KR20150127266A - 디포신류 및 이들의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 위험한 병원체인 클로스트리듐 디피실레 박테리아를 특이적으로 사멸하는 R-형 고분자량 박테리오신을 인코딩하는 유전자의 전체 클러스터의 발견 및 단리에 관한 것이다. 또한 개시내용은 무해한 호기성 생산자 세포 내에서 R-형 박테리오신을 생산하는 방법이다. 개시내용은 또한 디포신류 안으로 편입되어 변경된 사멸 스펙트럼을 갖는 조작된 또는 변이체 디포신류를 형성하는, 소분자의 비-ORF1374 수용체 결합 도메인(RBDs)이다. 본 명세서에서 제공된 변이체 디포신류는 이종성 RBD 및 그의 동족 기저판 부착 영역 (BPAR), 또는 융합된 BPAR을 포함할 수 있다. 본 발명은, C. 디피실레 박테리아가 감염된 환자 또는 농장 동물의 큰 피해 및 심지어는 사망을 야기할수 있는, 위장관의 환경에서 이들 박테리아를 선택적으로 사멸하기 위해, 증가된 열적 및 pH 안정성을 갖는 강력한 살균제 및 이를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

디포신류 및 이들의 사용 방법{DIFFOCINS AND METHODS OF USE THEREOF}

보조금 정보

본 발명은 알러지와 감염성 질환을 위한 국립연구소인, 미국 국립보건원에 의해 수여된 과제 번호 R43AI098186-01 하에 정부 지원을 받아 만들어졌다. 미국정부는 본 발명에서의 특정한 권리를 가진다.

서열 목록

본원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되고 그리고 이로써 그 전체가 참고로 편입된 서열목록을 포함한다. 2014년 3월 6일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 CF210341_SL.txt로 명명되고 그리고 크기는 476,921 바이트이다.

발명의 분야

본원은 일반적으로 박테리오신, 더 구체적으로는 클로스트리듐 디피실레를 특이적으로 사멸시키는 R-형 고분자량 박테리오신을 생성하기에 충분한 유전자의 클러스터의 동정 및 단리, 그리고 그의 살균 특이성의 변경, 이것을 생성 및 이용하는 방법에 관한 것이다.

클로스트리듐 디피실레는 인간 및 다른 포유동물에 대한 널리 알려져 있는 병원체인 편성 혐기성, 포자-형성, 그람 양성 박테리움이다(Bartlett 등, 1977; Bartlett 등, 1979; Keel 등, 2007; Sunenshine & McDonald, 2006). 저밀도 C. 디 피실레는 포유류 위장(GI) 관 내에 무해하게 잔류할 수 있으나, C. 디피실레 박테리아는 팽창에 의해, 종종 공생 박테리아를 감소시키는 항생제 투여의 결과로서, 중등의 설사 질환으로부터 특히 노인 및 유의미한 동반이환을 갖는 다른 사람들에게 생명을 위협하는 특징적인 가성-막성 대장염까지의 다양한 범위의 질환을 야기하기에 충분한 외독소를 생성한다(Bartlett, 2002]).

이러한 병원체에 의해 형성된 포자가 광범위하게 퍼지고, 병원 및 만성 질환 관리 시설에서 근절시키거나 불활성화시키기 어렵기 때문에, 환자의 C. 디피실레의 대량서식 개연성은 이러한 시설에 환자의 들어감에 의해 급격하게 증가한다(Bartlett, 2007). 사실상, C. 디피실레의 고독성의 독소생성 균주인 C. 디피실 레의 상대적으로 새로운 균주인, BI/NAP1/027은 엄청난 집단발병 설정에서 심각한 질환을 야기하며, 최근에 문서로 잘 기록되었다(Spigaglia 등, 2002;

등, 2004; McDonald 등, 2005; Muto 등, 2005; Loo 등, 2005; Belmares 등, 2009). 이전에는 위험이 낮았던 소아에서의 C. 디피실레 연관된 질환(CDAD)의 발생 정도가 또한 실질적으로 증가되었다(Benson 등, 2007; Zilberberg 등, 2010)..

무증상 보균자 또는 대량서식 대상체에서 항생제의 투여에 의한 예방적으로 병원체를 제거하는 것은 C. 디피실레 연관된 질환을 유도하는 높은 위험 때문에 강력하게 사용이 금지된다.

그람 음성 박테리아에 의해 만들어지는 R-형 박테리오신이 기재되어 있으며, 이는 다른 경쟁적 그람 음성 균주, 심지어 일부 상황에서는, 그람 음성 음성박테리아의 다른 종 또는 속을 사멸시키기 위해 이러한 박테리아에 의해 전개된다(Kageyama 등, 1964; Kageyama 등, 1964a; Kingsbury, D, 1966; Blackwell and Law, 1981; Blackwell 등, 1982; Campagnari 등, 1994; Strauch 등, 2001; Jabrane 등, 2002). R-형 피오신의 기저판 부착 영역(BPAR)의 이종성 수용체 결합 도메인(RBD)으로의 융합은 그람 음성 박테리아에 대한 신규한 살균 특이성을 갖는 신규한 R-형 피오신의 생성을 야기하는 것으로 기재되어 있다(Williams 등, 2008; Scholl 등, 2009).

다른 고-분자-중량 박테리오신 또는 R-형 박테리오신이 그람-양성 박테리아에 기재되어 있다(Coetzee 등, 1968; Thompson and Pattee, 1981; Zink 등, 1995). 그러나, 그람 양성 박테리아에 의해 생성되는 R-형 고분자량 박테리오신 구조에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 그러나, 이러한 것이 기재되어 있지만, 유전자 수준에서 특성화되거나 유용한 제제의 개발을 지원하거나 이에 필요한 방식으로 조작된 것이 없다. 고분자량 박테리오신은 2종의 클로스트리듐종, 즉 보 툴리늄 및 페르프린겐스에 대하여 기재되어 있다(Ellison 및 Kautter, 1970; Anastasio 등, 1971; Nieves 등, 1981). C. 디피실레에 의해 생성되거나 C. 디피실레를 사멸시키는 것은 기재된 것이 없다.

발명의 요약

본 발명은 다른 C. 디피실레의 균주에 대하여 살균성인 C. 디피실레-특이적 R-형 박테리오신(여기서 "디포신류"로 명명됨)을 인코딩하는 전체 유전자좌 또는 유전자 클러스터의 단리; 호기성 박테리아에서 디포신 유전자 클러스터의 발현 및 디포신류의 생성; 및 디포신 유전자 클러스터의 열린 해독틀(ORF) 1374가 C. 디피실레 균주에 대한 그 디포신의 살균 스펙트럼을 결정한다는 발견에 기초한다. 본 발명은 신규한 디포신류를 생성하기 위해 유전공학에 의해 디포신류의 특이성을 변경시키고 그리고 인간을 포함한 대량서식 동물의 위장(GI) 관으로부터 C. 디피실레를 제거하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 디포신류 제조하고 투여하는 실질적인 수단을 제공한다. 디포신류의 투여는 전통적 항생제가 그러한 것처럼, 양호한 건강에 필요한 공생적 GI 박테리아를 손상함이 없이, C. 디피실레 감염의 발생 및 관련 질환을 치료하거나 예방할 수 있다.

본 발명에 따르면, R-형 고분자량(hmw) 박테리오신을 인코딩하는 단리된 핵산 분자가 제공된다. 일 구현예에서, R-형 고분자량(hmw) 박테리오신을 인코딩하는 단리된 핵산 분자가 제공되며, 여기서, 상기 핵산 분자는 클로스트리듐 디피실레의 균주의 게놈으로부터의 것이며, 상기 R-형 hmw 박테리오신은 서열번호: 4-16, 18, 19, 및 66-80로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드에 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드를 포함하고, 그리고 R-형 hmw 박테리오신은 적어도 하나의 다른 C. 디피실레의 균주의 수용체에 결합하는 수용체 결합 도메인(RBD)을 가지며, 이에 따라 다른 C. 디피실레의 균주(들)에 대한 살균활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산분자는 Cd4, Cd16, Cd19108, Cd19123, Cd19126, Cd19145 및 ATCC 수탁 번호 43593으로 이루어진 군으로부터 선택된 클로스트리듐 디피실레의 균주의 게놈으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 균주는 Cd16이며, 핵산 분자는 서열 번호: 1을 포함하거나, 균주는 Cd4이고, 핵산 분자는 서열 번호: 61을 포함한다.

또 하나의 구현예에서, R-형 고분자량 (hmw) 박테리오신을 인코딩하는 단리된 핵산분자가 제공되며, 상기 핵산분자는 클로스트리듐 디피실레의 제1 균주의 게놈으로부터의 것이고, 그리고 서열번호: 66-77을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 적어도 80% 동일한 제1 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 핵산분자는 더욱이 C. 디피실레를 감염하는 박테리오파아지의 RBD 또는 C. 디피실레의 제2 균주의 게놈으로부터 프로파아지 또는 잔여 프로파아지의 수용체 결합 도메인 (RBD)을 인코딩하는 이종성 서열을 포함하고, 그리고 상기 R-형 hmw 박테리오신은 서열번호: 78의 폴리펩타이드에 적어도 80% 동일한 제1 기저판 부착 영역 (BPAR) 폴리펩타이드의 아미노 말단 부분의 적어도 50개의 인접 아미노산을 포함하고, 그리고 상기 R-형 hmw 박테리오신은 C. 디피실레의 적어도 하나의 균주에 대해 살균활성을 가진다.

본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 핵산분자에 의해 인코딩되는 단리된 R-형 박테리오신이 제공된다. 일 측면에서, R-형 박테리오신은 호기성 생산자 박테리움에서 발현된다. 일부 구현예에서, R-형 박테리오신은 동물에 경구로 퉁되어 질 수 있고 그리고 여전히 살균활성을 나타내는 형태로 배설물 안에 배출될 수 있다. 특정 구현예에서, R-형 박테리오신은 25 ℃에서 30분 동안 약 2.5 내지 10.6 사이의 pH에서 인큐베이션 후 얼마간의 살균활성을 보유한다. 일 측면에서, R-형 박테리오신은 25 ℃에서 30분 동안 약 3.4 내지 9 사이의 pH에서 인큐베이션 후 얼마간의 살균활성을 보유한다. 다른 구현예에서, R-형 박테리오신은 45 ℃에서 60분 동안 인큐베이션 후 얼마간의 살균활성을 보유한다.

본 발명의 또 하나의 구현예에서, 살균활성을 갖는 단리된 R-형 고분자량 (hmw) 박테리오신이 제공되며, 상기 R-형 hmw 박테리오신은 속 클로스트리듐의 박테리아의 제1 균주 또는 제1 종의 기저판 부착 영역 (BPAR), 및 클로스트리듐 종을 감염하는 박테리오파아지 또는 속 클로스트리듐의 제2종으로부터 또는 제1종의 제2 균주로부터 수용체 결합 도메인 (RBD) 또는 RBD의 변형된 형태를 포함하고, 상기 박테리오신은 클로스트리듐 디피실레의 적어도 하나의 균주에 대해 살균활성을 가진다. 특정 구현예에서, 상기 BPAR은 클로스트리듐 디피실레의 제1 균주로부터의 것이고 그리고 상기 RBD는 클로스트리듐 디피실레.를 감염하는 박테리오파아지로부터의 것이나 클로스트리듐 디피실레의 제2 균주로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 상기 BPAR는 서열번호:16, 54-56 및 78의 하나 이상의 상응하는 분절에 적어도 80% 동일하다. 어떤 구현예에서, 상기 BPAR은 서열번호: 16 또는 78의 50 또는 그 이상의 인접 아미노산을 함유하거나 또는 서열번호: 54-56의 50 또는 그 이상의 인접 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드에 적어도 80% 동일하다. 일부 구현예에서, 상기 BPAR은 서열번호: 78에 적어도 80% 동일한 제1 BPAR의 아미노-말단부와 이종성 RBD에 동족인 제2 BPAR의 C-말단부의 융합이다.

일부 구현예에서, 상기 RBD는 서열번호:17, 및 49-56의 하나 이상의 상응하는 분절에 적어도 80% 동일하다. 다른 구현예에서, 상기 인코딩된 RBD는 서열번호: 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 및 116으로 구성된 그룹으로부터 선택된 RBD에 적어도 80% 동일하다.

본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 핵산분자를 함유하는 발현 카세트가 제공된다. 발현 카세트는 발현 벡터, 예컨대 플라스미드 내에 포함될 수 있거나, 또는 생산자 세포의 염색체 내에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 발현 카세트는 R-형 박테리오신을 인코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 이종성 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 유도성, 억제성, 또는 구성적으로 활성일 수 있다. 일 측면에서, 상기 프로모터는 유도성이고; 또 하나의 측면에서 상기 프로모터는 억제성이다. 일부 구현예에서, 상기 프로모터는 소분자 유발제, 억제인자, 또는 탈-억제인자를 부가하거나 제거함에 의해 유도된다. 일 측면에서, 상기 프로모터는 소분자 유발제 또는 탈-억제인자에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 상기 소분자 유발제 또는 탈-억제인자는 반응성 산소종 (ROS) 또는 ROS의 생성자이다. 일 측면에서, 상기 ROS는 인간 또는 다른 동물에 비독성인 퍼옥사이드이다. 일 예에서, 상기 퍼옥사이드는 과산화수소이다. 특정한 측면에서, 상기 카세트의 발현은 구성적으로 활성인 RecA 단백질을 인코딩하는 작동 가능하게 연결된 recA recA 유전자에 의해, 그리고 소분자 유발제 또는 탈-억제인자에 대하여 반응성인 이종성 프로모터의 제어 하에서 조절된다.

본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 상기 발현 카세트를 함유하는 생산자 세포가 제공된다. 상기 발현 카세트는 생산자 세포 내의 에피솜 발현 벡터에 포함될 수 있다. 대안적으로, 상기 생산자 세포는 그것의 염색체 내에 본 발명의 핵산분자 또는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 생산자 세포는 비-병원성이고 편성 혐기성 박테리움이 아니다. 일부 구현예에서, 상기 비-병원성 및 편성 혐기성 박테리움이 아닌 것은 바실러스 , 락토바실러스, 및 리스테리아로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아의 속으로부터의 종이다. 어떤 구현예에서, 상기 비-병원성 및 편성 혐기성 박테리움이 아닌 것은 바실러스 속으로부터의 것이다. 일부 측면에서, 상기 박테리움은 바실러스 서브틸리스이다. 특정한 측면에서, 상기 B. 서브틸리스는 PBSX 유전자 클러스터가 결여되어 있다. 또 하나의 구현예에서 상기 생산자 세포는 편성 혐기성이지만 비-병원성 박테리움이다.

본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 R-형 hmw 박테리오신을 생성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 유도제 또는 억제제에 감수성인 유도가능한 또는 탈억제가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 핵산 서열을 함유하는 생산자 세포를 R-형 박테리오신의 발현을 유도하기에 효과적인 농도로 유도제 또는 억제제에 노출시키는 것, 및 발현된 R-형 박테리오신을 정제하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 R-형 박테리오신을 인코딩하는 핵산분자는 생산자 세포의 게놈에 대해 이종성이다. 특별한 측면에 있어서, 상기 핵산분자는 생산자 세포의 염색체 내에 포함되거나, 생산자 세포 내의 염색체외 발현 벡터에 포함된다. 어떤 구현예에서, 상기 생산자 세포는 비-병원성이고 편성 혐기성 박테리움이 아니다. 일부 구현예에서, 상기 비-병원성 및 편성 혐기성 박테리움이 아닌 것은 바실러스 , 락토바실러스, 및 리스테리아로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아의 속으로부터의 종이다. 어떤 구현예에서, 상기 비-병원성 및 편성 혐기성 박테리움이 아닌 것은 바실러스 속으로부터의 것이다. 일부 측면에서, 상기 박테리움은 바실러스 서브틸리스이다. 특정한 측면에서, B. 서브틸리스는 유도되어 R-형 박테리오신을 생성하는 경우 용해되 추가의 측면에서, B. 서브틸리스는 PBSX 유전자 클러스터가 결여되어 있다.

본 발명의 추가 구현예에서, 병원성 박테리움을 사멸시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 병원성 박테리움을 본 발명의 R-형 박테리오신과 접촉하는 것을 포함하고, 이에 의해 R-형 박테리오신이 병원성 박테리움과 결합하고 이를 사멸키는 것이다. 일 측면에서, 상기 병원체 박테리움은 클로스트리듐 디피실레이다. 일 측면에서, 상기 클로스트리듐 디피실레는 동물 내에 존재하며 R-형 박테리오신의 살균 양이 동물에 투여된다.

본 발명의 또 하나의 구현예에서, 동물 내의 클로스트리듐 디피실레의 질환-유발 감염의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 이 방법은 살균 량의 본 발명의 R-형 박테리오신을 그를 필요로 하는 동물에게 직접적으로 투여하거나, 또는 생산자 세포를 투여하거나, 또는 천연 디포신류를 생성하나 독소를 생성하지 않도록 유전적으로 변형된 C. 디피실레 박테리아의 포자를 투여함으로써 간접적으로 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 동물 내에 클로스트리듐 디피실레의 감염은 살균 량의 박테리오신을 생성하도록 하는 양의 본 발명의 생산자 세포를 이를 필요로 하는 동물에게 투여함에 의해, 그에 의해 감염을 치료함으로써 치료된다. 일 측면에서, 박테리오신을 인코딩하는 핵산은 lac 프로모터의 조절하에 있으며, 동물은 락토오스가 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 동물 포유동물이다. 일 측면에서, 상기 포유동물은 인간이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 서열번호: 1-80의 핵산 또는 아미노산 서열을 제공한다.

도 2. 임상적 C. 디피실레 분리주에서의 디포신류의 살균활성. 표시 균주 번호는 매트릭스의 상단을 따라 나타내었으며; 별표-표시된 균주는 NAP1/027/BI 균주이다. 시험된 디포신류의 C. 디피실레 공급원의 동일성은 좌측 경계를 따라 나타내었다. 균주는 엘씨 포르티어(4 및 16), ATCC(43593) 또는 미국 캘리포니아주 쿨버 시티 소재의 알엠 알덴 리서치 랩으로부터 수득되었다.

도 3은 dif16의 스캐닝 전자현미경 사진을 나타낸다. 꽃-유사 테일 섬유 부속지를 주목하길 바란다.

도 4는 표적 균주 Cd19135 상의 dif4의 스폿 시험의 결과의 사진을 나타낸다. 정제된 디포신은 10-배 연속적으로 희석되었으며, 희석물의 5 μl 분취량이 표적 C. 디피실레 박테리아의 론 상에 스폿팅되었다. 37 ℃ 밤새워 혐기성 인큐베이션 후에, 론 상에서의 성장의 제거에 의해 디포신 사멸이 나타났다.

도 5는 dif4 ("4") 및 dif16 ("16")의 여과된 ("F") 및 비여과된 ("UF") 제제 양자의 은 염색된 SDS-PAGE의 사진을 나타낸다. 화살표는 잘라내고 질량 분광분석법에 의해 확인한 밴드를 나타낸다.

도 6은 Cd630 및 Cd16의 디포신 유전자 클러스터의 개략도를 나타낸다. 유전자좌는 마이오바이러스과 파아지 테일 기구에 전형적인 구조적 어셈블리 단백질 및 구조적 단백질을 인코딩하는 ORF, ORF1362 내지 ORF1375로 이루어지고 아래 맵에 나타내어 졌다. 이들 유전자를 플랭킹하는 것은 추정의 파아지-유사 조절 단백질을 인코딩하는 유전자였다. 하측 화살표는 ORF가 전사되는 방향을 나타내며, ORF의 추정적인 기능은 맵 상측에 명시되어 졌다.

도 7은 C. 디피실레 균주 19099의 론(lawn) 상에서 시험된 바실러스 서브틸리스 BDR123-488(섹터 1) 및 BDR123-491(섹터 2)에 의해 생산된 dif16의 스폿 시험의 이미지이다.

도 8은 활성 디포신류를 생산하는 C. 디피실레 5개 균주의 각각으로부터의 ORF1374 유전자에 의해 인코딩된 부분 아미노산 서열(출현의 순서로, 각각 서열번호: 81-86)의 ClustalW 분석의 결과를 제공한다. 정렬된 서열의 각각의 줄 아래의 "*"는 모든 5개 유전자에 의해 인코딩된 그 위치에서의 아미노산 동일성을 나타내며, ":"는 모든 5개 유전자에 의해 인코딩된 그 위치에서의 매우 유사한 아미노산을 나타내며, "."는 모든 5개 유전자에 의해 인코딩된 그 위치에서의 어느 정도 유사한 아미노산을 나타내며; 서열 정렬 내의 주어진 위치에서의 블랭크는 모든 5개 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 유사성이 없음을 나타낸다.

도 9는 BDR123-580 및 "Dif 4-16"에 의해 생산된 "Dif4"의 스폿 시험의 이미지이다. 후자는 바실러스 서브틸리스 BDR123-587에 의해 생성되며, 여기서, dif4의 orf1374(서열번호: 49)를 dif16의 ORF1374(서열번호:17)로 전환시켰다. B . 서브틸리스에 의해 생산된 이들 2개의 디포신류는 양자가 명시된 바와 같이 균주 19137 및 19145의 론 상에서 시험되었다. "Dif4-16"에 의한 사멸의 특이성은 dif4의 것으로부터 dif16의 것으로 전환되었다.

도 10은 이종성 디포신류로 처리된 마우스 내에 C. 디피실레 부하를 미처리된 마우스의 것과 비교한 그래프를 나타낸다. 신규한 디포신류인, 비-1374-기재 RBD는 생체내에서 CDI를 감소하는 작용을 했다. C. 디피실레 포자 ("no Diff")로 챌린지된 미처리된 마우스에 비교된 바와 같이, C. 디피실레 포자로 챌린지되고 신규한 디포신류 ("+Diff")인 비-1374-기재 RBD가 경구로 투여된 마우스는 배설물 내에서 C. 디피실레 정량 넘침의 통계적으로 유의미한 (스튜던트 t-시험에 의해 p < 0.05) 감소/환원을 나타냈다.

도 11은 서열번호: 87-163의 핵산 또는 아미노산 서열을 제공한다.

발명의 상세한 설명

정의

본원에서 사용된 바와 같이, "R-형 고분자량 (hmw) 박테리오신"은 단순하게 "R-형 박테리오신"으로도 알려져 있으며, R-형 피오신, 디포신류, 모노신, 엔테로콜리티신, 메닝고신, 또는 박테리오파아지의 마이오바이러스과 패밀리와 구조적으로 또는 유전적으로 관련된 기타 고분자량(hmw) 박테리오신을 포함한다. R-형 박테리오신은 R-형 피오신, 디포신류, 엔테로콜리티신, 모노신 및 메닝고신의 변형된 버전을 포함한다(Williams 등 2008; Strauch 등, 2001; Kingsbury, 1966; Zink 등 1995).

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "디포신"은 클로스트리듐 디피실레로부터 단리되거나 그로부터 유래된 R-형 고분자량 박테리오신을 지칭하며, C. 디피실레로부터 수득되는 천연의 입자뿐 아니라 비-천연 생산자 세포에서의 디포신 유전자 클러스터의 발현을 통해 수득되는 입자를 포함한다. 디포신은 또한 C . 디피실레의 하나 이상의 균주로부터 유도된 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드로 이루어진 조작된 입자일 수 있으며, 서열번호: 2-23, 49 및 62-80의 1 이상의 폴리펩타이드와 80% 또는 이를 초과하여 동일할 수 있다.

본 발명의 R-형 박테리오신은 열불안정일 수 있고, 약한 내산성, 트립신 내성일 수 있고, 약 65,000 x g에서 원심분리에 의해 침전가능할 수 있으며, 전자 현미경 검사에 의한 분해할 수 있다(Kageyama 등, 1962; Bradley, 1967; Daw 등, 1996; Jabrane 등, 2002; Fortier 등, 2007). 많은 사례에서, 여기에 개시된 조작된 R-형 박테리오신은 1 이상의 이들 특성을 임의의 조합으로 갖는다. 본 명세서에 개시된 R-형 박테리오신에 공통의 추가의 특성은 이들이 핵산을 함유하지 않으며, 그리고 따라서 복제 결핍이어서, 이들이 많은 박테리오파아지가 할 수 있는 것처럼, 표적 박테리움의 사멸 후에 또는 그 동안에 그들 자체를 재생시킬 수 없다는 점이다. 이들은 순수하게 단백질이며, 유기체가 아니다.

본 명세서에 개시된 R-형 박테리오신은 다중단백질, 또는 폴리펩타이드, 서브유닛을 포함하는 복합 분자이고, 마이오바이러스과 패밀리의 박테리오파아지의 테일 구조와 유사하다. 천연 발생 R-형 박테리오신에 있어서, 서브유닛 구조는 박테리아 게놈, 예컨대 C. 디피실레 또는 P. 에어루기노사의 게놈에 의해 인코딩되며, 다른 박테리아에 대한 천연 방어로 작용하는 R-형 박테리오신을 형성한다(Kageyama, 1975). 민감성 표적 세균은 전형적으로 단일의 R-형 박테리오신 분자에 의해 사멸될 수 있다(Kageyama 등, 1964; Kageyama 등, 1964a; Morse 등, 1980; Strauch 등, 2001).

"표적 박테리움" 또는 "표적 박테리아"는 본 개시내용의 R-형 박테리오신에 의해 결합된 및/또는 그의 성장, 생존 또는 복제가 그에 의해 억제되는 박테리움 또는 박테리아를 지칭한다. 일부 구현예에서, 표적 박테리움은 클로스트리듐 속으로부터의 것이다. 특정 구현예에서, 박테리움은 클로스트리듐 디피실레이다. 일 측면에서, C. 디피실레의 1 초과 균주가 표적화된다. C . 디피실레의 예시적인 균주는 비제한적으로 NAP1/BI/리보타입 027뿐만 아니라 도 2에 열거된 것을 포함한다.

용어 "성장억제" 또는 이들의 변형체는 박테리아 세포 분할의 속도를 늦추거나 중단하는 것이나 박테리아 세포 분할의 중단 또는 박테리움 또는 박테리아의 사멸을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "핵산" 또는 "핵산분자"는 전형적으로 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드폴리머(순수 또는 혼합형)를 지칭한다. 상기 용어는 상기 용어는 합성이며, 천연 발생 및 비-천연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합, 구조적 또는 기능적 특성을 가지며, 참조 뉴클레오타이드에 유사한 방식으로 대사작용되는 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 유사체의 예는, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸포스포네이트, 키랄-메틸포스포네이트, 2-0-메틸리보뉴클레오타이드, 및 펩타이드-핵산(PNAs)을 포함한다. 상기 용어 핵산은 일부 상황에서 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

특정한 핵산서열은 또한 보존적으로 변형된 그의 변이체(예컨대, 퇴행성 코돈 치환) 및 상보적 서열뿐 아니라 명백하게 명시된 서열을 포함한다. 특이적으로, 퇴행성 코돈 치환은 1 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3("wobble") 위치가 혼합형-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 달성될 수있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 단백질 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 또한 본원에 기재된 바와 같이 그의 변형된 변이체를 포함한다.

아미노산 서열에 대한 참고로 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "분절"은 길이에서 10, 12, 15, 20, 25, 50, 또는 100 아미노산 잔기일 수 있는 아미노산의 인접서열을 지칭한다.

단백질 또는 핵산서열의 부분에 대한 참고로 사용되는 경우, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종성"은 서열이 천연에서 서로 동일한 관계에 있는 것으로 통상 관찰되지 않는 2개 이상의 하위 서열을 포함하는 것을 나타낸다. 일 예에서, 상기 이종성 서열은 상이한 종의 박테리아로부터의 것이다. 또 하나의 예에서, 이종성 서열은 동일한 종의 박테리아의 상이한 균주로부터의 것이다. 일 측면에서, 상기 이종성 서열은 C. 디피실레의 상이한 균주로부터의 것이다. 또 하나의 측면에서, 상기 이종성 서열은 박테리움 및 박테리오파아지 또는 프로파아지로부터의 것이거나, 박테리움 및 합성, 비-천연 DNA의 서열로부터의 것이다.

용어들 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 전형적으로 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭하기 위하여 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 아미노산은 본 명세서에서 그것의 통상적으로 공지되어 있는 3-문자 기호로, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 협회에 의해 권고되는 1-문자 기호로 지칭될 수 있다.

발병력 인자는 유기체의 병원성에 기여하나 필연적으로 그의 일반적인 생존력에 기여하는 것은 아닌 분자이다. 발병력 인자의 소실에 의해, 유기체는 병원성이 더 적으나, 필연적으로 덜 생존가능한 것은 아니다. 발병력 인자는 수많은 기능, 예컨대 유전자 발현 조절, 부착 또는 이동 제공, 독소 제공, 독소 주입, 항생제 배출 또는 바이오 필름을 포함한 보호 코팅물 형성 중 임의의 하나를 가질 수 있다.

적합성 인자는 유기체의 일반적인 생존력, 성장률, 또는 그의 환경에서의 경쟁력에 기여하는 분자이다. 적합성 인자의 소실에 의해, 유기체는 덜 생존가능하거나 덜 경쟁적이며, 그리고 이러한 절충 때문에, 간접적으로 거의 병원성이 아니다. 적합성 인자는 또한 수많은 기능, 예컨대 영양소, 이온 또는 물의 획득, 세포막 또는 세포벽의 성분 또는 보호제 형성, 핵산의 복제, 수선 또는 돌연변이 유발, 환경적인 또는 경쟁적인 손상으로부터의 방어 또는 그에 대한 공격 제공 중 임의의 하나를 가질 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "생산자 세포"는 디포신-인코딩 핵산 분자를 생성하거나 발현할 수 있으며, 이러한 핵산 분자를 천연적으로 함유하지 않는 세포를 지칭한다. 생성자 세포는 산소의 존재 하에서 생존하고 성장할 수 있으며, 디포신을 인코딩하는 핵산 분자를 함유하는 벡터로 형질전환되며, 이 벡터는 생성자 세포의 염색체 내로 통합되거나 에피솜일 수 있다. 상기 생산자 세포는 그람 양성 박테리움일 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 생산자 세포는 바실러스, 락토바실러스, 락토구균, 클로스트리듐, 또는 리스테리아 속으로부터의 박테리움일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 생산자 세포 바실러스, 락토바실러스, 락토구균, 또는 리스테리아 . 속으로부터의 박테리움이다. 일부 구현예에서, 상기 박테리움은 서브틸리스, 아밀롤리쿠에파시엔스, 및 메가테리움으로 이루어지는 군으로부터 선택된 바실러스 속으로부터의 종이다. 일 측면에서, 상기 박테리움은 바실러스 서브틸리스이다. 특정한 측면에서, 상기 생산자 세포는 PBSX 유전자 클러스터가 결여된 B. 서브틸리스 균주이다. 다른 구현예에서, 상기 박테리움은 악시도필러스, 카세이, 및 불가리쿠스로 이루어지는 군으로부터 선택된 락토바실러스 속으로부터의 종이다. 또 다른 구현예에서, 상기 박테리움은 리스테리아이노쿠아이다. 또 하나의 구현예에서, 상기 비-병원성 생산자 세포는 에스케리치아 콜리 또는 클로스트리듐 속의 것일 수 있다.

본 개시내용을 실행하는 방법의 상세한 설명

C. 디피실레 로부터 단리된 R-형 박테리오신은 살균활성을 가진다.

살균활성에 대한 시험을 위하여, 엄격한 혐기성 조건 하에서 세포를 중간-대수 증식에 대해 성장시킨 다음, 배양물을 3 μg/ml의 미토마이신 C에 노출시킴에 의해 2개의 C. 디피실레균주인, Cd4 및 Cd16(엘씨 포르티어로부터)의 용해물을 만들었다. 박테리아 세포를 용해 후, 용해물 중의 입자는 농축되고, 고속원심분리로 정제되었다(실시예 1 참조). 이들 제제는 전자 현미경에 의해 농축된 머리가 없는 파아지-유사 입자를 함유하는 것으로 나타났다(도 3). 농축 및 정제 후에, 제제는 스폿 플레이트 방법에 의하여 살균활성에 대하여 평가되었고, 이에 의해 샘플은 다시 엄격한 혐기성 조건 하에서 표적 C. 디피실레 박테리아의 오버레이 론에 적용되었다. 대부분의 파아지 테일-유사 박테리오신이 전형적으로 생성 박테리아와 상이한 균주를 표적화하기 때문에, 처음에 29개의 C. 디피실레 임상적 분리주의 패널로 이루어진 표적 균주가 시험되었다. 밤새 인큐베이션 후, 플레이트는 정제된 물질을 스폿한 C. 디피실레 박테리아의 론에서의 제거에 의해 명시된 바와 같은 사멸 활성의 존재에 대하여 시험되었다. 도 4는 C. 디피실레 균주인, Cd19135 상에 스폿된 Cd4로부터의 디포신(dif 4)의 전형적인 스폿 검정을 나타낸다.

Dif4(Cd4로부터의 디포신) 및 dif16(Cd16으로부터의 디포신)은 스폿 검정에 기초하여 상이한 세균 스펙트럼을 실증하였다(도 2). Dif4는 29개의 C. 디피실레 임상적 분리 균주 중 10개 상에서 살균활성을 보여주는 한편, dif16은 29개 균주 중 8개에 대하여 활성을 가졌다. 양자의 디포신류에 감수성인 균주의 일부 중첩이 존재하였으나, 두 개 디포신류는 뚜렷이 다른 살균 스펙트럼을 가졌다. Cd108 및 Cd 43593으로부터의 디포신류는 매우 유사한 사멸 스펙트럼을 가졌으며, 29개의 C. 디피실레 임상적 분리주의 패널에서 10개 NAP1/027/BI 고독성 균주 중 적어도 9개를 사멸시켰다. 추가로 시험하는 경우, dif43593은 모든 18개의 추가의 독립적인 NAP1/027/BI 분리주를 사멸시켰다. 따라서, dif43593은 NAP1/027/BI C. 디피실레,의 모든 28개의 시험된 균주를 사멸켰다, 도 2 참조.

디포신 유전자좌의 동정.

Cd4 균주로부터 단리되고 정제된 디포신 입자는 변성되고, 그리고 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE)에 의해 단백질 성분이 분리되고, 은 염색에 의해 검출되었다(도 5). 두 개의 개별적 밴드인, ~200 kD 및 ~40 kD가 잘려지고, 질량 분광분석법으로 분석되었다. 40 kD 밴드로부터의 펩타이드는 참조 균주 Cd630(유전자은행 Acc. No. NC_009089.1)을 포함하여 완전한 게놈이 시퀀싱된 몇몇의 C. 디피실레 균주에 인코딩된 두 개의 C. 디피실레 전사 해독틀 (ORF)로부터의 예상된 생성물과 부합하는 것으로 밝혀졌다. 이들 중 제1의 것은 ORF1363(서열번호: 5)로, 39,192 달톤 파아지-유사 단백질이었다. 이 밴드에서 제2의 우세한 폴리펩타이드는 ORF1371(서열번호: 14)로, 39,565 달톤 파아지-유사 기저판 단백질에 해당하였다. 이들 단백질은 공교롭게도 분자량이 매우 유사하기 때문에, 이들은 동일한 SDS PAGE 밴드로 이동하였다. 200 kD 밴드는 두 개의 다른 파아지-유사 ORF의 인접한 다운스트림인 ORF 1374(서열번호: 17)의 C-말단의 부분에 해당하는 지배적인 폴리펩타이드를 생산하였다.

이들 ORF가 Cd630 게놈 내에서 매우 근접한 부근에 맵핑되기 때문에, 주변 영역이 분석되었다. 프로파아지-유사 요소가 염기 1574593과 1596384 사이에 관찰되었으며, 이는 ORF1360A-1379를 포함한다(도 6 및 서열번호: 1-23). 이러한 영역에서 인코딩된 구조 유전자는 전형적인 마이오바이러스과 파아지의 테일 구조의 성분에만 해당되며; 캡시드, 캡시드 어셈블리 단백질 또는 관문 단백질에 대한 유전자가 관찰되지 않았음을 특히 주목하였다. 또한, 추정적인 DNA 복제 또는 DNA 패키징 기작을 암호화하는 어떤 ORF은 부재였다. 따라서, 이 유전자좌는 R-형(마이오바이러스과파아지 테일-유사) 박테리오신의 것과 일치하였다. 구조 유전자를 프랭킹하는 것은 추정적 파아지-유사 조절 단백질을 인코딩하는 몇몇 ORF였다. 이 유전자좌로부터의 몇몇 ORF가 디포신 입자에서 관찰되는 폴리펩타이드를 인코딩하며, 유전자 클러스터가 R-형 박테리오신의 것과 유사한 사실 때문에, 본 발명자들은 디포신 유전자좌를 이 영역에 배정하였다.

구조 유전자는 모두 한 가닥 상에 인코딩되었으며, 동일한 방향으로 전사되었다. 상기 유전자의 구성은 R-형 피오신 및 많은 마이오바이러스과 파아지의 유전자의 구성과 유사하였다. 몇몇의 구조 단백질은 파아지 Φ119 및 ΦC2를 포함한 공지된 C. 디피실레 박테리오파아지에 대하여 서열 유사성을 나타내었다(Goh 등, 2007; Govind 등, 2006). C. 디피실레 균주 Cd630은 또한 2개의 온전한 프로파아지를 인코딩하는 것으로 알려져 있으며, 이들 둘 모두는 유도 가능한 것으로 공지되어 있다(Goh 등, 2007). 몇몇 디포신 ORF는 C. 디피실레 균주 Cd630의 프로파아지 1 및 2에 대하여 서열 유사성을 가졌으며, 이는 이들 C. 디피실레 마이오바이러스과 파아지 및 디포신류가 공통의 선조를 공유함을 시사한다.

디포신의 ORF 1374 (서열번호:17)를 특히 주목하였다. 이 유전자는 ORF1374가 R-형 박테리오신 테일 섬유, 즉 수용체 결합 도메인(RBD)의 부분이었음을 나타내는 클러스터 내의 소정의 위치인, ORF1373, 서열번호: 16의 인접한 다운스트림에 위치하는 큰 폴리펩타이드를 인코딩하였다. 디포신류로 지정된 것의 전자 현미경사진에 의해 테일 섬유 영역 내의 큰 꽃 유사 구조가 드러났기 때문에, 이러한 구조가 큰 단백질을 포함하는 것이 명백하였다. ORF 1373 (서열번호:16)은 디포신 테일 섬유의 기저판 부착 영역, BPAR을 인코딩하였으며, C. 디피실레 파아지에 ORF1374가 결여되어 있는 것을 고려하면, 이는 RBD뿐 아니라 BPAR을 인코딩하는 이러한 파아지에서의 유사한 ORF1373의 끝이 잘린 형태인 것으로 보인다. 따라서, 천연 발생 디포신류의 테일 섬유는 두 개의 단백질, ORF1373 및 ORF1374로 이루어지며, 이들은 연결된 테일 섬유를 형성하는 한편, C. 디피실레의 박테리오파아지는 단일 단백질, 즉 BPAR 및 RBD 기능을 제공하는 어느 정도 더 긴 ORF1373으로 이루어진 테일 섬유를 갖는다. 이러한 이해와 함께, ORF1373 (서열번호:16) 또는 ORF1374 (서열번호:17) 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산이 본 명세서에서 새로운 RBD 특이성 기능을 조작하기 위한 것으로부터 기질로 전개되었다.

디포신류는 C. 디피실레 분리주 중에 광범위하게 분포되어 진다.

C. 디피실레의 일련의 독립적인 임상적 분리주가 상이한 살균 스펙트럼을 가질 수 있는 디포신 입자를 생성하는 능력에 대하여 시험되었다. 임상적 분리주 Cd19123, Cd19145, Cd19126, Cd19108(미국 캘리포니아주 쿨버 시티 소재 알엠 알덴 리서치 랩으로부터의 것) 및 ATCC Cd43593이 엄격한 혐기성 조건 하에서 미토마이신 C로 유도되었고, 그 다음 생성된 입자의 정제 및 농축이 따랐다. 그런 다음, 정제된 물질을 임상적 집단에서 다른 C. 디피실레 균주의 론 상에 따로 스폿팅하여, 살균활성을 검출하였다. 상기 결과는 이들 각각의 분리주가 상이한 살균 스펙트럼을 갖는 입자(각각 임상적 분리주 Cd19123, Cd19145, Cd19126, Cd19108 및 ATCC Cd43593으로부터의 dif123, dif145, dif126, dif108 및 dif43593로 명명되는 디포신류)를 생성하였음을 보여준다(도 2). Dif108 및 dif43593은 매우 유사하고 넓은 스펙트럼을 갖는 반면, 균주 Cd19145는 좁은 살균 삵균 스펙트럼을 갖는 입자를 생성하였다. Cd19113 및 Cd19150을 포함하는 유도에 대하여 시험한 몇몇 분리주는 미토마이신에 대한 노출 후에 용해되었만, 검출가능한 디포신 입자를 생성하지 않았다.

실험실 균주 Cd630을 시퀀싱한 게놈이 디포신 유전자좌를 인코딩하며; 그리고 사실상, 이 게놈을 본 명세서에서 사용하여 디포신 유전자를 동정하는 것이 본 명세서에서 인식되었다. 그러나, 균주 Cd630은 미토마이신 C로의 유도 후에 용해되는 반면, 검출가능한 디포신 입자를 생성하지는 않았다. 대신에, 소량의 프로파아지 1 및 프로파아지 2가 생성되었다.

디포신 클러스터의 동정 및 클로닝.

Cd630은 미토마이신 C에 의한 용해의 유도 시에 검출가능한 디포신 입자를 생성하지 않았다. 따라서, 대신에 Cd16으로부터 디포신 유전자 클러스터가 클로닝되었다. Cd16의 드래프트 게놈 서열을 먼저 수득하였다. Cd630의 것과 유사한 디포신 유전자좌를 동정하고, 주석을 달았다. 생산자 균주 Cd16으로부터의 전체 디포신 유전자 클러스터는 BAC 안으로 클로닝되었으며(서열번호: 1), 그리고 차후에 비-병원성 미생물 및 편성 혐기성이 아닌 것에서 활성 디포신을 생성하는데 필요한 모든 유전자를 포함하는 것으로 증명되었다. C. 디피실레는 병원성이면서 편성 혐기성 박테리움이며, 이는 천연 디포신류 또는 재조합 DNA 조작에 의해 변형된 디포신류를 위한 비현실적인 생성 세포이게 한다. 단리된 디포신 클러스터는 또한 재조합 DNA 기법에 의해 조작될 수 있어 그의 발현이 생산자 미생물의 배양물 또는 유도 배지에 첨가되는 비독성 소분자 유발제 또는 탈-억제인자에 반응하는 이종 프로모터에 의해 조절되게 할 수 있다. 이러한 소분자는 비제한적으로, 테트라사이클린, 안하이드로테트라사이클린, 락토오스, 아라비노오스, 자일로스 및 이들의 비-대사작용된 유사체, 예컨대 락토오스를 대체하기 위한 IPTG를 포함한다.

디포신류

디포신류는 클로스트리듐 디피실레로부터 단리된 R-형 hmw 박테리오신이며, 이는 다른 C. 디피실레의 균주에 대하여 살균성이다. 디포신류는 미토마이신 C의 존재 하에서 혐기성 조건 하에서 성장하는 C. 디피실레 균주로부터 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 디포신은 C. 디피실레 임상학적 분리주 Cd4, Cd16, Cd19123, Cd19145, Cd19126, Cd19108 또는 ATCC Cd43593로부터의 것이다(각각 dif4, dif16, dif123, dif145, dif126, dif108 및 dif43593으로 명명됨). 일 측면에서, 디포신은 Cd4로부터의 것이며; 또 하나의 측면에서 디포신은 Cd16으로부터의 것이다.

본 발명의 또 하나의 구현예에서, 속 클로스트리듐 박테리아의 게놈으로부터 유도된 디포신류를 인코딩하는 단리된 핵산분자가 제공된다. 일 측면에서, 상기 핵산분자는 서열번호: 1의 유전자 클러스터를 함유한다. 또 하나의 측면에서, 상기 핵산분자는 서열번호: 61의 유전자 클러스터를 함유한다 다른 구현예에서, 상기 핵산분자는 서열번호: 2-23; 49, 62-80로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 디포신을 인코딩한다. 또 다른 구현예에서, 상기 핵산분자는 서열번호: 4-16, 18, 19, 및 66-80로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 디포신을 인코딩한다. 일 측면에서, 상기 핵산분자는 서열번호: 2-23의 폴리펩타이드를 인코딩한다. 또 하나의 측면에서, 상기 핵산분자는 서열번호: 49 및 62-80의 폴리펩타이드를 인코딩한다.

또한 변이체 디포신류가 제공된다. 변이체 디포신류는 서열번호: 4-16, 18, 19, 및 66-80로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 디포신류의 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 변이체 디포신는 서열번호: 4-16, 18, 19, 및 66-80로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드에 적어도 85%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 더욱이는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

일부 구현예에서, 상기 변이체 디포신은 이종성 기저판 부착 영역 (BPAR)을 포함할 수 있고, 상기 BPAR은 서열번호: 16, 54-56, 및 78의 하나 이상의 상응하는 분절에 적어도 80% 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 BPAR은 서열번호: 16, 54-56, 및 78의 하나 이상의 상응하는 분절에 적어도 85% 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 BPAR은 서열번호: 16, 54-56, 및 78의 하나 이상의 상응하는 분절에 적어도 89% 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 BPAR은 서열번호: 16, 54-56, 및 78의 하나 이상의 상응하는 분절에 적어도 90% 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 BPAR은 서열번호: 16, 54-56, 및 78의 하나 이상의 상응하는 분절에 적어도 95% 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 BPAR은 서열번호: 16, 54-56, 및 78의 하나 이상의 상응하는 분절에 적어도 98% 동일하다. 추가 구현예에서, 상기 BPAR은 서열번호: 16, 54-56, 및 78의 하나 이상의 상응하는 분절에 적어도 99% 동일하다.

일부 구현예에서, 상기 변이체 디포신은 원상태 BPAR 폴리펩타이드의 아미노 말단 부분의 적어도 50 인접 아미노산을 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 변이체 디포신은 원상태 BPAR 폴리펩타이드의 아미노 말단 부분의 적어도 100 인접 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 적어도 50 인접 아미노산은 서열번호: 78의 폴리펩타이드에 적어도 80% 동일한 BPAR의 아미노 말단 부분으로부터의 것이다. 어떤 측면에서, 상기 적어도 50 인접 아미노산은 서열번호: 78의 폴리펩타이드에 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 98% 동일한 BPAR의 아미노 말단 부분으로부터의 것이다. 어떤 다른 측면에서, 상기 적어도 100 인접 아미노산은 서열번호: 78의 폴리펩타이드에 적어도 85%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 심지어 99% 동일한 BPAR의 아미노 말단 부분으로부터의 것이다.

다른 구현예에서, 상기 변이체 디포신은 RBD에 동족인 BPAR을 함유한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "RBD에 동족인 BPAR" 또는 "동족 BPAR"은 천연 디포신, C. 디피실레 게놈, 박테리오파아지, 또는 프로파아지에서 함께 발생하는 BPAR 및 RBD 쌍을 지칭한다. 특정 구현예에서, RBD 및 이의 동족 BPAR은 디포신 분자의 나머지에 이종성이다. 일 측면에서 동족 BPAR은 디포신의 원상태 BPAR의 아미노 말단 부분에 융합되어 "융합된 BPAR"를 형성한다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 변이체 디포신은 융합된 BPAR을 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 변이체 디포신은 이종성 RBD 및 이의 동족 BPAR을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 융합된 BPAR은 서열번호: 88, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 및 115로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일하다. 다른 구현예에서, 상기 융합된 BPAR은 서열번호: 88, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 및 115로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열에 적어도 85%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 심지어 99% 동일하다.

추가 구현예에서, 상기 변이체 디포신은 이종성 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 RBD는 서열번호: 17 및 49-53 중 하나 이상에 상응하는 분절에 적어도 80% 동일하거나 서열번호: 54-56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD)을 함유하는 폴리펩타이드에 적어도 80% 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 RBD는 서열번호: 17 및 49-53 중 하나 이상에 상응하는 분절에 적어도 85% 동일하거나 서열번호: 54-56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD)을 함유하는 폴리펩타이드에 적어도 85% 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 RBD는 서열번호: 17 및 49-53 중 하나 이상에 상응하는 분절에 적어도 89% 동일하거나 서열번호: 54-56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD)을 함유하는 폴리펩타이드에 적어도 89% 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 RBD는 서열번호: 17 및 49-53 중 하나 이상에 상응하는 분절에 적어도 90% 동일하거나 서열번호: 54-56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD)을 함유하는 폴리펩타이드에 적어도 90% 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 RBD는 서열번호: 17 및 49-53 중 하나 이상에 상응하는 분절에 적어도 95% 동일하거나 서열번호: 54-56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD)을 함유하는 폴리펩타이드에 적어도 95% 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 RBD는 서열번호: 17 및 49-53 중 하나 이상에 상응하는 분절에 적어도 98% 동일하거나 서열번호: 54-56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD)을 함유하는 폴리펩타이드에 적어도 98% 동일하다. 또 하나의 구현예에서, 상기 RBD는 서열번호: 17 및 49-53 중 하나 이상에 상응하는 분절에 적어도 99% 동일하거나 서열번호: 54-56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD)을 함유하는 폴리펩타이드에 적어도 99% 동일하다. 일부 구현예에서, 상기 수용체 결합 도메인 (RBD) 영역은 서열번호:54, 55, 또는 56의 아미노산 잔기 51 내지 카르복시-말단 잔기를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 상기 RBD는 C. 디피실레 게놈, C. 디피실레 게놈 내에 함유된 박테리오파아지, 프로파아지 삽입물 또는 프로파아지 잔여물로부터의 것이다. "프로파아지 잔여물" 또는 프로파아지 요소 또는 부분은 전체 파아지 분자보다는 단지 파아지 또는 불연속 파아지 단백질(들)의 일 부분을 인코딩하는 서열을 지칭한다. 따라서, 일부 구현예에서, 프로파아지 잔여물은, 예를 들면, RBD 및 그의 동족 BPAR, 및 기저판 유전자를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 RBD는 서열번호: 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 및 116으로 이루어지는 군으로부터 선택된 RBD에 적어도 80% 동일하다. 다른 구현예에서, 상기 RBD는 서열번호로 이루어지는 군으로부터 선택된 RBD에 적어도 85%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 심지어 99% 동일하다: 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 및 116.

또 하나의 구현예에서, 디포신류는 파아지 테일 RBD를 디포신 ORF 1373의 생성물에 융합함에 의해 변경된 살균 스펙트럼을 가지도록 조작될 수 있다. ORF 1374는 천연 디포신류의 일차 스펙트럼 결정 인자 또는 RBD를 인코딩하지만, 이 매우 큰단백질은 ORF 1373 단백질과 복합되고 그리고 ORF 1373 단백질은 BPAR을 제공, 즉, 이것은 디포신 기저판 구조에 ORF 1374 단백질의 RBD를 부착한다. ORF 1373은 마이오바이러스과 박테리오파아지 예컨대 ΦCD2 (서열번호:54), ΦCD119 (서열번호:55), 및 ΦCD27 (서열번호:56)의 테일 섬유 유전자뿐 아니라 R-형 피오신의 테일 섬유와 유사하고, 이와 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 디포신류의 상기 ORF 1373 (예를 들면, 서열번호:16 또는 78)은 특히, BPAR 또는 N-말단 부분의 처음 160개 아미노산에서 C. 디피실레 마이오바이러스과 파아지, ΦCD2 (서열번호:54)의 테일 섬유와 유의미한 서열 동일성을 공유한다. 그러나, 파아지 테일 섬유는 디포신 ORF1373 단백질보다 더 길고, 이들의 박테리아 표적을 인식하기 위한 C-말단 RBD를 함유한다. 디포신류의 ORF 1373 단백질은 이 후자 도메인을 함유하지 않으며, 그의 RBD 기능은 ORF1374에 의해 인코딩되는 별개의 폴리펩타이드에 의해 대체된다. 따라서, ORF1374는 디포신 클러스터로부터 완전히 결실될 수 있으며, 파아지 테일 섬유의 RBD, 예컨대 ΦCD2의 것은 ORF1373에 의해 인코딩되는 디포신 BPAR에 융합될 수 있어, 이에 의해 파아지 테일 섬유-유사 단백질을 가지며 이에 따라 공여체 파아지의 숙주 범위와 관련된 살균 스펙트럼을 갖는 디포신을 생성할 수 있다. 중요하게, C. 디피실레 파아지 테일 섬유와 ORF1373 단백질 간의 아미노산 서열 상동성의 영역이 둘 사이의 성공적인 기능적 융합을 가능하게 할 수 있기 때문에, 돌연변이되거나 돌연변이되지 않은 C. 디피실레 파아지로부터의 숙주-범위 변이체를 선택할 수 있으며, 이것은 이어서 신규한 살균 스펙트럼을 갖는 변형된 디포신류를 생성하기 위한 신규한 RBD의 공급원일 수 있다는 점이다.

조작된 디포신의 일 구현예에서, RBD가 다른 균주의 C. 디피실레로부터의 RBD 또는 C. 디피실레를 감염시키는 박테리오파아지로부터의 RBD로 대체된 디포신이 제공된다. 일 예에서, 핵산 분자는 서열번호: 16 또는 78을 암호화하는 서열을 포함하나, 상응하는 원상태 RBD(즉, 각각 서열번호 17 또는 49를 인코딩하는 서열)는 함유하지 않으며; 대신에, 원상태 RBD는 RBD를 인코딩하는 이종성 서열로 대체된다. 특정 구현예에서, 상기 핵산분자는 C. 디피실레의 상이한 균주의 R-형 박테리오신의 수용체 결합 도메인 (RBD)을 인코딩하는 이종성 서열을 포함한다. 일 측면에서, 상기 핵산분자는 서열번호:16 또는 78을 인코딩하는 서열 및 서열번호: 49-53로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 함유하거나 또는 서열번호: 54-56으로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 수용체 결합 영역을 함유한다. 또 하나의 측면에서, 상기 핵산분자는 서열번호:2-16 및 18-23 또는 서열번호: 17 및 49-56를 인코딩하는 서열로 이루어지고: 62-80, 그리고 서열번호로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 RBD를 인코딩하는 이종성 서열로 이루어진다.

조작된 디포신의 다른 구현예에서, 상기 디포신의 RBD는 원상태 RBD의 변형된 형태로 대체될 수 있다. "원상태 RBD"는 C. 디피실레의 균주로부터 또는 C. 디피실레를 감염시키는 박테리오파지로부터 단리되거나 클로닝된 RBD와 동일한 아미노산 서열을 갖는 RBD를 지칭한다. 수 많은 C. 디피실레 균주로부터 예시적인 원상태 RBD는 서열번호: 17 및 49-53를 포함한다. C. 디피실레를 감염시키는 박테리오파아지로부터의 예시적인 원상태 RBD는 서열번호를 포함한다: 54-56(예를 들면, 아미노산 잔기 51 내지 카복시 말단 잔기). 일부 구현예에서, 변형된 RBD는 원상태 RBD에 대해 RBD의 아미노산 서열에서의 변화를 포함한다. 아미노산 서열에서의 변화의 비-제한적인 예는 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입(또는 부가), 또는 결실을 포함한다. 추가 구현예에서, 디포신은 2006년 6월 8일 공개된 미국 특허 출원 공개 제2006-0121450호(본 명세서에 전체가 기재된 것처럼 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 다양성 생성 레트로엘리먼트(DGR)를 배치함으로써 구조를 다양화한 유기체로부터 유도된 RBD로의 치환 또는 이의 삽입을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 변형된 형태는 상응하는 비변형된 또는 원상태 RBD와 상이한 살균 스펙트럼을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 변형된 형태는 원상태 RBD에 적어도 80% 동일하다. 다른 구현예에서, 상기 RBD는 서열번호: 17 및 49-53로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩타이드에 적어도 85%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 심지어 99% 동일한 아미노산 서열을 가지거나 서열번호: 54-56으로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 수용체 결합 영역을 가지고 그리고 상기 변형된 RBD는 상응하는 비변형된 또는 원상태 RBD와 상이한 살균스펙트럼을 가진다.

일부 구현예에서, 상기 핵산분자는 더욱이 RBD의 동족 샤페론 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일 측면에서, 상기 동족 차페론은 서열번호: 89, 90, 113, 114, 및 117로 이루어진 군으로부터 선택된다.

표적 박테리아

환자로부터 단리된 클로스트리듐 디피실레 균주는 펄스 겔 전기영동에 의해 광범위하게 달라지며, 그의 병원성이 매우 다양하다. 독소를 과다 생성하는 BI/NAP1 또는 리보타입 027 균주는 특히 독소 A 및 독소 B의 발현 수준을 부정적으로 조절하는 유전자 tcdC의 기능을 소실하는 것의 결과로서 악성이다(McDonald 등,2005).

사실상, tcdC 유전자의 특정 돌연변이 대립유전자를 지니는 C. 디피실레 균주는 건강관리 시설 내에서, 그리고 그 사이에 유행성으로 퍼지는 것으로 보인다. 이들 유행병 및 고도의 악성 균주는 전통적인 항생제 요법의 시작 전에 또는 직후에 디포신류의 경구 적용에 의해 보균 환자의 GI 관으로부터 예방적으로 제거될 수 있는 특히 중요한 표적 박테리아이다. 야생형 수준의 독소 A 및 B를 생성하는 C. 디피실레 박테리아는 중요한 표적 병원체인데, 이는 그들이 또한 특히 50세가 넘거나 동반 질환이 있는 환자에게 잠재적으로 치명적이기 때문이다(Bartlett JG, 2002).

과다생성자이든지 아니든지, C. 디피실레 균주에서 유행하는 표면 접근가능한 발병력 또는 적합 인자, 예컨대, S-층 단백질을 표적화하는 것은 이러한 병원체가 그들이 표적화된 R-형 박테리오신에 내성이 있는 것으로 나타난다면, 그들의 발병력 또는 적합성을 절충하게 만드는 매력적인 수단을 제공한다. 디포신류의 RBD 의 높은 특이성 때문에, C. 디피실레를 제외한 유기체는 표적이 아니며, 그들이 GI 관의 공생적 박테리아 정상의 GI 기능 및 우수한 건강에 필요한 박테리아에 대한 부차적인 손상을 야기하지 않을 것이기 때문에 디포신류의 독특하고 강력한 이점이 있다.

"감염"은 예컨대 대상체 또는 조직 또는 비- 박테리아 세포에서의 박테리아의 성장을 언급하며, 여기서, 상기 박테리아는 상기 대상체, 조직 또는 비-박테리아 세포에서 질환 또는 증상을 실제적으로 또는 잠재적으로 야기할 수 있다. 감염의 치료는 디포신류, 예컨대 dif43593을 생성할 수 있는 탈독성화된 C. 디피실레 박테리아의 기질, 물질, 생산자 세포 또는 포자로 예방적 치료를 포함할 수 있다. 치료되는 대상체의 비-제한적인 예는 기증된 기관, 조직 및 세포; 인공호흡기 또는 투석 장치와 같은 의료 장비; 또는 상처, 예컨대 수술 동안 또는 수술 후의 상처를 포함한다. 다른 용도는 추가의 성장 시에 문제를 야기할 수 있는 표적 박테리아의 제거를 포함한다. 추가 구현예에서, hmw 박테리오신이 사용되어, 박테리아 감염 또는 오염이 있는 음식물, 공장 또는 공장의 수집된 부분을 처리하거나 또는 예컨대 병원 또는 상업의 환경에서 표적 박테리아의 환경적인 발생을 처리한다.

본원에 기재된 바와 같이, 항균 R-형 박테리오신은 특정한 박테리움의 성장, 생존, 또는 복제를 저해하기 위해 사용될 수 있다. 상기 박테리움은 병원성 또는 환경적으로 유해한 균주이거나 예방적 방식으로 처리될 수 있다. 병원성 미생물은 일반적으로 때때로 특정 상황에서만 질환을 야기한다.

디포신류의 제조 및 용도

디포신류는 대략 1000만 달톤의 입자이며, 이에 따라 분별 원심분리, 분별 여과, 수성 2-상 분리, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전 및/또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리하고 정제되어 생물 약제학적 등급의 경구 항균제를 생성할 수 있다. R-형 박테리오신은 동결-융해에 안정적인 것으로 밝혀졌으며, 안정적인 제형을 생성하기 위해 분무 건조되어질 수 있다.

본 발명의 일부 구현예에서, R-형 hmw 박테리오신의 생성 방법이 제공된다. 상기 방법은 생산자 세포를 R-형 박테리오신의 발현을 유발하는 농도의 유도제에 대하여 감수성인 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 R-형 hmw 박테리오신을 인코딩하는 핵산 서열에 노출시키고, 발현된 R-형 박테리오신을 정제하는 것을 포함한다. 일 측면에서, R-형 고분자량(hmw) 박테리오신은 서열번호:2-23 또는 서열번호:49 및 62-80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 함유한다. 핵산 분자는 생산자 세포의 천연 핵산에 대하여 이종성이며, 생산자 세포의 염색체에 함유될 수 있거나, 에피솜 발현 벡터 내에 함유될 수 있다.

표적화된, 강력한 항균제인 디포신류가 인간 및 다른 동물의 하부 GI 관으로부터 C. 디피실레를 제거하거나 탈집락화시키기 위하여 사용하여, CDAD를 예방할 것이다. 광범위 항생제로 치료된 동물 및 인간은 그들이 C. 디피실레에 의해 집락화된다면, 유력한 치사의 CDAD가 발생할 위험이 높다. 탈집락화는 그것의 건강한 GI 미생물총을 남기기 때문에, 특히 매력적인 디포신류의 유용성이다. 또한, 디포신류는 디포신을 생성할 수 있는 탈독소화된 C. 디피실레 박테리아의 투여된 생산자 세포 또는 포자를 통하여 직접적으로 또는 간접적으로 투여되어 질 수 있어 급성 CDAD에서의 병원체 로드를 감소시키고 및/또는 다른 양상에 의한 성공적인 치료 후에 CDAD의 높은 발병 또는 재발이나 반복을 감소시킨다.

투여 방식

R-형 박테리오신은 위 및 십이지장 상부에 공급되는 정상적으로 기능하는 산도인 pH 4.0 또는 그이하에 의해 불활성화된다. 그러나, 디포신류는 상부 GI 관을 통과하여 하부 GI 관에 주로 집락화된 표적화된 박테리아 병원체에 도달해야 한다. 따라서, 디포신류는 상부 GI 관의 산 및 프로테아제로부터 취약한 작용제를 보호하고 활성 상태의 이러한 제제를 원위의 상부 GI 관 또는 하부 GI 관에 전달하는 하나 또는 몇몇의 공지되어 있는 방법에 의해 제형화될 수 있다. 또한, 동물은 항히스타민제, 예컨대 시메티딘 또는 양성자 펌프 억제제로 처리될 수 있어, R-형 박테리오신의 경구 투여 전에 위 산성화를 예방한다. 따라서, 적절하게 제형화된 디포신류, 디포신류를 생성할 수 있는 생산자 세포 또는 디포신을 생성하는 탈독소화된 C. 디피실레 박테리아의 포자의 정상의 위가 있는 인간 또는 동물 또는 산성화가 약제학적으로 예방된 인간 또는 동물로의 경구 투여는 집락화된 장의 부분으로의 전달을 가능하게 하여, 그렇게 함으로써 효과적으로 할 수 있다. 장 통과 시간에 기초하여, 무증상 사람 또는 동물을 탈집락화시키기 위한 직접적으로 또는 간접적으로 디포신류의 경구 투여 당의 빈도는 매 6시간, 매 12시간, 매 18시간, 매 24시간, 매주 또는 매달일 수 있다. 디포신류는 또한 CDAD가 있는 환자 또는 최근에 CDAD가 "치유"된 환자에게 동일하거나 더 빈번한 빈도로 투여될 수 있다. 특히, 활성이 있는 CDAD의 관리를 위하여, 디포신류가 제형될 수 있고 그리고 좌약, 관장 또는 결장 관류에 의해 직장에 대하여 직접적으로 또는 간접적으로 투여될 수 있다.

본 개시내용의 조작된 디포신은 디포신에 감수성인 박테리아에 의한 감염 또는 오염을 앓거나, 이를 앓는 것으로 진단되거나, 또는 이를 앓는 것으로 의심되는 임의의 대상체에 투여될 수 있다. 이러한 대상체의 비-제한적인 예는 동물(포유동물, 파충류, 양성류, 조류 및 어류) 종뿐 아니라 곤충, 식물 및 진균류를 포함한다. 포유동물 종의 대표적이고 비제한적인 예는 인간; 비-인간 영장류; 농업상 관련된 종, 예컨대 소, 돼지, 염소 및 양; 설치류, 예컨대, 마우스 및 랫트; 교제, 전시 또는 쇼를 위한 포유동물, 예컨대, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼 및 말; 및 노동을 위한 포유동물, 예컨대 개 및 말을 포함한다. 조류 종의 대표적이고 비제한적인 예는 교제 또는 쇼를 위한 닭, 오리, 거위 및 새, 예컨대 앵무새 및 잉꼬를 포함한다. 본 개시내용의 조작된 디포신으로 처리된 동물 대상체는 또한 네발동물, 두발동물, 수생 동물, 척추동물 또는 곤충을 포함하는 무척추동물일 수 있다.

일부 구현예에서, 처리되는 상기 대상체는 아직 성숙하지 않은 소아 또는 다른 어린 동물이다. 따라서, 본 개시내용은 본 개시내용의 디포신에 감수성인 박테리아 또는 다른 미생물로의 감염을 포함하는 소아과 증상의 치료를 포함한다.

본 개시내용은 또한 기회 감염, 예컨대, 인간 대상체 또는 비-인간 동물의 미생물 총에 존재하는 박테리아의 바람직하지 않은 성장으로부터 야기되는 기회 감염의 치료 또는 예방을 위해 제공된다. 기회 감염은 대상체에서의 면역 억제된 증상의 결과 또는 비뇨생식기(GU) 또는 위장(GI) 관의 공생 미생물총을 변경시키는 항생체 처리의 결과일 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 또한 면역 억제된 대상체 및 다른 약제에 노출된 대상체의 치료 또는 예방을 위해 제공된다. 그의 항균활성이 있는 디포신은 다른 항균제 또는 항미생물제, 예컨대 비제한적인 예로서 항생제 또는 항진균제와 병용하여 사용될 수 있다. "항-미생물제"는 단일 세포의 유기체의 성장을 억제하거나 사멸시키는데 사용될 수 있는 작용제 또는 화합물이다. 항-미생물제는 항생제, 화학치료제, 항체(보체가 있거나 없는), DNA, RNA, 단백질, 지질 또는 세포벽 합성 또는 기능의 화학적 억제제를 포함한다.

일부 구현예에서, 디포신류, 디포신류를 생산할 수 있는 탈독성화된 C. 디피실레 박테리아의 생산자 세포, 또는 포자는 "약제학적으로 허용가능한" 부형제, 장용 코팅제 또는 담체와 함께 제형화된다. 이러한 성분은 과도한 불리한 부작용 없이 인간, 동물 및/또는 식물에 사용하기에 적합한 것이다. 불리한 부작용의 비-제한적인 예는 독성, 자극 및/또는 알러지 반응을 포함한다. 부형제 또는 담체는 전형적으로 합리적인 유익/유해 비율에 적합한 것이다. 비제한적인 약제학적으로 적절한 담체는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 예는, 비제한적으로 표준 약제학적 부형제, 예컨대 포스페이트 완충된 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 유/수 에멀젼 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸올레에이트이다. 수성 담체는 염수 및 완충된 매질을 포함하는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제(예컨대, 링거 덱스트로오스를 기반으로 한 것) 등을 포함한다.

본 명세서에 개시된 추가의 제형 및 약제학적 조성물은 박테리아 병원체에 특이적인 단리된 디포신; 동일한 박테리아 병원체를 표적화하는 디포신류를 생성할 수 있는 탈독소화된 C. 디피실레 박테리아의 2, 3, 5, 10 또는 20개 이상의 상이한 디포신류, 생산자 세포 또는 포자의 혼합물; 및 상이한 박테리아 병원체 또는 동일한 박테리아 병원체의 상이한 균주를 표적화하는 2, 3, 5, 10 또는 20개 이상의 혼합물을 포함한다.

임의로, 본 개시내용의 디포신 또는 생산자 세포를 포함하는 조성물은 또한 해당 분야에 잘 알려져 있는 방식을 사용하여 분무 건조시키거나 동결 건조될 수 있다. 차후의 재구성 및 사용은 본 분야에 알려져 있는 바와 같이 실시될 수 있다.

디포신은 전형적으로 "안전하며 효율적인" 양 또는 농도로 사용되며, 이는 상술된 것과 같은 과도한 불리한 부작용 없이 원하는 치료적 반응을 생성하는데 충분한 양을 지칭한다. 디포신은 또한 "치료적으로 효과적인" 양 또는 농도로 사용될 수 있으며, 이는 원하는 치료적 반응, 예컨대, 비제한적으로, 박테리아 세포 분열 속도를 늦추거나, 박테리아 세포 분열의 중단을 야기하거나 박테리아의 집단 성장의 사망을 야기하거나 그 속도를 감소시키는데 유효한 양을 언급한다. 안전하고 유효한 양, 또는 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 량은 다양한 인자에따라 달라질 것이나, 과도한 실험 과정 없이, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 비-제한적인 인자의 예는 치료되는 특정 증상, 상기 대상체의 신체 조건, 치료될 대상체의 유형, 치료의 지속기간, 동시요법의 성질(존재한다면) 및 사용되는 특정 제형을 포함한다.

이제 본 발명의 요지가 일반적으로 기재되었으며, 본 발명은 예시로 제공된 하기의 실시예를 참조하여 더욱 용이하게 이해될 것이며, 달리 특정되지 않는 한 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

1. 디포신류의 살균활성의 결정

C. 디피실레 배양물이 10% CO₂, 10% H₂, 80% N₂ 의 분위기로 포르마 사이언티픽 환경 챔버 내에서 엄격한 혐기성 조건 하에서 성장되었다. 모든 배지, 완충액 및 플레이트가 사용 전에 적어도 24시간 동안 이 분위기에서 환원되었다. 배양물은 C. 디피실레 선택적 아가 플레이트 상에 스트리킹되고(BD 디아그노스틱스, BBL Cat. 222228), 그리고 37 ℃에서 2일 동안 배양되었다. 이들 플레이트는 그런 다음 저장용으로서 주위 온도에서 혐기적으로 보관된다.

디포신류를 유도하기 위하여, C. 디피실레 박테리아가 브루셀라 배지(디프코)를 사용하여 액체 배양물에서, 쉐이킹하지 않고 37 ℃에서 성장되었다. 대략 0.2의 OD₆₀₀에서, 미토마이신 C가 3 μg/ml의 최종 농도로 첨가되었다. 배양물은 그런 다음 3 내지 16시간 동안 인큐베이션되었다. 박테리아 용해물은 배양물의 시각적인 제거에 의해 검출되었다.

배양물은 혐기성 챔버로부터 제거되고, 그리고 세포성 잔해는 5,000 xg에서의 원심분리에 의해 제거되었다. 상층액은 그런 다음 0.2 μ셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터를 통해 통과되었다. 여액은 90,000 xg에서 2시간 동안 원심분리되어, 디포신 입자를 펠렛화하였다. 펠렛은 1/50의 최초 배양 부피로 10 mM Tris pH 7.5, 50 mM NaCl, 3% 만니톨에 재현탁되었다.

표적 균주는 37 ℃에서 브루셀라 액체 배지에서 밤새 성장되었다. 100 μl의 배양 부피가 5 ml의 예열되고 환원된 브루셀라 오버레이 한천(0.5% 한천)에 부가되고, 한천 플레이트(1.5% 한천)에 부어 지고, 정치되었다. 디포신 제제의 5 μl의 샘플이 플레이트 상에 스폿팅되고, 공기 건조되게 하였다(약 30분). 플레이트는 그런 다음 37 ℃에서 밤새 혐기적으로 인큐베이션되었다. 살균활성이 샘플을 론에 적용한 위치 또는 스폿에서의 박테리아 성장의 제거 또는 결여에 의해 결정되었다.

2. Cd16 디포신 유전자좌의 클로닝.

C. 디피실레 균주 Cd16의 드래프트 게놈 서열이 게놈 DNA의 454 기기 서열 분석에 의해 수득되었다. 전체 dif16 유전자좌 또는 클러스터(서열번호: 1)는 균주 Cd630(상기 참조)과의 비교에 의해 동정되었다.

골격 BAC 벡터의 제조. 개시 벡터는 pETcoco1(Novagen)이었다. 이를 변형시켜, BbsI 말단을 갖는 프라이머 AV1419(서열번호: 24) 및 AV1420(서열번호: 25)을 사용하여 2개의 XhoI 부위를 제거하였다. 이를 행하기 위하여, 특정 영역을 이들 프라이머를 사용하여 pETcoco1 DNA로부터 증폭시키고, 그런 다음, PCR 생성물을 BbsI로 절단하고, 사전에 XhoI으로 절단한 더 큰 pETcoco1 벡터 단편에 다시 결찰시켰다. 이 결찰은 pETcoco1의 2개의 XhoI 부위를 파괴하였다. 이 후자의 플라스미드는 그런 다음 유사한 전략에 의해 추가로 변형되어, 프라이머 AV1416(서열번호: 26) 및 AV1245 (서열번호: 27)를 사용하여 EcoRI 부위를 파괴하였다. 수득된 벡터를 SW251로 명명하였다.

디포신 클러스터의 단편을 수용하기 위한 pUC19 벡터의 제조. pUC19(New England BioLabs)의 폴리링커를 EcoRI 및 HindIII으로의 분해 및 올리고 AV1372 (서열번호: 28), AV1373 (서열번호: 29), AV1374 (서열번호: 30), 및 AV1375 (서열번호: 31)에서의 결찰함에 의해 변형하였다. 이는 폴리링커를 NotI-NheI-KpnI-XhoI-EcoRV-Bst바이-BbsI-EcoRI-NsiI-SphI-BamHI-AscI로 변경시켰다. 이를 SW232로 명명하였다.

SW232 내로 디포신 클러스터의 클로닝. 디포신 클러스터, 서열번호 1의 3개의 단편을 Cd16 DNA로부터 PCR에 의해 개별적으로 증폭시켰다. 5' 단편(서열번호: 32)을 각각 Not1 및 Xho1 말단을 갖는 프라이머 1368 (서열번호: 35) 및 1289 (서열번호: 36)를 사용하여 증폭시켰다. 중간의 단편(서열번호: 33)을 각각 Xho1 및 EcoR1 말단을 갖는 프라이머 AV1288 (서열번호: 37) 및 AV1366 (서열번호: 38)을 사용하여 증폭시켰다. 3' 단편, 서열번호: 34를 각각 EcoR1 및 BamH1 말단을 갖는 프라이머 AV1367 (서열번호: 39) 및 AV1300 (서열번호: 40)을 사용하여 증폭시켰다. 이들 3개의 PCR 단편을 별도로 SW232 내로 클로닝하고, 각각 5', 중간 및 3' 부분에 대하여 SW241, SW242 및 SW243으로 명명하였다.

BAC SW251 내로 디포신 클러스터의 클로닝. E . 콜라이 내에서 클로닝에 의해 증식되고, 정제된 각각의 디포신 클러스터의 3개의 단편(SW241, SW242 및 SW243 내)을 SW241, SW242 및 SW243 벡터로부터 잘라냈다. SW241을 NotI 및 XhoI로 분해하고, SW242를 XhoI 및 EcoRI로 분해하고, SW243을 EcoRI 및 AscI로 분해하였다. (이 AscI 부위가 상술된 변형 SW232 폴리링커의 부분이었음을 주의한다.)

이들 3개의 단편을 먼저 NotI 및 AscI으로 분해한 SW251 내로 조합하였다. 수득한 플라스미드를 DG461로 명명하였으며, 이에는 전체 dif16 클러스터가 함유되어 있다. 이를 E. 콜라이에서 증폭시켰다.

B. 서브틸리스 내에서 발현을 위한 디포신 통합 벡터 제조. 클로닝/프로모터 영역 및 스펙티노마이신-내성 유전자를 플랭킹하는 amyE 유전자의 부분을 포함하는 B. 서브틸리스 통합 벡터, pDR111을 사용하였다.

pDR111 폴리링커를 HindIII 및 SphI을 사용하여 벡터를 분해시키고, 올리고 DG1(서열번호: 41) 및 DG2(서열번호: 42)에서 결찰시킴으로써 변형시켰다. 이것은 NotI 및 AscI 부위를 pDR111에 부가하였다. 변형된 폴리링커를 갖는 전체 amyE 프론트 및 백 영역을 함유하는 영역을 그런 다음프라이머 DG9(서열번호: 43) 및 DG10(서열번호: 44)을 사용하여 증폭시켰으며, 이 양자는 BsaI 말단을 갖는다. 이 단편을 SW251의 NotI 및 AscI 부위 내로 결찰시키고(두 부위의 파괴를 야기), DG487을 생성하였다. pDR111-유래의 삽입물의 변형된 폴리링커에 의하여 DG487 내로 도입된 새로운 NotI 및 AscI 부위가 존재함을 주목하길 바란다.

E. coli 내에서 DG487의 증식 후에, DG461로부터의 디포신 클러스터를 함유하는 NotI/AscI 단편을 그런 다음 잘라내고, 그리고 DG487의 NotI/AscI 부위 내로 클로닝하였다. 이 새로운 작제물을 DG488로 명명하였으며, 그리고 전체 디포신 유전자 클러스터를 B. 서브틸리스에 도입하는데 사용된 벡터였다(하기).

3. 바실러스 서브틸리스 내에 디포신 유전자 클러스터의 발현.

천연 디포신 생산자는 편성 혐기성 생물인 C. 디피실레이다. C. 디피실레 박테리아는 심지어 미량의 산소에 노출된다면, 포자를 형성하고 즉시 죽는다. 배양된 C. 디피실레로부터 심지어 미량의 디포신을 생성하는 능력은 어렵고 아주 힘든 것이며, 예방 또는 치료적 응용에 유용한 양의 디포신의 생성은 요구되는 엄격한 혐기성 조건에 따라 실용적이지 못하다. 따라서, C. 디피실레로부터의 전체 디포신 유전자 클러스터를 먼저 동정한 다음, 분자 클로닝에 의해 단리하고, 추가의 조작 및 생산을 위하여 이 클러스터를 호기성 그람 양성 박테리움인, 바실러스 서브틸리스에 도입시켰다.

바실러스 서브틸리스 통합벡터, DG488을 실시예 2에 기재된 바와 같이 만들었으며, 이는 전체 22,827개 염기 디포신 유전자좌(서열번호: 1)를 포함한다. 이 벡터를 사용하여 디포신 유전자좌를 바실러스 서브틸리스 게놈 내로 재조합시켰다.

수여자 바실러스서브틸리스 균주는 BDR123이었으며, 이는 amyE 유전자 내에 삽입된 클로르암페니콜 내성 마커를 가졌다. 이 균주를 DG488로 형질전환시키는 경우, 벡터 내의 프론트 및 백 amyE 서열과 게놈 g1>amyE 서열 사이에 재조합이 발생하였다. 이는 디포신 유전자좌 및 스펙티노마이신 내성 유전자를 포함하는 DG488의 프론트 및 백 amyE 영역 사이의 모든 서열의 BDR123 게놈 내로의 삽입을 야기하였다. 성공적인 재조합체는 스펙티노마이신 내성이었으나, 재조합의 결과로서 게놈 마커의 소실 때문에, 클로르암페니콜-민감성이 되었다. 이 B. 서브틸리스 균주를 BDR123-488로 명명하였다.

전체 디포신 유전자좌를 DG488 벡터 내로 삽입하였기 때문에(실시예 2), 이에 따라 그 전체가 BDR123-488 내로 삽입되었다. 클로스트리듐 내에서의 정상적인 발현에 필요한 조절 유전자 및 구조적 디포신 입자 유전자 모두를 포함하는 이 삽입된 디포신 유전자좌는 이들 유전자 및/또는 조절 인자의 제어 하에 있었다. 바실러스 및 클로스트리듐이 관련 있는 박테리아이기 때문에, 이들 디포신 조절 인자가 바실러스 배경에서 작용할 것이며, 그의 천연 상태에서, RecA-매개 메커니즘을 통한 DNA 손상에 의해 유도될 것으로 예상되었다. 이는 사실이었으며, DNA 손상제제 미토마이신 C와의 접촉에 의해 디포신 입자 생산을 BDR123-488에서 유도하였으며, 균주 Cd19099를 사멸시켰으며, 도 7을 참조하길 바람.

디포신 조절 유전자(ORF1359, 1360, 1361)는 구조 유전자와 비교하여 유전자좌의 5' 영역 내에 위치하였다. 또한, 구조 유전자와 비교하여 다운스트림, 3'에 위치한 조절 유전자(ORF1377(서열번호: 20), 1378 (서열번호: 21), 및 1379 (서열번호: 23))도 존재하였다. 이들 후자의 조절 유전자를 제거하기 위하여, 단일 3 방식 결찰에서 DG491을 DG488로부터 생산하였다. 하나의 PCR 단편을 프라이머 DG13(서열번호: 45) 및 DG14(서열번호: 46)를 사용한 PCR 증폭에 의하여 DG488로부터 만들고, 그리고 다른 하나를 프라이머 DG15(서열번호: 47) 및 DG16(서열번호: 48)을 사용한 PCR 증폭에 의해 만들었다. 양자 PCR 단편은 AscI 및 SphI.로 분해되었다DG488을 그런 다음 SphI으로 분해하고, 그리고 2개의 분해된 PCR 단편을 SphI-분해된 DG488로부터의 큰 벡터 단편 내로 결찰시켜, DG491을 생산하였다. DG491을 BDR123 내로 형질전환시켜(BDR123-491), ORFs1377 (서열번호: 20), 1378 (서열번호: 21), 및 1379 (서열번호:23)가 결여된 디포신 유전자 클러스터를 함유하는 재조합 B. 서브틸리스를 생성하였다. 이들 ORF가 결여된 변형된 디포신 클러스터는 BDR123-488에서 야생형 디포신 클러스터가 그러한 것처럼, 미토마이신 C에 대한 노출 시에 활성 디포신류를 발현하였다(도 7).

4. 다중 디포신류로부터 살균 스펙트럼-결정 서열의 특성규명

Cd16 디포신 유전자좌(서열번호: 1)와 Cd630뿐 아니라 시퀀싱된 다른 Cd 균주(QCD-66c26; QCD-23m63; QCD-32g58; QCD-63q42) 및 Cd4(서열번호: 61)의 디포신 유전자좌의 비교에 의해, 하나의 예외를 제외하고, 모든 전사 해독틀(서열번호: 1 및 61)이 89-100% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 것으로 나타났다. 상기의 예외는 ORF 1374였다. 이 예외적 서열은 모든 시퀀싱된 디포신 간에 가변/변수이었으며, 그리고 크기가 유사함에도, 30%만큼 적은 서열 동일성을 공유하였다. 디포신 클러스터 내의 ORF1374의 위치는 수용체 결합 도메인의 위치와 일치하였다. 단리된 활성 디포신류의 ORF1374의 서열을 결정하고, 이들은 서열에 있어 매우 고도로 가변/변수인 것을 알아냈다(서열번호: 17, 49-53). 이들 서열의 비교는 도 8에 나타내었다. 더욱이, 단리된 디포신류의 스펙트럼(도 2)은 ORF1374 아미노산 서열의 유사성 또는 비유사성을 반영하였으며, 도 8을 참조하길 바란다. 예를 들어, dif16(서열번호: 17) 및 dif126(서열번호: 52)의 ORF1374의 서열은 오직 1개의 아미노산만이 상이하며, 그들의 살균 스펙트럼은 거의 동일하였다. 반면에 dif16(서열번호: 17) 및 dif108(서열번호: 50)의 서열은 188개의 아미노산이 상이하고, 그들의 살균 스펙트럼은 거의 중첩되는 것 없이 매우 달랐다. 이러한 이유로, 그리고 ORF1374가 유전자 클러스터 내의 유일한 가변/변수 단백질이었기 때문에, ORF1374가 표적 인식 결정인자이며, 각각의 특정한 디포신의 독특한 스펙트럼의 원인이 되는 것으로 결론지었다.

5. B. 서브틸리스 내에 Dif4의 클로닝 및 발현.

디포신 4 유전자좌를 디포신 16에 대한 것과 유사한 방법으로 Cd4로부터 클로닝하였다. 그러나, dif4 유전자 클러스터, 서열번호: 61 내의 EcoR1 부위의 부재 때문에, 일부 변형이 필요하였다. 플라스미드 SW251(상기 실시예 2 참조)을 올리고 DG211, 서열번호: 57 및 DG212, 서열번호: 58을 사용하여 폴리링커 내에 XhoI 부위를 갖도록 변형시켜, 각각 NotI 및 AscI 부위를 도입하였다. 이것은 벡터 DG577을 생성하였다.

Cd4 DNA로부터 디포신 클러스터를 3개의 단편으로 증폭시켰다. 제1 단편은 프라이머 DG210(서열번호: 59) 및 AV1288(서열번호: 37)을 사용하여 XhoI 및 NcoI 부위를 도입하였다. 제2 단편은 프라이머 DG209(서열번호: 60) 및 DG15(서열번호: 47)를 사용하여 NcoI 및 AscI 부위를 도입하였다. 이들 2개의 단편을 사전에 XhoI/ AscI으로 절단한 DG577 내로 클로닝하여, DG578을 생성하였다. 제3 단편을 AV1368(서열번호: 35) 및 AV1289(서열번호: 36)를 사용하여 증폭시켜, XhoI 및 NotI 부위를 도입하고, 사전에 XhoI 및 NotI으로 절단한 DG578 내로 클로닝하여 DG579를 생성하였다. dif4 클러스터(서열번호: 61)를 함유하는 이 후자의 작제물은 dif16를 위한 DG491의 등가물이었으며, 다시 말하면, 이것은 ORF1377, ORF1378 및 ORF1379, 즉, 디포신에 대한 구조 유전자의 불필요한 추정의 다운스트림 조절 서열이 결여되어 있었다. dif4 클러스터를 B. 서브틸리스로 도입하기 위한 통합 벡터는 DG579로부터 NotI AscI 단편을 취하고, 이를 DG487 내로 클로닝함으로써 만들었다(상기 실시예 2 참조). 이러한 작제물된 플라스미드는 DG580이었다.

B. 서브틸리스에서 dif4를 발현하기 위하여, ORF1377-1379 없이 dif4 유전자좌를 함유하는 DG580(서열번호: 61)을 바실러스 서브틸리스 게놈 내로 재조합시켰다. 수여자 바실러스서브틸리스 균주는 BDR123이었으며, 이는 amyE 유전자 내에 삽입된 클로르암페니콜 내성 마커를 가졌다. 이 균주를 DG580으로 형질전환시키는 경우, 벡터 내의 프론트 및 백 amyE 서열과 게놈 amyE 서열 사이에 재조합이 발생하였다. 이는 디포신 유전자좌 및 스펙티노마이신 내성 유전자를 포함하는 DG580의 프론트 및 백 amyE 영역 사이의 서열 모두의 BDR123 게놈 내로의 삽입을 야기하였다. 성공적인 재조합체는 스펙티노마이신 내성이었으나, 재조합의 결과로서 게놈 마커의 소실 때문에, 클로르암페니콜-민감성이 되었다. 이 B. 서브틸리스 균주를 BDR123-580으로 명명하였다.

이 통합된 dif4 유전자좌는 C. 디피실레에서의 정상의 디포신의 발현에 필요한 모든 조절 유전자를 포함하였으며, 예상되는 바와 같이, 그리고 B. 서브틸리스에서 dif16에 대하여 이전에 나타낸 바와 같이, dif4 입자 생성은 미토마이신 C와의 접촉에 의해 BDR123-580에서 유도되었으며, 도 9를 참조하길 바란다. 따라서, 본 실시예는 dif4 및 dif16 양자에 대한 유전자좌의 클로닝 및 비-병원성 호기성 생산 박테리움의 일 예인 B. 서브틸리스에서의 각각의 발현을 제공한다.

6. ORF1374는 디포신류의 살균 스펙트럼을 결정한다.

ORF1374는 질량 분광분석법에 의해 정제된 디포신 구조의 부분인 것으로 보이는 예측된 큰 폴리펩타이드(~ 200 kDa)를 인코딩한다. 디포신 16 및 디포신 4의 유전자 클러스터를 비교하는 경우, 대부분의 유전자 생성물, 특히 구조적 성분인 것으로 예상되는 것은 아미노산 수준에서 거의 동일하다. 2가지 클러스터 간의 주요한 아미노산 서열 차이는 ORF1374이다. 이러한 이유 및 후술되는 다른 이유로, 이 유전자 생성물이 디포신류의 표적 특이성을 부여하는 것으로 추측하였다. 이를 시험하기 위하여, dif4의 ORF1374(즉, 서열번호: 49를 인코딩하는 서열)를 DG580에서, Cd16으로부터의 ORF1374(즉, 서열번호: 17을 인코딩하는 서열)로 대체하여, DG587을 생성하였다. DG587을 B. 서브틸리스 BDR123의 게놈 내로 통합하여, dif16 및 dif4에 대하여 상기에 제공된 바와 같이 BDR123-587 재조합체를 만들었다. 수득한 BDR123-587을 미토마이신에 노출시키고, 용해물을 처리하여, 디포신을 제조하였다. 수득한 디포신 입자는 디포신 16에 대하여 민감성인 C. 디피실레 균주 19145에 대하여 살균활성을 가졌으며, dif4에 대하여 민감성인 균주 19137를 사멸시키는 능력을 소실하였다(도 9).

이 실험을 추가로 개선하였다. DG587의 컨스트럭션은 Cd4 및 Cd16의 키메라인 ORF1373에서 수득하였다. DG587의 ORF 1373이 원래 Cd41373, 서열번호: 78과 100% 동일하게 복원되도록 작제물을 만들어, 이에 따라, 오직 ORF1374, 서열번호: 17만을 정확한 재배치인 작제물을 생성하였다. 이 작제물은 DG603으로 명명하였다. 이 작제물을 B. 서브틸리스 BDR123 게놈 내로 통합하고, 상술된 바와 같이 미토마이신 C로 유도하였다. 수득한 디포신 입자는 균주 19099 및 19145에 대하여 살균활성을 가졌으며, 19137을 사멸시키는 능력을 소실하였다. 따라서, 디포신류의 살균 스펙트럼을 ORF1374에 의해 인코딩된 단백질에 의해 결정하였으며, 본 명세서에서 증명된 바와 같이, ORF1374의 변화에 의해 디포신의 살균 스펙트럼이 변경되었다.

7. RecA가 활성화될 때 용해되지 않는 PBSX가 없는 생산자 세포

PBSX 프로파아지는 야생형 바실러스 서브틸리스에서 아주 흔하다. 유도되는 경우, 프로파아지는 그것이 저해된 헤드 구조를 가지며, 오직 작은 랜덤한 단편의 DNA를 함유한다는 점에서 결함이 있다. 이는 RecA의 조절 하에 있으며, 따라서, 이는 DNA 손상 제제, 예를 들면 미토마이신 C 및 박테리움에 대한 다른 형태의 심각한 스트레스에 의해 유도된다. 유도되는 경우, 이는 박테리움의 용해를 야기하고 PBSX 입자를 방출한다. 배양 배지의 PBSX 입자로의 오염을 피하고, 바실러스 서브틸리스 생산자 박테리아의 용해를 제거하기 위하여, 디포신류의 발현이 recA 또는 dinR / lexA 활성의 변형에 의해 조절되는 경우, PBSX 유전자 클러스터를 바실러스 서브틸리스 BDR11 박테리아으로부터 제거하였다.

PBSX 녹아웃을 Liu et al에 의해 개괄된 절차를 따라 작제하였다. 간단히 기술하면, Liu 논문에 사용된 프라이머 및 오버랩핑 연장 PCR 기법을 사용하여, 모 균주 BDR11의 araR 유전자를 결실시키고, 바실러스아라비노오스 프로모터 하의 네오마이신/카나마이신-내성 유전자, P _araA - neo ^R 로 대체하여, 균주 BDG2를 만들었다. 이 araR 유전자의 결실을 PCR 및 카나마이신에 대한 내성의 부여에 의해 확인하였다.

다음으로, PBSX 유전자좌 그 자체를 결실시켜 DNA 작제물을 제작하였다. 이 작제물을 제작하기 위하여, 하기의 5개의 PCR 생성물을 오버랩핑 연장 PCR에 의해 하나의 큰 생성물로 스플라이싱시켰다: BDR11로부터 증폭된 xylB 유전자의 5' 서열 1kb; BDR11로부터 증폭된 xylA 유전자의 3' 서열 1kb; 플라스미드 pJW034로부터 증폭된 클로르암페니콜 내성 유전자, cat; BDR11로부터 증폭된 araR , ; 및 마지막으로, BDR11로부터 증폭된 xylB 유전자를 함유하는 서열 1kb. 오버랩핑 연장 PCR 생성물을 pUC19의 XmaI 및 SpeI 부위 내로 클로닝하였다. 이 작제물은 그런 다음 SacII를 사용하여 선형화시키고, 균주 BDG2 박테리아 내로 형질전환시켰으며, μ클로르암페니콜/ml이 보충된 LB 아가 플레이트 상에 도말하였다. 이 플레이트로부터 콜로니를 고르고, 5 μ클로르암페니콜/ml 또는 20 μ카나마이신/ml 중 어느 하나가 보충된 LB 아가 플레이트 상에 패치시켰다. 클로르암페니콜 내성이며 카나마이신 민감성이었던 균주를 항생제 선택 없이 LB 액체배지에서 4시간 동안 성장시킨 다음, 20 μ카나마이신/ml이 보충된 LB 아가 플레이트 상에 도말하였다. 이들 플레이트 상에서 성장시킨 콜로니를 PBSX 유전자의 존재에 대하여 콜로니 PCR에 의해 시험하였다. PBSX 유전자 클러스터의 결실을 wt 균주 BD123 내의 PBSX 유전자의 부위를 스패닝하는 PCR 생성물 서열분석에 의해 균주 BDG9에서 확인하였다. 추가의 분석에 의해 BDG9가 바실러스 서브틸리스 균주 BD123 또는 BDG2와 달리, 3 μ미토마이신 C/ml의 존재 하에서 PBSX 입자를 용해시키거나 생성하지 않음이 나타났다.

PBSX 결실 균주, BDG9를 플라스미드 DG580으로 형질전환시켜, BDG27을 생성하였다. Cd4 디포신 클러스터의 통합을 스펙티노마이신 내성에 의해 확인하였다. BDG27을 성장시키고, 상기에서 기재된 바와 같이 미토마이신 C로 유도하였다. 16시간 후에, 세포를 수집하고, PBSX 없이 디포신류가 세포 내로 축적될 것으로 본 발명자 등은예상하였기 때문에, 버그버스터(Novagen)를 사용하여 세포를 용해시켜, 세포를 파괴하였다. 세포를 버그버스터로 용해시킨 후에, 잔해를 원심분리에 의해 제거하고, 상청액을 균주 19137에 대한 살균활성에 대하여 시험하였다. BDG27에 의해 생산된 디포신은 Cd19137에 대하여 활성을 보였으나, Cd19099에 대해서는 그렇지 않았으며, 따라서, 디포신 4가 이 비분해적, PBSX 결실된 균주에서 생산되었음이 입증되었다.

8. B. 서브틸리스 내 소분자 유발제, 과산화수소, 유도된 디포신 발현.

실시예 3에서는, 미토마이신 C를 B. 서브틸리스 균주 BDR123 내에 디포신류을 유도하기 위해 사용하였다. 미토마이신 C는 DNA 손상 제제 및 발암원이기 때문에, 대안적인 소분자 유발제를 모색하였다. 과산화수소 (H₂O₂)는 미토마이신 C에 유사한 방식으로 SOS 반응을 야기하는 것으로 밝혀졌으나 (Imlay and Linn, 1987)); 그러나, H₂O₂ 는 일반적으로 U.S. FDA에 의해 안전한 것으로 간주된다(GRAS). 또한, H₂O₂ 는 E. 콜라이 and B. 서브틸리스를 포함하는 몇 개의 호기성 박테리아 종에서 프로파아지 유도를 야지하는 것으로 밝혀졌다(Imlay and Linn, 1987; Bol and Yasbin, 1990). C. 디피실레가 편성 혐기성이고 그리고 정상적으로는 H₂O₂를 함유하지 않는 위장관 내 틈새에 잔류하기 때문에, C. 디피실레에서 프로파아지 및/또는 디포신 생산에 대한 H₂O₂ 의 효과는 공지되어 있지 않다.

H₂O₂ 가 B. 서브틸리스 내에서 디포신 생산을 유도할 수 있는지를 결정하기 위해, B. 서브틸리스 균주 BDG45 내에서 디포신을 유도하는 미토마이신 C와 H₂O₂ 의 능력을 비교하는 연구를 개시하였다. BDG45는 그의 게놈에 디포신4 유전자 클러스터 (서열번호: 61)를 함유하고 이는 amyE 서열 내에 통합된 클로르암페니콜 내성 유전자에 연결된다. BDG45 배양물을 밤새 성장시키고, 백-희석하고, 그리고 약 1.0의 OD600에 도달할 때까지 성장시켰다. 그때, 배양물을 처리하지 않거나 또는 0.5ug /mL 미토마이신 C, 0.2mM H₂O₂, 또는 1mM H₂O₂ 로 처리하고 그리고 28 ℃에서 배양하였다. 샘플은 유도 21시간후에 취해지고, 그리고 디포신 제제가 디포신 펠렛을 10 mM Hepes pH 7.4, 50mM NaCl (HN50) 에서 재현탁시키는 것을 제외하고 실시예 1에서와 같이 제조되었다. 제제의 살균활성은 디포신4에 민감성인 분리주(19137)를 함유하는 박테리아 론 상에 스폿되어 지기 전에 HN50에 일련으로 희석된(5-배) 샘플로 실시예 1에서와 같이 결정되었다. 살균성 검정의 결과는 표 I에 나타냈다. 21시간 유도 후, 미토마이신 C 및 1 mM H₂O₂ 처리 양자는 각각 625-배 및 3,125-배 희석 후 쉽게 검출가능한 디포신 살균활성을 생성했다. 0.2 mM H₂O₂ 는 완만하게 디포신 생산을 유도했다. 차후의 연구는 H₂O₂ 0.2mM 내지 20mM 농도로 디포신 생산을 유도하였다는 것을 실증하였다.

표 I. 미토마이신 C (Mito-C) 또는 과산화수소 (H₂O₂)의 어느 하나로 B. 서브틸리스에서 유도된 디포신류의 일련의 5-배 희석에 대한 스폿 검정 결과

9. C. 디피실레 게놈, 파아지 및 프로파아지로부터 단리된 핵산은 이종성 디 포신류에 대해 기능적 RBD 단백질을 인코딩한다.

M68 C. 디피실레 분리주로부터 제조된 디포신 제제는 넓은 살균스펙트럼을 가지진다(표 II). 디포신4 ORF1374 (서열번호: 49)가 이종성 ORF1374 (서열번호: 87)으로 대체되고 이는 균주 M68로부터의 것이고 그리고 3' 부분의 디포신4 BPAR (서열번호: 78)을 3' 말단의 동족 BPAR (서열번호: 88)로 대체하고 이는 균주 M68로부터의 것이고 ATCC43593 (서열번호: 89 및 90)으로부터의 차페론과 함께되고 그리고 실시예 6에 기재된 바와 같이 B. 서브틸리스에서 발현되어, 수득한 디포신, Diff4_M68-1374는 미토마이신 C-유도 M68 균주로부터 직접적으로 단리된 디포신 제제보다 좁은 살균스펙트럼을 가진다. 비록 다른 디포신 유전자 클러스터가 M68 게놈 서열에서 발견되지 않았지만, 공지된 마이오바이러스과 파아지에 상동성을 갖는 몇몇의 추정 프로파아지 유전자 삽입물이 발견되었다. 디포신 클러스터 내의 몇몇 유전자가 C. 디피실레 마이오바이러스과 파아지의 수축성 테일 내의 유전자와 상동성을 공유하기 때문에, 비제한적으로 프로파아지 서열을 포함하는 C. 디피실레 파아지 및 C. 디피실레 게놈으로부터의 유전자가 디포신류에 대해 다시 직접적으로 표적하는 이종성 RBD의 공급원으로 기능할 수 있다는 가설을 제기했다 그러나, 어떤 C. 디피실레 파아지, 프로파아지 또는 그의 게놈 서열 내 기타 ORF에 대한 스펙트럼 결정 인자 또는 RBD 유전자의 이전의 확인은 없었다.

표 II. 이종성 디포신류 및 천연 M68 디포신의 제제에 대한 균주 C. 디피실레의 민감성

M68 내 추정 프로파아지 삽입물로부터의 ORF에 대한 디포신 유전자 클러스터로부터의 ORF의 비교는 많은 유사한 유전자 및 유사한 유전자 클러스터 구조를 나타냈다. 그러나, ORF 다음 전형적인 디포신 RBD에 대한 ~1700 아미노산 잔기를 인코딩하는 위치에서, 예상된 기저판 J 어셈블리단백질 및 BPAR에 대한 상동성을 갖는 ORF의 다운스트림은, 전형적인 디포신 RBD (예를 들면: 서열번호 17, 49-53)가 전형적으로 잔류하여, 보다 짧은 ORF가 인코딩하는 단백질의 400-560 아미노산 잔기(표 III 및 서열번호: 92, 94, 96, 98)로 이는 전형적인 디포신 RBD와 상동성을 공유하지 않는 것이 밝혀졌다.

표 III. 전략 I, II, 또는 III에 의해 작제물된 이종성 RBD, BPAR 융합, 및 이종성 디포신류의 차페론에 대한 서열번호.

추정 프로파아지 BPAR에 대한 이들 ORF 다운스트림의 서열분석은 이들이 다음 ORF에 대하여 그리고 적어도 하나의 3도메인 (N-말단, 중간-섹션, 및 C-말단)에서 상호 상동성을 공유하였다는 것이 밝혀졌고 그리고 ORF (서열번호: 92) 다운스트림은 phiC2 파아지로, 서열번호: 54에서 BPAR로 각주됨. 흥미롭게도, phiC2에서 서열번호: 92를 인코딩하는 DNA 서열은 phiC2 파아지에서 예상된 단백질로 주석을 달지 않는다. 파아지 및 프로파아지 서열 내에서 BPAR의 ORF 즉시 다운스트림은 도메인-유사 방식에서 상동성을 공유하고 그리고 ORF1374를 인코딩하는 유전자와 같이 BPAR 동족체의 다운스트림을 모두 발견하였기 때문에, 이들 ORF가 잠재적 RBD를 인코딩하는 것이 예측되었다. 여기에서 제시된 바와 같이, C. 디피실레 M68으로부터의 최초관찰 이래로 C. 디피실레를 감염하는 파아지 내 또는 다른 C. 디피실레 분리주의 게놈에서 추정 BPAR의 잠재적 RBD 다운스트림을 인코딩하는 보다 많은 DNA 서열이 확인되었다. 기능적 이종성 디포신류를 제작하기 위해 사용된 RBD에 대한 서열번호는 (표 III)에 열거된다.

이전에 미공지된 기능을 갖는 이들 새로 확인된 ORF가 새로운 C. 디피실레 표적 균주에 대해 직접적인 디포신 사멸을 할 수 있는가를 결정하기 위해, 신규한 이종성 디포신류가 디포신4 ORF 1374 (서열번호: 49)를 추정 RBD를 인코딩하는 ORF로 대체함에 의해 조작되었다. 추정 RBD를 인코딩하는 핵산서열 및 그의 동족 BPAR을 인코딩하는 ORF의 인접한 3' 부분은 다음의 Diff4 유전자 클러스터를 함유하는 (실시예 2에 기재된) 벡터 내에 클로닝되고, 상기 Diff4 유전자 클러스터 (서열번호: 61),는 전체 디포신4 ORF 1374를 대체하고(서열번호: 49) 그리고 C-말단부의 디포신4 BPAR을 대체한다(서열번호: 78). 융합된 BPAR의 아미노산 잔기에 대한 서열번호는 표 III에 제공된다. 본 발명자 등은 그의 동족 BPAR의 적어도 C-말단 절반의 함입이 없이 이종성 디포신4 안으로 편입된 주어진 추정 RBD가 최소의 살균활성을 생성하거나 또는 하지 않는 것을 관측하였다. 삽입물은 벡터 골격 내에 양립가능한 클로닝 부위를 가지지 않기 때문에 3가지 클로닝 전략이 고안되어 이 장애를 극복하였다.

전략 I로 제작된 작제물을 위해, 중첩 말단을 함유하는 3개 이중-가닥 DNA 분절(업스트림 분절, 중간-분절, 및 다운스트림 분절로 지칭됨)이 PCR에 의해 생성되었다(표 IV; 패널 A, B 및 C). 업스트림 분절 (표 IV, 패널 A)은 서열번호: 61 내의 특정 BstBI 부위 내지 서열번호: 78를 인코딩하는 BPAR 유전자의 5' 말단으로 구성된다. 중간-분절 (표 IV, 패널 B)는 추정 RBD의 전체 ORF와 그의 3' 업스트림 동족 BPAR의 절반으로 구성된다. 다운스트림 분절 (표 IV, 패널 C)은 서열번호: 49의 즉시 다운스트림 영역으로 구성되고 그리고 서열번호: 79 및 80를 인코딩하고 상기 실시예 2에서 기재된 벡터 폴리링커 내의 특정한 Asc I 제한 부위로 신장한다. 모든 3개 분절은 조합을 적잘하게 할 수 있도록 하기 위해 주형에 대해 상보적이고 인접한 단편에 대해 상보적인 오버행을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 제작된다. 각 작제물을 증폭하기 위해 사용된 코딩 가닥 및 비-코딩 가닥 올리고뉴클레오타이드는 표 IV에서 서열번호에 의해 열거되었다. 각 PCR 반응을 위한 DNA tem플레이트 또한 표 IV에 열거되었다. 다음으로, 각 컨스트럭션을 위한 3개 분절이 조합되고 업스트림 분절 내 코딩 가닥과 다운스트림 분절 내 비-코딩 가닥에 대해 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR에 의해 단일 단편 내에서 증폭되었다(표 IV의 서열번호참고). 수득한, 조합된 단일 PCR 단편은 그런 다음 BstBI 및 AscI로 잘단되고 그리고 BstBI 및 AscI로 미리-분해된 Diff4 벡터 골격에 결찰되어 열거된 작제물을 만든다. 각 작제물은 그런 다음 B. 서브틸리스 안으로 형질전환되고 그리고 0.5 mM H₂O₂ 가 소분자 유발제로 사용된 것을 제외하고는 실시예 3에서 기술된 바와 같이 발현된다.

전략 II로 제작된 작제물을 위해, 업스트림 분절, RBD 영역을 함유하는 중간-분절 및 다운스트림 분절에 상보적인 중첩 PCR 생성물이 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전략 I에서 기재된 바와 같이 제작되었고 그리고 각 작제물에 대한 주형은 표 IV에 열거되었다. 다음으로, 중첩 PCR 생성물은 서열번호: 61를 함유하는 (실시예 4에 기재된) 벡터골격과 혼합되고, 상기 서열번호는 BstBI 및 AscI로 미리-분해되고 그리고 Gibson 방법에 의해 단일 작제물 안으로 조립된다 (Gibson 등 2009). 각각의 얻어진 작제물은 그런 다음 개별적으로 B. 서브틸리스 안으로 형질전환되고 그리고 0.5 mM H₂O₂ 가 소분자 유발제로 사용된 것을 제외하고는 실시예 3에서 기술된 바와 같이 발현된다.

전략 III 작제물은 다운스트림 분절이 생성되지 않는 것으르 제외하고는 전략 II에 동일한 방식으로 제작되었다. 대신에, RBD 영역을 함유하는 중간-분절이 확장되어 추정 RBD (표 IV에 각 작제물에 대해 열거된 서열번호)의 ORF 즉시 다운스트림을 포함하고 그리고 벡터 골격 AscI 부위로 오버랩되었다. 그 결과, 서열번호 79-80를 인코딩하는 DNA, 디포신4 테일 구조 어셈블리에 대한 추정 차페론은 동족 추정 RBD의 ORF의 발견 즉시 다운스트림을 인코딩하는 DNA 서열로 대체되고 그리고 추정, 동족 RBD의 어셈블리에 대한 차페론이 될 수 있다는 것이 고려된다. 각각의 얻어진 작제물은 그런 다음 B. 서브틸리스 안으로 형질전환되고 그리고 0.5 mM H₂O₂ 가 소분자 유발제로 사용된 것을 제외하고는 실시예 3에서 기술된 바와 같이 발현된다.

표 IV. 이종성 디포신류를 작제하기 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드 및 그것의 서열번호, 주형, 및 전략. (패널 A) 업스트림 분절용. (패널 B) 중간-분절용. (패널 C) 다운스트림 분절용.

패널 A

패널 B

패널 C

전략 I-III으로부터의 각 발현된 이종성 디포신 DNA 컨스트럭션으로부터 디포신 제제가 제작되고 그리고 C. 디피실레 분리주의 패널에 대한 살균활성에 대해 검정되었다. 각 이종성 디포신 컨스트럭션의 살균활성에 민감성인 분리주가 표 II에 열거되었다. 보다 강력한 사멸 활성이 Diff4_R20291-RBD1+ Diff4_R20291-RBD1 컨스트럭션에 비교된 바와 같이 R20291-RBD1에 대한 동족 차페론(서열번호: 113, 114)을 함유하는 작제물에 대해 관측되었고, 천연 디포신4 차페론을 함유했다(서열번호: 79-80).

10. 신규한, 비-1374-기재 RBD를 함유하는 이종성 디포신류의 증가된 안정성.

디포신류는 효과적으로 제조되고 그리고 필요에 따라 동물에 전달되도록 하기 위해 많은 상이한물리적 환경에서 활성을 유지하는 것을 요구한다. 이를 염두에 두고, 천연 발생 및 이종성 디포신류의 물리적특성을 조사하였다. 디포신류는 제조된 디포신류의 원심펠렛이 각 연구에 대해 적절한 버퍼에 재현탁시키는 것을 제외하고 실시예 9에 기재된 바와 같이 제조되었다.

온도 안정성 연구(표 V)를 위해, 디포신류를 HN50 (pH 7.4)에 재현탁시키고 그리고 명시된 온도 및 시간에서 배양하였다.

표 V. 스폿 검정에 의해 결정된 것으로 천연 디포신4 및 이종성 디포신류의 열적 민감성. 도시된 것은 살균활성이 각 열적 조건에서 관측된 다수의 일련의 5-배 희석이다.

pH 민감성 연구(표 VI)를 위해, 디포신류는 명시된 산성 pH로 시트르산으로 산성화된 5mM 소디움 시트레이트 용액이나 12.5 mM 중탄산나트륨/HN50 (또는 명시된 알칼리성 pH로 NaOH로 알카리화된 디포신4 용액에 대해 TN50)의 어느 하나에서 재현탁시켰다. 명시된 pH에서, 샘플은 30분 동안 실온에서 인큐베이션되었다.

표 VI. 스폿 검정에 의해 결정된 것으로 산(패널 A) 및 알칼리성 용액(패널 B)에 대한 천연 디포신4 및 이종성 디포신류의 민감성. 도시된 것은 살균활성이 각 pH 조건에서 관측된 다수의 일련의 5-배 희석이다.

패널 A

패널 B

양자 연구를 위해, 샘플은 그런 다음 HN50 내에 연속으로 (5-배) 희석되고 그리고 민감성 C. 디피실레 분리주 상에 스폿 검정에 의해 살균활성에 대해 검정되었다. (각 디포신에 대한 살균활성을 분석하기 위해 사용된 민감성 균주가 표 V 및 VI에 명시되었다). 연구된 디포신류는 다음을 포함했다: 천연 디포신4 (서열번호: 61에 의해 인코딩된 것) 이종성 Diff4_43593-1374 (서열번호:53에 의해 인코딩된 RBD), 이종성 Diff4_M68-RBD1 (서열번호:91 및 92에 의해 인코딩된 BPAR 및 RBD), 이종성 Diff4_M68-RBD4 (서열번호:95 및 96에 의해 인코딩된 BPAR 및 RBD), 이종성 Diff4_M68-RBD5 (서열번호:97 및 98에 의해 인코딩된 BPAR 및 RBD).

파아지 RBD를 함유하는 이종성 디포신류는 RBD와 같은 ORF1374 단백질을 함유하는 천연 디포신류 또는 이종성 디포신류보다 높은 온도에서 더 길게 안정하였다(표 V). 신규한 RBD M68-RBD1 (서열번호: 91, 92), M68-RBD4 (서열번호: 95, 96) 및 M68_RBD5 (서열번호: 97, 98)를 함유하는 이종성 디포신류의 제제는 37 ℃에서 15분 동안 인큐베이션된 때에 비교하여 45 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션된 때에 활성 유지했거나 증가했다(표 V). 흥미롭게도, CD1374 RBD, 예컨대 천연 디포신4 RBD (서열번호: 49) 및 이종성 Diff4_43593-1374의 RBD (서열번호: 53)를 함유하는 디포신류는 동일한 열적 조건 하에서 신규한, 더 작은, 비-1374-기재 RBD를 갖는 이종성 디포신류에 의해 유지된 것에 비교할만한 활성을 보유하지 않는다(표 V). 1374-기재 RBD를 갖는 이들 두 개의 이전 디포신류는 45 ℃에서 1시간 동안 가열될 때, 이들은 각각 80% 및 95%보다 더 많이 살균활성을 소실하였다.

증가된 열적 안정성을 나타내는 것에 부가하여, RBD M68-RBD4 (서열번호: 96)을 함유하는 이종성 디포신은 ORF1374를 함유하는 천연 디포신 4보다 더 큰 pH 범위에 걸쳐 안정하였다(표 VI). 살균 스폿 검정에 대한 결과는 Diff4_M68-RBD4가 pH 3.4부터 pH 9까지 활성을 유지하였고 그리고 더욱이 아래로 pH 2.5 및 최대 pH 10.6까지 검출가능한 얼마간의 잔류 활성을 유지하였다는 것을 보여준다. 디포신4는 단지 pH 5.5 내지 pH 10에서만 활성을 유지했다. 팽창된 pH 범위를 갖는 디포신류는 이들이 산성 환경 예컨대 위에 직면하기 쉬운 곳인 생체내에서 작용하기에 보다 더 적절하다. 이들 결과는 신규한 분류의 비-1374로부터 RBD인, 더 작은 RBD를 함유하는 이종성 디포신류가 천연 디포신류 또는 큰 이종성 1374-기재 RBD를 갖는 디포신류의 것과 비교하여 보다 강력하고 그리고 따라서 효율적인 생산 및 치료적 적용에 대해 이점을 가지는 것을 명시한다.

11. 신규한 RBD를 함유하는 이종성 디포신류의 살균활성은 뮤어라인 GI 관에서 지속했다.

생체내에서 생존하는 경구로 투여된 디포신류의 능력이 마우스 내에서 평가되었다. 다음으로 구성된 칵테일, 즉 천연 디포신4 (서열번호: 61으로 인코딩된 것), 이종성 Diff4_M68-RBD4, 및 관련없는조작된 R-형 박테리오신, AvR2-V10로 된 양성 대조군 (Scholl 등, 2009)이 12.5 mM 중탄산나트륨 내에서 제형화되고 그리고 정상의 건강한 마우스(n=3)에 경구 위관영양법을 통해 투여된다. 위관영양법 두 시간 전에, 마우스에는 H₂ 수용체 길항제인, 라니티딘 (100mg/kg)으로 주사되어, 위의 산성화를 방지하거나 최소화하였다. 배설물을 8시간 동안 매 시간 수집하였고, 프로테아제 억제제를 함유하는 HN50에서 균질화하였고 그리고 원심분리하여 잔해를 제거했다. 상청액을 0.45 마이크론 필터를 통해 여과하고, HN50 내에서 연속으로 5-배 희석하였고 그리고 그 다음 감수성 C. 디피실레 분리주의 론 상에서 스폿 검정을 통해 살균 활성에 대해 분석하였다. C. 디피실레 균주 19137은 디포신4에 의한 사멸에 대해 독특하게 민감성이기 때문에, C. 디피실레 균주 CF5는 디포신4_M68-RBD4에 의한 사멸에 대해 독특하게 민감성이고, 그리고 에스케리치아 콜리 EDL933은 AvR2-V10에 의한 사멸에 대해 독특하게 민감성이고, 상대적인 회수는 투여된 칵테일 내에서 각각의 독특한 살균성분에 대해 특이적으로 관측될 수 있다. 각 감수성 균주에 대한 살균 검정 결과는 각 시험된 마우스로부터의 배설물에 대해 나란히 도시되었다. 투여된 칵테일의 분취량이 보존되고 그리고 각 박테리아 론 상에 양성 대조군과 평행하게 스폿되었다.

배설물 샘플 내에서 살균활성이 이종성 Diff4_M68-RBD4에 대해서는 회복되었지만, 천연 디포신 4에 대해서는 되지 않았다(표 VII).

표 VII. 경구 투여 후 마우스의 배설물 내 천연 디포신 4 및 이종성 Diff4_M68-RBD4의 살균활성의 회복. 살균활성이 각 지시된 시점에서 스폿 검정에 의해 관측된 다수의 일련의 5-배 희석이 도시되었다.

마우스 사이의 활성을 비교하여, Diff4_M68-RBD4 활성이 이르면 위관영양법 2시간 후에 그리고 늦어면 8시간 후에 관측되었다. 활성의 피크 회복은 25-배 희석 후 관측된 살균활성으로 위관영양법 3 내지 4시간 후 관측되었다. 천연 디포신 4의 활성은 어떤 시점에서 배설물 내에서 회복되지 않았다. 균주 19137에 대한 칵테일 용액의 보유된 분취량의 활성은 투여된 칵테일 내 천연 디포신4가 투여 시간에서 활성이었다는 것을 확인하였다. 이들 결과와 실시예 10에서의 것은 천연 디포신류에 비교하여 신규한, 비-1374-기재 RBD를 함유하는 이종성 디포신류가 더 높은 온도에서 그리고 보다 산성 환경에서 안정하였다는 것을 보여준다. 경구로 투여될 때, 더욱이 그리고 유사하게 관련된 이들의 살균활성은 C. 디피실레 증식 및 발병 부위인 동물 GI 관에 노출에 대해 생존하였다.

12. 이종성 디포신은 생체내에서 CDI를 감소했다.

C. 디피실레 감염에 대한 디포신의 효과가 C. 디피실레 포자로 챌린지된 마우스를 사용하여 조사되었다. 두 그룹의 마우스(그룹 당 6마리)을 충분한 세포 페라존 (0.5mg/mL)을 함유하는 음료수로 5일 동안 전처리하여, 위장 미생물총을 파괴하고 그리고 마우스를 경구로 투여된 포자로 챌린지로부터 C. 디피실레 감염에 감수성으로 하였다. 양자의 그룹은 그런 다음 음료수 내 라니티딘을 섭취하기 전 36시간 동안 회복하도록 허용되었다 (용량: 100mg/kg/일) 라니티딘 투여 시작 12시간 후, 처리 그룹은 12.5 mM 중탄산나트륨 용액 내 경구 위관영양법을 통해 이종성 디포신4_M68-RBD4를 섭취하였다(용량: 10¹¹ 사멸 단위 Gebhart 등, 2012; Ritchie 등, 2011; Scholl 등, 2009에 기재되고 정의된 사멸 단위를 가짐). 두 시간 후 마우스의 양 그룹은 균주 CD630으로부터 제조된 C. 디피실레 포자의 2x10⁵ CFU로 챌린지되었다. 처리 그룹은 포자 챌린지 후 4시간에 시작하여 그런 다음 매 6시간 마다 위관영양법에 의해 디포신을 섭취하는 것을 계속했다. 포자 챌린지 후 24시간에, 양 그룹 안의 마우스로부터의 배설물이 수집되고, 정량되고, 균질화되고 그리고 발육을 증진하기 위해 0.05% 소디움 타우로콜레이트를 함유하는 C. 디피실레 선택적 제제 플레이트 상에서 일련의 10-배 희석으로 도말되었다. 샘플 당 총 CFU가 계수되고 그리고 CFU/g 배설물로 전환되었다(도 10). 기하학적 평균 CFU/g 배설물이 각 그룹에 대해 계산되고 그리고 스튜던트 t-시험에 의해 비교되었다.

데이터의 분석은 이종성 디포신인, Diff4_M68-RBD4가 생체내에서 활성이어서, 쉐딩을 감소하고 그리고 따라서 C. 디피실레 균주 CD630의 군집화를 감소한다는 것을 보여주었다. 디포신을 섭취하기 않은 마우스는 6.9x10⁵ CFU/g 배설물 (기하학적 평균)에서 C. 디피실레를 쉐딩하는 반면, C. 디피실레 챌린지 전에 또는 그 동안 이종성 디포신을 섭취한 마우스는 3.7x10⁴ CFU/g 배설물 (기하학적 평균) C. 디피실레를 쉐딩하였다. 이것은 C. 디피실레 쉐딩에서 18.6-배 감소를 나타냈다. 스튜던트 t-시험에 의한 쉐딩 결과의 비교는 무가치한 가설 p-값< 0.05을 제공하고, 그리고 디포신에 의해 야기된 쉐딩에서의 차이는 통계적으로 유의미하였다는 것을 명시하였다. 이 실험은 신규한 비-1374-기재 RBD를 갖는 이종성 디포신류는 생체내에서 활성이었고 그리고 C. 디피실레 쉐딩과 군집화를 감소하였다는 것을 실증하였다.

"구비하는", "함유하는" 또는 "특징으로 하는"과 상호교환적으로 사용되는 용어 "포함하는"은 포괄적이거나 한정적이지 않은 언어이며, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 어구 "로 이루어진"은 특허청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 어구 "본질적으로 ~로 이루어진"은 특허청구범위의 범주를 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이며 신규한 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들로 제한한다. 본 개시내용에서, 본 발명의 구현예를 각각의 이들 어구의 범주에 해당하는 조성물 및 방법으로 고려한다. 따라서, 기재된 요소 또는 단계를 포함하는 조성물 또는 방법은 특정한 구현예를 고려하며, 여기서, 조성물 또는 방법은 그들 요소 또는 단계로 이루어지거나, 본질적으로 이들로 이루어진다.

특허, 특허 출원서 및 공보를 포함하는 본 명세서에 기재된 모든 참고문헌은 이전에 구체적으로 포함되든지 아니든지 간에, 그들 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.

이제 본 발명이 완전히 기재되었으며, 본 발명이 과도한 실험과정 없이, 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고, 넓은 범위의 동등한 파라미터, 농도 및 조건 내에서 수행될 수 있음이 당해분야의 숙련가에 의해 인정될 것이다.

본 발명이 본 발명의 특정 구현예에 관하여 기재되지만, 본 발명이 추가로 변형될 수 있음이 이해될 것이다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따르고, 본 발명이 속한 기술분야 내에서 공지된 또는 관례적 실무 범위 내에서 일어나고 본 명세서에 제시된 필수적인 특징들에 적용될 수 있는 바와 같이, 본 개시내용으로부터의 출발하는 것을 포함하는, 본 발명의 임의의 변화, 용도 또는 적용을 포괄하고자 한다.

본 발명이 상기 실시예를 참고로 기재되었으나, 본 발명의 사상 및 범주 내에서 변형 및 변화가 포함되는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 특허청구범위에 의해서만 제한된다.

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tagtttgagg aggaatcgca 20700 aattaaatct gatttatgtg atagattatc tccatttaat agccagtcta ctgaaacatt 20760 aaatatctca gctatagatt ttaatatttc ataatttggt tttctaatgt ttctctcaaa 20820 tttacttaag ttgtcacagc ctaacatttc ttctagttca tattgtttaa ggttttttgc 20880 ttttctcaaa taaacaattc tttctcctaa agtatccata aacactctcc attcaattaa 20940 tgtcaaaaag actttttaag atgtaaatag tttcaaatta aaggtcaaaa tgacataaaa 21000 accattgact taaggtcaaa atgactttat aattaactta atgatacgaa tttacatcct 21060 aattttagca caaagtaatc aaaaaatctt atttagtatt aaataaattt atatacttaa 21120 tatgtgtaca tattaaaaat atatactaaa tagagggggt gcgtaagcta aagtaatata 21180 aaagtaaata taaatcactt agaaaggaag ttgataaatg gatgctcgaa aaaaatggat 21240 accttttttg ggagtgcaag tcaagcaaag acttattgaa ttaaatatga ctcaaaggga 21300 attagcgaag aaaataggtg ttaatgaaaa ctatttgtca gctattttaa atggaagaag 21360 aacaggtaaa aaatataaat catcaattta tcaattactt aatatagaat attcagaaga 21420 tgattaataa atagtatata aagtaggtga atattcttgt gtgcaaattg gattcagatg 21480 gggttataga gtgttgtaga gcaattgatg attttattac agcacttagt aatataaaaa 21540 gcttaaatat ggaaagatta aatactttaa ctaaatattc tagtacatgt tcaatccttc 21600 ttaaagaggg gaattatgaa ggatgtacaa ttgtgtatag aaagatgttg gaagaattaa 21660 aaacatgagt aatgcatttc ttaggaatat aaattataca tagaaatgta ttatattttt 21720 caaagtactt aaactaaaat atggataaga taatctaaat attataaatg tgcttgaaat 21780 tagactatac ttgtttttaa ataatccaat atccatattt tagtaatata ctacaaaaaa 21840 agaaggttaa tagatgatgt aaaatcgtat caaattatgt atgtttaaac cattttatct 21900 tcattattat tagaggaatg cttttttaag tctttatatt cagatatctt aagttcaagt 21960 attccttcta tttttatttt atcacgttcg tttagttgtc tgtatagatt taatatcatc 22020 atttcatcat tagtaacatg taagtaatct tctttatctt cttttacact actattgaca 22080 tttaccttct ctttaccata gagaagccag tcagtcgtaa cattaaaata atcagctatt 22140 gacattagta tatcacaatt aggttttcta tctcctgttt catacttgcc taagttttca 22200 aattttaaaa tatccataag tttgcgctga gtaagttttt tggagtttct caaataagca 22260 attctttttc ctaaagtatc cacaaaatac actcctttct ttttatgagt aatgtctaaa 22320 tgacatttga aattaaaaat 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difficile <400> 3 Met Glu Asn Lys Lys Asp Ile Leu Phe Lys Glu Thr Asp Glu Arg Leu 1 5 10 15 His Asn Tyr Lys Tyr Leu Asp Ile Lys Ile Lys Asn Ile Asn Leu Asp 20 25 30 Ile Lys Arg Cys Glu Asn Glu Tyr Ser Gly Cys Gly Ala Met Val Tyr 35 40 45 Thr Glu Lys Thr Ser Asn Thr Tyr Asn Ile Ser Ser Ser Val Glu Asn 50 55 60 Glu Val Leu Lys Arg Glu Glu Arg Leu Arg Lys Leu Lys Met Glu Lys 65 70 75 80 Glu Asp Ile Glu Ile Glu Lys Glu Lys Ile Glu Asn Ala Leu Thr Cys 85 90 95 Leu Asn Asp Ile Glu Met Glu Phe Phe Asn Leu Phe Tyr Asn Ser Lys 100 105 110 Thr Lys Asn Asn Met Thr Tyr Ile Ser Met Lys Leu His Leu Asp Arg 115 120 125 Thr Ser Cys Tyr Asn Leu Lys Lys Lys Met Ile Phe Lys Leu Ser Glu 130 135 140 Ile Leu 145 <210> 4 <211> 130 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 4 Asn Phe Thr Glu Ser Ile Phe Ile Asp Asp Glu Ser Val Gln Gly Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ser Cys Phe Phe Val Ser Ile Leu Ser Val Ile Cys Thr Pro 20 25 30 Ile Met Leu Asn Thr Asn Asn Lys Asp Ile Val Ile Ser Ile Lys Tyr 35 40 45 Leu Pro Lys Pro 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acaatatttc cttttatagg tgtcccagag 10380 gattatatct tacctaaaac agaagaattg ccaatctttc gtgaagtggc atgggatttt 10440 gaaaaagatg aacctatttt agaaaaaggt gactttaaaa taattgaaaa aaaagaagcc 10500 ttaaaagttt ggatatacaa gtgtataaag acaaatagat atgaacatga gatatactct 10560 ttagaatatg ggacagagct ttcagaacta ataggacaaa aatatacaaa aggtcttaca 10620 gaaagtgaag ctagtagatt cataaaagag gcccttctaa taaatccata tatattagaa 10680 gtaaacgtaa aaagtgctaa ctttaacaga gacatattga gtgcaaatgt aaaagtatcc 10740 actatctatg gggaggtgga aataaatgta tagtgaccag acatatgaag taataaaaaa 10800 tagaactctt gaaaatatta atcttgatat ttataaagga gaaggttctt ttctaaacaa 10860 catggtatct ggaaataatc tagaactttc gaagatatat ctagaacttt caaagatgca 10920 taaaatggct tttatacaag acacatataa ccagtttctt gataaaagag tcaatgaatt 10980 tggtgtatat agaaagttag gtacagagtc aaatggagaa gttgaattta ttggagagaa 11040 aggtactgta ataaataatg gcacaataat atcatataga gatttactat ttgtagtaat 11100 aaaagatgta actattggta gtgaagaagg tgacaatagc ccagttcaag ctctggaagt 11160 tggtaagaaa tataatttac ctacaaattg tgaatttaaa ctagttgata atatatctgg 11220 agtaacaaag attactaaca caagaagttt tgaaggtggt acagatatag agacagatga 11280 agaactaaaa gaaagatttt ataaaatcca aagaaatcaa gctacaagtg gaaataaagc 11340 tcactatgaa gaatgggctt tggaagtaga tggagtctat aatgttaagg tttatccaag 11400 atgggatggt ccgggaacag ttaaggtctt gatatttggg aaaaataatc aagctgttga 11460 tacagaaaca attgaaaggt gtcagcaaca tatagatgaa gagaagccta ttggaccaac 11520 tataacagtt gtgacaccat taccaataga aataagtata agtgcagtaa tgaaactaga 11580 agatggatat acattagaca atgtaaaaga atctttccta gaaagtataa atacatactt 11640 tagagatatt agaggagaga taatctatac aaaagtaatg ggaatactta taaatactac 11700 tggtgtacac gatttaagta acctacttat aaatggaagt acagataata taactattaa 11760 tgaagataaa atacctagtg taacaactgt taattttagt gaggtggaaa atcaatgaag 11820 ctaattgata aactaccatc atttgataga aattacattg tagaggagat acaaggtgca 11880 tacgatacag aattaaatat tcttaaagaa gatattgatg atacctttaa ccaattattt 11940 gttgacactg caacatgggg attagatatg tgggaagaca tactctgcat tgaaaaaaaa 12000 gaacttgatt 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atggatgtgg 13680 agataatagt aactttcaac ttggattggg agaagacaat acaacaagaa aattatttac 13740 gaaaatacca aatatatcta ccaatattaa aaaagttgca tgtggagaat ctcatgcagt 13800 tatacttact tcagatggag aattacttgt cgcaggtata aatacagatg gtcaaatggg 13860 attgggatta gaaaaagtag ggaaaacagt ttctacattt gagaaggttc cagaaataaa 13920 aggcgtaaag gatattgcat gtggacttca atcaacatat cttttataca atgatggaac 13980 tttatatgtt gctggaaata atttgtatgg tcaattaggt ctaggaacta atggagcatc 14040 tgcaaatgta aatacattta caaaagtaga tgttgacaat gtaaaggctg tattttcata 14100 taataaatca gcttttataa taaagaatga caataaatgc tattctactg gttttaataa 14160 tcaaggtcaa ctaggtttag gagataagaa taatagagat ttatttagtt tagtttctat 14220 taatgatgtt aagactatag cttgtggttc tgaacacact gtgttaatga cgtataataa 14280 tgatatatat ggttgtggaa aggaaaaatg ttttggaaat gcacttcaat catcactatt 14340 tactaagata gaagaagtaa atataaaaac tattgcatgt ggtcatggta acactatgct 14400 tatagataac aaaggtactt taaaggttgc tggaaataat gatatatatc agttaggtat 14460 agcaaattac tctgagaata tagataattc atttatagat ttaaaaaata ttgtagctaa 14520 gaatattttc attggtttat cacatagcat actaattgat tcaaataatg attcatattg 14580 tacaggagat aatacttatg gacaattagg ttcgtttttt gatgatatgc acattgtaga 14640 atttaagaaa atggatagtg aaaaatatag ttatagtaat tatataaatt taattaaatc 14700 tgaggataaa ttaactttat taaaagaaga aatggaaata aaggatattg aacttccact 14760 agatatacat tctgtaagag atgtcgtttt tagtccttat tgtactctgg ttattttagg 14820 gaatggagat gtatatggtc taggaaataa tagatacaaa ggaatgggtt ctgacttacc 14880 aagtcaatta aatgagttga caaaattaag tatctctaat gtaaagtcta tagtagcatc 14940 aaaaaatatt tctggaggaa tattctacat taaaaatgat gatacttgtt attattctgg 15000 accaaatagt aactcaatag caggtgttct tccttctaat tcagatgtat ttaagaaaat 15060 atctatagat aatgtaaaaa aagttgttat aaatactgat ttatcaaact ggttttcatt 15120 aattgtaact aataataagc aaatatacac ttctggaaag agttcaagtt atgttaatgg 15180 acttagtaat gcattaataa gtcaatatac tgagattagc cttagtaatg taactgatgc 15240 ttatagttca tataatgcaa catttattgt agttgatgaa aaaaaggtat atgcaactgg 15300 tataaataca aattacctgt taggttttag 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tatcttctaa tatacaagaa atatatagcc attcaaagtc 16200 tacatattta ttaactaata ataatatgct ttacagtgtt ggtttaaatg atgtaggtca 16260 attaggagtg ggagatgaga taaatagaaa ggtatttact aaaataaata ttgataatat 16320 aaaatctata aatgtaaata gatttactga caatagtaaa catgcatttg cgataaaaaa 16380 tgataatacc tgttatgctg ttggtttaaa taattctggt cagttaggaa taggagataa 16440 tgtaaataga aatatattta ctaaaataaa tgttgaaaat gtaaaatatg tagctgtata 16500 tggaaacaca tctctattat taactaatga tggtctttta tatggagcag gtaataatgg 16560 aaaaggacag ttaggattgg gtgatactac aagtaggaat atatttacac gtatacctat 16620 aaatggtgtt agagatgtat atctatgtaa tgatgtatca atcattgtta aaaatgataa 16680 tacatgctat gtatgtggac ttgtaaatgg ctattttggg tttactgaag gaagtataag 16740 tacatttaca aaaataaata ttgagaatgt aaaatctgtt gtgacagcag gaagtgaagc 16800 tacatttttt ataacaaatg acaatatgat ttatactaca gggaaaaaag agagggtatt 16860 cttttcaaca gagactaatg atataaaggg gatacgagta attaataata ttataaatgc 16920 aaaaaaaata gtagttaatg gatatacttc agccatttta acaaatgaca ataaactatt 16980 tgttggaggt cttagtggat atggaagtat agcaaataat aataatacaa atagtgtgga 17040 agatgttaaa gatgtttttg taacagctaa taatacactt tatatagata ataataacaa 17100 tttgatatca tcaggtagag atacttatgg tatatctgat gaatcttata gggatatgtc 17160 agttccatat tataaagtat ctataaagaa agatgttgat actgtatttt ctagttacaa 17220 tactatattt attaaagata tatatggaaa attttattct tcaacaagag ataatagata 17280 taatcattta ggtattcacc atagatatga taatgataaa aatgaagctc ttgaaggttc 17340 cctacattca tattttaaaa cagataacac atcagataaa atagttttta ataagaaaaa 17400 tgaaaagcta gtaatgttta atgataagta tataaaaaca aataataagt atataaatta 17460 taaaaacata tttaaagata attttaagta tacttcaata atattgccat ttgaggtatc 17520 tgatattgat atatcaaaaa cacattcatt ggctgttgct aaggatggca agttatatgg 17580 aataggaagt aattcatata aagaaattaa tcaaaccctt gaagatatag aattattaac 17640 tcttactgaa gtaaatatat cagatgtcaa aaaagttgct tgtggagata actactccta 17700 tattattaag acagataata ctctatggtc atatggaaag aatactgagt accaattggg 17760 agttggccac aataatgatg taagagagtt acaaaaggtt actggattac cttctgttaa 17820 agatataagt atatataact caatgacact tgttttaact aatgagggag agttgtacgc 17880 tcaagggtac aatacaaatg gattatttgg actaggagaa agtgaaaaag ataagataat 17940 aagaactttt actaaagtat taactaatgt taaagaaatt aagtcacata atgatgacca 18000 catactagta attaaaaatg ataatagtct atggataact ggtaaaaata aatctatgta 18060 taaaatatct atatcaatta ctgatttata tgaatttact aaaataccaa ttcctgaaca 18120 tctaaatgat attttagata tagagctttc agatgataca atatacatga taacaaaagt 18180 agatacaagt aaagcatcta tagaaatagt tgaaaaatca atatctcaag tgagagttgt 18240 agtacaagac cctaataatg ttatagaaaa acttgaaatg tttataaatg atgaattaat 18300 atctactaag actaatttgg aaataaatag cattatattt gagataccac aaaataaaat 18360 agtattagga gaaaataaga tactgattaa agccagtagt cctacaggcg atttatattc 18420 aagtatgttt atatttaaat cagaaacagg gcttaaagta aaaaaggatt ctattttaat 18480 gataaacaat aaagtatatt caatcataaa cattactgaa aataacactg acttaatagt 18540 aacattaaat gagggattaa aggatgatat gatggaaaac aatcctatat atcaattaat 18600 aaataaaact aaagttcaag taaaaataaa taaatctgac ttattcaaag 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 129 agttgtatca attttagtgt ctaattcttg aatatccttt tgagttacaa 50 <210> 130 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 130 tggtttttgt aactcaaaag gatattcaag aattagacac taaaattgat acaac 55 <210> 131 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 131 tttaaacaat tttcacacct ccattttata caaattttat agcataccaa 50 <210> 132 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 132 tacaattggt atgctataaa atttgtataa aatggaggtg tgaaaattgt 50 <210> 133 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 133 agttgtatca attttagagt ctaggtcttg aatatccttt tgagttacaa 50 <210> 134 <211> 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Claims (30)

1. R-형 고분자량(hmw) 박테리오신을 인코딩하는 단리된 핵산분자로서,
   상기 핵산분자는 클로스트리듐 디피실레의 제1 균주의 게놈으로부터의 것이며, 하기를 포함하는 핵산 분자:
   서열번호: 66-77를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드에 적어도 80% 동일한 제1 폴리뉴클레오타이드 서열, 상기 핵산분자는 C. 디피실레를 감염하는 박테리오파아지의 RBD 또는 C. 디피실레의 제2 균주의 게놈으로부터 프로파아지나 프로파아지 잔여물의 수용체 결합 도메인(RBD)을 인코딩하는 이종성 서열을 추가로 포함하고, 그리고
   상기 R-형 hmw 박테리오신은 서열번호: 78의 폴리펩타이드에 적어도 80% 동일한 제1 기저판 부착 영역 (BPAR) 폴리펩타이드의 아미노 말단 부분의 적어도 50 인접 아미노산을 포함하고, 그리고
   상기 R-형 hmw 박테리오신은 C. 디피실레의 적어도 하나의 균주에 대해 살균활성을 가지고; 그리고
   상기 RBD에 동족인 제 2 BPAR의 적어도 C-말단부를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오타이드.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 RBD는 서열번호: 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 및 116으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 RBD에 적어도 80% 동일한 핵산분자.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 제3 폴리뉴클레오타이드는 RBD의 전장 동족 BPAR을 인코딩하는 핵산분자.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 RBD의 동족 BPAR을 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오타이드는 핵산분자 안으로 삽입되어 RBD의 전장 동족 BPAR의 C-말단부가 제1 BPAR의 아미노-말단부에 융합된 핵산분자.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 RBD의 동족 BPAR의 C-말단부를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 88, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 및 115로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 BPAR을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산분자.
6. 청구항 1에 있어서, RBD의 동족 차페론을 인코딩하는 제4 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는 핵산분자.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 동족 차페론은 서열번호: 89, 90, 113, 114, 및 117로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산분자.
8. 청구항 1의 핵산분자를 포함하는 발현 카세트.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 R-형 고분자량 (hmw) 박테리오신의 상기 발현은 유도성이거나 억제성인 발현 카세트.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 발현은 소분자 유발제 또는 탈-억제인자에 의해 유도된 발현 카세트.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 소분자 유발제 또는 탈-억제인자는 ROS의 발생자나 반응성 산소종(ROS)인 발현 카세트.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 ROS는 인간 또는 기타 동물에 비독성인 퍼옥사이드인 발현 카세트.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 퍼옥사이드는 과산화수소인 발현 카세트.
14. 청구항 1에 의해 인코딩된 R-형 hmw 박테리오신.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 박테리오신은 동물에 경구로 투여될 수 있고 그리고 여전히 살균활성을 나타내는 형태로 배설물 중에 배출될 수 있는 R-형 hmw 박테리오신.
16. 청구항 14에 있어서, 상기 박테리오신은 25 ℃에서 30분 동안 pH 2.5 내지 10 사이에서 인큐베이션 후 살균활성을 보유하는 R-형 hmw 박테리오신.
17. 청구항 14에 있어서, 상기 박테리오신은 45 ℃에서 30분 동안 인큐베이션 후 살균활성을 보유하는 R-형 hmw 박테리오신.
18. 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 청구항 1에 따른 핵산분자를 포함하는 생산자 세포를, R-형 hmw 박테리오신의 발현을 유도하기에 효과적인 농도로 유도제에 노출하고, 이렇게 함으로써 R-형 hmw 박테리오신을 생산하는 것을 포함하는, R-형 hmw 박테리오신을 생산하는 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 상기 R-형 hmw 박테리오신을 인코딩하는 상기 핵산분자는 상기 생산자 세포의 게놈에 이종성이고 그리고 상기 핵산분자는 생산자 세포의 염색체 내에 함유되거나 생산자 세포 내의 염색체외 발현 벡터에 함유되는 방법.
20. 청구항 18에 있어서, 상기 생산자 세포는 비-병원성이고 편성 혐기성 박테리움이 아닌 방법.
21. 청구항 20에 있어서, 상기 비-병원성이고 편성 혐기성 박테리움이 아닌 것은 바실러스 , 락토바실러스, 락토구균 , 및 리스테리아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아의 속으로부터의 종인 방법.
22. 청구항 21에 있어서, 상기 종은 바실러스 서브틸리스인 방법.
23. 청구항 22에 있어서, 상기 B. 서브틸리스는 R-형 hmw 박테리오신을 생산하기 위해 유도될 때 융해되지 않는 방법.
24. 병원체 C. 디피실레를 청구항 14의 효과적인 양의 R-형 hmw 박테리오신과 접촉하는 것을 포함하고, 이로써 R-형 hmw 박테리오신이 병원체 C. 디피실레에 결합하여 사멸하는 것인, 클로스트리듐 디피실레를 사멸하는 방법.
25. 청구항 24에 있어서, 상기 클로스트리듐 디피실레는 동물 내에 존재하고 그리고 R-형 hmw 박테리오신의 살균양을 동물에 투여하는 방법.
26. 청구항 25에 있어서, 상기 동물은 포유동물인 방법.
27. 청구항 26에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 방법.
28. 박테리오신의 살균양을 생성하는 양의 청구항 1에 따른 핵산분자를 포함하는 생산자 세포를 감염의 치료를 필요로 하는 동물에 투여하는 것을 포함하여, 그렇게 함으로써 감염을 치료하는 것인, 동물에 있어서 클로스트리듐 디피실레의 감염을 치료하는 방법.
29. 청구항 14의 R-형 hmw 박테리오신 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
30. 청구항 1에 있어서, 상기 RBD는 C. 디피실레의 제2 균주를 감염하는 박테리오파아지로부터의 것인 핵산분자.
    
    

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