uno a o ß esteroquímica, R es OH, O-azúcar o O-galato; Los sustituyentes de C-4, C-6 y C-8 son X, Z e Y, respectivamente, y la unión de unidades monoméricas ocurre a C-4, C-6 o C-8; en donde cualquiera de -4, C-6 o C-8 no están unidos a otra unidad monomérica, cada X, Y o Z es un hidrógeno o un azúcar; el azúcar es opcionalmente sustituido con una porción fenólica en cualquier posición, por ejemplo, vía una ligadura de ester; y Por lo menos una de las unidades monoméricas tiene la siguiente fórmula: Las uniuduei nionunitü- cii) en a rórmula anterior pueden unirse vía ligaduras descritas antes para los compuestos de la fórmula An. Los azúcares, porciones fenólicas y derivados son como se describió antes para los compuestos de la fórmula An. En otra modalidad, la invención se refiere a un compuesto, y la composición que comprende una cantidad efectiva del compuesto, que tiene la fórmula En, o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma (incluyendo productos de oxidación, derivados metilados, derivaos glucuronidados) : en donde n es un número entero de 2 a 18; R y X tiene cada uno estereoquímica ya sea a o ß; R es OH; los sustituyentes de C-4, C-6 y C-8 son X, Z e Y, respectivamente, y la unión de las unidades monoméricas ocurre en C-4, C-6 o C-8; cuando cualquiera de C-4, C-6 o C-8 no se unen a otra unidad monomérica, X, Y y Z son hidrógeno; y por lo menos una de las unidades monoméricas tiene la siguiente fórmula: Los ejemplos de los compuestos de la Fórmula En son aquellas en donde el número entero n es de 3 a 18; de 2 a 12; de 3 a 12; de 2 a 5; de 4 a 12; de 5 a 12; de 4 a 10; o de 5 a 10. En algunas modalidades, el compuesto es un dímero o trímero de procianidina con por lo menos una unidad monomérica en una forma de epímero. En ciertas modalidades el compuesto En es un dímero o trímero, es decir, n = 2, n = 3. Por ejemplo, la presente invención se refiere a un compuesto y una composición que comprende una cantidad efectiva del compuesto, que tiene la siguiente fórmula En o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma (incluyendo los productos de oxidación, derivados metilados, derivados flucuronidados) : en donde n es 2; R y X tiene cada uno estereoquímica ya sea OÍ O ß; R es OH, O azúcar u O galato; los sustituyentes de C-4, C-6 y C-8 son X, Z e Y, respectivamente, y la unión de las unidades monoméricas ocurre en C-4, C-6 o C-8; cuando cualquiera de C-4, C-6 o C-8 no se unen a otra unidad monomérica, X, Y y Z son hidrógeno o azúcar; el azúcar es opcionalmente sustituido con una porción fenólica en cualquier posición, por ejemplo, vái una ligadura de ester; y por lo menos una de las unidades monoméricas es (-) -catequina. En otro ejemplo, la invención se refiere a un compuesto y la composición que comprende una cantidad efectiva del compuesto, que tiene la fórmula En, o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma (incluyendo productos de oxidación, derivados metilados, derivados glucuronidados) : en donde n es 2; R y X tiene cada uno estereoquímica ya sea a o ß; R es OH; los sustituyentes de C-4, C-6 y C-8 son X, Z e Y, respectivamente, y la unión de las unidades monoméricas ocurre en C-4, C-6 o C-8; cuando cualquiera de C-4, C-6 o C-8 no se unen a otra unidad monomérica, X, Y y Z son hidrógeno; y por lo menos una de las unidades monoméricas es (-) -catequina. Como se sabe en la materia, los epímeros son diaesteroisómeros que tienen la configuración opuesta en solo uno de los dos o más centros estereogénicos tetrahédricos, por ejemplo en uno de dos o más átomos de carbón asimétricos. Con respecto al tipo de compuestos descritos en la presente, un epímero ha invertido configuración esteroquímica en uno de los centros de carbono asimétricos C-2 y C-3. Como se usa en la presente, el término epímero se aplica a un compuesto que tiene una invención en el átomo de carbono en el anillo de C-2 tal como la configuración estereoquímica en el átomo de carbono de C-2 es beta. Los flavanoles y procianidinas presentes en la naturaleza normalmente tienen estereoquímica alfa en el átomo de carbono C-2. La invención también abarca los epímeros de carbono 2 (C-2) de flavanoles (+) -catequina y (-) -epicatequina, es decir, (+) -epicatequina y (-) -catequina, y sus derivados (v.gr., derivados metilados, derivados glucuronidados y productos de oxidación excepto derivados galados) y composiciones que comprenden estos compuestos.

Métodos de Uso Cualquier compuesto y/o composición descritos en la presente pueden usarse para practicar los métodos descritos en la presente solicitud. Como se usa en la presente, "enfermedad o trastorno vascular" se refiere a cualquier enfermedad o trastorno que afecta el sistema vascular, incluyendo el corazón y el cerebro. Los ejemplos de dichas condiciones incluyen aterosclerosis, trombosis, hipertensión (v.gr., hipertensión primaria, secundaria y pulmonar) , enfermedad cardiovascular (ECV) , enfermedad de arterias coronarias (EAC) (incluyendo isquemia al miocardio, infarto al miocardio, angina estable e inestable, oclusión o restenosis aguda) , diabetes (tipo I y tipo II) (v.gr., complicaciones vasculares de diabetes), disfunción cognitiva o trastorno y/o trastornos de circulación vascular (incluyendo aquellos del cerebro), ataque al corazón, enfermedad cerebrovascular (incluyendo apoplejía, ataque isquémico temporal inicial y/o recurrente, o complicaciones isquémicas v.gr., después de angioplastía coronaria o intervención coronaria percutánea) , falla cardíaca congestiva, falla de riñones, enfermedad renal; enfermedades y/o trastornos asociados con vasoconstricción de vasos sanguíneos periféricos (v.gr., vasos sanguíneos localizados en brazos y pierna) tal como enfermedad vascular periférica y más específicamente enfermedad de Raynaud, enfermedad arterial periférica (EAP) , claudicación intermitente, vasculitis (v.gr., de vasos sanguíneos pequeños) , vasoespa-smo, trombosis venosa, insuficiencia venosa, insuficiencia linfática, isquemia de miembros aguda, ateroembolismo e isquemia de extremidades inferiores. Una "enfermedad o trastorno que responde a NO" se refiere a una condición de salud que responde al tratamiento con NO. Ejemplos de dichas condiciones incluyen, pero no están limitados a enfermedades y trastornos mediadas por NO o dependientes de NO, en las cuales la patología de la enfermedad/trastorno se ocasiona por funcionamiento anormal de la ruta de NO. Por ejemplo, las condiciones incluyen hipertensión (v.gr., hipertensión primaria, secundaria y .pulmonar) , enfermedad cardiovascular, enfermedad de las arterias coronarias, diabetes (tipo I y tipo II) (v.gr. complicaciones vasculares de diabetes) , anemia drepanocítica, disfunción o trastorno cognitiva y/o trastornos de circulación vascular (incluyendo aquellos del cerebro) , ataque cardíaco, apoplejía, falla cardiaca congestiva, falla de riñon, y enfermedad renal. Debido a que la presión sanguínea alta incrementa el riesgo de ataque cardíaco, apoplejía, falla cardiaca congestiva, y falla de riñon, se pueden usar los compuestos descritos antes que ocasionan vasorelaj amiento, solos o en combinación con otros agentes protectores vasculares (incluyendo cardiovascular), para evitar estas condiciones. Los sujetos particularmente adecuados incluyen sujetos con alta presión en combinación con diabetes, obesidad, perfil de lípidos adverso (v.gr., altos niveles de colesterol) y/o fumadores, en cuyos pacientes se incrementa varias veces el riesgo de ataque al corazón y apoplejía. Generalmente, cualquier sujeto que tiene por lo menos un factor de riesgo de enfermedad cardiovascular (como se reconoce por la Asociación Americana del Corazón) puede tratarse como se describió en la presente. Como se usa en la presente, "tratamiento" significa mejorar una condición médica existente, tal como enfermedad cardiovascular, por ejemplo, desacelerando la progresión de la enfermedad, prolongando la supervivencia, reduciendo el riesgo de enfermedad y/o proporcionando una mejora que puede medirse de parámetros de enfermedad. El término "prevenir" significa reducir los riesgos asociados con el desarrollo de una enfermedad, incluyendo reducir el inicio de la enfermedad. Como se usa en la presente, los términos "protector vascular o agente terapéutico" se refiere a un agente diferente a un compuesto de la invención en la cual es efectivo tratar o proteger el sistema vascular. Ejemplos de dichos agentes son agentes de terapia antiplaquetas (v.gr., inhibidores de COX, tales como aspirina) ; agentes moduladores de NO, agentes reductores de colesterol (v.gr., esterol, estanol) . Por lo tanto, la invención se refiere a (i) un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno vascular, o (ii) un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno que responde a NO, o (iii) un método de terapia contra plaquetas administrando a un sujeto que necesita del mismo una cantidad efectiva de cualquier compuesto descrito en la presente (v.gr, el compuesto de la fórmula An o En o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma (incluyendo los productos de oxidación, derivados metilados y derivados glucuronidados) . Por ejemplo, los métodos anteriores pueden practicarse por la administración de cualquier compuesto de la fórmula An o En o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma (incluyendo productos de oxidación, derivados metilados y derivados glucuronidados) . Por ejemplo, los métodos anteriores pueden practicarse administrando cualquier compuesto de la fórmula An, en donde n es 2. Los compuestos de la presente también son adecuados para usarse en terapia en combinación con otros agentes vasculares/cardioprotectores y/o moduladores de NO. Ejemplos de dichos agentes serán evidentes para las personas expertas en la materia y pueden incluir procianidinas tipo B así como procianidinas del tipo A. Dichos compuestos pueden administrarse mezclados con los compuestos de la invención o por separado. Las procianidinas del tipo A puede tener un origen natural o estar preparados sintéticamente. Por ejemplo, las procianidinas del tipo A pueden aislarse de piel de cacahuate como se describió en Lou y otros, Phytochemistry, 51: 297-308 (1999), o Karchesy y Hemingway, J. Agrie. Food Chem., 34: 966-970 81986) , las porciones relevantes de cada uno siendo incorporados aquí por referencia. Otras fuentes de los compuestos anteriores y arándanos como se describió, por ejemplo en Foo y otros, J. Nat. Prod., 163: 1225-1228, y en Prior y otros, J. Agricultural Food Chem., 49(3): 1270-76 (2001), las porciones relevantes de cada uno siendo incorporadas aquí por referencia y Ecdysanthera utilis (Lie-Chwen y otros, J. Nat. Prod., 65:505-8 (2002)) y Aesculus hippocastanun (Patente de E.U.A. No. 4,863,956), las porciones relevantes de cada uno siendo incorporadas aquí por referencia. Los compuestos del tipo A también pueden obtenerse de procianidinas tipo B vía oxidación usando radicales 1, l-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) bajo condiciones neutras como se describió en Kondo y otros, Tetrahedron Lett. 41: 485 (2000), las porciones relevantes de las cuales se incorporan aquí por referencia. Los métodos para obtener procianidinas tipo B naturales y sintéticas son bien conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,670,390 de Romanczyk y otros; 6,207,842 de Romanczyk y otros; 6,420,572 de Romanczyk y otros; y 6,156,912 de Romanczyk y otros. Los métodos de la invención se pueden usar en un ser humano o en un animal veterinario, tal como un perro, un gato y un caballo. Por o tanto, los siguientes usos están dentro del alcance de la invención. El uso de cualquier compuesto descrito en la presente o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma en la manufactura de un medicamento, alimento, suplemento nutritivo o dietético para usarse para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno vascular; (ii) tratar o prevenir una enfermedad que responde a NO; o (iii) como terapia antiplaquetas. Todas las condiciones específicas recitadas en la presente están dentro del alcance de dichos usos . La cantidad efectiva para usarse en los métodos anteriores pueden determinarse por una persona con experiencia en la materia usando la guía provista en la presente y reconocimiento general en la materia. Por ejemplo, la cantidad efectiva puede ser tal que se logre una concentración fisiológicamente relevante en el cuerpo (v.gr., sangre) de un mamífero. Dicha concentración fisiológicamente relevante puede ser por lo menos 20 nanomolar (nM) , preferiblemente por lo menos aproximadamente 100 y más preferiblemente por lo menos 500 nM. En una modalidad, se logra por lo menos un micromol en la sangre del mamífero, tal como un ser humano. Los compuestos de la fórmula An como se definió en la presente puede administrarse de aproximadamente 50 mg/día a alrededor de 1000 mg/día, preferiblemente de aproximadamente 100-150 mg/día a alrededor de 900 mg/día, y aún más preferiblemente de aproximadamente 300 mg/día a alrededor de 500 mg/día. Sin embargo, se pueden usar las cantidades superiores a las establecidas antes. Los compuestos pueden administrarse agudamente, o el tratamiento/administración preventiva puede continuar como un régimen, es decir, durante un tiempo efectivo, v.gr., diariamente, mensualmente, bimestralmente, bianualmente, anualmente o en algún otro régimen, como se determina por el practicante médico experto durante el tiempo que sea necesario. La administración puede continuar durante por lo menos un tiempo requerido para exhibir efectos terapéuticos/profilácticos. Preferiblemente, la composición se administra diariamente, más preferiblemente dos o tres veces al día, por ejemplo, en la mañana y en la tarde para mantener los niveles del compuesto efectivo en el cuerpo del mamífero. Para obtener los resultados más benéficos, la composición se puede administrar durante por lo menos aproximadamente 30, o por lo menos aproximadamente 60 días. Estos regímenes pueden repetirse periódicamente. Basado en la guía provista en la presente y reconocimiento general en la materia, una persona experta en la materia puede seleccionar compuestos que son adecuados para administración aguda y/o crónica. Por ejemplo, los compuestos que muestran el efecto después de la administración de una sola dosis y/o brevemente después de la administración (v.gr., dos horas después de la administración) se puede usar cuando se requiere respuesta aguda rápida. Los compuestos que muestran efecto después de la administración repetida consecuentemente pueden usarse. Por lo tanto, las formas de dosis adaptadas para dicha administración (v.gr., aguda o crónica) están dentro del alcance de la invención.

También dentro del alcance de la invención son análisis para determinar una cantidad de dosis terapéuticamente requerida mínima o una cantidad de dosis óptima para usarse en los métodos terapéuticos anteriores. Se pueden usar los métodos descritos en los ejemplos o cualquier otro método de respuesta de dosis conocidas por predecir la efectividad del compuesto para tratar la enfermedad o trastorno recitada en la presente. Las formas de dosis adaptadas para suministrar por o menos una cantidad terapéuticamente efectiva mínima, o una cantidad óptima, están dentro del alcance de la invención.

Composiciones y Formulaciones La invención se refiere a composiciones descritas en la presente que pueden formularse como farmacéuticos, alimentos, aditivos alimenticios o suplementos dietéticos. Como se usa en la presente, un "farmacéutico" es un fármaco medicinal. Véase Merriam Webster 's Collegiate Dictionary, 10a. Edición, 1993. Un farmacéutico también se denomina como un medicamento. Como se usa en la presente, un "suplemento dietético" es un producto (diferente al del tabaco) que se pretende que suplemente la dieta que porta o contiene uno o mas de los siguientes ingredientes dietéticos: una vitamina, un mineral, una hierba u otro botánico, un aminoácido, una sustancia dietética para usarse por el hombre para suplementar la dieta incrementando el consumo diario total, o un concentrado, metabolito, constituyente, extracto o combinación de estos ingredientes. Un "alimento" es material que contiene proteína, carbohidrato y/o grasa, la cual se usa en el cuerpo de un organismo para sostener el recipiente, preparación y procesos vitales y para proporcionar energía. Los alimentos también pueden contener sustancias suplementarias tales como minerales, vitaminas y condimentos. Véase Merriam-Webster ' s Collegiate Dictionary, 10a. Edición, 1993. El termino alimento incluye una bebida adaptada para consumo humano o animal. Un "aditivo alimenticio" es como se definió por la FDA en 21 C.F.R. 170.3 (e) (1) e incluye aditivos directos o indirectos. Las composiciones pueden contener un vehículo, un diluyente, o un excipiente. Dependiendo del uso pretendido, el vehículo, diluyente o excipiente puede elegirse para ser adecuado para el ser humano o uso veterinario, alimento, aditivo, suplemento uso farmacéutico. Las composiciones opcionalmente pueden contener un agente para tratar cáncer y/o un agente terapéutico cardiovascular adicionales. Las composiciones se pueden co-administrar o administrar secuencialmente con dicho agente adicional que toma en cuenta los factores como edad, sexo, peso, genética y condición del sujeto o paciente particular, y, la ruta de administración.

Ejemplos de composiciones de la invención para uso humano o veterinario incluyen composiciones comestibles para administración oral, dichas formulaciones sólidas o líquidas, por ejemplo, cápsulas, tabletas, pildoras y similares, así como formulaciones sólidas masticables o en bebida, (v.gr., composiciones sólidas o líquidas con sabor a cacao o chocolate) ; preparaciones líquidas para administración en orificios, v.gr., oral, nasa, anal, vaginal, etc., tal como suspensiones, jarabes o elíxires (incluyendo composiciones como sabor a cacao o chocolate) ; y, preparaciones para administración parental, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (v.gr, administración inyectable) tal como suspensiones o emulsiones estériles. Sin embargo, el ingrediente activo en las composiciones puede formar complejos con proteínas tal como cuando se administran en el torrente sanguíneo, puede ocurrir la formación de coágulos debido a la precipitación de proteínas sanguíneas; y, el experto podría tomar eso en cuenta. En dichas composiciones, el extracto de cacao activo puede mezclarse con un vehículo, diluyente, o excipiente adecuado tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, DMSO, etanol o similares. Los compuestos de la invención se pueden preparar tratando térmicamente compuestos derivados de diferentes fuentes, por ejemplo, procianidinas de origen natural (v.gr., el género Theobroma, género Herrania) o aquellos preparados sintéticamente . Los métodos para preparar el material de partida (flavanoles y procianidinas) para usarse en la presente invención son bien conocidos en la materia (v.gr., Patentes de E.U.A. Nos. 5,554,645; 6,420,572; 6,156,912; 6,476,214; y 6,864,377, las porciones relevantes de las cuales se incorporan aquí por referencia. Los polifenoles pueden ser de origen natural, por ejemplo, de un grano de cacao a otra fuente natural de polifenoles, o de polifenoles preparados sintéticamente. Una persona experta en la materia puede seleccionar polifenol natural o basado en disponibilidad o costo. Los derivados de flavanol y/o procianidina también pueden ser útiles como un material de partida. Estos incluyen esteres de monómeros y oligómeros tales como esteres de galato (v.gr., galato de epicatequina y galato de catequina); los compuestos derivados con una porción de sacáridos tales como porción de mono o disacáridos (v.gr., ß-D-glucosa) , por ejemplo, en las posiciones X, Y, y/o Z en las fórmulas anteriores; los monómeros y oligómeros glicosilados, y mezclas de los mismos; los metabolitos de los monómeros y oligómeros de procianidina, tales como formas sulfatadas, glucuronidadas y metiladas excepto por los productos de separación de enzimas de procianidinas generadas por metabolismo de microflora colónica. Los derivados pueden ser de fuentes naturales o pueden prepararse sintéticamente. Los compuestos de la invención se pueden preparar mediante tratamiento térmico (en una solución acusa) de flavanoles, procianidinas o sus derivados teniendo estereoquímica alta, en el átomo de C-2 para ocasionar rotación alrededor del átomo de C2 dando como resultando la estereoquímica beta en el átomo de C-2. Este enfoque es particularmente adecuado para preparar epímeros de flavanoles, por ejemplo, epímeros de (-) -epicatequina y (+)-catequina. La preparación de epímeros de flavanoles pueden llevarse a cabo de acuerdo con el siguiente esquema 1 (y como se describió en Freudenberg, K. y Purrmann, L. (1924). Raumisomere Catechin IV. Liebi ' s Annalen, 437, 472-85; Fredengerg, K., Bohme, L., y Purrmann, L. (1922). Raumisomere Catechin II. Ber. Dscht. Chem. Ges., 55, 1734-47, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia) : Esquema 1. Epimerización de flavan-3-oles a C-2 en medio acuoso (Freudenberg y otros, 1992; Freunberg y 1924) . (+) -catequina, [2R, 3S]* (+) -epicatequina, [2R, 3S] principalmente (ent-epicatequina] (+) -epicatequina, [2R, 3S]* (+) -catequina, [2R, 3S] principalmente (ent-catequina] + se sabe que se presenta en cacao Mientras sea más baja la temperatura, más larga será la exposición requerida para ocasionar epimerización.

Por ejemplo, dichas temperatura y tiempos pueden ser de por lo menos 40°C, más preferiblemente por lo menos 50°C, por lo menos 10 horas, más preferiblemente por lo menos 24 horas, o más preferiblemente por lo menos 48 horas; o por lo menos 60°C, por lo menos 70°C, por lo menos 80°C, por lo menos 90°C, por lo menos 100°C, por lo menos 110°C, o por lo menos 120°C, cada uno durante por lo menos cinco, o por lo menos 10, 15, o 20 minutos. Por ejemplo, el compuesto puede tratarse a 120°C durante 10 minutos, o 120° durante 20 minutos. Otras combinaciones de temperatura/tiempo también son efectivas y el experto puede determinarlo sin experimentación indebida usando reconocimiento general en la materia y se proveen lineamientos en la presente. Las técnicas conocidas, tales como análisis de CLAR/MS se pueden usar para monitorear el éxito de la reacción. Los compuestos epiméricos pueden. prepararse tratando térmicamente compuestos derivados de diferentes fuentes, por ejemplo procianidinas de origen natural (v.gr., género Theobroma, género Herrania) o aquellos preparados sintéticamente (obtenidos como se sabe bien en la materia, véase v.gr., Patentes de E.U.A. Nos. 5,554,645, 6,420,572, 6,156,912, 6,476,241, 6,864,377) o comprando flavanoles de fuentes comerciales. Los epímeros de procianidinas pueden prepararse de acuerdo con los métodos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,420,572; 6,156,912; 6,476,241; y 6,864,377; y Publicación de Solicitud Internacional WO 04/030440 (las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia) usando epímeros de flavanoles como bloques de construcción de partida. Por ejemplo, los siguientes bloques de construcción se pueden usar en la síntesis de epímeros de procianidina: Los epímeros de procianidina que tienen una ligadura de 4ß-8 (tales como aquellos descritos en la Tabla 1) pueden prepararse de acuerdo con el siguiente esquema (los pasos de bencilación, hidroxietoxilación, acoplamiento, y de bencilación son como se describió en las patente de E.U.A. recitados antes) . Dependiendo de los bloques de construcción de partida, el enfoque puede tomarse para prepara varias combinaciones de procianidinas epiméricas.

Paso 1 (-) -epicatequina Tetra-O-bencil- (+) -epicatequina Paso 2 bencil- Tetra- 4-hidroxietoxi-O-bencil- (+) -epicatequina Paso 3 4-hidroxietoxi tetra-O-bencil- ( + ) - epicatequina Paso 4 Tetra-O-bencil- {+) -epicatequina- (4ß, 8) -tetra-O-bencil- (-) - (+) -epicatequina- (4ß, 8] epicatequina epicatequina Una persona experta en la materia preverá otros métodos para formar los compuestos de la invención usando el reconocimiento en la materia y la guía en la presente. Los alimentos que comprenden los compuestos descritos en la presente, y opcionalmente otro agente protector cardio/vascular pueden adaptarse para uso humano y veterinario e incluyen alimentos para mascotas. Los alimentos pueden ser un alimento con bajo contenido de humedad tales como dulces, o un alimento con alto contenido de humedad tal como una bebida de cacao. Normalmente, los alimentos incluyen hasta 25% de una proteína, preferiblemente de 5-20%, más preferiblemente de 1-15 hasta 60% de grasa, preferiblemente de 1 a 50%, más preferiblemente de 5-45%, y hasta 70% de un carbohidrato, preferiblemente 1-60%, aún más preferiblemente de 5-50%. Algunos alimentos no siempre contendrán proteínas, grasa y carbohidratos. La actividad del agua del alimento es de aproximadamente de 0.2-0.95, preferiblemente de 0.4 a alrededor de 0.85. El alimento puede ser un dulce tal como una norma de identidad (NDI) y chocolate sin NDI, tal como leche, chocolate dulce o semidulce, incluyendo chocolate oscuro, chocolate con bajo contenido de grasas y un caramelo que puede ser un caramelo cubierto con chocolate. Otros ejemplos incluyen un producto horneado (v.gr., pastel de chocolate, bocadillo horneado, galleta, tostada) un condimento, una barra de granóla, un chicloso de caramelo, una barra de reemplazo de alimento, un untable, un jarabe, una mezcla de bebida en polvo, una bebida con sabor a cacao o chocolate, un pudín, una torta de arroz, una mezcla de arroz, una salsa de sabor y similares. Si se desea, los alimentos pueden ser con sabor a chocolate o cacao. Los productos alimenticios pueden ser chocolates y barras de dulces, tales como barras de granóla, que contienen frutos secos, por ejemplo, cacahuates, nueces, almendras y avellanas. Una bebida, tal como una bebida de cacao, que comprende (-) -catequinas y/o dímeros descritos en la presente también está dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, la bebida puede comprender más (-) -catequina que (-)-epicatequina, v.gr., la relación de (-) -epicatequina a (-)-catequina puede ser de por lo menos 1:2 o por lo menos 1:3.

Ingredientes de Cacao Los ingredientes de cacao procesados térmicamente se usan en los productos alimenticios con alto CP. Cuando los productos son un producto con bajo contenido de humedad, contienen por lo menos aproximadamente 6 miligramos, preferiblemente aproximadamente 8, y más preferiblemente aproximadamente 10 miligramos de polifenoles de cacao por gramo del producto y la relación de epicatequina a catequina en el producto es de 1 a más de 1. Preferiblemente contienen por . lo menos aproximadamente 10 miligramos, más preferiblemente aproximadamente 12, y aún más preferiblemente aproximadamente 14 miligramos de polifenoles de cacao por gramo de producto, y la relación de epicatequina a catequina en el producto es de 1.0 a más de 0.66. Más preferiblemente contienen por lo menos aproximadamente 12 miligramos, más preferiblemente aproximadamente 14, y aún más preferiblemente aproximadamente 16 miligramos de polifenoles de cacao por gramo del producto y la relación de epicatequina a catequina en el producto es de 1.0 a más de 0.54. Aún más preferiblemente, contienen por lo menos aproximadamente 13 miligramos, más preferiblemente aproximadamente 15, y aún más preferiblemente aproximadamente 17 miligramos de polifenoles de cacao por gramo del producto y la relación de epicatequina a catequina en el producto es de 1.0 a más de 0.42. Los ingredientes de cacao con alto CP incluyen polvos de cacao con alto contenido de CP térmicamente procesados, parcialmente desgrasados o completamente desgrasados, que comprenden (±) -catequina y (±) -epicatequina, y oligómeros de procianidina de los mismos, que tienen un contenido de CP total de por lo menos aproximadamente 25 miligramos, preferiblemente de aproximadamente 12 a alrededor de 25 miligramos de polifenoles de cacao por gramo del polvo de cacao desgrasado. Cuando los productos tienen alimentos con alto contenido de humedad tal como una bebida, contienen por lo menos aproximadamente 0.2, preferiblemente de 0.2 a 0.4, o aún más preferiblemente de 0.4 a 0.8, o todavía más preferiblemente de 0.8 a 1.2 miligramos de polifenoles de cacao total por gramo del producto. Como con los alimentos con bajo contenido de humedad, el contenido de epicatequina a catequina de los alimentos con alto contenido de humedad varía dependiendo del contenido de polifenol de cacao del producto. Normalmente, los productos que contienen de aproximadamente 0.2 a alrededor de 0.4 miligramos tienen una relación de 1 a más de 1, los productos que contienen de aproximadamente 0.8 a alrededor de 1.2 miligramos tienen una relación de aproximadamente 1 a alrededor de 0.54, y los productos que contiene de aproximadamente 1 a más de 1.2 miligramos a alrededor de 0.66 tienen una relación de aproximadamente 1 a alrededor de 0.66. Los ingredientes también incluyen extractos de cacao con alto CP procesado térmicamente, secos o líquidos, que tienen un contenido de CP total de por lo menos aproximadamente 200 miligramos, preferiblemente de aproximadamente 250 a alrededor de 500, más preferiblemente de aproximadamente 350 a alrededor de 500, por gramo del extracto de cacao seco. Los extractos también tienen perfiles alterados comparados con extractos de cacao que no se han procesado térmicamente. Los ingredientes también incluyen productos de cacao procesados térmicamente tales como bebidas de cacao que tienen un perfil alterado comparado con productos de cacao que no se han procesado térmicamente. Los productos contienen ingredientes de cacao con alto CP tales como polvo de cacao y/o extracto de cacao líquido o seco y/o licor de chocolate. Cuando lo productos tienen un producto con alto contenido de humedad tal como una bebida, los productos contienen por lo menos aproximadamente 0.2 miligramos de polifenoles de cacao total por gramo de producto. Preferiblemente, el contenido de polifenol de cacao es de 0.2 a 5 miligramos, más preferiblemente de aproximadamente 0.6 a alrededor de 2.0 miligramos, más preferiblemente de aproximadamente 0.6 a alrededor de 2.0 miligramos . En este polvo de cacao, extracto de cacao, y productos de cacao con alto contenido de CP, la cantidad total de epicatequina y catequina sustancialmente no se cambia por el proceso térmico pero las relaciones de (+)-catequina a (-) -catequina se cambia de 90:10 a 4:95 para los sólidos de cacao y de 90:10 a 34:66 para el extracto de cacao. De manera interesante, la relación de (-) -epicatequina a (+) -epicatequina no cambia o solo ligeramente cambiado por el proceso térmico. El polvo de cacao con alto contenido de CP, extractos de cacao con alto contenido de CP y productos de cacao con alto contenido de CP con los perfiles alterados se prepararon calentando una dispersión acuosa de polvo de cacao parcial o completamente desgrasado o cacao seco, preferiblemente preparado de granos de cacao no fermentados o sub-fermentados. Los ingredientes de cacao o productos de cacao se calientan durante un tiempo y a un pH y temperatura suficientes para epimerizar la (-) -epicatequina. Normalmente, los ingredientes o productos se calientan de aproximadamente 3.8 a alrededor de 8 y de aproximadamente 37° a alrededor de 200°C durante aproximadamente 0,5 minutos a varios díaas. Preferiblemente se calientan de aproximadamente pH 5 a alrededor de pH 7.5 de aproximadamente 72° a alrededor de 160 °C durante aproximadamente 1 minuto a alrededor de 6 horas. Más preferiblemente se calientan de aproximadamente pH 6 a alrededor de pH 7.4 y de aproximadamente 100 | a alrededor de 140°C durante aproximadamente 1 a alrededor de 4 horas. Los ingredientes también incluyen licor de chocolate procesado térmicamente. El licor de chocolate contiene por lo menos aproximadamente 10 miligramos de polifenoles de cacao por gramo de licor de cacao desgrasado, preferiblemente de aproximadamente 20 a alrededor de 50 miligramos, más preferiblemente de aproximadamente 13 a alrededor de 17 miligramos. Los fármacos que contienen los compuestos de la invención, opcionalmente en combinación con otro agente de modulación de NO o agente terapéutico cardio/vascular, puede administrarse en una variedad de formas tales como oralmente, sublingualmente, bucalmente, nasalmente, rectalmente, intravenosamente, parenteralmente y tópicamente. Una persona con experiencia en la materia podrá determinar un modo adecuado de administración para aumentar al máximo el suministro del compuesto de la fórmula An, y opcionalmente otro agente protector cardio/vascular. Por lo tanto, las formas de dosis adaptadas para cada tipo de administración dentro del alcance de la invención e incluyen formas de dosis sólidas, líquidas y semisólidas, tales como tabletas, capsulas, cápsulas de gelatina (gelcaps) , polvos o granulos en volumen o dosis unitarias, emulsiones, suspensiones, pastas, cremas, geles, espumas o gelatinas. Las formas de dosis de liberación sostenida también están dentro del alcance de la invención. Los vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados, se conocen generalmente en la materia y pueden determinarse fácilmente por alguien experto en la ametría. La tableta, por ejemplo puede comprender una cantidad efectiva de la composición que contiene polifenol y opcionalmente un vehículo, tal como sorbitol, lactosa, celulosa o fosfato de dicalcio. El suplemento dietético que contiene flavanol y/o procianidina de cacao, y (opcionalmente otro agente de modulación de NO, o terapéutico cardio/vascular) , puede prepararse usando métodos conocidos en la materia y puede comprender, por ejemplo, nutriente tal como fosfato de dicalcio, estearato de magnesio, nitrato de calcio, vitaminas y minerales. Además, dentro del alcance de la invención es un articulo de manufactura tal como un producto empacado que comprende la composición de la invención (v.gr., un alimento, un suplemento dietético, un fármaco) y una etiqueta indicando la presencia de los compuestos de la invención y/o dirige el uso de la composición para tratar problemas cardio/vasculares, o como terapias preventivas descritas en la presente. La etiqueta y/o instrucciones de uso pueden referirse a cualquiera de los métodos de uso descritos en esta solicitud. La invención también se refiere a métodos para fabricar el artículo de manufactura que comprende cualquiera de las composiciones descritas en la presente, empacando la composición para obtener un artículo de manufactura e instruyendo, dirigiendo o promoviendo el uso de la composición/artículo de manufactura para cualquiera de los usos descritos en la presente. Dicha instrucción, dirección o promoción incluye publicidad. También dentro del alcance de la invención hay un artículo de manufactura (tal como un producto o quipo empacado) adaptado para usarse en combinación con terapia comprendiendo por lo menos un compuesto de la invención y por lo menos un agente quimioterapéutico y/o cardio/vascular adicional (es decir, diferente al compuesto de la invención) , cuyo agente quimioterapéutico y/o cardio/vascular puede proveerse como una composición separada, en un recipiente separado, o mezclado con el compuesto de la invención. Los siguientes procedimientos se usaron para la preparación y prueba de los productos con CP alto.

Preparación de Muestras En el Ejemplo 1, las bebidas se secaron por congelación y se extrajeron dos veces con una mezcla de acetona/agua/ácido acético (CH2COCH3:H20:HOAc, 79.5:20:0.51), tratado con sonido durante 15 minutos a 50°C, centrifugado durante 6 minutos a 35000 rpm. Los solventes se recuperaron de los sobrenadantes recopilados bajo presión reducida o bajo vacío y secado por congelación. El material resultante se usó para el análisis de CLAR de fases. En los Ejemplos 3 y 4, la preparación de muestras, para las bebidas de cacao se modificó para adaptar mejor el análisis de productos con alto contenido de humedad. La preparación de la muestra consistió de tomar 32-25 gramos de la bebida y transferirla cuantitativamente a un matraz volumétrico agregando 0.5 ml de ácido acético glacial y agregando acetona. Este enfoque da una solución que es comparable con el solvente de extracción usado con otras muestras de cacao que consistió de 70:29.5:0.5-acetona: agua: ácido acético (v/v/v). Las muestras de bebidas no se desgrasaron antes del análisis. El agua de la bebida se uso para constituir la porción acuosa del solvente de extracción. Cromatografía de Fase Normal - Análisis de CLAR/MS - Método de Adamson y otros. Para el Ejemplo 1, se usó el método de CLAR de fase normal publicado de Adamson y otros (J. Agrie. Food, Chem., 1999, 47 págs. 4184-4186). Las condiciones fueron las siguientes : a) Columna Sílice Phenomenex Lichrosphere Tamaño: 25cm x 4.6mm Tamaño de partícula: 5 mieras Tamaño de poro: 100 Angstroms b) Fase Móvil: A. Cloruro de Metileno B. Metanol C. Agua: Ácido Acético (1:1) Condiciones de Gradiente: Inicial: 82% A/ 14% B/ 4% C Tiempo = 30 mins. 67.6% A/ 28.4% B/ 4% C Tiempo = 50 mins. 53.2% A/ 42.8% B/ 4% C Tiempo = 51 mins. 10% A/ 86% B/ 4% C Tiempo = 56 mins. 82% A/ 14% B/ 4% C Re-equilibrio - 7 minutos c) Régimen de Flujo: 1.0 mil/min d) Temperatura de columna.37 °C e) Volumen de Inyección: 5.0 microlitros f) Detección: Fluorescencia: longitud de onda de excitación de 276 nm: Longitud de onda de onda-316 nm Cromatografía de Fase Normal - Método de Diol Para los otros ejemplos, la cromatografía de fase normal empleada fue un método libre de halógeno denominado generalmente como el método de DIOL. El método se describió en "Hagih Performance liquid Chromatography Separation and Purification of Cacao (Theobroma cacao L.) Procyanidins According to Degree of Polymerization Using a Diol Stationary Phase" por M.A. Kelm, y otros, (J. Agr. & Food Chem. 2006 Mar 8; 54 (5) : 1571-6) . Las Condiciones fueron las siguientes: Método de CLAR de Fase Normal analítica Nombre: CPDI0L-3.M Columna: Intersil Diol 250x4.6mm Fase Móvil A 98.2 acetonitrilo: ácido acético Fase Móvil B 95:3:2 metanol: H20: ácido acético Régimen de Flujo: Gradiente Tiempo (min) %B 0 0 35 40 45 40 46 100 50 100 La columna usada fue una Develosil diol de 5µ e.d., de 250 x 4.6 mm (Phenmenex, Torrance, CA) . La fase móvil binaria consistió de (A) CH3CN:HOAc, (98:2, v/v) y (B) CH3OH:H20:HOAc (95:3:2). Las separaciones se efectuaron por un gradiente lineal a 30°C con un régimen de flujo de 1.0 ml/min de la siguiente manera: 0-35 min, 0-40% B; 35-45 min, 40% B isocrático; 45-46 min, 40-0%B, 4 min mantenido a 0%B. El eluyente se monitoreó por detección de fluorescencia con excitación a 276 nm y emisión a 316 nm..

Cromatografia Liquida de Alta presión ¿1© Fase Inversa - Método C18 Un instrumento de CL Agilent 1100 se acopló con dispositivo con de fotodiodo, detector de fluorescencia, y MS de cuatro polos se usó para la separación y detección de los monómeros y procianidinas, así como la determinación de relaciones de epicatequina a catequina en los granos de cacao no fermentados, extractos de cacao, polvo de cacao no cocidos y cocidos, y la bebida de cacao. Se empleó una columna de Hypersil ODS (C18, 100 x 4.6 mm, 5 µm) . La fase móvil consistió de A (ácido acético al 1% en agua) y B (0.1% de ácido acético en metanol) usando gradientes lineales de 10.25% B (v/v) durante 20 min seguido por un incremento al 100 % B durante 10 min y hasta 100 % B durante 10 min. El régimen de flujo se ajustó a 1.0 l/min. La columna sobre temperatura se ajustó a 20°C. El detector de UV se ajustó a 280 nm para registrar la intensidad del pico, y los espectros de UV se registraron de 200 a 600 nm. La técnica de ionización se electro roció (ESI) y los datos del espectro de masa se adquirieron en modo de iones negativos. Para el trabajo cuantitativo, se establecieron curvas de calibración usando esta cromatografía y detección de FLD. El eluyente se monitoreó por detección de fluorescencia con excitación a 276 nm y emisión a 316 nm.

Cromatografía de líquidos a Alta Presión (CLARP) Preparativa - Método de Diol Un método de CLAR preparativo se usó para el aislamiento físico de las fracciones monoméricas y diméricas del Ejemplo 5. El proceso mejorado para separar y eluir monómeros de flavan-3-oles y/o oligómeros de procianidina individuales comprende los paso de (A) introducir una muestra líquida que contiene los monómeros y/o oligómeros en una columna de cromatografía de líquidos empacada con una fase estacionaria de diol unida de manera polar; (B) separar los monómeros individuales y/u oligómeros basados en el grado de polimerización , pasando las fases A y B móviles binarias a través .de la columna; y (C) eluyendo fracciones individuales que contienen las fracciones monoméricas y diméricas. La fase estacionaria tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 3 µm a alrededor de 10 µm. Se usó una columna de diol preparativa con las siguientes condiciones ligeramente modificadas : Columna: Devosil 100DIOL-10 Régimen de Flujo: 55 ml/min Composición gradiente: Tiempo (min) %B 0 0 35 30 40 80 41 0 50 0 EJEMPLOS Ejemplo 1: Investigación de LCMS de química de procianidina de bebidas de cacao y prueba de fracciones de bebidas en análisis de anillo aórtico. El ejemplo describe Análisis de Espectrometría de Masa de Cromatografía de líquidos (EMCL) de dos bebidas de cacao (Preparadas de acuerdo con diferentes procesos) y sus polvos de cacao respectivos. Las diferencias cualitativas con la particular atención prestada a los monómeros, dímeros y trímeros se evaluaron en las diferentes muestras. El análisis de anillo aórtico se usó para identificar fracciones/compuestos funcionales usando extractos de bebidas como un material de partida. Se prepararon dos bebidas de acuerdo con los siguientes procesos.

El polvo de cacao con alto contenido de polifenol preparado de acuerdo con un método descrito en la Patente de E.U.A. No. 6,015,913 de Kealey y otros, se usó para la preparación de ambas bebidas. Los perfiles de CLAP representativos de los polvos de cacao, y sus fracciones de monómero, dímero y trímero, se muestran en las Figuras 1, 2, 3, y 5. La Bebida de Cacao A se preparó de la siguiente manera: (i) el polvo de cacao se mezcló con agua a 80°C durante 20 minutos (este paso reaviva cualquier espora restante en el polvo y permite su destrucción durante UHT) ; (ii) la mezcla se sometió a tratamiento de UHT a la temperatura de 140°C durante el período de 6-7 segundos; (iii) la mezcla se empacó en un recipiente a 85 ml y se sometió para retortear a la temperatura del agua máxima de 115°C durante 10 minutos (tratamiento total de 19 minutos), y la presión máxima de 2.6 bars. La rotación se aplicó p ara ayudar a la transferencia de calor. Se puede usar cualquier variación del proceso que puede lograr los efectos funcionales y/o estructurales descritos en la presente. La Bebida de Cacao B se preparó de la siguiente manera. El polvo de cacao de con alto contenido de polifenol, polvo de leche, azúcar, grosores, emulsificantes, mezcla de vitaminas, sabor de vainilla y agua embotellada (a 22°C) se combinaron y mezclaron a temperatura ambiente, se homogeneizaron usando bomba de alta presión , se trataron con UHT (160°C durante 15 segundos) y se empacaron asépticamente. El equipo ilustrativo para usarse en la preparación de esta bebida incluye una licuadora Breddo (Divison of American Ingredients Co., Kansas City, Missouri) con tubería de conexión a través de una bomba de desplazamiento positivo Waukesha y la mezcladora Silverson 275/400 (Silverson Machines Ltd., Waterside, Chesham Bucks, Inglaterra). La bebida resultante contuvo aproximadamente 170 mg de flavanoles y procianidinas. Los extractos de ambas bebidas y sus polvos de cacao respectivos se prepararon como se muestra en la Figura 7. En resumen, las bebidas se secaron por congelación y se extrajeron dos veces con una mezcla de acetona/agua/ácido acético (CH3COCH3: H20:HOAc, 79.5:20:0.5=, se trataron con sonido durante 15 minutos a 50°C, se centrifugaron durante 6 minutos a 3500 rpm, y los solventes se removieron de los sobrenadantes recuperados bajo presión reducida o bajo ácido, y se secaron por congelación. El material resultante se usó para análisis de CLAP.

Resultados de EMCL Los extractos de cada una de las bebidas y sus polvos de cacao respectivos se sometieron a estudios de EMCL de NP y RP. Los cromatogramas de CLAR de NP de las muestras probadas se representaron en las Figuras 1 y 2. Haciendo referencia a la Figura 1, el cromatograma de CLAR-NP de Bebida A de Cacao difirieron significativamente del observado para el polvo de cacao del cual se preparó la bebida. Mientras el polvo de cacao contuvo agrupaciones discretas de monómeros a través de los decámeros (Figura 1, panel superior), el cromatograma de CLAP-NP de Bebida A de Cacao contuvo la mayoría de los monómeros a través de los trímeros (Figura 1, panel inferior) . Por lo tanto, en la Bebida A de Cacao, las áreas pico para la epicatequina y catequina se invirtieron en comparación con su polvo de cacao, es decir, Bebida A de Cacao contuvieron más catequina que epicatequina en contraste al polvo de cacao que contuvo más epicatequina que catequina. Normalmente, en el polvo de cacao, la relación de (-)-epicatequina para (+) -catequina es de aproximadamente 9:1. En contraste, la relación de epicatequina a catequina observadas en la Bebida A de Cacao fue de aproximadamente 1:3, y una separación quiral indicó que la mayoría de catequina tuvo la forma de (-) -catequina, una relación de (+) -catequina a (-)-catequina fue en el orden de 1:44. No se observó (+)-epicatequina. Haciendo referencia a la Figura 2, la Bebida B de Cacao también contuvo más catequina que el polvo de cacao del cual se prepararon, sin embargo, la relación de epicatequina a catequina observada en la Bebida B de Cacao fue de aproximadamente 1:1. Las diferencias en dímeros también son muy evidentes. Los cromatogramas de iones extraídos (CIÉ) mostrados en las Figuras 1 y 2, soportan la identidad de estos picos como dímeros (m/z 577) . Los CIÉ (Figuras 3 y 5) de polvos de cacao usados en preparación de Bebidas A y B de Cacao muestran dímeros normales presentes en cacao (dímeros B2 y B5) . Haciendo referencia a la Figura 4 y 6, el pico para el dímero B5 tiene todo pero desapareció en basa bebidas. Sin embargo, y de la manera más importante, la Bebida de Cacao A contuvo un número de dímeros (~4-5) no encontrados en el material de partida de cacao (Figura 4). Más notoriamente, un pico más grande a 14.5 min cuyo patrón de fragmentación (no representado) concuerda con otros dímeros de tipo B. La Bebida de Cacao B también contuvo picos de dímero adicionales aunque más pequeños.

Resultados de Análisis de Anillo Aórtico Los extractos de Bebida A de Cacao se sometieron a la fraccionación guiada por bionanálisis como se muestra por diagrama en el Esquema 1. Las fracciones 96A-96E se probaron como se describió más adelante. Se obtuvieron cinco fracciones (9A-9E) de la fracción bioactiva 96E usando CLAR RP preparativa y espera el análisis. Las fracciones 9A, 9B, 9C, 9D y 9E se han caracterizado tentativamente por EMCL por estar compuestas de no procianidina/trímero tipo B/dímero tipo A, trímero tipo B (principal) /tetrámero tipo B (trazas), dímero tipo B (principal)/ trímero tipo B (traza), dímero tipo B/trímero tipo B y trímero tipo B respectivamente. Los cultivos de anillos aórticos se obtuvieron como se describió previamente en Karim M., McCormik K., Kappagoda CT., "Effects of Cacao procyanidins on Endothelium Dependent Relaxation", Journal of Nutrition 2000; 130: 2105S-2108S. Después de que los anillos se montaron en 10 ml de solución reguladora de Krebs oxigenada, y se dejó estabilizar, los anillos primero se contrajeron previamente con norepinefrina (10-6 M) luego la viabilidad del endotelio se probó usando acetilcolina (10~6 M) . Los anillos se lavaron luego y se dejaron regresar a la tensión de la línea de base. Una vez en la línea de base, los anillos se contrajeron de nuevo con norepinefrina (10~6 M) . Cuando la contracción alcanzó un estado en reposo, se les dio catalasa a los anillos (400 U / ml) , y después de un período adicional de estabilización, se agregaron las concentraciones acumulativas de los compuestos de prueba (10 µg/ml a 500 µm/ml) . Dos anillos separados también se probaron como un control de tiempo (acetilcolina, 10~9 M a 10"4 M) y como un control de vehículo (etanol o DMSO) . Cuando es apropiado, el efecto de éster metílico de N"?-nitro-L-arginina (L-NAME) , un inhibidor de nOS, se agregó (10~5 M) antes de la adición de catalasa y el compuesto de prueba. También, se desnudaron los anillos de selección de endotelio antes de la adición de los compeustos de prueba, con el fin de probar el relajamiento que depende de enotelio. El relajamiento de los anillos aórticos se midió como una disminución en tensión (g) , y se expresó porco un porcentaje de la respuesta de contracción a norepinefrina. Todas las concentraciones de fármacos se expresaron con la concentración final en la solución reguladora de baño de tejido. Los datos de grupo se expresaron como ± SEM de n experimentos . La acetilcolina logró su relajamiento máximo a 10"6 M* DMSO no produjo una repuesta de' relajamiento a concentraciones superiores (800 - 1000 µl de 50% o 100% de DMSO) ; estas son concentraciones que están asociadas con las dosis de 400 µg/ml y 500 µg/ml de los compuestos de prueba. Todos los compuestos de prueba produjeron una respuesta de relajamiento a 500 µg/l (n=l) que estuvo a un grado similar o menor que el control de vehículo correspondiente, como resultado, el relajamiento observado con los compuestos de prueba a esta dosis se consideró que no producía respuesta Para concentraciones que varían de 10 µg/ml a 300 µg/ml, no se observó relajamiento importante con el 50% o 100% de DMSO (n=2) del control del vehículo. En el resto de los experimentos (n=2), los compuestos de prueba se formaron en 50% de etanol. No se observó respuesta de relajamiento cuando los recipientes tuvieron equivalentes del 50% de etanol como un control de vehículo. Los siguientes resultados incluyen un experimento con los compuestos de prueba formados del 50% de DMSO y dos experimentos con 50% etanol: solo MK-1312-96E produjo una respuesta de relajamiento máxima importante (33.5% ± 3.0, n = 3; p<0.05, ANOVA, con corrección de Bonferroni) a la concentración de baño final de 200 µg/ml. No hubo diferencia importante entre la respuesta de relajamiento máxima de MK-1312-95E y la respuesta de relajamiento máxima de acetilcolina (prueba t de estudiante) . MK-1312-6D pareció producir una respuesta de relajamiento (20.3 % ± 8.7, n = 3) a la concentración de baño de 200 µg/ml, pero este efecto no fue estadísticamente importante. MK-1312-96A (el compuesto se disolvió en 100% de DMSO) , MK-1312-96B, y MK-1312-96C no respondió. Se eliminaron todas las respuestas de relajamiento a estos compuestos, o se inhibieron significativamente cuando al vaso se le desprendió el endotelio o se le dio L-NAME antes de la adición al compuesto de prueba. En conclusión, MK-1312-96E puede producir respuestas de relajamiento que dependen del endotelio en este modelo in vitro capaz de función de endotelio aguda que es medid a través de óxido nítrico. El bioanálisis descrito antes y proceso de fraccionación se repitieron hasta que se aisló un compuesto o compuestos activos puros. RMN y MS se usaron para lograr elucidación estructural de los compuestos bioactivos. jemplo 2 : Investigación de EMCL de química de procianidina en polvo de cacao parcialmente desgrasado con alto CP. Un polvo de cacao con alto CP (50 g) se suspendió en 500 ml de agua desionizada (pH 5.3) en un matraz de fondo redondo de 1 1 equipado con un condensador enfriado con agua. Se usó un manto de calor como la fuente de calor y la mezcla se calentó a reflujo. Se tomaron muestras a 30 min, 7.75 horas, y 24 horas. La traza de CLAP/EFL de fase normal del polvo de cacao con alto CP no cocinado original se muestra en la Figura 10. La separación fue con el método de diol. La Figura 11 muestra la traza de CLAP de fase normal para el polvo de cacao con alto contenido de CP cocinado (Método de Adamson, y otros). Las Figuras 12A a D muestran las trazas antes de cocerse y después de cocerse 3 minutos, 7.75 horas y 24 horas. El contenido de CP total del polvo de cacao con alto contenido de CP antes de cualquier procesamiento fue de ~57 mg/g o ~6%. El contenido de CP se midió usando un sistema de medición cromatográfica normal doméstico. Los polifenoles medidos incluyendo el monómero a través del decámero. Una vez cocinado, el contenido de CP total se redujo a 30 mg/g. El contenido de monómero determinado a partir de estos datos muestra que fue de 13.79 mg/g de monómeros presentes en el polvo de cacao con alto CP no cocido (1.4% de monómero por masa) y que la cantidad de monómero no se cambió después de cocinado, la cantidad siendo de 15.8 mg/g (1.6% por masa). También se realizó la cuantificación usando CLAP-FI de fase inversa (C18). Las curvas de calibración se establecieron con normales auténticas. Las cantidades de monómeros para el polvo de cacao con alto CP no cocidos fue realmente concordante con las cantidades determinadas bajo condiciones de fase normal. Como un control, la fracción monomérica se aisló del polvo de cacao con alto CP cocido usando una columna de diol preparativa. El análisis de fase inversa de la fracción purificada aislada del polvo de cacao con alto CP cocido mostró una traza limpia de epicatequina y catequina. El contenido de catequina y epicatequina en polvo de cacao con alto CP no cocido y cocido se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1 Catequina Epicatequina Monómeros Monómeros (mg/mL] (mg/mL) totales basados (mg/mL) en masa de muestra CP Alto 1.70x10 -3 1.01x10-3 1.18x10" 1.14% polvo de cacao 3.13x10" 1.21x10-2 1.52x10 -2 1.52% CP alto 9.86x10" 3.12x10-3 1.30x10" 1.27% cocinado polvo de 8.18x10" 4.8x10-3 1.30x10 -2 1.27% cacao Fracción 0.323 0.176 0.500 50% monomérica Aislada de polvo de cacao de CP alto cocinado Ejemplo 3 : Investigación de relación de epicatequina a catequina La relación de epicatequina a catequina se midió usando metodología de CLAP de C18. Los diferentes productos de cacao probados incluyeron granos de cacao no fermentados, dos extractos de cado con alto CP, polvo de cacao con alto CP no cocido y cocido y Bebida de Cacao A. El Extracto de Cacao A se preparó extrayendo granos de cacao no fermentados con etanol acuoso (25% agua/75% etanol, V/v) . El Extracto de Cacao B se preparó extrayendo granos de cacao no fermentados con acetona acuosa (agua al 20%/acetona al 80%, v/v) . Las relaciones se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Producto de Cacao Epicatequina : catequina Basada en 100 Granos de cacao 95:5 subfermentado Extracto A de cacao 96:4 Extracto B de cacao 90:10 Polvo de cacao con alto 79:21 contenido de CP no cocido Polvo de cacao con alto 33:67 contenido de CP cocido Bebida de cacao A 35:65 En los productos que no se han procesado térmicamente, v.gr., los extractos de cacao, el contenido de epicatequina es mayor que el contenido de catequina, lo cual concuerda con lo que se observó en granos de cacao no fermentados. Para el polvo de cacao con alto CP, la relación de epicatequina a catequina es de 79:21. Para las muestras altamente procesadas, tales como Bebida A de Cacao y el polvo de cacao con alto CP cocido, se alcanza una relación de epicatequina a catequina de ~35:65. Es el equilibro termodinámico de estos dos diaesterómeros para la reacción de epimerización (la catequina naturalmente es la forma más estable) . Por lo tanto, el grade de procesamiento provee alguna dentro del grado de conversión de epicatequina a catequina. Con el menor o ningún procesamiento, la relación de epicatequina a catequina es de ~95:5. Con más procesamiento, particularmente el procesamiento a alta temperatura, la relación cambia a ~80:20 como con el polvo de cacao de alto CP no cocido. Con alto procesamiento, la relación alcanza el punto de equilibrio.

Ejemplo 4 : Investigación de Contenido Quiral Con el fin de determinar la relación de estereoisómeros, se realizó la cromatografía quiral. La relación de (+/-) -catequina se obtuvo bajo un conjunto de condiciones cromatográficas y la de la (+/-) -epicatequina se obtuvieron bajo un grupo diferente de condiciones cromatográficas . La epicatequina y catequina observada en varias muestras de cacao además se analizaron para acumulación estereoquímica. El contenido quiral se proveyó en la Tabla 3.

Tabla 3 Producto de Cacao (-)/(+) -Epicatequina (+)/(-) -Cat equ Granos de cacao subf ermentado 100 : 0 90 : 10 Extracto A de cacao 100 : 0 39 : 61 Extracto B de cacao 100 : 0 34 : 66 Polvo de cacao con alto contenido 100 : 0 13 : 87 de CP no cocido Polvo de cacao con alto contenido 95:5 4:96 de CP cocido La catequina es un componente menor en el grano de cacao y la relación presente en la naturaleza de (+)-catequina a (-) -catequina es de 90:10. Para catequina, la forma predominante en el grano es (+) -catequina. En los dos extractos de cacao la relación cambia a aproximadamente 40:60 (+/-) -catequina lo cual difiere de datos de grano de cacao -hay un incremento en presencia de (-) -estereoisómero. Presumiblemente, la fuente de (-) -catequina es la conversión de (-) -epicatequina a (-) -catequina dado que la conversión es estereoespecífica. El proceso adicional mejora la conversión hasta que la forma predominante es (-) -catequina. El proceso mejora el contenido de (-) -catequina hasta que se vuelve el estereoisómero predominante en las muestras de cacao altamente procesadas tales como Bebida A de Cacao. Esto concuerda con la reacción de conversión esperada dado que (-) -catequina se genera por la conversión de (-) -epicatequina bajo las condiciones del proceso de calor usadas para preparar una Bebida A de Cacao. (-) -epicatequina es el único isómero observado en los materiales procesados en menor parte. El estereoisómero, (+) -epicatequina se observa en cantidades muy pequeñas en las muestras de cacao altamente procesadas. Esto concuerda con el hecho de que se espera que la (+) -epicaequina se genera de la (+) -catequina y que la (+) -epicatequina es el esteroisómero menos estable. Con el fin de determinar la relación de estereoisómeros, se realizó la cromatografía quiral. La relación de (+/-) -epicatequina se obtuvieron bajo un grupo diferente de condiciones cromatográficas.

Los resultados muestran que los cuatro estereoisómeros existen en varias cantidades en los materiales procesados, es decir, el polvo de cacao con alto CP cocido y Bebida A de Cacao. jemplo 5 : Aislamiento de monómeros y dimeros Un total de 1.02 g de polvo de cacao con alto CP se disolvió en 15 ml de 75:25 (acetonitrilo:ácido acético 99:1) : (metanol: agua: ácido acético 95:4:1), se centrifugó durante 5 minutos a 3500 rpm, y se filtró con un filtro de 0.45 µm. Se realizaron varias operaciones de CLAP para purificar el polvo de cacao cocido (Operación 2: inyección de 2.0 ml, Operación 2: inyección de 5.0 ml, Operación 3: inyección de 5.0 ml, y operación 4: inyección de 4.0 ml) . Todos los picos monoméricos que se eluyeron a -12.4 minutos y picos diméricos que eluyeron a ~27.5 minutos se combinaron, se evaporaron bajo presión reducida, y liofilizaron. Los rendimientos de monómeros y dímeros fueron de 6 mg y 4 mg, respectivamente. La Figura 13 muestra las trazas para la fracción monomérica aislada del polvo de cacao con alto CP cocido.

Ejemplo 6 : Comparación de polvo de cacao con alto CP no cocido, el polvo de cacao con alto CO cocido y dimero de (-) -epicatequina- (4ß-8 (-) -catequina sintética Menos de 1 g de dímero de (-) -epicatequina- (4ß, 8)-(-) -catequina sintética, se disolvió en una mezcla que contiene 10% de etanol y 0.1% de ácido acético en agua desionizada. El dímero es un dímero de epímero de dímero de B2 presente en la naturaleza, es decir, (-) -epicatequina- (4ß, 8) - (-) -epicatequina. Un total de 0.3 g del polvo de cacao con alto CP cocido se disolvió en 2 m de una mezcla que contiene 0% de etanol y 0.1% de ácido acético en agua desionizada, tratada con sonido durante 5 minutos, se centrifugó durante 5 minutos a 4500 rpm y se filtró con un filtro de 45 µm. Una muestra de 200 µ se tomó entonces para análisis de CL/MS. Un total de 0.3 g de polvo de cacao con alto CP cocido se disolvió en 2 ml de una mezcla que contiene 10% de etanol y 0.1% de ácido acético en agua desionizada, se trató con sonido durante 5 minutos, se centrifugó durante 5 minutos a 45000 rpm, y se filtró con un filtro de 45 µm. Se tomó una muestra de 200 µl y se agregó <1 mg de (-) -epicatequina- (4ß, 8) -(-) -catequina sintética. Un total de 0.33 g de polvo de cacao con alto CP no cocido se disolvió en 2 ml de una mezcla que contiene 10% de etanol y 0.1% de ácido acético en agua desionizada, tratada con sonido durante 5 minutos, centrifugada durante 5 minutos a 4500 rpm y filtrada con un filtro de 45 µm. Una muestra de 200 µl se tomó para análisis de CL/MS. Los ajustes de MSD fueron en modo iónico: API-ES, Modo: Barrido, Polaridad: Negativa, Rango de Masa: 100-1500, Fragmentos: 70, Umbral: 150, Tamaño de Pasos: 0.20, Voltaje Capilar: 3000, Fase de secado 10 l/min, Presión de Nebulizador 3.5 kg/cm2, Temperatura de gas de secado: 345°C. El análisis de CLAR mostró que la región dimérica sufrió alteraciones importantes. Véase Figuras 14A a 14D. El tiempo de retención bajo estas condiciones para el dímero B2 fue de 12.7 min, para el dímero B5 fue de 24.5 min. y para el dímero de B2 epimerizado fue de 6.8 min, para el dímero de B5 fue de 24.5 min, y para el dímero epimerizado B2 fue de 6.8 min. Las Figuras 14A a D muestran trazas para la separación de fase inversa de dímero de B2 epimerizado sintético (A) , el polvo de cacao con alto CP no cocido (D) . El polvo de cacao con alto CP cocido muestra que casi ya no hay dímero B5, que el dímero B2 aún está presente y que un nuevo dímero con un tiempo de retención de ~6.8 minutos está presente. Hablando de la muestra con el dímero B2 epimerizado sintético mostró un incremento en el área del mismo pico (véase Figura 14D) . La fracción del dímero se aisló del polvo de cacao con alto CP cocido usando una columna de diol preparativa. La traza de CLAR-FI/DFL y MS (modo de monitoreo de un solo ion m/z = 577) de esta fracción purificada mostró que los monómeros, como se esperaba, no estaban presentes. Sin embargo, claramente se muestran nuevos dímeros. Los nuevos dímeros tienen tiempos de retención que no concuerdan con B2, B5 y B2 epimerizado bajo estas condiciones cromatográficas. Considerando que los epímeros posibles de los dímeros de B2 y B5 incluyen un total de seis isómeros adicionales, es posible que los nuevos dímeros sean epímeros de los dímeros de B2 y B5 normalmente presentes en cacao. Mientras que la invención se ha descrito con respecto a ciertas modalidades específicas, se apreciará que se pueden hacer muchas modificaciones y cambios por los expertos en la materia sin alejarse de la invención. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones anexas cubran dichas modificaciones y cambios dado que pueden estar dentro del espíritu y alance real de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1.- Un proceso térmico, el polvo de cacao desgrasado parcial o completamente que tiene un contenido total de polifenol de cacao de por lo menos 25 miligramos por gramo de polvo de cacao desgrasado, en donde los polifenoles de cacao comprenden (±) -catequina, (±) -epicatequina y oligómeros de procianidina de los mismos, caracterizados por un perfil monomérico alterado donde la relación de epicatequina a catequina es de aproximadamente 1 a más de alrededor de 1.

2.- El polvo de cacao de la reivindicación 1, en donde el contenido total de polifenol de cacao es aproximadamente de 20 a alrededor de 50 miligramos por gramo y en donde la relación es mas de aproximadamente 1 a alrededor de 0.42.

3.- Un licor de chocolate procesado térmicamente, que tiene contenido total de polifenol de cacao de por lo menos 10 miligramos por gramo, basado en sólidos de cacao desgrasado, en donde los polifenoles de cacao comprenden (±)-catequina, (±) -epicatequina y oligóminos de procianidina de los mismos, caracterizado por un perfil monomérico alterado en donde la relación de epicatequina o catequina es de aproximadamente 1 a más de alrededor de 1.

4.- El licor de chocolate de la reivindicación 3, en donde el contenido total de polifenol de cacao es de aproximadamente 12 a alrededor de 25 y en donde la relación es de aproximadamente 1 a más de alrededor de 0.42.

5. - Un extracto de cacao procesado térmicamente, en donde el contenido total de polifenol del extracto es de por lo menos 200 miligramos de polifenoles cacao por gramo de extracto seco; en donde los polifenoles de cacao comprenden (±) -catequina, (±) -epicatequina y oligómeros de procianidina de los mismos, caracterizados por un perfil monomérico alterado donde la relación de epicatequina a catequina es de aproximadamente 1 a más de alrededor de 1.

6.- El extracto de la reivindicación 5, en donde el contenido total de polifenol de cacao es de aproximadamente 250 a alrededor de 500 y la relación es de aproximadamente 1 a alrededor de 0.42.

7.- Un producto de cacao con bajo contenido de humedad, procesado térmicamente, que contiene ingredientes de cacao seleccionados del grupo de cacao que consiste de un polvo de cacao con alto CP, un extracto de cacao líquido o seco con alto CP, un licor de chocolate con alto, CP, y mezclas de las mismas , dicho producto tiene un contenido total de polifenol de cacao de por lo menos aproximadamente 6.0 miligramos por gramo del producto, en donde los polifenoles de cacao comprenden (±) -catequina, (±)-epicatequina y oligómeros de procianidina de los mismos, caracterizados por un perfil monomérico alterado donde las relación de epicatequina a catequina es de 1 a más de 1.

8.- El producto de cacao de la reivindicación 7, en donde el producto tiene un contenido total de polifenol de cacao por arriba de 49 miligramos.

9.- Un proceso térmico, de producto con alto contenido de humedad que contiene ingredientes de cacao seleccionados del grupo que consiste de polvo de cacao con alto contenido de CP, un extracto de cacao con alto contenido de CP líquido o seco, licor de chocolate con alto contenido de CP, y mezclas de las mismas, dicho producto tiene un contenido total de polifenol de cacao de por lo menos aproximadamente 0.2 miligramos por gramo del producto, en donde los polifenoles de cacao comprenden (±) -catequina, (+)-epicatequina y oligómeros de procianidina de los mismos, caracterizados por un perfil monomérico alterado donde las relacione de epicatequina a catequina es de 1 a más de 1.

10.- El producto de la reivindicación 9, en donde el producto tiene un contenido total de polifenol de cacao por arriba de aproximadamente 5 miligramos.

11.- El polvo de cacao de la reivindicación 1, licor de chocolate de la reivindicación 3, extracto de cacao de la reivindicación 5, o producto de cacao de la reivindicación 7 o 9, en donde la cantidad total de epicatequina y catequina inicialmente no se cambia de la cantidad inicialmente presente en el polvo de cacao, extracto de cacao, licor de chocolate o producto de cacao.

12.- El polvo de cacao de la reivindicación 1, licor de chocolate de la reivindicación 3, extracto de cacao de la reivindicación 5, producto de cacao de la reivindicación 7 o 9, caracterizada por la presencia de cuatro dimeros adicionales los cuales tienen diferentes tiempos de elución que los dimeros conocidos como B2 y B5 bajo las mismas condiciones cromatográficas.

13.- El polvo de cacao de la reivindicación 1, el cual se prepara calentando polvo de cacao preparado de granos de cacao fermentado o subfermentado a aproximadamente 37° a alrededor de 190°C por un tiempo y a un pH suficiente para epimerizar la (-) epicatequina.

14.- El licor de chocolate de la reivindicación 3, el cual se prepara calentando licor de chocolate preparado de granos de cacao fermentado o subfermentado a aproximadamente 37° a alrededor de 190°C por un tiempo y a un pH suficiente para epimerizar la (-) -epicatequina .

15.- El extracto de cacao de la reivindicación 5, el cual se prepara disolviendo el extracto de cacao seco en agua o un solvente orgánico acuoso y calentando la solución de aproximadamente 37° a alrededor de 190 °C a un pH de aproximadamente 4.0 a alrededor de 8.0 de por de aproximadamente 0.5 minutos por algunos días.

16.- Una bebida de cacao que consiste esencialmente de agua y polvo de cacao, dicha bebida contiene más catequina que epicatequina, en contraste con el polvo de cacao del cual se prepara, y en donde la relación de epicatequina a catequina en la bebida es aproximadamente de 1:3.

17.- La bebida de cacao de la reivindicación 16, en donde la mayoría de la catequina en la bebida es (-)-catequina.

18.- Un método para tratar o prevenir una enfermedad vascular o trastornos administrando a un ser humano o animal veterinario una bebida de cacao que comprende (-) -catequina y dimeros los cuales tienen tiempos de elusión diferentes de los dimeros B2 y B5 bajo las mismas condiciones y en donde la enfermedad vascular o trastorno es seleccionado del grupo de ateroesclerosis, trombosis hipertensión (v.gr., hipertensión, primaria, secundaria y pulmonar) , enfermedad cardiovascular (ECV) , enfermedad arterial coronaria (EAC) (incluyendo isquemia al miocardio, infarto al miocardio, angina estable e inestable, oclusión aguda o restenosis), diabetes (tipo I y tipo II) (v.gr., complicaciones vasculares de diabetes) disfunción cognitiva o trastorno y/o trastornos de circulación vascular (incluyendo aquellos del cerebro) , ataque cardiaco, enfermedad cerebrovascular (incluyendo apoplejía, ataque de isquemia temporal inicial y/o recurrente, o complicaciones de isquemia, v.gr., después de angioplastía coronaria o intervención coronaria percutánea) , falla cardiaca congestiva, falla renal, enfermedad renal, enfermedad y/o trastornos asociados con vasoconstricción de vasos sanguíneos periféricos (v. gr. , vasos sanguíneos localizados en brazos y piernas) tales como enfermedad vascular periférica y más específicamente enfermedad de Raynaud, enfermedad arterial periférica (EAP) , claudicación intermitente, vasculitis (v.gr., de vasos sanguíneos pequeños), vasoespasmo, trombosis venos, insuficiencia venosa, isquemia de miembros crítica, isquemia de miembros aguda, ateroembolismo e isquemia de extremidades inferiores.

19.- El método de la reivindicación 18, en donde la bebida es una bebida de cacao.

20.- El método de la reivindicación 19, en donde la bebida es una bebida de cacao y en donde la enfermedad vascular o trastornos es seleccionada del grupo de ateroesclerosis, trombosis, hipertensión, hipertensión (v.gr., primaria, secundaria, y pulmonar), enfermedad cardiovascular (ECV) , enfermedad arterial coronaria (EAC) (incluyendo isquemia al miocardio, infarto al miocardio, angina estable e inestable, oclusión aguda o restenosis) , diabetes (tipo I y tipo II) (v.gr ., complicaciones vasculares de diabetes), disfunción cognitiva o trastorno y/o trastornos de circulación vascular (incluyendo aquellos del cerebro), ataque cardiaco, enfermedad cerebrovascular, (incluyendo apoplejía y/o ataques de isquemia temporal inicial y/o recurrente, o complicaciones de isquemia, v.gr., angioplastía coronaria o intervención coronaria percutanea) falla cardiaca congestiva, falla renal, enfermedad renal, enfermedades y/o trastornos asociados con vasoconstricción de vasos sanguíneos periféricos (v. gr. , vasos sanguíneos localizados en brazos y piernas) tales como enfermedad vascular periférica y más específicamente enfermedad de Raynaud, enfermedad arterial periférica, (EAP) , claudicación intermitente, vasculitis (v.gr., de vasos sanguíneos pequeños), vasoespasmos, trombosis venosas, insuficiencia venosa, isquemia de miembros crítica, isquemia de miembros aguda, arteroembolismo, e isquemia de extremidades inferiores.