CN101223269B - 处理组织的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细菌学领域。特别的，本发明涉及用于改变(例如抑制)病原性微生物种群的生长和毒力的新的组合物和方法。

Description

处理组织的组合物和方法

此申请要求2005年5月26日提交的美国申请系列号11/137,950的优选权，后者在此处被引用作为参考。

技术领域

本发明涉及细菌学领域。特别的，发明涉及新的组合物(例如，抗微生物剂)和使用它们处理组织(例如皮肤和其它软组织损伤)的方法。在一些实施方案中，本发明包含杀死或改变(例如，抑制)微生物种群的生长和毒力。

发明技术

抗生素抗性病原体例如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)和大环内酯抗性酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和多药抗性绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的蔓延已经造成对皮肤和软组织感染的治疗越来越困难(Fung et al.，Drugs 63：1459-80(2003))。

例如，灼伤创面护理中的一个长期问题是发展为微生物感染。人类不是生活在一个无菌的环境中，而是生活在和细菌和其它微生物的共生关系中。完整的皮肤和粘膜表面的作用是维持我们组织和细菌种群之间的一种微妙的平衡。皮肤或粘膜屏障中的任何裂口改变这种平衡，并因此有可能因让细菌进入到下层的组织并达到临界数量而引发感染。灼伤外科的主要治疗目标之一个是防止感染，并且，如果污染发生了，目标是减少微生物污染使之低于引发并扩散感染所需的临界数量以下。随着抗生素的发现，灼伤感染看似得到控制。但是，已经发现细菌能够并确实已经通过发展抗性战胜了抗生素。细菌的抗性菌株的出现已经成为许多基于医院的感染的主要来源，并且给灼伤外科医生带来重大的临床难题。

抗生素抗性问题影响所有类型的细菌感染，包括但不限于皮肤和软组织感染。有许多致病性微生物抗生素抗性迅猛上升的例子。在德克萨斯州科珀斯克里斯蒂城(Corpus Christi，Texas)的一个医院中，社区获得性甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)(多见于皮肤和软组织感染)，从1990年的3％缓慢增长到1999年的10％，随后在4年多时间里快速增长到2003年的62％(Goodman，J Clin Invest 114，1181(2004))。在迈阿密医院，小腿溃疡中对喹诺酮类药物抗性的绿脓假单胞菌，从1992年的19％增长到2001年的56％(Valencia et al.，JAm Acad Dermatol 50，845-9(2004))。在这个领域中不言自明，需要新的疗法来控制这些感染。

抗菌剂例如硝酸银、磺胺嘧啶银(Silverdene、Thermazine、Flamazine)和醋酸甲磺灭脓(Sulfamylon)的预防性使用已经成为标准护理，其减少伤口例如灼伤的细菌定居。但是，这些试剂具有局限性。例如，Silverdene已经显示延缓伤口愈合并不能用于对磺胺药物过敏的病人。Sulfamylon的代谢产物是碳酸酐酶的潜在抑制剂，并因此能引起代谢性酸中毒。在吸入性损伤患者和发展出脓毒症的患者中尤其禁用这种化合物。

其它用于预防或减少细菌定居的抗微生物剂是硫酸庆大霉素、杆菌肽、呋喃妥因。不幸的是，这些抗微生物剂的不断使用导致被刺激的细菌的抗性菌株的出现。

尽管在灼伤患者治疗中这些抗微生物治疗策略作为标准护理方法已经被接受，药物抗性细菌感染(例如，甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii))的发展给在延长住院期的病人(例如，严重损伤的灼伤或者或带有慢性溃疡的糖尿病患者)带来重大的临床问题。

因此，存在着开发抗微生物治疗替代治疗策略的巨大需求。特别的，需要能解决并有效杀死或减弱药物抗性微生物的疗法。

发明内容

本发明涉及细菌学领域。特别的，发明涉及新的组合物(例如，抗微生物剂)和使用它们处理组织(例如皮肤和其它软组织损伤)的方法，包括杀死或改变(例如，抑制)微生物种群的生长和毒力，在一些实施方案中，新的组合物的作用包括用所述组合物定居(colonizing)组织，例如，定居创伤、肠道或泌尿道的一种或多种组成部分。

在一些实施方案中，本发明的方法包括，通过将组织暴露于供体细胞中来处理组织，其中所述供体细胞含有重组的可转移质粒和辅助质粒，所述重组的可转移质粒含有编码杀菌蛋白的基因，所述辅助质粒含有编码免疫蛋白的基因，其中所述免疫蛋白被设置为用于抑制所述杀菌蛋白。在这个实施方案中，供体细胞被设置为用于接合性地将重组的可转移质粒转移到受体细胞中，这样重组的可转移质粒在受体细胞中表达编码杀菌蛋白的基因。在优选的实施方案中，编码杀菌蛋白的基因的表达对于受体细胞来说是致死性的。在一些实施方案中，杀菌蛋白是大肠杆菌素。在一些优选的实施方案中，大肠杆菌素是colE3，而在其它优选的实施方案中，杀菌蛋白包括但不限于colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9或溶菌酶。

本发明的方法设想了被设置为用于抑制杀菌蛋白效果的免疫蛋白的用途。在优选的实施方案中，免疫蛋白结合到杀菌蛋白上。例如，免疫蛋白immE3结合到并且抑制(例如，使失活)杀菌蛋白colE3。本领域已知有许多对杀菌蛋白和相对应的免疫蛋白。在本发明中，列于上面的杀菌蛋白分别被相对应的大肠杆菌素A，大肠杆菌素B、大肠杆菌素D、大肠杆菌素Ia、大肠杆菌素Ib、大肠杆菌素K、大肠杆菌素N、大肠杆菌素E1，大肠杆菌素E2、大肠杆菌素E4、大肠杆菌素E5、大肠杆菌素E6、大肠杆菌素E7、大肠杆菌素E8和大肠杆菌素E9免疫蛋白抑制。

本发明提供了用于处理组织的组合物和方法，所述组织包括但不限于皮肤、粘膜组织、肺组织、膀胱组织等。在一些实施方案中，处理的是未受伤的组织。同时在一些实施方案中，组织包括创伤。在一些优选的实施方案中，创伤包括灼伤创面。在一些实施方案中，治疗包括定居所述组织，例如，和本发明的组合物一起。

在一些实施方案中，用本发明的方法和组合物的治疗可以应用于感染的组织或受污染的表面。在这种实施方案中，被处理的组织或表面在感染的组织或受污染的表面暴露于本发明的组合物(例如供体细胞，处理的表面)之前和受体细胞(例如，一种病原体细胞)接触。

在一些实施方案中，使用本发明的方法和组合物的治疗可以是预防性的(prophylactic/preventative)。在这种实施方案中，被处理的组织或表面在感染的组织或受污染的表面暴露于本发明的组合物(例如供体细胞，处理的表面)之前不和受体细胞(例如，一种病原体细胞)接触。

设想本发明的方法和组合物可以利用许多不同的重组的可转移质粒。在一些实施方案中，重组的可转移质粒是可自体转移的，而在其它实施方案中，重组的可转移质粒是非自转移的。在一些优选的实施方案中，重组的可转移质粒选自包括pCON15-56A、pCON19-79。辅助质粒包括但不限于pCON1-93和pCON1-94。

本发明的方法和组合物靶向的受体细胞包括但不限于细菌细胞。在优选的实施方案中，受体细胞是病原性细菌细胞。在特定的优选的实施方案中，受体细菌细胞所属菌属选自于沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏杆菌属(Shigella)、大肠杆菌属(Escherichia)、肠道细菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、耶尔森菌属(Yersinia)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、哈夫尼亚菌属(Hafnia)、爱文菌属(Ewingella)、克罗非菌属(Kluyvera)、摩根氏菌属(Morganella)、动性球菌属(Planococcus)、口腔球菌属(Stomatococcus)、细球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、(Plessiomonas)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、放线杆菌属(Actinobacillus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、支原菌属(Mycoplasma)、脲原体属(Ureaplasma)、立克次体(Rickettsia)、柯克斯氏体属(Coxiella)、罗卡利马氏体菌属(Rochalimaea)、埃里希氏体属(Ehrlichia)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、气球菌属(Aerococcus)、兼性双球菌属(Gemella)、乳球菌属(Lactococcus)、白联珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pedicoccus)、芽胞杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、隐秘杆菌属(Arcanobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、李斯特菌属(Listeria)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、加德纳菌属(Gardnerella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弓形菌属(Arcobacter)、沃廉菌属(Wolinella)、缠绕杆菌属(Helicobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、华丽单胞菌属(Chryseomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、埃肯菌属(Eikenella)、黄色单胞菌属(Flavimonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、寡源杆菌属(Oligella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、威克氏菌属(Weeksella)、黄(单包)杆菌属(Xanthomonas)、博德特氏菌属(Bordetella)、弗朗西丝氏菌属(Franciesella)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、军团杆菌属(Legionella)、阿菲波菌属(Afipia)、巴尔通氏体属(Bartonella)、荚膜菌属(Calymmatobacterium)、心杆菌属(Cardiobacterium)、链杆菌属(Streptobacillus)、螺旋菌属(Spirillum)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、八迭球菌属(Sarcinia)、粪球菌属(Coprococcus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、丙酸菌属(Propionibacterium)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、乳酸菌属(Lactobacillus)、罗氏菌属(Rothia)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)、卟啉菌属(Porphyromonas)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)、纤毛菌属(Leptotrichia)、沃廉菌属(Wolinella)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、巨球型菌属(Megasphaera)、韦荣氏球菌属(Veilonella)、诺卡氏菌属(Norcardia)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、拟诺卡氏菌属(Norcardiopsis)、链霉菌属(Streptomyces)、小多孢菌属(Micropolysporas)、高温放线菌属(Thermoactinomycetes)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、密螺旋体(Treponema)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)或衣原体(Chiamydiae)。

本发明提供了包含供体细胞的组合物，其中所述供体细胞含有重组的可转移质粒和辅助质粒，所述重组的可转移质粒含有编码杀菌蛋白的基因，所述辅助质粒含有编码免疫蛋白的基因，其中所述免疫蛋白被设置为用于抑制所述杀菌蛋白，在这个实施方案中，供体细胞被设置为用于将重组的可转移质粒转移到受体细胞中，因此重组的可转移质粒在受体细胞中表达编码杀菌蛋白的基因。在优选的实施方案中，编码杀菌蛋白的基因的表达对于受体细胞来说是致死性的。在一些实施方案中，杀菌蛋白是大肠杆菌素。在一些优选的实施方案中，大肠杆菌素是colE3，而在其它优选的实施方案中，杀菌蛋白包括但不限于colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9，或溶菌酶。在本发明的一些实施方案中，可转移质粒含有RSF 1010的oriT和oriV，并且其中所述的编码ColE3的基因在lac启动子/操纵子控制之下。在一些优选的实施方案中，可转移质粒是pCON15-56A或pCON19-79。

在一些实施方案中，供体细胞属于低毒力细菌菌株。在一些实施方案中所述低毒力菌株是E.coli菌株。在一些优选的实施方案中，低毒力菌株是大肠杆菌83972。

本发明的组合物考虑到了被设置为用于抑制杀菌蛋白效果的免疫蛋白的用途，在优选的实施方案中，免疫蛋白结合到杀菌蛋白上。例如，免疫蛋白immE3结合并且抑制(例如，使失活)杀菌蛋白colE3。本领域已知有许多对杀菌蛋白和相对应的免疫蛋白。在本发明中，列于上面的杀菌蛋白分别被相对应的大肠杆菌素A，大肠杆菌素B、大肠杆菌素D、大肠杆菌素Ia、大肠杆菌素Ib、大肠杆菌素K、大肠杆菌素N、大肠杆菌素E1，大肠杆菌素E2、大肠杆菌素E4、大肠杆菌素E5、大肠杆菌素E6、大肠杆菌素E7、大肠杆菌素E8和大肠杆菌素E9免疫蛋白抑制。在一些实施方案中，编码免疫蛋白的基因在启动子的控制之下，其中所述启动子是组成型活性的。在一些实施方案中，启动子是Pneo。在其它实施方案中，编码免疫蛋白的基因在可诱导的启动子的控制之下。在一些实施方案中，辅助质粒是pCON1-93或pCON1-94。

设想了本发明的组合物可以被用于处理表面。能被本发明的方法和组合物处理的表面包括但不限于医学装置、创伤护理装置、体腔装置、人体、动物体、个人保护装置、生育控制装置和药物运输装置的表面。在一些优选的实施方案中，装置包括导尿管。表面包括但不限于硅、塑料、玻璃、聚合物、陶瓷、光致抗蚀剂、皮肤、组织、硝酸纤维素、水凝胶、纸、聚丙烯、衣服、棉花、羊毛、木、砖、皮革、乙烯树脂、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯酰胺、光导纤维、天然纤维、尼龙、金属、橡胶和它们的混合物。在一些实施方案中，所述处理是抑制受体细胞在表面的生长，而在其它实施方案中，处理是杀死或减弱进入接触表面的受体细胞。在一些实施方案中，处理是定居所述表面。

附图说明

图1是监测接合效率的方法的描述。图1A显示了示例性的接合检测的示意图。图1B提供了用于计算接合效率的稀释检测的例子。

图2显示了将细菌点在培养基上用于监测杀伤质粒的接合和杀伤效果的图像。

图3图片显示使用含有本发明的质粒的供体细胞的体内效果检测的结果。

图4A提供了通过根据本发明的供体细胞检测细菌抑制的示例性方法的示意图。图4B显示了所示靶细胞的菌苔图像(在a栏)和来自接合依赖性的生长抑制的病原细胞菌苔中的清除区域(在b栏)。

图5显示了质粒RSF1010 pCON15-56A的示意图。

图6显示了质粒pCON1-94的示意图。

图7显示了pCON19-79的示意图。

图8显示了pCON1-93的示意图。

图9显示了使用含有pCON19-79质粒的供体细胞的体内效果检测的结果。

定义

为了便于理解本发明，一些术语和惯用语被定义如下：

如此处所述，术语“受试者”指的是被本发明的方法或组合物处理的个体(例如人、动物或其它生体)。受试者包括但不限于哺乳动物(例如，鼠、猴、马、牛、猪、犬、猫等)，并且最优选的包括人。在本发明的上下文中，术语“受试者”通常指的是在某种条件下将要接受或已经接受处理(例如，给予供体细胞，和可选择的一种或多种其它试剂)的个体，所述条件的特征是存在病原体细菌或预计有可能会暴露于病原体细菌中。

如此处所述，术语“诊断的”指的是通过其体征和症状(例如，对常规疗法的抗性)，或通过遗传分析、病理分析、组织学分析等，对疾病(例如，因存在病原体细菌所引起的)的识别。

如此处所述，术语“在体外”指的是一种人为环境，和在人为环境中发生的过程或反应。体外环境包括，但不限于试管和细胞培养物。术语“在体内”指的是天然环境(例如，动物或细胞)以及在天然环境中的过程或反应。

如此处所述，术语“细胞培养物”指的是任意的细胞体内培养物。包括于此术语中的有连续的细胞系(例如，带有永生表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如，非转化的细胞)和在体外维持的任何其它细胞群体，包括卵母细胞和胚胎。

如此处所述，术语“接合(conjugation)”指的是DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程。虽然结合主要见于细菌细胞之间，但是从细菌细胞到更高级或更低级的真核细胞也发生此过程(Waters，NatGenet.29：375-376(2001)；Nishikawa等人，Jpn J Genet.65：323-334(1990))。接合由复杂的细胞结构介导，并且关键的蛋白组件通常被编码为质粒中的一系列基因(例如，质粒RK2的tra基因)。这些基因产物中的一些组装到一起来促进直接的细胞-细胞相互作用(例如，交配对的形成)，并且它们中的一些用于转移DNA和伴随的蛋白分子，并用于复制DNA分子(例如，DNA转移/复制)。oriT是一种DNA序列，在接合过程中DNA分子的转移从它开始。

如此处所述，术语“接合供体”和“供体细胞”是可交换使用的，指的是一种细胞，例如，一种细菌细胞，携带有一种质粒，其中所述质粒能通过接合转移到另一个细胞中。供体细胞的例子包括，但不限于，含有可自我转移型或非自我转移型质粒的大肠杆菌菌株。通过接合转移从供体细胞中接受质粒或其它细胞物质的细胞被称为“受体细胞”。如此处所述，术语“可转移质粒”指的是能通过接合从供体细胞转移到受体细胞中的质粒。

如此处所述，术语“可自我转移型质粒”指的是一种编码所有介导接合所需基因的质粒。可自我转移型质粒的受体成为将可自我转移型质粒进一步转移到另一个受体细胞中的专业供体(proficientdonot)。

如此处所述，术语“非自我转移型质粒”或“可移动质粒”指的是缺乏某些介导接合所需基因的质粒。携带体自我转移型质粒的细胞不能通过接合转移DNA，除非在相同细胞中反式补充缺失的基因。因此，缺乏缺失基因的受体细胞在接受非自我转移型质粒后不会成为专业的接合供体。

如此处所述，术语“转移原点”或“oriT”指的是DNA转移需要的顺式作用位点，并且将oriT序列整合进入非转移质粒中能将其转变为可移动质粒(Lanka and Wilkins，Annu Rev Biochem，64：141-169(1995))。

在一些实施方案中，供体细胞是细菌细胞(例如，革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌)。供体细胞的例子包括，但不限于，属于选自于如下菌属的细菌细胞：沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏杆菌属(Shigella)、大肠杆菌属(Escherichia)、肠道细菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、耶尔森菌属(Yersinia)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、哈夫尼亚菌属(Hafnia)、爱文菌属(Ewingella)、克罗非菌属(Kluyvera)、摩根氏菌属(Morganella)、动性球菌属(Planococcus)、口腔球菌属(Stomatococcus)、细球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、(Plessiomonas)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、放线杆菌属(Actinobacillus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、支原菌属(Mycoplasma)、脲原体属(Ureaplasma)、立克次体(Rickettsia)、柯克斯氏体属(Coxiella)、罗卡利马氏体菌属(Rochalimaea)、埃里希氏体属(Ehrlichia)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、气球菌属(Aerococcus)、兼性双球菌属(Gemella)、乳球菌属(Lactococcus)、白联珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pedicoccus)、芽胞杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、隐秘杆菌属(Arcanobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、李斯特菌属(Listeria)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、加德纳菌属(Gardnerella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弓形菌属(Arcobacter)、沃廉菌属(Wolinella)、缠绕杆菌属(Helicobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、华丽单胞菌属(Chryseomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、埃肯菌属(Eikenella)、黄色单胞菌属(Flavimonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、寡源杆菌属(Oligella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、威克氏菌属(Weeksella)、黄(单包)杆菌属(Xanthomonas)、博德特氏菌属(Bordetella)、弗朗西丝氏菌属(Franciesella)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、军团杆菌属(Legionella)、阿菲波菌属(Afipia)、巴尔通氏体属(Bartonella)、荚膜菌属(Calymmatobacterium)、心杆菌属(Cardiobacterium)、链杆菌属(Streptobacillus)、螺旋菌属(Spirillum)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、八迭球菌属(Sarcinia)、粪球菌属(Coprococcus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、丙酸菌属(Propionibacterium)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、乳酸菌属(Lactobacillus)、罗氏菌属(Rothia)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)、卟啉菌属(Porphyromonas)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)、纤毛菌属(Leptotrichia)、沃廉菌属(Wolinella)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、巨球型菌属(Megasphaera)、韦荣氏球菌属(Veilonella)、诺卡氏菌属(Norcardia)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、拟诺卡氏菌属(Norcardiopsis)、链霉菌属(Streptomyces)、小多孢菌属(Micropolysporas)、高温放线菌属(Thermoactinomycetes)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、密螺旋体(Treponema)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)和衣原体(Chlamydiae)。

在一些实施方案中，供体细胞是非生育(non-viable)的细胞，包括单不限于细菌微细胞、大细胞或不分裂细胞。

如此处所述，术语“大细胞”指的是已经被处理进行最大程度的染色体降解的细胞，例如，通过紫外线照射和扩大培养。大细胞包括大部分的质粒DNA，并且大细胞内蛋白质的合成主要来自于细胞中的质粒DNA。

如此处所述，术语“不分裂细胞”或“ND细胞”指的是一种被处理的细胞，所选择的处理方式用于优先破坏细胞的染色体DNA(例如，通过紫外线或其他辐射)，其中所述细胞被进一步处理，例如，DNA损伤处理后快速冷冻，来使染色体降解最小化。还可以通过例如在供体细菌中暂时表达细菌蛋白(例如，ColE3)的方法获得“ND细胞”。因此，在一些实施方案中，诱导蛋白(例如，ColE3)破坏细胞中的蛋白质合成，导致细胞死亡，同时留下接合装置，并且染色体DNA在ColE3完整合成之前合成。ND细胞含有染色体和质粒DNA，但是细胞的功能被完全改变了，例如，通过紫外线照射，所述ND细胞几乎没有或完全没有分裂能力。

在此处术语“靶细胞”、“靶”、“受体细胞”和“受体”可互换使用。在优选的实施方案中，用于本发明的组合物和方法的靶细胞包括但不限于能通过接合转移从供体细胞中接受物质的微生物，例如病原微生物(例如，病原菌)。病原菌包括但不限于沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏杆菌属(Shigella)、大肠杆菌属(Escherichia)、肠道细菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、耶尔森菌属(Yersinia)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、哈夫尼亚菌属(Hafnia)、爱文菌属(Ewingella)、克罗非菌属(Kluyvera)、摩根氏菌属(Morganella)、动性球菌属(Planococcus)、口腔球菌属(Stomatococcus)、细球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、(Plessiomonas)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、放线杆菌属(Actinobacillus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、支原菌属(Mycoplasma)、脲原体属(Ureaplasma)、立克次体(Rickettsia)、柯克斯氏体属(Coxiella)、罗卡利马氏体菌属(Rochalimaea)、埃里希氏体属(Ehrlichia)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、气球菌属(Aerococcus)、兼性双球菌属(Gemella)、乳球菌属(Lactococcus)、白联珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pedicoccus)、芽胞杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、隐秘杆菌属(Arcanobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、李斯特菌属(Listeria)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、加德纳菌属(Gardnerella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弓形菌属(Arcobacter)、沃廉菌属(Wolinella)、缠绕杆菌属(Helicobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、华丽单胞菌属(Chryseomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、埃肯菌属(Eikenella)、黄色单胞菌属(Plavimonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、寡源杆菌属(Oligella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、威克氏菌属(Weeksella)、黄(单包)杆菌属(Xanthomonas)、博德特氏菌属(Bordetella)、弗朗西丝氏菌属(Franciesella)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、军团杆菌属(Legionella)、阿菲波菌属(Afipia)、巴尔通氏体属(Bartonella)、荚膜菌属(Calymmatobacterium)、心杆菌属(Cardiobacterium)、链杆菌属(Streptobacillus)、螺旋菌属(Spirillum)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、八迭球菌属(Sarcinia)、粪球菌属(Coprococcus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、丙酸菌属(Propionibacterium)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、乳酸菌属(Lactobacillus)、罗氏菌属(Rothia)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)、卟啉菌属(Porphyromonas)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)、纤毛菌属(Leptotrichia)、沃廉菌属(Wolinella)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、巨球型菌属(Megasphaera)、韦荣氏球菌属(Veilonella)、诺卡氏菌属(Norcardia)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、拟诺卡氏菌属(Norcardiopsis)、链霉菌属(Streptomyces)、小多孢菌属(Micropolysporas)、高温放线菌属(Thermoactinomycetes)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、密螺旋体(Treponema)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)和衣原体(Chlamydiae)。在一些实施方案中，靶细胞是连续培养的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是在其天然环境(例如，在创伤或感染部位)中存在的或从病人组织(例如，通过活组织解剖)中获得的培养细胞，在优选的实施方案中，靶细胞显示病理学生长或增殖。

如此处所述，术语“毒力”指的是微生物的病原性程度，例如，用产生疾病的严重程度或其侵入受试者组织的能力来表明。通常通过半数致死量(LD₅₀)或半数感染剂量(ID₅₀)对其进行实验测定。该术语还可被用于表述产生病理效果的任意感染性试剂的能力。

术语“杀伤基因”指的是一种通过在易感细胞中表达，产生杀死细胞的产物的基因。

术语“杀伤质粒”指的是包含杀伤基因的质粒。如此处所述，术语“减弱”和“弱化作用”指的是一种特性，例如，属于受体或靶细胞的，指的是该特性的降低或减弱，或该特性的效果的降低。例如，当涉及到靶细胞的病原体或病原性时，弱化作用通常指的是病原体毒力的降低。病原体的弱化作用不限于任何特定的弱化毒力机制，在一些实施方案中，可能实现了弱化毒力，例如，通过破坏分泌通路，在其它实施方案中，可以通过改变细胞代谢来增加对药物(例如，减弱病原体毒力的药物或杀死该病原体的药物)的反应性或易感性来实现弱化毒力。在一些实施方案中，弱化作用指的是一种特性，例如，细胞群体的毒力。例如，在本发明的一些实施方案中，病原细胞群体被处理，例如，通过发明的方法和组合物，因此细胞群体中毒力方面下降。参见，例如，2005年5月26日提交的系列号为11/137,948的共同待审的申请和2006年5月26日提交的邮件快递标签号(ExpressMail Label No)为EV 850782307 US的PCT申请，其全部被整体引入此处作为参考。

如此处所述，术语“毒力”指的是微生物的病原性程度，例如，以产生疾病的严重程度或其侵入受试者组织的能力来表示。通常通过半数致死量(LD₅₀)或半数感染量(ID₅₀)对其进行实验测定。该术语还可被用于表述产生病理效果的任意感染性试剂的能力。

如此处所述，术语“有效量”指的是足够产生有益效果或所需结果的组合物(例如，供体细胞)的数量。可以通过一次或多次给药、应用或用药给予有效量，并且不特意限定于特定的剂型或给药途径。

如此处所述，术语“给药”指的是向生理系统(例如，受试者或体内、体外或离体的细胞、组织和器官)给予药物、药物前体或其它试剂、或治疗处理(例如，本发明的组合物)的行为。示例性的人体给药途径可以通过眼睛(眼的)、嘴(口腔的)、皮肤(经皮肤的)、鼻子(鼻的)、肺(吸入的)、口腔粘膜(口腔的)、耳朵，通过注射(例如，静脉的、皮下的、瘤内的、腹膜内的等)、通过引入到膀胱等。

如此处所述，术语“处理表面”指的是将表面暴露于一种或多种本发明的组合物的行为。处理表面的方法包括，但不限于喷射、喷雾、浸没和包被。

如此处所述，术语“共给药(co-administration)”指的是向受试者至少给予两种试剂(例如，两种单独的供体细菌，每种包含不同的质粒)或疗法。在一些实施方案中，共给药两种或两种以上试剂或疗法是同时发生的，在其它实施方案中，第一种试剂/疗法在第二种试剂/疗法之前给予。所使用的不同试剂或疗法的剂型和/或给药途径是可以改变的，这是本领域熟练人员所已知的。本领域的熟练人员能够容易的测定共给药的合适剂量。在一些实施方案中，当共给药试剂或疗法时，采用比其单独给药的合适剂量更低的剂量给予各自的试剂或疗法。在某些实施方案中，试剂或疗法的共给药降低了有可能有害的(例如，有毒的)试剂的需要量，因此，在该实施方案中共给药是尤其需要的。

如此处所述，术语“有毒的”指的是和对相同细胞或组织给予有毒物质之前相比，对受试者、细胞或组织的任何有害效果。

如此处所述，术语“药物组合物”指的是活性试剂(例如，供体细菌细胞)和载体(惰性的或活性的)的组合，使该组合物尤其适用于体外的、体内的或离体的诊断或治疗用途。

如此处所述，术语“药学可接受的”或“药理学可接受的”指的是当向受试者给药时基本上不产生副作用的组合物，所述副作用例如，有毒的、过敏的或免疫反应。

如此处所述，术语“局部的”指的是，本发明的组合物在皮肤和粘膜细胞和组织(例如，肺泡的、口腔的、舌的、咀嚼的或鼻粘膜和其它排列于中孔洞器官或体腔例如膀胱中的组织和细胞)的表面的应用。

如此处所述，术语“药物可接受载体”指的是任意的标准药物载体，包括但不限于，磷酸盐缓冲的生理盐水、水、乳剂(例如，油/水或水/油乳剂)，和不同类型的湿润剂，和所有的溶剂、湿润剂、包被剂、硫酸月桂酯钠、等渗和吸收延迟剂、分解剂(例如，土豆淀粉或淀粉羟乙酸钠)等。组合物还能包括稳定剂和防腐剂。例如载体、稳定剂和辅剂的。(参见，例如，Martin，Remington′s PharmaceuticalSciences，15th Ed.，Mack Pub1.Co.，Easton，Pa.(1975)，引入此处用作为参考)。此外，在某些实施方案中，本发明的组合物可以配制用于园艺或农业用途。这种剂型包括蘸剂、喷射剂、种子敷料、茎注射剂、喷射剂和喷雾剂。

如此处所述，术语“药物可接受的盐”指的是在目标受试者(例如，哺乳动物受试者和/或体内或离体的细胞、组织或器官)中生理耐受的，本发明的化合物的任意盐(例如，通过和酸或碱反应得到的)。本发明的化合物的“盐”可以来自于无机或有机酸和碱。酸的例子包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、磷酸、羟基乙酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸(methanesulfonic)、甲磺酸(ethanesulfonic)、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其它酸，例如草酸，虽然其自身不是药学可接受的，但是可以用于制备盐，用作获得本发明的化合物的中间物，以及它们药学可接受的酸加成盐。

碱的例子包括但不限于碱金属(例如，钠)氢氧化物、碱土金属(例如，镁)氢氧化物、铵和化学式NW₄ ⁺的化合物，其中W是C_1-4烷基等。

盐的例子包括但不限于醋酸盐、已二酸盐、藻(朊)酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、重硫酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊丙酸雌二醇盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、氟庚酸盐(flucoheptanoate)、磷酸甘油、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、噻嘧啶(palmoate)、果胶酸盐、过硫酸盐、苯珍酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐等。盐的其它例子包括本发明的化合物的阴离子和合适的阳离子例如Na⁺、NH₄ ⁺、和NW₄ ⁺(其中W是C_1-4烷基)等。对于治疗用途，本发明的化合物的盐被考虑到为药学可接受的。但是，非药学可接受的酸和碱的盐也可以找到用途，例如，在制备或纯化药物可接受化合物中。

对于治疗用途，本发明的化合物的盐被考虑到为药学可接受的。但是，非药学可接受的酸和碱的盐也可以找到用途，例如，在制备或纯化药物可接受化合物中。

如此处所述，术语“医学装置”包括在受试者或病人身体内、上或通过受试者或病人身体使用的任意材料或用具，例如，在医学处理过程中(例如，对于疾病或损伤)。医学装置包括但不限于，例如医学埋植物、创伤护理装置、药物运输装置和体腔和个人保护装置这些物品。医学埋植物包括但不限于导尿管、血管内导管、透析分流器、伤口引流管、皮肤缝线、人造血管、可定居网、眼内装置、心脏瓣膜等。创伤护理装置包括但不限于，一般性创伤敷料、生物定居物质、闭合带和敷料和外科切割布单。药物运输装置包括但不限于针、药物运输皮肤贴片、药物运输粘膜贴片和医用海绵。体腔和个人保护装置包括但不限于棉塞、海绵、外科和检查手套和牙刷。控制生育装置包括但不限于子宫内装置(IUD)、膈膜和避孕套。

如此处所述，术语“治疗试剂”指的是，在和病原性微生物接触的受试者中降低传染性、发病率或死亡发作的组合物，或在和病原性微生物接触的宿主中防止传染性、发病率或死亡发作的组合物。如此处所述，治疗试剂包含用于预防用途的试剂，例如，在没有病原体存在时，考虑到将来暴露于病原体的可能性。这种试剂还可以包含药学可接受的化合物(例如，佐剂、辅料、稳定剂、稀释剂等)。在一些实施方案中，本发明的治疗试剂以局部使用组合物、注射组合物、可吸收组合物等形式给药。当给药途径是局部给药时，形式可以是例如，溶液、乳剂、软膏、油膏剂或喷雾剂。

如此处所述，术语“病原体”指的是在宿主中引起疾病状态(例如，感染，癌症等)的生物试剂。“病原体”包括但不限于病毒、细菌、古菌(archaea)、真菌、原生动物、支原体、蛋白酶传染性因子(prion)和寄生生物。

术语“细菌(bacteria/bacterium)”指的是所有原核生物，包括原核生物界中所有的门中的那些。其意指该术语包括所有被认为是细菌的微生物，包括支原体、衣原体、放线菌、链霉菌和立克次体。所有形式的细菌都被包括进这个定义中，包括球菌、杆菌、螺旋菌、球形体、原生质体等。该术语还包括革兰氏阴性或革兰氏阳性的原核生物。“兰氏阴性”或“革兰氏阳性”指的是革兰氏染色过程中的染色模式，这是本领域所熟知的。(参见例如，Finegold and Martin，Diagnostic Microbiology，6th Ed.，CV Mosby St.Louis，pp.13-15(1982))。“革兰氏阳性细菌”是保留革兰氏染色中使用的原始染料的细菌，导致染色的细胞在显微镜下通常显示黑蓝色到紫色。“兰氏阴性细菌”不保留革兰氏染色中使用的原始染料，但是被负染染色。因此，兰氏阴性细菌通常显示红色。

如此处所述，术语“微生物”指的是任意的微生物物种或类型，包括单不限于，病毒、细菌、古菌、真菌、原生动物、支原体、蛋白酶传染性因子和寄生生物。本发明设想，其中包括的一些微生物对受试者来说还将是病原性的。

如此处所述，术语“真菌”被用于表述例如霉菌和酵母的真核生物，包括双相型真菌。

如此处所述，术语“非人类动物”指的是所有非人类动物，包括，但不限于脊椎动物，例如啮齿类、非人类灵长类、羊、牛、反刍动物、兔类动物、猪、羊、马、犬、猫、鸟类等。

如此处所述，术语“核酸分子”指的是任意含有核酸的分子，包括但不限于，DNA或RNA。该术语包括包含DNA和RNA的任意已知碱基类似物的序列，所述类似物包括但不限于，4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、乙烯亚氨基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧羟基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧羟基氨甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、次黄嘌呤核苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤苷、2、2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧氨基甲基-2-硫脲嘧啶、p-D-甘露糖Q核苷、5′-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧丁基核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-巯基胞嘧啶和2、6-二氨基嘌呤。

术语“基因”指的是包含产生多肽、前体或RNA(例如，rRNA、tRNA)所必需的编码序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可以被全长编码序列或被编码序列的任意部分编码，只要该全长或片段的所需活性或功能特性(例如，酶活性、配体结合、信号传导、免疫原性等)被保留下来。该术语还包括结构基因的编码区，以及位于邻接编码区5′和3′末端处距离每个末端大约1kb或以上的序列，因此该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5′端并存在于mRNA中的序列被称为5′非翻译序列，或者5′侧翼顺序。位于编码区3′端或下游并存在于mRNA中的序列被称为3′非翻译序列，或者3′侧翼顺序。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有被命名为“内含子”或“间隔区”或“间隔序列”的非编码序列所间隔的编码区。内含子是基因的一部分，被转录到mRNA前体；内含子可能含有调控元件，例如增强子。通常内含子从原始转录子(mRNA前体)中去除或“切割掉”；因此内含子通常不存在于信使RNA(mRNA)转录子中。mRNA在翻译时发挥功能，来指定新生多肽的氨基酸序列或顺序。

如此处所述，术语“异源基因”和“异源核酸”指的是未处于其天然环境中的基因或核酸。例如，异源基因或核酸包括从一个物种引入到另一个物种中的基因或核酸。异源基因或核酸还包括已经发生了某种改变的生物体(例如，突变的，加入多重拷贝，和非天然调控序列连接等)的天然基因或核酸。异源基因或核酸和内源基因或核酸的区别在于，异源基因或核酸序列通常和在染色体中未发现和该基因或核酸序列有天然联系的DNA序列连接，或者和天然情况下未发现的染色体部分相联系(例如，基因组正常情况下基因不会表达的座位发生表达)。

如此处所述，术语“基因表达”指的是通过基因“转录”(即，通过RNA聚合酶的酶促作用)，基因编码的遗传信息转换为RNA的过程(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，而对于编码蛋白基因，则是通过mRNA “翻译”转变为蛋白质。可以在该过程中的多个阶段调控基因表达。“上调”或“激活”指的是增加基因表达产物(即，RNA或蛋白质)的调节，而“下调”或“抑制”指的是减少产物的调节。参与上调或下调的分子(例如，转录因子)通常被分别称为“激活子”和“抑制子”。

术语“野生型”指的是以分离自天然产生源的形式存在的基因或基因产物。野生型基因是群体中被观察到的频率最多的基因，因此被人为定义为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”或“突变体”指的是和野生型基因或基因产物相比，在序列或功能特性(即，变更的特性)中表现出变更的基因或基因产物。需要注意的是，能分离到天然产生的突变体；通过和野生型基因或基因产物相比它们具有变更的特性(包括变更的核酸序列)这个事实来鉴别。

如此处所述，术语“核酸分子编码”“DNA序列编码”和“DNA编码”指的是沿着一条脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。因此DNA中的核苷酸序列编码了相对应的多肽的氨基酸序列。

如此处所述，术语“具有编码一个基因的核酸序列的寡核苷酸”和“具有编码一个基因的核酸序列的多(聚)核苷酸”的意思是包含基因编码区的核酸序列，或者换句话说是编码基因产物的核酸序列。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA的形式存在。当以DNA的形式存在时，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的(即，正义链)或双链的。如果需要，在临近基因编码区的位置可以存在合适的调控元件例如增强子/启动子、剪切点、多腺苷酸化信号等，来允许进行合适的转录起始和/或正确的原始RNA转录子加工过程。

可选择的，在本发明的表达载体中使用的编码区可能含有内源增强子/启动子、剪切位点、间隔序列、多腺苷酸化信号等，或者内源和外源调控元件的结合。

如此处所述，术语“寡核苷酸”指的是长度短的单链多聚核苷酸链。寡核苷酸通常小于200个残基的长度(例如，15到100之间)，但是，如此处所述，该术语还意图包括更长的多聚核苷酸链。通常通过其长度表述寡核苷酸。例如，一个24残基的寡核苷酸被称为“24聚体(24-mer)”。寡核苷酸能通过自杂交或通过和其它寡核苷酸杂交形成二级和三级结构。这种结构能包括，但不限于，双联体、发夹、交叉形、转角和三联体。

如此处所述，术语“互补的”或“互补性”用于表述通过碱基配对原则相关的多聚核苷酸(即，核酸例如寡核苷酸或目标核苷酸的序列)。例如，序列“5′-A-G-T-3′”对于序列“3′-T-C-A-5′”是互补的。互补性可以是“部分”的，其中只有一些核苷酸的碱基根据碱基配对原则是匹配的。或者，核酸之间可以具有“完全”或“全”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有明显影响。这种在扩增反应中尤其重要，对于依赖核酸直接结合的检测方法同样如此。两个术语都可以用于表述单独的核苷酸，尤其是在多聚核苷酸背景下。例如，对于寡核苷酸内的特定核苷酸可以强调其对另一个核酸链中的核苷酸的互补性(或缺乏互补性)，和寡核苷酸其余部分与核酸链之间的互补性进行对比或比较。

术语“同源性”指的是分子(例如核酸分子)之间的相似程度。有可能是部分同源或完全同源(即，同一性)。部分互补序列是至少部分抑制完全互补核酸分子杂交到“大体上同源”的目标核酸上的核酸分子。可以使用杂交检测(Southern或Northern印记，溶液杂交等)在低严紧度条件下检测对完全互补序列和目标序列的杂交的抑制作用。在低严紧度条件下，大体同源的序列或探针将竞争并抑制完全同源核酸分子对目标的结合(即，杂交)。这不是说低严紧度条件造成允许非特异性结合；低严紧度条件需要两个序列的互相结合是特异性的(即，选择性的)相互作用。可以通过使用大体上非互补的(例如，一致性小于大约30％)第二靶标检测没有非特异性结合；在没有非特异性结合下，探针将不会杂交到第二非互补靶标上。

当用于表述双链核酸序列例如cDNA或基因组克隆时，术语“大体同源”指的是，在上述低严紧度条件下能杂交到该双链核酸序列的任意一条或两条链上的任意核酸。当用于表述单链核酸序列时，术语“大体同源”指的是在上述低严紧度条件下能杂交(即，它是互补体)到该单链核酸序列的互补体上的任意核酸。

通过原始RNA转录子的不同剪切，基因可以产生多种RNA。是相同基因的剪切变体的cDNA将包含相同或完全同源的(表现为在两个cDNA中存在相同的外显子或相同外显子的部分)序列区域和完全不同区域(例如，表现为在cDNA1中存在外显子“A”，而cDNA2含有外显子“B”)。因为两种cDNA含有相同序列，它们都将和源自完整基因或基因部分的含有两种cDNA中都存在的序列的探针杂交；因此这两种剪切变体对这种探针并互相是大体同源的。

如此处所述，术语“杂交”被用于表述互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即，核酸之间关联的强度)受到下述因素的影响：核酸之间互补程度、有关条件的严紧性、形成杂交体的T_m以及核酸中的G∶C比例。在其结构中含有互补核酸对的单个分子被称为“自杂交”。

如此处所述，术语“部分”在表述核苷酸序列(如在“给定核苷酸序列的一部分”中)时指的是该序列的片段。该片段的大小范围可以是从4核苷酸到整个核苷酸序列减去一个核苷酸(10核苷酸，20，30，40，50，100，200等)。

此处使用的术语“可操作地组合”“可操作的顺序”和“可操作的连接”指的是核酸序列以某种方式的连接，在这种方式下产生了能指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子。该术语还表述了氨基酸序列以某种方式的连接，结果产生了功能性蛋白质。

当和核酸有关使用术语“分离的”时，如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多聚核苷酸“中，该术语指的是被鉴别的并从其天然来源中通常伴随的组分或污染物中分离出来的核酸序列。因此分离的核酸以区别于其天然状态下的形式或设定存在，相反，未分离核酸是天然状态下存在的核酸例如DNA和RNA。例如，在宿主细胞染色体上发现临近毗邻基因的给定的DNA序列(例如，基因)；RNA序列，例如编码特定蛋白质的特定mRNA序列，被发现在细胞中和编码许多种蛋白质的其它多种mRNA混合在一起。但是，编码给定蛋白质的分离的核酸包括，例如，这种核酸在细胞中通常表达给定蛋白质，其中该核酸位于不同于天然细胞的染色体位置，或者其侧翼是和天然情况下不同的核酸序列。分离的核酸、寡核苷酸或多聚核苷酸可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸、寡核苷酸或多聚核苷酸被用于表达蛋白质时，寡核苷酸或多聚核苷酸将至少含有正义或编码链(即，寡核苷酸或多聚核苷酸可以是单链的)，但是可以同时含有正义和反义链(即，寡核苷酸或多聚核苷酸可以是双链的)。

如此处所述，术语“纯化的”或“纯化”指的是从样品中去除成分(例如，污染物)。例如，通过去除污染的非免疫球蛋白纯化抗体；还通过去除不结合靶分子的免疫球蛋白来对抗体进行纯化。去除非免疫球蛋白和/或去除不结合靶分子的免疫球蛋白导致样品中具有目标反应活性的免疫球蛋白的百分比的增加。在另一个实施例中，重组多肽在细菌宿主细胞中表达，并通过去除宿主细胞蛋白质来纯化该多肽；因此样品中重组多肽的百分比增加。而在另一个实施例中，通过从样品中去除或减少一种或多种成分来纯化样品中的核酸。在纯化中减少或去除的成分包括其它核酸、破坏了的核酸、蛋白质盐等。

“氨基酸序列”和术语例如“多肽”或“蛋白质”的意思并不局限于和所述蛋白质分子相关联的完整的、天然的氨基酸序列。

此处所述的术语“天然蛋白质”表明蛋白质不含有载体序列编码的氨基酸残基；即，仅含有在天然存在的蛋白质中发现的那些氨基酸的天然蛋白质。可以通过重组的方法或从天然来源中分离来产生天然蛋白质。

此处所述的术语“部分”，当表述蛋白质(如在“给定蛋白质的一部分“)时，指的是那种蛋白质的片段。该片段的大小范围可以从4氨基酸残基到整个氨基酸序列减去一个氨基酸。

如此处所述，术语“细胞培养”指的是细胞的任意体外培养。包括在这个术语内的有连续细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养、变异细胞系、有限细胞系(例如，非变异细胞)和可在体外维持的其它任意细胞群体。

如所述，术语“真核生物”指的是区别于“原核生物”的生物体。其意指该术语包括所有具有显示出常见的真核生物特征的细胞的有机物，所述特征例如存在由核膜包裹的真正的核，染色体位于其中，存在膜旁细胞器，和其它通常在真核生物中观察到的特征。因此，该术语包括但不限于例如真菌、原生动物和动物(例如人类)这些生物体。

如此处所述，术语“转显性负突变基因”指的是编码防止相同基因或基因产物的其它拷贝的蛋白质产物的基因，所述相同基因或基因产物没有发生功能特性的突变。转显性负突变基因的产物在此处被称为“显性负相”或“ DN”(例如，显性负相蛋白质，或DN蛋白质)。

如此处所述，术语“试剂盒”指的是用于运输材料的任意运输系统。对于反应材料，例如供体细胞，这种运输系统包括从一个场所到另一个场所允许反应试剂(例如，细胞、缓冲剂、选择试剂等，在合适的容器中)和/或支持材料(例如，介质、使用材料的书写的技术说明书等)储存、运输(transport/delivery)的系统。例如，试剂盒包括一种或多种，含有有关反应试剂盒/或支持性材料的围绕物(例如，盒子)。如此处所述，术语“分段式试剂盒”指的是包括两个或两个以上包装的运输系统，每个包装含有试剂盒全部组件的一个子部分。该包装可以一起或单独运输给接受者。例如，第一个包装可以含有用于特定用途的细胞，而第二个包装含有选择性培养基。术语“分段式试剂盒”包括含有符合联邦食品、药物和化妆品法案520(e)部分规定的分析物专属试剂(ASR)的试剂盒，但是不限于此。事实上，任意的包括两个或两个以上分离的包装、每个包装含有试剂盒全部组件的一个子部分的运输系统都被包括在术语“分段型试剂盒”中。相反，“组合型剂盒”指的是，在单一包装中含有特定用途所需反应材料的所有组件的运输系统(例如，在单独一个盒子中存放每个所需组件)。术语“试剂盒”包括分段型和组合型试剂盒。

如此处所述，术语“细胞代谢功能”指的是除了基因组复制以外，任意或所有的细胞进行的过程(例如，与细胞功能关联的酶促或化学过程)。

发明详述

许多类型的治疗皮肤损伤的病人需要延长住院、多次接受手术治疗、医药介入和输血(例如，灼伤患者或带有慢性溃疡的糖尿病患者)。一些研究表明，创伤和手术的严重程度和这些患者发展为脓血病的素因之间有因果关系(参见，例如，Angele和Faist，Crit Care 6，298(2002)；Roumen等人，Ann Surg 218，769(1993))。

未分辨的脓血病导致多器官衰竭并最终导致死亡。器官衰竭是创伤和手术患者死亡的最主要的原因。过度的炎症应答和细胞介导免疫的抑制使这些病人容易遭受感染性并发症(参见，例如Angele andFaist，Crit Care 6，298(2002)；Faist，Curr Top MicrobiolImmunol 216，259(1996)；和Schinkel等人，J Trauma 44，743(1998))。

每年，在紧急医护医院和持久性保健服务机构中有500万名以上病人使用导尿管(Maki，D.G.和P.A.Tambyah，Emerg Infect Dis7(2)：342-7(2001))。对于尿路梗阻患者、需要精确的输出监查的情况、手术期间选择的泌尿外科和妇科手术来说使用尿引流导管是必需的(Nicolle，L.E.Drugs Aging 22(8)：627-39(2005))。有时，使用长期留置导管来辅助压迫性溃疡愈合；它们还有时被用于治疗失禁或尿潴留。最常见的导尿管的并发症是UTI，并且在医院和疗养所中导管相关UTI(CAUTI)是最常见的医院感染占全部院所获得性感染的40％以上。

最近几年里，一些多抗生素抗性细菌菌株的出现已经使严重受伤患者的医院感染治疗非常困难。甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌和鲍氏不动杆菌(A.baumannii)是严重受伤患者中最难以控制和消除的的几种感染中的两种。通常，鲍氏不动杆菌或者是全药抗性或者是仅对毒性非常大的抗生素可立其丁(Colistin)敏感。鲍氏不动杆菌的爆发正在变得更加常见和普遍。需要新策略来提供有效的治疗武器对抗这些全药抗性感染。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了治疗疗法，包括含有一种或多种质粒(例如，自我转移型或非自我转移型质粒)的供体细胞(例如，致病的或非致病细菌，不分裂细胞)，其中该质粒可以从供体细胞转移(例如，通过接合)到靶/受体细胞(例如，致病微生物)中，导致质粒在靶中表达其遗传物质。

在一些实施方案中，本发明提供了包含可转移质粒的供体细胞，其中质粒可以从供体细胞转移(例如，通过接合)到受体细胞(例如，病原性微生物)中，导致质粒在受体细胞中表达其遗传物质，来改变细胞功能，例如，受体细胞的致病因子。在优选的实施方案中，可转移质粒是重组的可转移质粒。用于多种目的的从供体细胞转移遗传物质到目标受体细胞的接合已经被描述。参见，例如，PCT公开WO02/18605，美国专利申请系列号20040137002和美国专利申请系列号10/884,257，每一个均引入此处以其整体作为参考。本发明利用接合转移来改变受体细胞的细胞功能，例如，杀死或损伤靶细胞。

考虑到了，根据本发明的受体细胞的改变还包括改变这种细胞来改变这种受体细胞对药物例如，抗生素的反应。考虑到了，对受体细胞进行的改变该受体细胞的代谢因此所述受体细胞变得对药物敏感或增强对药物的敏感或反应的任何改变都被包括在本发明的方法、组合物和系统中，在一些实施方案中，本发明的可转移质粒编码能抑制病原体破坏或灭活药物例如抗生素的能力的因子。例如，转移质粒的表达产物可以破坏能够破坏或灭活抗生素的病原体酶的能力，在其它实施方案中，转移质粒的表达产物可以在病原体细胞上或细胞中提供抗生素受体，或者在病原体细胞上或细胞中恢复有缺陷的抗生素受体，而在其它实施方案中，转移质粒的表达产物可以促进抗生素进入病原体细胞，或者抑制病原体细胞的将抗生素运出病原体细胞之外的能力。

在一些实施方案中，转移质粒的表达产物可以用于将失活的药物例如前体药物代谢为活性形式，例如，受体细胞敏感的形式。使用代谢为活性药物形式的前体药物对于绕过药物抗性机制和提供选择性治疗尤其有益，例如，具有合适的可转移质粒的靶细胞。

可转移质粒

RK2接合系统是非常优秀的DNA从革兰氏阴性细菌宿主(例如，大肠杆菌)中转移的方法，并且RK2质粒甚至能跨界接合(参见，例如，Bates等人，J Bacteriol 180，6538-6543(1998)；Waters，NatGenet 29，375-376(Dec，2001))。RK2在动物或酵母细胞中不能稳定复制，但是发生DNA转移。因此，功能性RK2接合装置能从大量革兰氏阴性细菌宿主中迁移质粒DNA。已经表明，只要引入合适的营养复制起点，质粒能从这些供体(大肠杆菌和其它革兰氏阴性供体)迁移到其它革兰氏阴性目标菌株中，并且甚至是革兰氏阳性菌株(参见，例如，Giebelhaus等人，J Bacteriol 178，6378-6381(1996))，产生接合后体。本发明的接合系统不限于RK2，因为接合质粒的主体部分有很高的相似性，并且其它任何系统都能被用作运输系统。

例如，考虑了多种其它的接合系统适用于本发明中，包括单不限于RK2、R6K、pCU1、p15A、pIP501、pAM1、pCRG1600。在一些实施方案中，同时使用了两种或两种以上的接合系统，除了那些已描述的，能在本发明中使用的示例性质粒包括，但不限于，美国专利申请20040137002，20040224340和10/884,257(此处被整体引用仅作为参考)中的那些。

杀伤质粒

在实行本发明时不必理解机制，并且本发明不限于任何特定的作用机制，已经考虑到，在一些实施方案中，供体细胞包含能接合转移到目标中的可转移质粒，在靶细胞中该质粒编码的一种或多种产物被表达(例如，制备mRNA或蛋白质)，导致杀死靶细胞或抑制靶细胞的生长(参见，例如，实施例6和7)。在一些实施方案中，供体细胞进一步包含了辅助质粒。在一些实施方案中，可转移质粒是自我可转移质粒。

在一些实施方案中，供体细胞包含含有编码杀菌多聚氨基酸(例如，多肽或蛋白质)的核酸的非自转移质粒(例如，pCON15-56A)，在优选的实施方案中，供体细胞进一步包含了编码能中和供体细胞中非自体转移质粒的多聚氨基酸的杀菌特性的多聚氨基酸的核酸(例如，一种免疫蛋白质；参见，例如，实施例2和4)。在优选的实施方案中，编码中和多聚氨基酸的基因位于辅助质粒上，包括但不限于pCON1-93或pCON1-94。在一些实施方案中，能中和杀菌多聚氨基酸的多聚氨基酸被组成型启动子控制。在一些实施方案中，能中和杀菌多聚氨基酸的多聚氨基酸被可诱导的启动子控制。在实行本发明时不必理解机制，并且本发明不限于任何特定的作用机制，已经考虑到，在一些实施方案中，在供体细菌中能中和杀菌多聚氨基酸的多聚氨基酸和杀菌多聚氨基酸形成一种非毒性复合物，该复合物被分泌到供体细菌外面，该复合物或构成部分结合到靶细胞的受体上，被易位进入靶细胞并且随后靶细胞死亡。

在一些实施方案中，杀菌多聚氨基酸被colE3基因编码。本发明不限制使用的杀菌基因的类型。事实上多种杀菌基因被考虑到，包括但不限于colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9和编码溶菌酶的基因。在一些实施方案中，自体转移型或非自转移型质粒包含驱动杀菌蛋白表达的启动子(例如，lac启动子/操纵子)。在一些实施方案中，辅助质粒编码能抑制杀菌基因表达的阻遏蛋白(例如lacI)。在一些实施方案中，阻遏蛋白被组成型启动子控制，在一些实施方案中，阻遏蛋白被可诱导启动子控制。

如上所述，在优选的实施方案中，本发明的供体细胞包含抑制或中和可转移质粒表达的杀菌蛋白的免疫蛋白。本领域已知多对杀菌蛋白和相对应的免疫蛋白。在本发明中，列于上面的杀菌蛋白分别被相对应的大肠杆菌素A、大肠杆菌素B、大肠杆菌素D、大肠杆菌素Ia、大肠杆菌素Ib、大肠杆菌素K、大肠杆菌素N、大肠杆菌素E1、大肠杆菌素E2、大肠杆菌素E4、大肠杆菌素E5、大肠杆菌素E6、大肠杆菌素E7、大肠杆菌素E8、和大肠杆菌素E9免疫蛋白所抑制。本领域还已知其它的杀菌蛋白(例如，杆菌素(bacteriocins))和中和性免疫蛋白(参见，例如，在环球网网址us.expasy.org/cgi-bin/get-entries？KW＝Bacterioin％20immunity中的杀菌蛋白的示例性表格，瑞士生物信息学研究所(SwissInstitute of Bioinformatics，SIB)的ExPASy(专业蛋白质分析系统，Expert Protein Analysis System)蛋白组学服务器)。在一些实施方案中编码免疫蛋白的基因被启动子控制，其中所述启动子是组成活性的。在一些实施方案中，启动子是Pneo。在其它的实施方案中，编码免疫蛋白的基因被可诱导的启动子控制，在一些实施方案中，辅助质粒是pCON1-93或pCON1-94。

多种自体转移和非自体转移质粒被考虑在本发明中，例如，在一些实施方案中，本发明使用了质粒RSF 1010作为骨架来构建质粒。在一些实施方案中，质粒衍生于pACYC177。已经考虑到，包括本发明的质粒的组合物被用于研究和治疗应用。

供体细胞

供体细菌

已经考虑到，在本发明中任意类型的细菌(例如，革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌)能被用作供体细胞(参见，例如，实施例1)。可以采用一些方法来防止供体细菌的扩散(例如，生长)。除了使用不分裂细胞作为供体(参见，例如，美国专利申请10/884,257，2004年7月2日提交，其整体引入此处作为参考)以外，其它一些方法包括，但不限于，使用带有温度敏感突变(例如，氨酰tRNA合成酶和RNase P突变)、营养突变(例如，dapA和aroA)、丝氨酸突变和/或其它突变或氨基酸合成缺陷的供体。这些例子不意味着限制发明的范围。本领域熟练人员将会立刻认识到有减弱供体细菌的替代方法。在本领域内这些突变体已经被分析并被充分了解，并且本领域熟练人员完全具有将这些突变引入到新获得的细菌供体的能力。

在一些实施方案中，本发明的供体细菌细胞包含温度敏感突变体。温度敏感突变体与其同源野生型细菌相比在特定温度范围内异常生长，在突变体中，RNA或蛋白质的突变产生对稳定敏感的效果(例如，构象改变)，因此突变体可以在其允许温度下在实验室中生长；但是，它们在非允许(例如，较高)温度(例如，在体温下)下具有严重的生长缺陷。

这些突变的例子包括氨酰tRNA合成酶(参见，例如，Sakamoto等人，J Bacteriol 186，5899-5905(2004)；Martin等人，J Bacteriol179，3691-3696(1997))，和RNase P(Li，Rna 9，518-532(2003)；Li和Altman，Proc Natl Acad Sci U S A 100，13213-13218(2003))。氨酰tRNA合成酶催化，特定氨基酸和相对应的tRNA的3′末端腺苷的酯化作用，并且在所有生物体中RNase P在产生成熟的tRNA  5′末端中都是关键的(Gopalan等人，J Biol Chem 277，6759-6762(2002))。这些酶功能的缺陷防止了蛋白质在细胞中的合成。

在一些实施方案中(例如，当革兰氏阳性细菌是目标时)，使用了革兰氏阳性供体。革兰氏阳性供体细菌包括，但不限于，芽胞杆菌(Bacillus sp.)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、肠球菌(Enterococcus sp.)、链球菌(Streptococcus sp.)、乳(酸)杆菌(Lactobacillus sp.)和乳球菌(Lactococcus sp.)。在这些菌株中，乳(酸)杆菌和乳球菌尤其有用，因为这些菌种已经被用于食品工业中，并且在联邦管理法规(Code of Federal Regulations，CFR)第21条(Title 21)中被分类为GRAS(公认为安全的)。对于这些革兰氏阳性宿主来说，在其它质粒中，有可能使用接合质粒pAD1和/或pCF10，它们是被研究的最透彻的两种革兰氏阳性接合质粒(参见，例如，Hirt等人，J Bacteriol 187，1044-1054(2005)；Francia的人，Plasmid 46，117-127(2001))。这些质粒的接合装置和RK2具有相当水平的相似性。根据文献，考虑了在用于本发明时这些质粒能被修饰(参见，例如，实施例2)。这些修饰包括(还有其它的)产生可迁移质粒、整合细菌基因、和加入和删减限制性内切酶切割位点。

在本发明的优选的实施方案中，在发明的质粒和供体细胞中采用某种特征来最小化因使用DNA或遗传修饰的有机体而伴随的对环境的潜在危险。例如，在环境敏感情况下可以优选使用非自体转移质粒。因此，在一些实施方案中，质粒是通过接合装置迁移的，而不是自体转移的。如此处所述，在一些实施方案中这可以通过将所有的tra基因整合进宿主染色体来实现，其中所整合基因的产物是接合装置组装所必须的。在这种实施方案中，质粒被设置为仅拥有一个转移起始位点(oriT)。这种特征防止受体进一步转移质粒(在其死亡之前甚至之后)。

另一种生物安全性特征包括使用带有预定宿主范围的接合系统。如上面所述，已知某些元件仅在少数相关细菌(窄宿主范围)中有功能，而其它的已知在许多不相关细菌(广宿主范围或泛宿主性)中也有功能(del Solar等人，Mol.Microbiol.32：661-666，(1996)；Zatyka和Thomas，FEMS Microbiol.Rev.21：291319，(1998))。并且，那些接合系统中的许多只能在革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌中发挥功能，通常不能在两者中都发挥功能(del Solar，1996，supra；Zatyka and Thomas，1998，同上)。

在一些实施方案中，本发明的供体细菌细胞包括营养缺陷型突变体。本领域已知非常多的营养缺陷型突变体。引起这种表型的基因的例子有dapA和aroA。dapA编码一种二氢吡啶二羧酸合酶(dihydropicolinate synthase)，该酶是植物和细菌(参见，例如，Ledwidge和Blanchard，Biochemistry 38，3019-3024(1999))中赖氨酸生物合成的关键酶，而aroA编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶，该酶催化芳香族氨基酸的合成的关键步骤(参见，例如，Rogers等人，Appl Environ Microbiol 46，37-43(1983))。这些突变体能在补充这些细菌缺乏的氨基酸的实验室条件下生长。但是，在应用中，这些突变体因为缺乏关键的营养因子不能良好的生长。除了两个实施例之外，本领域熟练人员知道有许多相似的营养缺陷型突变体能被使用。

在本发明中，通过避免使用抗生素抗性标记来最小化抗生素抗性的悄然增加。在一个优选的替代方法中，能突变负责一种氨基酸(例如，丝氨酸)合成的基因，在供体中产生对这种氨基酸的需求。这种突变细菌在它们含有带有ser基因的质粒的情况下能在缺乏的所述丝氨酸的培养基中生长，该基因的产物是生长所需要的。相似的，能突变负责任意数量的管家功能的基因，因此细胞将不能生长，除非它们含有能提供被突变管家基因的有功能版本的质粒。

因此，发明考虑了含有Ser基因或许多其它营养遗传标记中的一个、或者一种或多种管家基因的质粒的有益用途。这些标记允许来质粒在供体细胞中的选择和维持。

另一种方法包括使用限制-修饰系统来调整质粒的宿主范围。预计在分类学相关物种之间接合和质粒定居的发生频率更高，其中质粒能避开限制系统并复制。II型限制型核酸内切酶在双链DNA中特定的识别序列中或在其附近让双链断裂。同源修饰酶能甲基化这个相同的序列并保护它不被切割。限制-修饰系统(RM)在细菌和古细菌中是普遍存在的，但是在真核生物中是不存在的。一些RM系统是质粒编码的，而其它的在细菌染色体上(Roberts和Macelis，Nucl.Acids Res.24：223-235，(1998))。当外源DNA例如病毒或质粒DNA没有被合适的修饰酶修饰时，限制性酶切割这种DNA。用这种方法，细胞被保护免于外源DNA的入侵。因此，通过使用产生一种或多种甲基化酶的供体菌株，能避免一种或多种限制性酶的切割。使用定向诱变产生没有特异性限制性位点或含有新位点的质粒DNA，分别来保护质粒DNA不受核酸内切酶的伤害或使其易受核酸内切酶的伤害。在一些实施方案中，使用了广谱宿主范围的质粒，仅简单的通过不具有许多存在于窄宿主范围质粒中的典型的限制性切割位点来规避限制系统(Wilkins等人，J.Mol.Biol 258，447-456(1996))。

在一些实施方案中，本发明利用了环境安全的细菌作为供体。安全细菌是本领域已知的。例如，已经报道了通过减毒的胞内革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌运输DNA疫苗(Dietrich等人，2001 Vaccine 19，2506-2512；Grillot-Courvalin等人，1999 Current Opinion inBiotech.10，477-481)。此外，供体菌株可以是克隆身体的有菌部分(例如，皮肤、胃肠、泌尿生殖、嘴、鼻道、咽喉和上气道系统)的数千种有害细菌中的一种，在一些优选的实施方案中，使用了低毒力的菌株。例如，大肠杆菌83972是获自于一个瑞典女孩泌尿道的野生型菌株，该女孩被菌寄居3年，其间她没有任何症状并且肾功能没有受损。在人体实验中已经证实大肠杆菌83972能暂时无症状的移殖到膀胱中。

1991年公布了大肠杆菌83972人体中的第一个实验(Darouiche，R.O.和R.A.Hull，J Spinal Cord Med 23(2)：136-412000(2000))。8名具有复发的有症候的对常规抗生素疗法UTI耐药的历史的妇女接受了总共15次定居尝试。大肠杆菌83972在尿道中平均维持88天(范围：1-226天)。仅有一名受试者显示出较低UTI症状，并且用抗生素对她成功地进行了治疗；大肠杆菌83972是从她尿液中培养出的唯一生物体。其他7名病人显示短暂的(＜48小时)脓尿和排泄尿白(细胞)介素IL-6和IL-8，但是没有包括发烧、血白细胞数、排尿困难、血清IL-6、血清IL 8或红细胞沉降率增加在内的系统体征和症状(Andersson，P.，I.Engberg，等人，Infect Immun 59(9)：2915-21(1991)；Agace，等人，J Clin Invest 92(2)：780-5(1993))。因此，大肠杆菌83972显示出在体内引起极小的炎症反应，参见，例如，美国专利6,719,991，所述专利在此处被整体引用作为参考。

非生育供体细胞

在另一种策略中使用了非生育供体来代替活细胞。例如，微细胞和大细胞是研究透彻的具有代谢活性但是不能生育的细菌细胞的模型系统。微细胞缺乏染色体DNA，是通过特殊的突变细胞经过没有DNA复制的细胞分裂产生的。如果细胞含有多个拷贝的质粒，那么微细胞中有许多将含有质粒。微细胞既不分裂也不生长。但是，具有接合质粒的微细胞能接合复制并将质粒DNA转移到活的受体细胞中(参见，例如，美国专利4,968,619)。

大细胞是被处理来破坏其染色体DNA的细胞，但是保留了其所含质粒的功能。能从在其关键DNA修复通路(recA、uvrA、和phr)中携带突变的大肠杆菌菌株中获得大细胞。因为大细胞缺乏非常多的DNA修复功能，它们在暴露于低剂量的紫外线后死亡。重要的是，没有接受紫外线辐射的质粒分子(例如，pBR322)继续复制。在这种条件下能有效的发生转录和翻译(质粒指导的)(Sancar等人，J.Bacteriol.137：692-693(1979))，并且在辐射前产生的蛋白质足够维持接合。这被下面两个观察所支持：i)链霉素杀死的细胞存留活性供体，和ii)能在阻止基因重新表达的抗生素存在的情况下发生接合质粒的转移(参见，例如，Heineman和Ankenbauer，J.Bacteriol.175.583-588(1993)；Cooper和Heineman，Plasmid 43，171-175(2000))。相应的，紫外线处理的大细胞将能够转移质粒DNA到活的受体中。还要注意的是，细菌间recA和uvrA基因的保守性将会允许供体菌株的大细胞，而不是获得大肠杆菌。

在一些实施方案中，本发明利用了不分裂细胞(例如，在2004年7月2日提交的美国专利系列10/884,257中所描述的，其整体引入此处作为参考)作为供体细胞。不分裂细胞通常被处理，因此分裂和生长能力被去除而接合效果被保留下来。在优选的实施方案中，不分裂细胞被处理，因此染色体DNA被损坏，但是没有被破坏到和创建大细胞中相同的程度。

在一些实施方案中，使用了没有功能改造的微生物，无功能的原因是其对细胞功能(例如，细胞壁、蛋白合成、RNA合成，例如，如美国专利4,968,619中所述)关键的编码基因含有稳定敏感突变。

对于许多方法来说，能够使用条件复制质粒。这种质粒，能在供体中复制而不能在受体细菌中复制，仅因为它们的同源复制起始蛋白(例如，Rep)在前一种细胞中产生而不在后一种细胞中产生。在一些实施方案中，变种质粒在rep基因中含有温度敏感突变，因此它只能在低于37℃的稳定下复制。因此，其复制将在细菌应用于皮肤上时发生，而如果这种细菌侵入到身体核心复制则不会发生。

在一些实施方案中，本发明提供了能杀死任意细菌细胞的组合物和方法。本发明不被靶细胞的类型所局限。例如，靶细菌细胞包括，但不限于，选自于沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏杆菌属(Shigella)、大肠杆菌属(Escherichia)、肠道细菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、耶尔森菌属(Yersinia)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、哈夫尼亚菌属(Hafnia)、爱文菌属(Ewingella)、克罗非菌属(Kluyvera)、摩根氏菌属(Morganella)、动性球菌属(Planococcus)、口腔球菌属(Stomatococcus)、细球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、(Plessiomonas)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、放线杆菌属(Actinobacillus)、巴斯德菌属(pasteurella)、支原菌属(Mycoplasma)、脲原体属(Ureaplasma)、立克次体(Rickettsia)、柯克斯氏体属(Coxiella)、罗卡利马氏体菌属(Rochalimaea)、埃里希氏体属(Ehrlichia)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、气球菌属(Aerococcus)、兼性双球菌属(Gemella)、乳球菌属(Lactococcus)、白联珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pedicoccus)、芽胞杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、隐秘杆菌属(Arcanobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、李斯特菌属(Listeria)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、加德纳菌属(Gardnerella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弓形菌属(Arcobacter)、沃廉菌属(Wolinella)、缠绕杆菌属(Helicobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、华丽单胞菌属(Chryseomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、埃肯菌属(Eikenella)、黄色单胞菌属(Flavimonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、寡源杆菌属(Oligella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、威克氏菌属(Weeksella)、黄(单包)杆菌属(Kanthomonas)、博德特氏菌属(Bordetella)、弗朗西丝氏菌属(Franciesella)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、军团杆菌属(Legionella)、阿菲波菌属(Afipia)、巴尔通氏体属(Bartohella)、荚膜菌属(Calymmatobacterium)、心杆菌属(Cardiobacterium)、链杆菌属(Streptobacillus)、螺旋菌属(Spirillum)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、八迭球菌属(Sarcinia)、粪球菌属(Coprococcus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、丙酸菌属(Propionibacterium)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、乳酸菌属(Lactobacillus)、罗氏菌属(Rothia)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)、卟啉菌属(Porphyromonas)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)、纤毛菌属(Leptotrichia)、沃廉菌属(Wolinella)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、巨球型菌属(Megasphaera)、韦荣氏球菌属(Veilonella)、诺卡氏菌属(Norcardia)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、拟诺卡氏菌属(Norcardiopsis)、链霉菌属(Streptomyces)、小多孢菌属(Micropolysporas)、高温放线菌属(Thermoactinomycetes)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、密螺旋体(Treponema)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)、或衣原体(Chlamydiae)的那些。

在一些实施方案中，编码蛋白质(例如细菌蛋白)的核酸序列在可转移的或不可转移的质粒(例如，RK2、R6K、pCU1、p15A、pIP501、pAM1、pCRG1600或PCON4-78)上编码，并被置于拥有接合转移质粒到受体细胞(例如，细菌的致病或非致病的属)来表达蛋白质的能力的供体细胞(例如，细菌的致病或非致病的属)中，在优选的实施方案中，在可接合转移质粒上编码的核酸序列的表达导致杀死受体/靶细胞。除了此处描述的那些以外，能用于本发明的示例性的供体细胞包括，但不限于，美国专利申请20040137002、20040224340和10/884,257的那些，其整体引入此处作为参考。

治疗(Therapeutics)

本发明的组合物和方法能应用于人体治疗和多种的兽医、农艺、园艺以及食品加工应用。

对于人体和兽医用途，并且根据细胞群体或保护的目标组织(例如，通过杀死致病靶细胞)，考虑了下面的给予本发明的组合物(例如，含有可转移质粒的供体细菌细胞)的方式：局部、口腔、鼻腔、肺/支气管(例如，通过吸入剂)、眼、直肠、泌尿生殖器、皮下、腹膜内和静脉内。优选的细菌以药物制剂提供，在适用于为治疗患者选择的给予方式的运输载体中。

例如，给予供体细菌细胞到胃肠道或鼻道或通过吃(单独或掺入到受试者的饲料或食物中)。在这点上，需要注意前生命细菌，例如嗜酸乳(酸)杆菌，以含有低压冻干的细菌细胞和固体支撑物(例如甘露醇)的混合物的凝胶胶囊的形式销售。当凝胶胶囊和液体一起摄入时，低压冻干的细胞重新水合并变为活的、有克隆性的(colono genic)细菌。因此，以相似的方式，本发明的供体细菌细胞能以粉末的、低压冻干的制剂形式在凝胶胶囊中或在用于撒入食物或饮料的容器中提供。重新水合的、活的细菌细胞随后将定居和/或移殖到上和下胃肠系统中的所有部位，并且随后和目标致病细菌接触。

对于局部应用，细菌可以被配制为软膏或乳剂来涂抹于受影响的皮肤表面。软膏或乳剂制剂也适用于直肠或阴道运输，还有其它标准制剂，例如栓剂。合适的用于局部、阴道或直肠给药的制剂是药剂师所熟知的。

本发明将尤其适用于局部或粘膜给药来治疗多种细菌感染或细菌相关的不良症状。这些用途的一些代表性例子包括，但不限于，治疗(1)嗜血杆菌引起的结膜炎；(2)绿脓假单胞菌引起的外耳炎；(3)许多革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌引起的慢性(鼻)窦炎，并用于bronchii的(and for general decontamination of bronchii)；(4)与绿脓假单胞菌有关的囊性纤维化；(5)幽门螺旋杆菌(溃疡)、大肠杆菌、鼠伤寒沙门(氏)菌、弯曲杆菌和志贺(氏)杆菌引起的肠炎；(6)和阴道加德菌和其它厌氧菌关联的公开WO 02/18605PCT/USOI/27028；和(12)多种生物体引起的龈炎和/或齿衰变。

本发明的供体细胞能被应用于皮肤(例如，灼伤或感染皮肤)作为治疗剂或作为预防剂应用来防止细菌感染。考虑了通过一些运输装置将供体细胞应用于皮肤表面。

例如，本发明的组合物(例如包含杀伤质粒的供体细胞)能通过多种方法应用(例如，到皮肤灼伤或创伤表面上)，包括但不限于：悬浮于溶液中(例如，胶体溶液)并应用于表面；被悬浮于溶液中并使用喷雾涂布器喷到表面上；和纤维蛋白胶混合并应用到(例如喷雾)表面上(例如，皮肤灼伤或创伤)；被浸渍到创伤敷料或绷带上并将绷带应用到表面(例如，感染或创伤)；通过控释装置应用；浸渍到无细胞生物基质的一侧或两侧并随后置于表面上(例如，皮肤灼伤或创伤)因此保护伤口和定居物界面；以脂质体形式应用；被注入到体腔(例如通过导管注入到膀胱)或应用于体腔的开口处(例如，应用于尿道开口)；或应用在聚合物上。

在实行本发明时不必理解机制，并且本发明不限于任何特定的作用机制，已经考虑到，在一些实施方案中，一旦在皮肤或创伤表面，供体细菌就和目标致病细菌接触并通过接合过程让抗菌基因进入目标病原体，杀死病原体。

供体细菌可以是细菌的任意菌株包括任意革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。例如，在一些实施方案中，本发明提供了大肠杆菌、假单胞菌、克雷白(氏)杆菌、肠道细菌、不动杆菌、乳(酸)杆菌、乳球菌、葡萄球菌、链球菌、肠道球菌或拟杆菌作为供体细菌。在一些优选的实施方案中，供体细菌是大肠杆菌83972。参见，例如，Hull等人Infect Immun.Jan；67(1)：429-32(1999)。

在其它的实施方案中，本发明的组合物和方法能应用于表面治疗来减弱或生长抑制不需要的细菌(例如，病原体)。例如，处理用于侵入式治疗(例如手术、导管插入术等)的表面来防止因表面上细菌污染造成的受试者感染。已经考虑到了本发明的方法和组合物能用于治疗多种表面、物体、材料等(例如，医疗或急救器材、保育室和厨房设备和表面)来控制其细菌污染。

在其它的实施方案中，组合物能浸渍到可吸收材料中，例如缝线、绷带和纱布，或覆盖到固相材料的表面上，例如手术U形钉、拉链和导管来将组合物运输到防止微生物感染的位点。此类型的其它运输系统是本领域熟练人员所熟知的。

包含供体细菌的药物制品被制备为剂量单位形式来方便给药和剂量统一。如此处所用的剂量单位形式指的是，药物制品的物质分割单位，适于别人接受治疗。每个剂量应含有定量的供体细菌细胞来产生所需抗菌(例如，减弱病原性)效果，所述供体细菌细胞和选择的药物载体缔合在一起。确定合适的剂量单位过程是本领域熟练人员所熟知的。

根据病人体重剂量单位可以成比例的增加或减少。可以通过剂量浓度曲线计算来确定消除靶细菌群体或组织中的致病细菌的合适的浓度，这是本领域已知的。

也设想了发明的供体细胞的其它用途。包括多种农业、园艺、环境和食品加工应用。例如，在农业和园艺中，能将多种植物致病菌作为靶点来使植物疾病减到最少。一个适合作为靶点的植物病原体的例子是“梨火疫病病菌(Erwinia amylovora)”，它是导致火烧病的病因。

可以利用相似的策略来减少或防止切花的萎蔫。在兽医或动物农业中，发明的组合物(例如，质粒系统)能被掺入到动物饲料(鸡、牛)中来减少生物负载(bio-burden)或减弱某种病原生物(例如，沙门氏菌)。在其它实施方案中，发明能用于肉或其它食物中来减弱或中和病原菌(例如，肉中的大肠杆菌0157:H7)

环境应用包括，例如，工程改造苏云金杆菌和它的一种接合质粒来运输并条件表达杀昆虫剂(例如，控制散播疟疾或西尼罗病毒的蚊子)，在此应用以及在上述的农业和园艺应用中，已经设想了质粒和供体细菌的溶液、气溶胶或凝胶胶囊剂型。

实施例

提供下面的实施例来示范并进一步说明某些优选的实施方案和本发明的优选方面，并且不被解释为对其范围的限制。

在下面公开的实验中，应用来下面的缩写：℃(摄氏度)；cm(厘米)；g(克)；1或L(升)；μg(微克)；μl(微升)；μm(微米)；μM(微摩尔)；μmol(微摩尔)；mg(毫克)；ml(毫升)；mm(毫米)；mM(毫摩尔)；mmol(毫摩尔)；M(摩尔)；mol(摩尔)；ng(纳克)；nm(纳米)；nmol(纳摩尔)；N(当量)；pmol(皮摩尔)；bp(碱基对)；cfu(集落形成单位)；Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)；lacOP(编码大肠杆菌lac操纵子/启动子的区域)；Kan(卡那霉素抗性决定子)；Cm(氯霉素抗性决定子)；Tral(编码负责接合转移的基因的区域)；Control(编码调控区域的区域)；oriV(编码营养复制起点的区域)；oriT(编码接合转移起点的区域)；tetR(编码tetA的抑制子的基因)；tetA(编码对四环素抗性的基因)；Rep(编码负责复制的基因的区域)；Primase(编码参与复制的基因的区域)；Tra2(编码负责交配对形成的基因的区域)；colE3(编码大肠杆菌素E3的基因)；repA、repB和repC(编码RSF1010的营养复制中的关键蛋白)；mobA、mobB和mobC(编码负责RSF1010的迁移的蛋白)；编码重复子的区域，ssiA和ssiB(营养复制起始)

实施例1

用于体外和体内检测的供体

通过接合，质粒能以自体转移或非自体转移方式迁移。为了产生接合转移产物，需要tra基因和oriT(转移起始)DNA序列。tra基因产物识别oriT序列并在序列内产生单链缺口，并将这个单链质粒DNA迁移到受体细胞中。当所有的必需tra基因和oriT序列都位于一个质粒上时，该质粒被称为自体转移型，因为该质粒的受体细菌会变为有效的接合供体。相反，非自转移型质粒携带有oriT序列，而没有整套的tra基因。只有在相同供体细胞中反式提供tra基因的产物时(来自于染色体或其它质粒中编码的基因)，该质粒才能迁移进入受体细胞中。在本发明开发过程中使用了大肠杆菌的衍生物(例如，K12、S17，参见，例如，Simon等人，Bio/Technologyl，784-791(1985))。这些菌株具有整合的RK2质粒，提供迁移质粒复制和接合转移所必需的所有tra基因产物，所述迁移质粒例如微RK2或IncQ质粒(例如，RSF1010)。因此，在一些实施方案中，本发明使用自体转移型质粒。

除了整合的tra基因以外，S17-1还是recA缺陷的，防止细胞中的多数同源重组。和亲本菌株相比，recA^-大肠杆菌生长明显变慢，并且其缓慢的生长是防止该供体扩散的一个重要因素。下面描述了这种菌株的进一步修饰，用于本发明的组合物和方法中的使用。

动物宿主中因感染触发炎症的主要成分是脂多糖(LPS)，而S17-1也带有LPS。LPS是细菌生存所必需的成分；因此去除该分子是不合理的方法。但是，LPS的某些修饰能让细胞生长但是显著降低炎症反应。例如，msbB基因编码负责肉豆蔻酰基团连接LPS的酶。从LPS中去除该酰基基团导致炎症反应下降10到100倍(参见，例如，Low等人，NatBiotechnol 17，37-41(1999))。因此，在一些实施方案中，本发明提供了删除(例如，通过基因置换)msbB基因的S17-1。我们使用常规的分子遗传技术(基因置换，参见，例如，Court等人，Annu RevGenet 36，361-388(2002)；和Gong等人，Genome Res 12，1992-1998(2002))在S17-1中删除msbB。根据此方法设计的新产生的大肠杆菌供体菌株被命名为CON4-11c。

测定了这种msbB缺陷菌株的接合效率，和对照相比其接合效率没有可检测的差别。因此，对治疗应用来说这是一种非常有用的菌株，因为它触发较少的炎症并不损害接合效率。在体外和体内试验中都使用了该菌株，来证明本发明的组合物和方法的有效性和广泛的应用范围。

实施例2

构建非自转移型杀伤质粒

RK2是一种广宿主范围质粒，并能够在几乎所有的革兰氏阴性细菌中复制。但是，它的接合效率根据不同的受体菌株而发生变化，并且绿脓假单胞菌是这些相对较差的接合受体之一，相反，IncQ组的质粒(例如，RSF1010)是迁移质粒，并且利用了RK2提供的tra基因产物(参见，例如，Less1等人J Bacteriol 174，2493-2500(1992)；Tietze，Microbiol Mol Biol Rev 65，481-496(2001))。使用绿脓假单胞菌作为受体比较了RSF1010和RK2的接合效率。结果显示，RSF 1010和该细菌的接合比RK2大约好100倍。因此，使用RSF1010作为骨架用于构建杀伤质粒。产生的这种质粒的一个例子是pCON15-56A(参见，例如，图5)。

为了产生pCON15-56A，RSF1010的PstI-NotI片段被携带有colE3和来自于RK2的tetA的PstI-NotI片段所置换，来产生pCON15-56A。colE3被lac启动子/操纵子lacPO所控制，在存在lac抑制子LacI以及在培养基中存在葡萄糖的情况下被严格抑制，在lacPO前面，克隆了转录终止子来防止因lacPO前发生的通读转录造成的colE3的泄露表达。RSF1010还携带有链霉素和磺胺耐药性决定子，但是在构建pCON15-56A过程中把它们删除来。下面显示来载体的简图。

在一些实施方案中，使用colE3作为杀菌基因。只要在培养基中加入葡萄糖，colE3在质粒上就被紧密抑制(参见，例如，Anthony，JMicrobiol Methods 58，243-250(2004))。这种高效毒素是一种核糖核酸酶，在16S核糖体RNA的3′末端特异性地切割保守的核酸序列(参见，例如，Bowman等人，Proc Natl Acad Sci U S A 68，964-8(1971))。但是，当携带有这种质粒的供体暴露于不含大量葡萄糖的环境(例如，在创伤部位)时观察到了泄漏表达。当这种情况发生时(即，只要细菌开始表达colE3)，因为该毒素的表达供体细胞会被杀死。为了避免该情况，在相同宿主细菌中引入辅助质粒。这种辅助质粒pCON1-94携带有编码一种针对毒素的免疫蛋白的immE3(参见，例如，Jakes和Zinder，Proc Natl Acad Sci U S A 71，3380-3384(1974))和lacPO的抑制子lacI。

pCON1-94质粒的骨架衍生自pACYC177。使用组成型启动子Pneo(来自于Tn5的表达新霉素耐药性决定子的启动子)来表达immE3。LacI在其自身的来自于lacI^Q的启动子的控制下表达。这种质粒具有卡那霉素耐药性决定子KmR。质粒pCON15-56A和pCON1-94是能共存的，并合适的选择压力下(卡那霉素和四环素)在大肠杆菌宿主中稳定维持。pCON1-94的结构在图6中描绘。

实施例3

监测接合

使用常规的过滤接合法检测接合效率。该方法在本领域中是成熟的方法(Merryweather等人，J Bacteriol 167，12-17(1986)。其过程见图1所示。在对两个平板上的菌落进行计数后，使用公式计算接合效率：

简而言之，供体和靶细胞在含有合适的抗生素的Luria Bertani(LB)培养基中生长过夜，使用相同数量的供体和受体/靶细胞用于过滤接合。接合后，细胞被连续稀释，并点到LB-抗生素平板上检测集落形成单位(cfu)。通过两种选择性标记(RifR TetR)选择接合后体，选择标记防止细胞混合悬液中的供体和靶细菌的生长。使用含有Rif的LB平板计算受体细胞的总数量(参见，例如，图1A)。随后，检测了使用接合质粒pCON4-45的接合效率。pCON4-45是RK2的衍生体，删除了6kb的包含有RK2上的IS21和Par/Mrs区域的NsiI-AsiSI片段。这个删除的区域对于这种质粒的接合是非必需的。因此，pCON4-45是自体转移型质粒。过滤接合后，细胞被系列稀释用于在Rif和Rif/Tet平板上铺板(参见，例如，图1B)。在两种平板上计算菌落数量，并计算接合效率。

实施例4

pCON15-56A的接合和杀死效果

如实施例2所述构建非自转移型杀伤性质粒pCON15-56A(参见，图5)。使用大肠杆菌作为受体/靶监测质粒的接合和杀死效果。使用常规的过滤接合法监测接合效率(参见，实施例3和图1B)。为了监测接合效率，使用携带有immE3基因的大肠杆菌菌株来中和进入的毒素基因来防止受体被杀死。

携带有pCON15-56A和pCON1-94的供体细菌能向培养基中分泌活性ColE3毒素，并杀死附近的ColE3敏感细菌。ColE3复合物和它的免疫蛋白ImmE3形成复合体，并分泌到供体细菌外。这种复合体结合到大肠杆菌表面的受体上(James等人，Microbiology 1421569-1580(1996))，毒素易位进入细胞，随后细胞死亡。在过滤接合过程中，供体和受体/靶细胞混合在一起，而大肠杆菌素敏感的受体/靶能被供体细胞周围的分泌的毒素以不依赖接合的方式杀死。但是，当这种受体发生突变时，因为毒素不能易位进入细胞，所以携带有这种突变的大肠杆菌菌株不再被ColE3杀死。象这样的突变体(例如，在ColE3受体中含有突变的大肠杆菌)被用作受体，用于将依赖接合型杀伤从不依赖结合型杀伤中区分出来。这种突变的大肠杆菌菌株被命名为RL315-E3R，并且也是K12的衍生体。

随后检测了杀伤质粒的接合和杀伤效率。使用过滤接合法(如实施例3所述)来介导接合。接合后，收获供体和受体细胞的混合物，并系列稀释。系列稀释的细胞悬液被点到含有利福平(rifampicin)/四环素的一套LB平板上来选择性生长接合后体。特异性的，供体细胞(con4-11c/pCON15-56A/pCON1-94)被接合到两种不同的大肠杆菌菌株上：一种对杀伤质粒(RL315-E3R)敏感，而另一种是抗性的(RL315-E3R/pCON1-94)。抗性菌株携带有具有immE3的辅助质粒，因此被保护免于受到杀伤质粒上的colE3的作用。在过滤接合后，供体和受体细胞的混合物被系列稀释，并被点到Rif/Tet平板上，在这些平板上只有接合后体能够生长。列‘a’显示了ColE3敏感菌株作为受体的结果，而列‘b’显示了ColE3抗性菌株作为受体的结果。

抗性菌株的存活表明杀伤质粒被成功的转移进入到受体菌株中。因此，敏感菌株的生长缺乏表明这些细胞被转移的ColE3基因的表达所杀伤，而不是因为选择性生长培养基(参见图2，从上到下，稀释度如下：×1，×10²，×10⁴和×10⁶)。

从杀伤质粒或非杀伤质粒处理的受体中分别计数了大约55和6×10⁶个生长菌落(参见，例如，图2)。这两个数字的对比说明用杀伤质粒处理的接合后体的存活率大约为0.001％。因此，使用此处所述的组合物，本发明提供了非常有效率的和有效的杀死靶细菌细胞的方法。

实施例5

体内效果检测

使用实施例4中所述的供体/质粒对，使用鼠灼伤/脓血病模型，检测了体内效果。简单的说，实验动物通过浸入100℃水中9秒接受3级全厚度(15％总体表面积)背侧烫伤。随后将绿脓假单胞菌PA14局部应用于灼伤伤口处。已经显示这种菌株对于一些宿主包括植物、蠕虫和动物是有毒力的(Rahme等人Science 268，1899-1902(1995))。根据其OD₆₀₀计算将病原体的数量调节为2×10⁴cfu。随后立即使用不同数量的包含质粒的供体细胞，并监测动物的生存率。

3天后几乎所有的单独暴露于PA14的小鼠都死亡了，并且在第5天所有的都死亡(参见，例如，图3)。但是，暴露于PA14和含有杀伤质粒的供体细菌的小鼠显著降低了死亡率。在第10天，对不同处理组之间的生存动物百分比进行来比较并计算了P值。所有的P值都小于0.000001，表明未处理小鼠(即，灼伤加病原体)和处理小鼠(即，灼伤加病原体加所有剂量的供体细菌细胞)之间的差异是高度显著的。

实施例6

构建新的杀伤质粒

RSF1010是属于IncQ组的可迁移质粒。使用一些接合系统包括RK2(Less1等人，J Bacteriol 174，2493-2500(1992))，该组质粒能够接合迁移。当RK2和RSF1010共存于一个细菌中时，RK2提供的接合装置能非常有效的迁移RSF1010。因为对宿主细菌的复制因子依赖性较小，该质粒能非常有效地接合绿脓假单胞菌，并且在实施例3中的过滤接合检测中经常达到100％的效率。RSF1010和RK2被组合在一起来产生自体转移型质粒来有效地接合绿脓假单胞菌。

特别的，衍生自RK2的tra基因和RSF1010的骨架结合在一起产生了pCON19-79。来自于RK2的oriT序列被诱变处理来防止质粒从该区域转移。通过删除源自RK2的复制起点oriV去除RK2的质粒复制功能。不同的是，pCON19-79利用源自RSF1010的oriT和oriV来分别进行质粒的迁移和复制。colE3在lacPO启动子的控制之下，并且其泄漏表达被该质粒前面串联位置的转录终止子所进一步抑制(参见，例如，Anthony等人，J Microbiol Methods 58，243-250(2004))。

RK2上tra基因的表达成功地被其自身质粒编码的一套抑制子蛋白所调整(Bingle等人，Mol Microbiol 49，1095-1108(2003))。没有这些抑制子，质粒中的tra基因的组成型表达会变得对宿主细胞致死性的，大概是因为在细菌细胞被膜中形成了微孔(Grahn等人，JBacteriol 182，1564-74(2000))。我们把这种抑制子降低型接合质粒导致的高水平的组成型tra表达称为CDC(ConstitutivelyDerepressed Conjugation，组成型脱阻抑接合)。该质粒的结构如图7所示。

pCON1-93(参见图8)被设置为为使用杀伤基因和强大的质粒转移来最大化受体/靶杀伤。在辅助质粒pCON1-93的伴随下该质粒能在大肠杆菌供体中维持(例如，con4-11c，参见实施例1)。辅助质粒携带有编码针对大肠杆菌素E3的免疫蛋白immE3，并且该质粒的结构如图8所示。pCON1-93的骨架源自于pUC19，并且通过PCR扩增immE3并克隆到质粒中。immE3在组成型启动子Pneo(新霉素耐药性决定子的启动子)的控制之下。

这两种质粒，pCON19-79和pCON1-93，在大肠杆菌供体CON4-11c(实施例1)中维持，并用于体外的杀伤实验。

实施例7

新质粒改善的体外杀伤示例

检测来开发作为本发明的一部分的新杀伤质粒(例如，参见实施例6)的杀伤能力。除了此处讨论的新质粒以外，还设计了一种新的检测来证明本发明的质粒(例如，实施例6的质粒pCON19-79和pCON1-93)的增强的杀伤能力。在这个实施例中，使用了两种不同的绿脓假单胞菌菌株和一种鲍氏不动杆菌菌株。两种绿脓假单胞菌菌株都是临床分离的菌株。其中一个分离自受伤病人，显示对多种抗生素有耐药性(PanR：多抗生素耐药)。鲍氏不动杆菌与灼伤和/或创伤有关，并且经常被发现对多种临床有用的抗生素有耐药性，因此成为主要的健康威胁。两种绿脓假单胞菌菌株都是利福平抗性的，而鲍氏不动杆菌菌株不是。如实施例2所述，需要合适的选择标记来监测接合效率，并且使用利福平抗性来选择性生长受体菌株。通过在染色体DNA上的自发突变获得利福平抗性突变。简而言之，鲍氏不动杆菌的过夜生长培养物被涂布到含有利福平的LB平板上，分离在这些平板上生长的突变体用于后续实验。靶菌株的过夜生长的细菌培养物覆盖到含有利福平的LB平板上。

携带有杀伤质粒(例如，实施例6的质粒)的供体细菌生长过夜，被系列稀释，并点到靶细菌的菌苔上面。只有受体/靶细菌以及接合后体能在含有利福平的LB平板上选择性生长。如果杀伤质粒迁移并有效杀死了受体细胞，供体斑点区域维持澄清，留下生长抑制地带。该实验策略如图4A所示。

简而言之，供体细菌的细胞悬液被点到均匀涂布在含有利福平的LB平板上的靶细菌的表面上。在利福平的存在下，只有靶细菌能够生长。当靶细胞被供体细菌杀死时，点上细胞悬液的区域变得澄清，因为供体和靶细菌的生长都被抑制了。如果供体对靶细菌没有效果(例如，如果供体不杀死受体/靶细菌或减弱其生长)，点上的区域就会变得被生长的靶细胞所覆盖。因此，使用这种检测方法能够测定新构建的供体/质粒对对于三种病原体的效果(参见，例如，图4B)。

每种病原体都用非杀伤质粒(处理′a′)和杀伤质粒(处理′b′)处理。如图4B所示，杀伤质粒(即，实施例6中产生的pCON19-79)在病原体菌苔上形成了生长抑制地带(在图4B中显示为变黑斑点)，证明了质粒杀死靶细菌的能力。要注意的是，供体细菌向培养基中分泌少量的大肠杆菌素E3。但是，在此实验中检测的每种病原体都对培养基中的毒素不敏感，有可能是因为它们在细胞表面缺乏这种毒素的受体。

实施例8

pCON19-79的体内效果检测

对于实施例6产生的质粒pCON19-79进行了和实施例5中完成的那些实验相似的实验。简而言之，通过浸入85℃的水中9秒使实验动物带上3级12％TBSA(总体表面积)背侧烫伤。随后将绿脓假单胞菌PA14局部应用于灼伤伤口。应用PA14后，立即将携带有pCON19-79的供体细胞以不同剂量应用于灼伤表面。监测10天的小鼠的生存率。接受2×10⁴cfu绿脓假单胞菌PA14处理而未应用包含有pCON19-79的供体细胞的52只对照小鼠中有42只在应用绿脓假单胞菌PA14到灼伤部位后的6天之内死亡(见表1，下面)。而和对照组相比，接受2×10⁴cfu绿脓假单胞菌PA14加多种剂量的含有pCON19-79的供体细胞处理的小鼠显示显著改善的生存率(参见，例如，图9)。例如，在接受2×10⁴cfu绿脓假单胞菌PA14和1.3×10¹⁰cfu供体细胞处理的52只小鼠中，没有一只在应用后10天内死亡。当使用较低剂量的供体细胞时观察到了死亡率的显著改善(参见，例如，图9)。

在上面详述中提到的所有出版物和专利在此处引用作为参考。发明描述的组合物和方法的多种修改和变化对于本领域熟练人员是明白的，没有脱离发明的范围和精神。虽然发明和特定的优选的实施方案结合在一起进行描述，但是应该了解所权利要求的发明不应当被不适当的限制在这些特定的实施方案中。事实上，所描述的执行发明的模型的多种修改对于相关领域的那些熟练人员是明白的，属于本发明的范围内。

Claims (47)

1.供体细胞用于制备组合物的用途，所述组合物用于处理组织表面而使所述表面对靶微生物的受体细胞有毒，包括：将所述表面暴露于所述组合物，其中所述供体细胞包含：

i)包含编码杀菌蛋白的核酸的重组的可转移质粒；和

ii)编码免疫蛋白的核酸，其中所述免疫蛋白被设置为抑制所述杀菌蛋白；

其中所述供体细胞选自：生育的细菌细胞和非生育的细菌细胞，所述非生育的细菌细胞缺乏染色体DNA或具有破坏的和/或降解的染色体DNA，且所述供体细胞中导入了对脂多糖的修饰，所述对脂多糖的修饰能让细胞生长，但降低对所述组合物的炎症反应，且其中所述供体细胞被设置为接合性地转移所述重组的可转移质粒到所述靶微生物的受体细胞中，并且其中所述重组的可转移质粒被设置为在所述受体细胞中表达所述的编码杀菌蛋白的核酸。

2.权利要求1的用途，其中所述的编码杀菌蛋白的核酸的表达对于所述受体细胞是致死的。

3.权利要求1的用途，其中所述杀菌蛋白是大肠杆菌素。

4.权利要求3的用途，其中所述大肠杆菌素是colE3。

5.权利要求1的用途，其中所述杀菌蛋白选自于colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、co1E8、co1E9和溶菌酶。

6.权利要求1的用途，其中所述免疫蛋白结合所述杀菌蛋白。

7.权利要求6的用途，其中所述免疫蛋白是immE3。

8.权利要求1的用途，其中所述免疫蛋白选自于大肠杆菌素A、大肠杆菌素B、大肠杆菌素D、大肠杆菌素Ia、大肠杆菌素Ib、大肠杆菌素K、大肠杆菌素N、大肠杆菌素E1、大肠杆菌素E2、大肠杆菌素E4、大肠杆菌素E5、大肠杆菌素E6、大肠杆菌素E7、大肠杆菌素E8、和大肠杆菌素E9免疫蛋白。

9.权利要求1的用途，其中对所述组织的所述处理包含处理所述组织中的创伤。

10.权利要求9的用途，其中所述创伤包含灼伤。

11.权利要求1的用途，其中在所述组织暴露于所述供体细胞之前所述组织和受体细胞接触。

12.权利要求1的用途，其中在所述组织暴露于所述供体细胞之前所述组织不和受体细胞接触。

13.权利要求1的用途，其中所述组织是皮肤。

14.权利要求1的用途，其中所述重组的可转移质粒是可自我转移的。

15.权利要求1的用途，其中所述受体细胞包含细菌细胞。

16.权利要求15的用途，其中所述细菌细胞是病原性细菌细胞。

17.权利要求16的用途，其中所述细菌细胞属于选自下述的菌属：沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏杆菌属(Shigella)、大肠杆菌属(Escherichia)、肠道细菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、耶尔森菌属(Yersinia)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、哈夫尼亚菌属(Hafnia)、爱文菌属(Ewingella)、克罗非菌属(Kluyvera)、摩根氏菌属(Morganella)、动性球菌属(Planococcus)、口腔球菌属(Stomatococcus)、细球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcu s)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、放线杆菌属(Actinobacillus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、支原菌属(Mycoplasma)、脲原体属(Ureaplasma)、立克次体(Rickettsia)、柯克斯氏体属(Coxiella)、罗卡利马氏体菌属(Rochalimaea)、埃里希氏体属(Ehrlichia)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、气球菌属(Aerococcus)、兼性双球菌属(Gemella)、乳球菌属(Lactococcus)、白联珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pedicoccus)、芽胞杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、隐秘杆菌属(Arcanobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、李斯特菌属(Listeria)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、加德纳菌属(Gardnerella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弓形菌属(Arcobacter)、沃廉菌属(Wolinella)、缠绕杆菌属(Helicobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、华丽单胞菌属(Chryseomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、埃肯菌属(Eikenella)、黄色单胞菌属(Flavimonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、寡源杆菌属(Oligella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、威克氏菌属(Weeksella)、黄(单包)杆菌属(Xanthomonas)、博德特氏菌属(Bordetella)、弗朗西丝氏菌属(Franciesella)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、军团杆菌属(Legionella)、阿菲波菌属(Afipia)、巴尔通氏体属(Bartonella)、荚膜菌属(Calymmatobacterium)、心杆菌属(Cardiobacterium)、链杆菌属(Streptobacillus)、螺旋菌属(Spirillum)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、八迭球菌属(Sarcinia)、粪球菌属(Coprococcus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、丙酸菌属(Propionibacterium)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、乳酸菌属(Lactobacillus)、罗氏菌属(Rothia)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)、卟啉菌属(Porphyromonas)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)、纤毛菌属(Leptotrichia)、沃廉菌属(Wolinella)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、巨球型菌属(Megasphaera)、韦荣氏球菌属(Veilonella)、诺卡氏菌属(Norcardia)、马杜拉放线菌属(Actinoma dura)、拟诺卡氏菌属(Norcardiopsis)、链霉菌属(Streptomyces)、小多孢菌属(Micropolysporas)、高温放线菌属(Thermoactinomycetes)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、密螺旋体(Treponema)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)、或衣原体(Chlamydiae)。

18.权利要求1的用途，其中所述导入了能让细胞生长，但降低对所述组合物的炎症反应的对脂多糖的修饰的供体细胞被修饰为减少所述供体细胞中的脂多糖上的肉豆蔻酰基基团。

19.包括供体细胞的组合物，所述供体细胞包含：

i)包含编码杀菌蛋白的核酸的重组的可转移质粒；和

ii)编码免疫蛋白的核酸，其中所述免疫蛋白被设置为抑制所述杀菌蛋白；

其中所述供体细胞选自：生育的细菌细胞和非生育的细菌细胞，所述非生育的细菌细胞缺乏染色体DNA或具有破坏的和/或降解的染色体DNA，且所述供体细胞中导入了对脂多糖的修饰，所述对脂多糖的修饰能让细胞生长，但降低对所述组合物的炎症反应，且其中所述供体细胞被设置为接合性地转移所述重组的可转移质粒到靶微生物的受体细胞中，其中所述重组的可转移质粒被设置为在所述受体细胞中表达所述的编码杀菌蛋白的核酸。

20.权利要求19的组合物，其中所述杀菌蛋白是大肠杆菌素。

21.权利要求20的组合物，其中所述大肠杆菌素是colE3。

22.权利要求19的组合物，其中所述杀菌蛋白选自colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colEl、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9和溶菌酶。

23.权利要求19的组合物，其中所述免疫蛋白结合所述杀菌蛋白。

24.权利要求23的组合物，其中所述免疫蛋白是immE3。

25.权利要求19的组合物，其中所述免疫蛋白选自于大肠杆菌素A，大肠杆菌素B、大肠杆菌素D、大肠杆菌素Ia、大肠杆菌素Ib、大肠杆菌素K、大肠杆菌素N、大肠杆菌素E1、大肠杆菌素E2、大肠杆菌素E4、大肠杆菌素E5、大肠杆菌素E6、大肠杆菌素E7、大肠杆菌素E8、和大肠杆菌素E9免疫蛋白。

26.权利要求19的组合物，其中所述可转移质粒包含RSF1010的oriT和oriV，并且其中所述编码ColE3的核酸在1ac启动子/操纵子的控制之下。

27.权利要求19的组合物，其中所述编码免疫蛋白的核酸在启动子的控制之下，其中所述启动子是组成型活性的。

28.权利要求27的组合物，其中所述启动子是Pneo。

29.权利要求19的组合物，其中所述的编码免疫蛋白的核酸在启动子的控制之下，其中所述启动子是可诱导的。

30.权利要求19的组合物，其中所述导入了能让细胞生长，但降低对所述组合物的炎症反应的对脂多糖的修饰的供体细胞被修饰为减少所述供体细胞中的脂多糖上的肉豆蔻酰基基团。

31.供体细胞用于制备组合物的用途，所述组合物用于处理离体表面而使所述表面对靶微生物的受体细胞有毒，包括将所述表面暴露于所述组合物，其中所述供体细胞包含：

i)包含编码杀菌蛋白的核酸的重组的可转移质粒；和

ii)编码免疫蛋白的核酸，其中所述免疫蛋白被设置为抑制所述杀菌蛋白；

其中所述供体细胞选自：生育的细菌细胞和非生育的细菌细胞，所述非生育的细菌细胞缺乏染色体DNA或具有破坏的和/或降解的染色体DNA，且所述供体细胞中导入了对脂多糖的修饰，所述对脂多糖的修饰能让细胞生长，但降低对所述组合物的炎症反应，且其中所述供体细胞被设置为接合性地转移所述重组的可转移质粒到所述靶微生物的受体细胞中，其中所述重组的可转移质粒被设置为在所述受体细胞中表达所述的编码杀菌蛋白的核酸。

32.权利要求31的用途，其中所述表面存在于医学装置、创伤护理装置、体腔装置、个人保护装置、生育控制装置和药物运输装置中的一种或多种上。

33.权利要求31的用途，其中所述表面包含硅、塑料、玻璃、聚合物、陶瓷、光致抗蚀剂、硝酸纤维素、水凝胶、纸、聚丙烯、衣服、棉花、羊毛、木、砖、皮革、乙烯树脂、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯酰胺、光导纤维、天然纤维、尼龙、金属、橡胶或它们的复合物。

34.权利要求31的用途，其中所述处理抑制受体细胞在所述表面上的生长。

35.权利要求34的用途，其中所述处理杀死与所述表面发生接触的受体细胞。

36.权利要求31的用途，其中所述质粒是可自我转移的。

37.权利要求31的用途，其中所述被修饰为降低对所述组合物的炎症反应的供体细胞被修饰为减少所述供体细胞中的脂多糖上的肉豆蔻酰基基团。

38.权利要求31的用途，其中所述供体细胞是低毒力细菌细胞。

39.权利要求38的用途，其中所述低毒力细菌细胞是大肠杆菌(E.coli)83972细胞。

40.权利要求31的用途，其中所述表面是组织表面。

41.权利要求40的用途，其中所述组织是膀胱组织。

42.权利要求31的用途，其中所述导入了能让细胞生长，但降低对所述组合物的炎症反应的对脂多糖的修饰的供体细胞被修饰为减少所述供体细胞中的脂多糖上的肉豆蔻酰基基团。

43.权利要求19的组合物，其中所述供体细胞是低毒力细菌细胞。

44.权利要求43的组合物，其中所述低毒力细菌细胞是大肠杆菌83972细胞。

45.权利要求31的用途，其中所述供体细胞是低毒力细菌细胞。

46.权利要求45的用途，其中所述低毒力细菌细胞是大肠杆菌83972细胞。

47.权利要求32的用途，其中所述表面包括导管表面。

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