KR101955171B1 - 디포신 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 위험한 인간 병원체인 클로스트리듐 디피실리 세균을 특이적으로 사멸시키는 R-형 고분자량 박테리오신을 암호화하는 유전자의 전체 클러스터의 발견 및 분리에 관한 것이다. 또한, 클로스트리듐 디피실리와 달리 산소의 존재하에서 죽지 않는 무해한 생성자 세포에서의 R-형 박테리오신의 생성 방법이 개시된다. 또한, R-형 박테리오신의 사멸 스펙트럼을 결정하는 분리된 유전자 클러스터의 특정 유전자가 개시되며, 디포신의 사멸 스펙트럼이 디포신 유전자좌의 orf1374를 엔지니어링함으로써 변경될 수 있다는 증명이 개시된다. 본 발명은 위장관의 환경에서 클로스트리듐 디피실리 세균이 선택적으로 사멸되게 하는 강력한 살균제 및 살균 수단을 제공하며, 여기서, 클로스트리듐 디피실리 세균은 감염된 환자 또는 농장 동물의 큰 피해 및 심지어는 사망을 야기할 수 있다.

Description

디포신 및 그의 사용 방법{DIFFOCINS AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에서, 현재 계류 중인 미국 가출원 제61/349,145호(출원일: 2010년 5월 27일)로부터의 우선권의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 완전히 기재되어 있는 것처럼 참고로 포함된다.
기술 분야
본 출원은 일반적으로 박테리오신(bacteriocin), 더욱 구체적으로는 클로스트리듐 디피실리(Clostridium Difficile)를 특이적으로 사멸시키는 R-형 고분자량 박테리오신을 생성하기에 충분한 유전자의 클러스터의 동정 및 분리, 및 그의 살균 특이성의 변경, 생성 및 이용 방법에 관한 것이다.
클로스트리듐 디피실리는 인간 및 기타 포유류에 대한 널리 알려져 있는 병원체인 편성 혐기성, 포자-형성, 그람 양성 세균이다(문헌[Bartlett et al., 1977]; 문헌[Bartlett et al., 1979]; 문헌[Keel et al., 2007]; 문헌[Sunenshine & McDonald, 2006]). 저밀도 클로스트리듐 디피실리는 포유류 위장(GI) 관 내에 무해하게 잔류할 수 있으나, 클로스트리듐 디피실리 세균은 증식 시에, 종종 공생 세균을 감소시키는 항생제 투여의 결과로서, 중등의 설사 질환으로부터 특히 노인 및 유의미한 병존 질환(co-morbidity)을 갖는 다른 사람들에게 생명을 위협하는 특징적인 가막성 대장염까지의 다양한 질환을 야기하기에 충분한 외독소를 생성한다(문헌[Bartlett, 2002]).
이러한 병원체에 의해 형성된 포자가 광범위하게 퍼지고, 병원 및 만성 질환 관리 시설에서 근절시키거나 불활성화시키기 어렵기 때문에, 환자의 클로스트리듐 디피실리의 서식 가능성은 환자가 이러한 시설에 들어감에 따라, 급격하게 증가한다(문헌[Bartlett, 2007]). 사실, 클로스트리듐 디피실리의 고독성 독소생성 세균 균주인 클로스트리듐 디피실리의 상대적으로 새로운 균주, BI/NAP1/027는 거대한 집단발병 설정에서 중증의 질환을 야기하며, 최근에 충분히 입증되었다(문헌[Spigaglia et al., 2002]; 문헌[Pepin et al., 2004]; 문헌[McDonald et al., 2005]; 문헌[Muto et al., 2005]; 문헌[Loo et al., 2005]; 문헌[Belmares et al., 2009]). 이전에는 위험이 낮았던 소아에서의 클로스트리듐 디피실리 관련 질환(CDAD)의 발병이 또한 실질적으로 증가되었다(문헌[Benson et al., 2007]; 문헌[Zilberberg et al., 2010]).
무증상 보균자 또는 서식 대상체에서 항생제의 투여에 의한 예방적인 병원체의 제거는 클로스트리듐 디피실리 관련 질환 유도의 위험이 높기 때문에 강력하게 사용이 금지된다.
그람 음성 세균에 의해 만들어지는 R-형 박테리오신이 기재되어 있으며, 이는 다른 경쟁적 그람 음성 균주, 심지어 일부 환경에서는, 그람 음성 세균의 다른 종 또는 속을 사멸시키기 위해 이러한 세균에 의해 효율적으로 사용된다(문헌[Kageyama et al., 1964]; 문헌[Kageyama et al., 1964a]; 문헌[Kingsbury, D, 1966]; 문헌[Blackwell and Law, 1981]; 문헌[Blackwell et al., 1982]; 문헌[Campagnari et al., 1994]; 문헌[Strauch et al., 2001]; 문헌[Jabrane et al., 2002]). R-형 피오신의 기저판(base plate) 부착 영역(BPAR)의 이종 수용체 결합 도메인(RBD)으로의 융합은 그람 음성 세균에 대한 신규한 살균 특이성을 갖는 신규한 R-형 피오신의 생성을 야기하는 것으로 기재되어 있다(문헌[Williams et al., 2008]; 문헌[Scholl et al., 2009]).
다른 고분자량 박테리오신 또는 R-형 박테리오신이 그람-양성 세균에서 기재되어 있다(문헌[Coetzee et al., 1968]; 문헌[Thompson and Pattee, 1981]; 문헌[Zink et al., 1995]). 그러나, 그람 양성 세균에 의해 생성되는 R-형 고분자량 박테리오신 구조에 대해서는 훨씬 더 적게 알려져 있다. 그러나, 이러한 것이 기재되어 있지만, 유전자 수준에서 특성화되거나 유용한 작용제(agent)의 개발을 지원하거나 이에 필요한 방식으로 조작된 것이 없다. 고분자량 박테리오신은 2종의 클로스트리듐 종, 즉, 보툴리늄(botulinum) 및 퍼프린젠스(perfringens)에 대하여 기재되어 있다(문헌[Ellison and Kautter, 1970]; 문헌[Anastasio et al., 1971]; 문헌[Nieves et al., 1981]). 클로스트리듐 디피실리에 의해 생성되거나 클로스트리듐 디피실리를 사멸시키는 것은 기재된 적이 없다.
본 발명은 다른 클로스트리듐 디피실리의 균주에 대하여 살균성인 클로스트리듐 디피실리-특이적 R-형 박테리오신(본 명세서에서 "디포신"으로 명명)을 암호화하는 전체 유전자좌(locus) 또는 유전자 클러스터의 분리; 호기성 세균에서의 디포신 유전자 클러스터의 발현 및 디포신의 생성; 및 디포신 유전자 클러스터의 전사해독틀(ORF) 1374에 의해 클로스트리듐 디피실리 균주에 대한 디포신의 살균 스펙트럼이 결정된다는 발견에 기초한다. 본 발명은 유전자 엔지니어링(genetic engineering)에 의해 디포신의 특이성을 변경시켜 신규한 디포신을 생성하기 위한 실용적 수단 및 디포신을 제조하고, 디포신을 직간접적으로 투여하여, 인간을 비롯한 서식 동물의 위장(GI) 관으로부터 클로스트리듐 디피실리를 제거하기 위한 실용적 수단을 제공한다. 디포신의 투여에 의해, 종래의 항생제가 그러한 것처럼, 양호한 건강에 필요한 공생의 위장 세균을 손상시킴 없이, 클로스트리듐 디피실리 감염의 발생 및 관련 질환을 치료하거나 예방할 수 있다.
본 발명에 따르면, R-형 고분자량(hmw) 박테리오신을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 제공된다. 일 실시형태에서, R-형 고분자량(hmw) 박테리오신을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 제공되며, 여기서, 핵산 분자는 클로스트리듐 디피실리의 균주의 게놈으로부터의 것이며, R-형 hmw 박테리오신은 서열 번호 4 내지 16, 18, 19 및 66 내지 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드와 80% 이상 동일한 폴리펩타이드를 포함하고, R-형 hmw 박테리오신은 하나 이상의 다른 클로스트리듐 디피실리의 균주의 수용체에 결합하는 수용체 결합 도메인(RBD)을 가지며, 이에 따라 다른 클로스트리듐 디피실리의 균주(들)에 대한 살균성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 핵산 분자는 Cd4, Cd16, Cd19108, Cd19123, Cd19126, Cd19145 및 ATCC 수탁 번호 43593으로 이루어진 군으로부터 선택되는 클로스트리듐 디피실리의 균주의 게놈으로부터의 것이다. 일부 실시형태에서, 균주는 Cd16이며, 핵산 분자는 서열 번호 1을 포함하거나, 균주는 Cd4이고, 핵산 분자는 서열 번호 61을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화되는 분리된 R-형 박테리오신이 제공된다. 일 태양에서, R-형 박테리오신은 호기성 생성자 세균에서 발현된다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 살균성을 갖는 분리된 R-형 고분자량(hmw) 박테리오신이 제공되며, 여기서, R-형 hmw 박테리오신은 클로스트리듐 속의 세균의 제1 종의 제1 균주의 기저판 부착 영역(BPAR), 및 클로스트리듐 속의 제1 종 또는 제2 종의 제2 균주로부터의, 또는 클로스트리듐 종을 감염시키는 박테리오파지의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 변형된 형태의 RBD를 포함하며, 여기서, 박테리오신은 하나 이상의 클로스트리듐 디피실리 균주에 대한 살균성을 갖는다. 특정 실시형태에서, BPAR은 클로스트리듐 디피실리의 제1 균주로부터의 것이며, RBD는 클로스트리듐 디피실리의 제2 균주 또는 클로스트리듐 디피실리를 감염시키는 박테리오파지로부터의 것이다. 일부 실시형태에서, BPAR은 서열 번호 16, 54 내지 56 및 78 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트(segment)와 80% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, RBD는 서열 번호 17 및 49 내지 56 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 80% 이상 동일하다. 특정 실시형태에서, BPAR은 서열 번호 16 또는 78의 50개 이상의 연속 아미노산을 함유하거나, 또는 서열 번호 54 내지 56의 50개 이상의 연속 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드와 80% 이상 동일하다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 발현 카세트가 제공된다. 발현 카세트는 발현 벡터, 예컨대 플라스미드 내에 포함될 수 있거나, 또는 생성자 세포의 염색체 내에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 R-형 박테리오신을 암호화하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함한다. 프로모터는 유도가능하거나, 억제가능하거나, 또는 구성적으로 활성이 있을 수 있다. 일 태양에서, 프로모터는 유도가능하며; 다른 태양에서, 프로모터는 억제가능하다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 소분자 유도자(inducer), 억제자(repressor) 또는 탈억제자(de-repressor)를 부가하거나 이를 제거함으로써 유도된다. 일 태양에서, 프로모터는 소분자 유도자 또는 탈억제자에 의해 유도된다. 특정 태양에서, 카세트의 발현은 작동가능하게 연결된, 구성적으로 활성이 있는 RecA 단백질을 암호화하는 recA 유전자에 의해, 그리고 소분자 유도자 또는 탈억제자에 대하여 반응성인 이종 프로모터의 제어 하에서 조절된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 발현 카세트를 함유하는 생성자 세포가 제공된다. 발현 카세트는 생성자 세포 내의 에피솜 발현 벡터에 포함될 수 있다. 대안적으로, 생성자 세포는 그들의 염색체 내에 본 발명의 핵산 분자 또는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 생성자 세포는 비-병원성이며, 편성 혐기성이 아닌 세균이다. 일부 실시형태에서, 비-병원성이며 편성 혐기성이 아닌 세균은 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus) 및 리스테리아(Listeria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 세균의 속으로부터의 종이다. 특정 실시형태에서, 비-병원성이며 편성 혐기성이 아닌 세균은 바실러스 속으로부터의 것이다. 일부 태양에서, 세균은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이다. 특정 태양에서, 바실러스 서브틸리스에는 PBSX 유전자 클러스터가 결여되어 있다. 다른 실시형태에서, 생성자 세포는 편성 혐기성이나 비-병원성인 세균이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 R-형 hmw 박테리오신의 생성 방법이 제공된다. 상기 방법은 유도제 또는 억제제에 감수성인 유도가능한 또는 탈억제가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 핵산 서열을 함유하는 생성자 세포를 R-형 박테리오신의 발현을 유도하기에 효과적인 농도로 유도제 또는 억제제에 노출시키는 단계, 및 발현된 R-형 박테리오신을 정제하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, R-형 박테리오신을 암호화하는 핵산 분자는 생성자 세포의 게놈에 대하여 이종이다. 특정 태양에서, 핵산 분자는 생성자 세포의 염색체 내에 포함되거나, 생성자 세포 내의 염색체외 발현 벡터에 포함된다. 특정 실시형태에서, 생성자 세포는 비-병원성이며 편성 혐기성이 아닌 세균이다. 일부 실시형태에서, 비-병원성이며 편성 혐기성이 아닌 세균은 바실러스, 락토바실러스 및 리스테리아로 이루어진 군으로부터 선택되는 세균의 속으로부터의 종이다. 특정 실시형태에서, 비-병원성이며 편성 혐기성이 아닌 세균은 바실러스 속으로부터의 것이다. 일부 태양에서, 세균은 바실러스 서브틸리스이다. 특정 태양에서, 바실러스 서브틸리스는 유도되어 R-형 박테리오신을 생성하는 경우 용해되지 않는다. 추가의 태양에서, 바실러스 서브틸리스에는 PBSX 유전자 클러스터가 결여되어 있다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 병원성 세균을 사멸시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 병원성 세균을 본 발명의 R-형 박테리오신과 접촉시켜, 이에 의해 R-형 박테리오신이 병원성 세균과 결합하고 이를 사멸키는 것을 포함한다. 일 태양에서, 병원성 세균은 클로스트리듐 디피실리이다. 일 태양에서, 클로스트리듐 디피실리는 동물 내에 존재하며, R-형 박테리오신의 살균량(bactericidal amount)을 동물에게 투여한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 동물 내의 클로스트리듐 디피실리의 질환-유발 감염의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 상기 방법은 살균량의 본 발명의 R-형 박테리오신을 그를 필요로 하는 동물에게 직접 투여하거나, 또는 생성자 세포를 투여하거나, 또는 천연 디포신을 생성하나 독소를 생성하지 않도록 유전자 변형된 클로스트리듐 디피실리 세균의 포자를 투여함으로써 간접적으로 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 동물에서의 클로스트리듐 디피실리의 감염은 살균량의 박테리오신을 생성하도록 하는 양의 본 발명의 생성자 세포를 감염의 치료를 필요로 하는 동물에게 투여하여, 그에 의해 감염을 치료함으로써 치료한다. 일 태양에서, 박테리오신을 암호화하는 핵산은 lac 프로모터의 조절하에 있으며, 동물에는 락토스를 투여한다. 일부 실시형태에서, 동물은 포유류이다. 일 태양에서, 포유류는 인간이다.
도 1은 서열 번호 1 내지 80의 핵산 또는 아미노산 서열을 제공한다.
도 2는 임상적 클로스트리듐 디피실리 분리주에서의 디포신의 살균성. 표시 균주 번호는 행렬의 상측을 따라 나타내었으며; 별표-표시된 균주는 NAP1/027/BI 균주이다. 시험한 디포신의 클로스트리듐 디피실리 공급원의 아이덴티티(identity)는 좌측 가장자리를 따라 나타내었다. 균주를 엘씨 포르티어(LC Fortier)(4 및 16), ATCC(43593) 또는 미국 캘리포니아주 쿨버 시티 소재의 알엠 알덴 리서치 랩(RM Alden Research Lab)으로부터 수득하였다.
도 3은 dif16의 주사 전자 현미경 사진을 보여준다. 꽃-유사(flower-like) 테일 섬유 부속지를 주목하길 바란다.
도 4는 표적 균주 Cd19135 상의 dif4의 스폿 시험의 결과의 사진을 보여준다. 정제된 디포신을 10-배 단계 희석하였으며, 희석액의 5㎕ 분취액을 표적 클로스트리듐 디피실리 세균의 론(lawn) 상에 스폿팅하였다. 37℃에서 하룻밤 혐기성 인큐베이션 후에, 론 상에서의 성장의 제거에 의해 디포신 사멸이 나타났다.
도 5는 dif4("4") 및 dif16("16")의 여과("F") 및 미여과("UF") 제제 둘 모두의 은 염색된 SDS-PAGE의 사진을 보여준다. 화살표는 잘라내고 질량 분석법에 의해 확인한 밴드를 나타낸다.
도 6은 Cd630 및 Cd16으로부터의 디포신 유전자 클러스터의 개략도를 보여준다. 마이오비리대(Myoviridae) 파지 테일 기구에 전형적인 구조적 어셈블리 단백질 및 구조적 단백질을 암호화하는 ORF, ORF1362 내지 ORF1375로 이루어진 유전자좌는 맵 아래에 나타내었다. 이들 유전자를 플랭킹(flanking)하는 유전자는 추정의 파지-유사 조절 단백질을 암호화하는 유전자였다. 하측의 화살표는 ORF가 전사되는 방향을 나타내며, ORF의 추정적인 기능을 맵의 상측에 나타내었다.
도 7은 클로스트리듐 디피실리 균주 19099의 론 상에서 시험한 바실러스 서브틸리스 BDR123-488(섹터 1) 및 BDR123-491(섹터 2)에 의해 생성된 dif16의 스폿 시험의 이미지이다.
도 8은 활성이 있는 디포신을 생성하는 5개의 클로스트리듐 디피실리 균주의 각각으로부터의 ORF1374 유전자에 의해 암호화된 부분 아미노산 서열(출현의 순서로, 각각 서열 번호 81 내지 86)의 클러스털 더블유(ClustalW) 분석의 결과를 제공한다. 정렬된 서열의 각 줄 아래의 "*"는 모든 5개의 유전자에 의해 암호화된 그 위치에서의 아미노산 동일성을 나타내며, ":"는 모든 5개의 유전자에 의해 암호화된 그 위치에서의 매우 유사한 아미노산을 나타내며, "."는 모든 5개의 유전자에 의해 암호화된 그 위치에서의 다소 유사한 아미노산을 나타내며, 서열 정렬 내의 주어진 위치에서의 블랭크(blank)는 모든 5개의 유전자에 의해 암호화된 아미노산 유사성이 없음을 나타낸다.
도 9는 BDR123-580에 의해 생성되는 "Dif4" 및 "Dif4-16"의 스폿 시험의 이미지이다. 후자는 바실러스 서브틸리스 BDR123-587에 의해 생성되며, 여기서, dif4의 orf1374(서열 번호 49)를 dif16의 orf1374(서열 번호 17)로 전환시켰다. 바실러스 서브틸리스에 의해 생성되는 이들 2개의 디포신을 둘 모두 나타낸 바와 같이 균주 19137 및 19145의 론 상에서 시험하였다. "Dif4-16"에 의한 사멸의 특이성은 dif4의 것으로부터 dif16의 것으로 전환되었다.
정의
본 명세서에서 사용되는 "R-형 고분자량(hmw) 박테리오신"은 또한 단순하게 "R-형 박테리오신"으로 알려져 있으며, R-형 피오신, 디포신, 모노신, 엔테로콜리티신(enterocoliticin), 메닝고신(meningocin), 또는 박테리오파지의 마이오비리대 패밀리와 구조적으로 또는 유전적으로 관련된 기타 고분자량(hmw) 박테리오신을 포함한다. R-형 박테리오신은 변형된 R-형 피오신, 디포신, 엔테로콜리티신, 모노신 및 메닝고신의 버전을 포함한다(문헌[Williams et al., 2008]; 문헌[Strauch et al., 2001]; 문헌[Kingsbury, 1966]; 문헌[Zink et al., 1995]).
본 명세서에서 사용되는 용어 "디포신"은 클로스트리듐 디피실리로부터 분리되거나 그로부터 유래된 R-형 고분자량 박테리오신을 지칭하며, 클로스트리듐 디피실리로부터 수득되는 천연의 입자뿐 아니라 비-천연 생성자 세포에서의 디포신 유전자 클러스터의 발현을 통해 수득되는 입자를 포함한다. 또한, 디포신은 클로스트리듐 디피실리의 하나 이상의 균주로부터 유래된 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드로 이루어진 엔지니어링된 입자일 수 있으며, 서열 번호 2 내지 23, 49 및 62 내지 80의 하나 이상의 폴리펩타이드와 80% 이상 동일할 수 있다.
본 발명의 R-형 박테리오신은 열불안정이며, 약한 내산성, 트립신 내성이고, 약 65,000 x g에서의 원심분리에 의해 침전가능할 수 있으며, 전자 현미경에 의한 분해능이 있을 수 있다(문헌[Kageyama et al., 1962]; 문헌[Bradley, 1967]; 문헌[Daw et al., 1996]; 문헌[Jabrane et al., 2002]; 문헌[Fortier et al., 2007]). 많은 경우에, 본 명세서에 개시된 엔지니어링된 R-형 박테리오신은 하나 이상의 이들 특성을 임의의 조합으로 갖는다. 본 명세서에 개시된 R-형 박테리오신에 통상적인 추가의 특성은 그들이 핵산을 함유하지 않으며, 이에 따라 복제 결핍이어서, 그들이 많은 박테리오파지가 할 수 있는 것처럼, 표적 세균의 사멸 후에 또는 그 동안에 그들 자체를 재생시킬 수 없다는 점이다. 그들은 순전히 단백질이며, 유기체가 아니다.
본 명세서에 개시된 R-형 박테리오신은 다수의 단백질 또는 폴리펩타이드, 서브유닛을 포함하는 복합 분자이며, 마이오비리대 과의 박테리오파지의 테일 구조와 유사하다. 천연 발생 R-형 박테리오신에서, 서브유닛 구조는 세균 게놈, 예컨대 클로스트리듐 디피실리 또는 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)의 게놈에 의해 암호화되며, 다른 세균에 대한 천연 방어로 작용하는 R-형 박테리오신을 형성한다(문헌[Kageyama, 1975]). 감수성 표적 세균은 전형적으로 단일의 R-형 박테리오신 분자에 의해 사멸될 수 있다(문헌[Kageyama et al., 1964]; 문헌[Kageyama et al., 1964a]; 문헌[Morse et al., 1980]; 문헌[Strauch et al., 2001]).
"표적 세균"은 본 개시내용의 R-형 박테리오신에 의해 결합되고/거나 성장, 생존 또는 복제가 그에 의해 억제되는 세균을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표적 세균은 클로스트리듐 속으로부터의 것이다. 특정 실시형태에서, 세균은 클로스트리듐 디피실리이다. 일 태양에서, 1종 초과의 클로스트리듐 디피실리의 균주가 표적화된다. 예시적인 클로스트리듐 디피실리의 균주는 NAPl/BI/리보타입(ribotype) 027뿐 아니라 도 2에 열거된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "성장 억제" 또는 이의 변이형은 세균 세포 분열의 속도의 저하 또는 중지, 또는 세균 세포 분열의 중단 또는 세균의 사멸을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 전형적으로 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 폴리머(순수 또는 혼합형)을 지칭한다. 상기 용어는 합성이며, 천연 발생 및 비-천연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합, 구조 또는 작용적 특성을 가지며, 참조 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사작용되는 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 백본(backcone) 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 유사체의 예에는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-0-메틸 리보뉴클레오타이드 및 펩타이드-핵산(PNA)이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 상기 용어 핵산은 일부 상황에서 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
또한, 특정 핵산 서열은 보존적으로 변형된 그의 변이체(예컨대, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적인 서열뿐 아니라 명시적으로 나타낸 서열을 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3("동료(wobble") 위치가 혼합형-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 그의 변형된 변이체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세그먼트"는 아미노산 서열에 관하여 10, 12, 15, 20, 25, 50 또는 100개 아미노산 잔기 길이일 수 있는 연속 아미노산의 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이종"은 단백질 또는 핵산 서열의 부분에 관하여 사용되는 경우, 서열이 천연에서 통상 함께 관찰되지 않는 2개 이상의 하위 서열을 포함하는 것을 나타낸다. 일 예에서, 2개 이상의 이종 서열은 서로 각각 상이한 종의 세균으로부터의 것이다. 다른 예에서, 2개 이상의 이종 서열은 동일한 세균 종의 서로 각각 상이한 균주로부터의 것이다. 다른 태양에서, 2개 이상의 이종 서열은 세균 및 박테리오파지로부터의 것, 또는 세균 및 합성, 비-천연 DNA 서열로부터의 것이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 전형적으로 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭하기 위하여 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 아미노산은 본 명세서에서 그들의 통상적으로 공지되어 있는 3-문자 기호로, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명칭 협회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권고되는 1-문자 기호로 지칭될 수 있다.
독성 인자는 유기체의 병원성에 기여하나 반드시 그의 일반적인 생존력에 기여하는 것은 아닌 분자이다. 독성 인자의 소실 시에, 유기체는 병원성이 더 적으나, 반드시 덜 생존가능한 것은 아니다. 독성 인자는 많은 기능, 예컨대 유전자 발현의 조절, 부착 또는 이동의 제공, 독소의 제공, 독소의 주입, 항생제의 배출 또는 바이오필름(biofilm)을 비롯한 보호 코팅의 형성 중 임의의 것을 가질 수 있다.
적합성 인자(fitness factor)는 유기체의 일반적인 생존력, 성장 속도, 또는 그의 환경에서의 경쟁력에 기여하는 분자이다. 적합성 인자의 소실 시에, 유기체는 덜 생존가능하거나 덜 경쟁적이며, 이러한 절충 때문에, 간접적으로 병원성이 더 적다. 또한, 적합성 인자는 수많은 기능, 예컨대 영양소, 이온 또는 물의 획득, 세포막 또는 세포벽의 성분 또는 보호제의 형성, 핵산의 복제, 수선 또는 돌연변이유발, 환경 또는 경쟁적인 손상(insult)으로부터의 방어 또는 그에 대한 공격의 제공 중 임의의 것을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생성자 세포"는 디포신-암호화 핵산 분자를 생성하거나 발현할 수 있으며, 이러한 핵산 분자를 천연에서 함유하지 않는 세포를 지칭한다. 생성자 세포는 산소의 존재 하에서 생존하고 성장할 수 있으며, 디포신을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환되며, 이 벡터는 생성자 세포의 염색체 내로 통합되거나 에피솜일 수 있다. 생성자 세포는 그람 양성 세균일 수 있다. 특정 실시형태에서, 생성자 세포는 바실러스, 락토바실러스 및 리스테리아 속으로부터의 세균일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세균은 서브틸리스, 아밀로리쿠에파시엔스(amyloliquefaciens) 및 메가테리움(megaterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바실러스 속으로부터의 종이다. 일 태양에서, 세균은 바실러스 서브틸리스이다. 특정 태양에서, 생성자 세포는 PBSX 유전자 클러스터가 결여된 바실러스 서브틸리스 균주이다. 다른 실시형태에서, 세균은 아시도필러스(acidophilus), 카세이(casei) 및 불가리쿠스(bulgaricus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 락토바실러스 속으로부터의 종이다. 또 다른 실시형태에서, 세균은 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)이다. 다른 실시형태에서, 비-병원성 생성자 세포는 에스케리키아 콜라이이거나 또는 클로스트리듐 속의 것일 수 있다.
본 발명의 실시 방식의 상세한 설명
클로스트리듐 디피실리로부터 분리된 R-형 박테리오신은 살균성을 갖는다.
살균성에 대하여 시험하기 위하여, 엄격한 혐기성 조건 하에서 세포를 미드-로그(mid-log) 단계로 성장시킨 다음, 배양물을 3㎍/㎖의 미토마이신 C에 노출시킴으로써 2개의 클로스트리듐 디피실리 균주, 즉 Cd4 및 Cd16(엘씨 포르티어로부터)의 용해물을 만들었다. 세균 세포를 용해시킨 후에, 용해물 중의 입자를 농축시키고, 고속 원심분리로 정제하였다(실시예 1 참조). 이들 제제는 전자 현미경에 의해 농축된 머리가 없는 파지-유사 입자를 함유하는 것으로 나타났다(도 3). 농축 및 정제 후에, 제제를 스폿 플레이트(spot plate) 방법에 의하여 살균성에 대하여 평가하였는데, 이에 의해 시료를 다시 엄격한 혐기성 조건 하에서 표적 클로스트리듐 디피실리 세균의 오버레이 론에 적용하였다. 대부분의 파지 테일-유사 박테리오신이 전형적으로 생성 세균과 상이한 균주를 표적화하기 때문에, 처음에 29개의 클로스트리듐 디피실리 임상학적 분리주의 패널로 이루어진 표적 균주를 시험하였다. 하룻밤 인큐베이션 후에, 플레이트를 정제된 물질을 스폿딩한 클로스트리듐 디피실리 세균의 론에서의 밝아짐(clearing)에 의해 나타나는 바와 같은 사멸 활성의 존재에 대하여 시험하였다. 도 4는 클로스트리듐 디피실리 균주, Cd19135 상에 스폿팅된 Cd4로부터의 디포신(dif 4)의 전형적인 스폿 검정을 보여준다.
dif4(Cd4로부터의 디포신) 및 dif16(Cd16으로부터의 디포신)은 스폿 검정에 기초하여, 상이한 세균 스펙트럼을 나타냈다(도 2). dif4는 29개의 클로스트리듐 디피실리 임상학적 분리주 균주 중 10개 상에서 살균성을 보여주는 한편, dif16은 29개 균주 중 8개에 대하여 활성을 가졌다. 둘 모두의 디포신에 감수성인 균주에는 일부 중첩이 존재하였으나, 2가지 디포신은 별개의 살균 스펙트럼을 가졌다. Cd108 및 Cd43593으로부터의 디포신은 매우 유사한 사멸 스펙트럼을 가졌으며, 29개의 클로스트리듐 디피실리 임상학적 분리주의 패널에서 10개의 NAP1/027/BI 고독성 균주 중 9개 이상을 사멸시켰다. 추가로 시험하는 경우, dif43593은 모든 18개의 추가의 독립적인 NAP1/027/BI 분리주를 사멸시켰다. 따라서, dif43593은 모든 28개의 시험한 NAP1/027/BI 클로스트리듐 디피실리의 균주를 사멸켰으며, 도 2를 참조한다.
디포신 유전자좌의 동정.
Cd4 균주로부터 분리되고 정제된 디포신 입자를 변성시키고, 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE)에 의해 단백질 성분을 분리하고, 은 염색에 의해 검출하였다(도 5). 2개의 개별 밴드, 약 200 kD 및 약 40 kD을 잘라내고, 질량 분석법으로 분석하였다. 40 kD 밴드로부터의 펩타이드는 참조 균주 Cd630(진뱅크(GenBank) 수탁 번호_NC 009089.1)을 포함하여 완전한 게놈이 시퀀싱된 몇몇의 클로스트리듐 디피실리 균주에서 암호화된 2개의 클로스트리듐 디피실리 전사해독틀(ORF)로부터의 예측된 생성물과 부합하는 것으로 밝혀졌다. 이들 중 첫번째는 ORF1363(서열 번호 5), 39,192 달톤 파지-유사 단백질이었다. 이러한 밴드에서 두번째의 우세한 폴리펩타이드는 ORF1371(서열 번호 14), 39,565 달톤 파지-유사 기저판 단백질에 해당한다. 이들 단백질은 공교롭게도 분자량이 매우 유사하기 때문에, 이들은 동일한 SDS PAGE 밴드로 이동한다. 200 kD 밴드는 2개의 다른 파지-유사 ORF의 인접한 다운스트림인 ORF1374(서열 번호 17)의 C-말단의 부분에 해당하는 우세한 폴리펩타이드를 제공한다.
이들 ORF가 Cd630 게놈 내에서 매우 근접하게 맵핑되기 때문에, 주변 영역을 분석하였다. 프로파지-유사 요소가 염기 1574593과 1596384 사이에 관찰되었으며, 이는 ORF1360A 내지 1379를 포함한다(도 6 및 서열 번호 1 내지 23). 이러한 영역에서 암호화된 구조적 유전자는 전형적인 마이오비리대 파지의 테일 구조의 성분에만 해당되며; 캡시드, 캡시드 어셈블리 단백질 또는 포털(portal) 단백질에 대한 유전자가 관찰되지 않았음을 특히 주목하였다. 또한, 추정적인 DNA 복제 또는 DNA 패키징 기작을 암호화하는 임의의 ORF가 부재이다. 따라서, 이러한 유전자좌는 R-형(마이오비리대 파지 테일-유사) 박테리오신의 것과 일치하였다. 구조 유전자를 프랭킹(franking)하는 것은 추정적인 파지-유사 조절 단백질을 암호화하는 몇몇 ORF였다. 이러한 유전자좌로부터의 몇몇 ORF가 디포신 입자에서 관찰되는 폴리펩타이드를 암호화하며, 유전자 클러스터가 R-형 박테리오신의 것과 유사한 사실 때문에, 본 발명자들은 디포신 유전자좌를 이러한 영역에 배정하였다.
구조 유전자는 모두 한 가닥 상에 암호화되었으며, 동일한 방향으로 전사되었다. 상기 유전자의 구성은 R-형 피오신 및 많은 마이오비리대 파지의 유전자의 구성과 유사하였다. 몇몇의 구조 단백질은 파지 Φ119 및 ΦC2를 비롯한 공지되어 있는 클로스트리듐 디피실리 박테리오파지에 대하여 서열 유사성을 나타내었다(문헌[Goh et al., 2007]; 문헌[Govind et al., 2006]). 클로스트리듐 디피실리 균주 Cd630은 또한 2개의 무손상(intact) 프로파지(prophage)를 암호화하는 것으로 알려져 있으며, 이들 둘 모두는 유도가능한 것으로 공지되어 있다(문헌[Goh et al., 2007]). 몇몇 디포신 ORF는 클로스트리듐 디피실리 균주 Cd630의 프로파지 1 및 2에 대하여 서열 유사성을 가졌으며, 이는 이들 클로스트리듐 디피실리 마이오비리대 파지 및 디포신이 공통의 선조를 공유함을 시사한다.
디포신의 ORF1374(서열 번호 17)를 특히 주목하였다. 클러스터 내의 소정의 위치, ORF1373, 서열 번호 16의 인접한 다운스트림에 위치하는 이러한 유전자는 큰 폴리펩타이드를 암호화하였으며, 이는 ORF1374가 R-형 박테리오신 테일 섬유, 즉 수용체 결합 도메인(RBD)의 부분이었음을 나타낸다. 디포신으로 지정된 것의 전자 현미경 사진에 의해, 테일 섬유 영역 내의 큰 꽃 유사 구조가 드러났기 때문에, 이러한 구조가 큰 단백질을 포함하는 것이 명백하였다. ORF1373(서열 번호 16)은 디포신 테일 섬유의 기저판 부착 영역, BPAR을 암호화하였으며, 클로스트리듐 디피실리 파지에 ORF1374가 결여되어 있는 것을 고려하면, 이는 RBD뿐 아니라 BPAR을 암호화하는 클로스트리듐 디피실리의 파지에서의 유사한 ORF1373의 절두형인 것으로 보인다. 따라서, 천연 발생 디포신의 테일 섬유는 2개의 단백질, ORF1373 및 ORF1374로 이루어지며, 이들은 연결된 테일 섬유를 형성하는 한편, 클로스트리듐 디피실리의 박테리오파지는 단일의 단백질, 즉, BPAR 및 RBD 기능을 제공하는 다소 더 긴 ORF1373으로 이루어진 테일 섬유를 갖는다. 이러한 이해와 함께, ORF1373(서열 번호 16) 또는 ORF1374(서열 번호 17) 중 어느 하나를 암호화하는 핵산을 본 명세서에서 새로운 RBD 특이성 기능을 엔지니어링하기 위한 기질로서 효율적으로 사용하였다.
디포신은 클로스트리듐 디피실리 분리주 중에 광범위하게 퍼져있다.
클로스트리듐 디피실리의 일련의 독립적인 임상학적 분리주를 상이한 살균 스펙트럼을 가질 수 있는 디포신 입자의 생성 능력에 대하여 시험하였다. 임상학적 분리주 Cd19123, Cd19145, Cd19126, Cd19108(미국 캘리포니아주 쿨버 시티 소재의 알엠 알덴 리서치 랩으로부터의) 및 ATCC Cd43593을 엄격한 혐기성 조건 하에서 미토마이신 C를 사용하여 유도하고, 생성된 입자의 정제 및 농축으로 이어졌다. 이어서, 정제된 물질을 임상학적 집단에서 다른 클로스트리듐 디피실리 균주의 론 상에 따로 스폿팅하여, 살균성을 검출하였다. 상기 결과는 이들 각각의 분리주가 상이한 살균 스펙트럼을 갖는 입자(각각 임상학적 분리주 Cd19123, Cd19145, Cd19126, Cd19108 및 ATCC Cd43593으로부터의 dif123, dif145, dif126, dif108 및 dif43593로 명명되는 디포신)를 생성하였음을 보여준다(도 2). dif108 및 dif43593은 매우 유사하고 넓은 스펙트럼을 갖는 한편, 균주 Cd19145는 좁은 살균 스펙트럼을 갖는 입자를 생성하였다. Cd19113 및 Cd19150을 비롯한 유도에 대하여 시험한 몇몇 분리주를 미토마이신에 대한 노출 후에 용해시켰지만, 검출가능한 디포신 입자를 생성하지 않았다.
실험실 균주 Cd630을 시퀀싱한 게놈이 디포신 유전자좌를 암호화하며; 사실상, 이러한 게놈을 본 명세서에서 사용하여 디포신 유전자를 동정하는 것이 본 명세서에서 인식되었다. 그러나, 균주 Cd630은 미토마이신 C로의 유도 후에 용해되는 동안, 검출가능한 디포신 입자를 생성하지 않았다. 대신에, 소량의 프로파지 1 및 프로파지 2가 생성되었다.
디포신 클러스터의 동정 및 클로닝.
Cd630은 미토마이신 C에 의한 용해의 유도 시에 검출가능한 디포신 입자를 생성하지 않았다. 따라서, 대신에 Cd16으로부터 디포신 유전자 클러스터를 클로닝하였다. Cd16의 드래프트(draft) 게놈 서열을 먼저 수득하였다. Cd630의 것과 유사한 디포신 유전자좌를 동정하고, 주석을 달았다. 생성자 균주 Cd16으로부터의 전체 디포신 유전자 클러스터를 BAC로 클로닝하였으며(서열 번호 1), 이후에 비-병원성 미생물 및 편성 혐기성이 아닌 것에서 활성 디포신을 생성하는데 필요한 모든 유전자를 포함하는 것으로 증명되었다. 클로스트리듐 디피실리는 병원성이면서 편성 혐기성 세균이며, 이는 천연 디포신 또는 재조합 DNA 엔지니어링에 의해 변형된 디포신을 위한 비현실적인 생성 세포이게 한다. 분리된 디포신 클러스터는 또한 재조합 DNA 기법에 의해 엔지니어링하여 그의 발현이 생성자 미생물의 배양물 또는 유도 배지에 첨가되는 비독성 소분자 유도자 또는 탈-억제자에 반응하는 이종 프로모터에 의해 조절되게 할 수 있다. 이러한 소분자에는 테트라사이클린, 언하이드로테트라사이클린, 락토스, 아라비노스, 자일로스 및 그들의 비-대사작용된 유사체, 예컨대 락토스를 대체하기 위한 IPTG가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
디포신
디포신은 클로스트리듐 디피실리로부터 분리된 R-형 hmw 박테리오신이며, 이는 다른 클로스트리듐 디피실리 균주에 대하여 살균성이다. 디포신은 미토마이신 C의 존재 하에서 혐기성 조건 하에서 성장하는 클로스트리듐 디피실리 균주로부터 분리할 수 있다. 일부 실시형태에서, 디포신은 클로스트리듐 디피실리 임상학적 분리주 Cd4, Cd16, Cd19123, Cd19145, Cd19126, Cd19108 또는 ATCC Cd43593로부터의 것이다(각각 dif4, dif16, dif123, dif145, dif126, dif108 및 dif43593으로 명명됨). 일 태양에서, 디포신은 Cd4로부터의 것이며; 다른 태양에서, 디포신은 Cd16으로부터의 것이다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 클로스트리듐 속의 세균의 게놈으로부터 유래된 디포신을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 제공된다. 일 태양에서, 핵산 분자는 서열 번호 1의 유전자 클러스터를 함유한다. 다른 태양에서, 핵산 분자는 서열 번호 61의 유전자 클러스터를 함유한다. 다른 실시형태에서, 핵산 분자는 서열 번호 2 내지 23, 49, 62 내지 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 디포신을 암호화한다. 다른 실시혀태에서, 핵산 분자는 서열 번호 4 내지 16, 18, 19 및 66 내지 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 디포신을 암호화한다. 일 태양에서, 핵산 분자는 서열 번호 2 내지 23의 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 태양에서, 핵산 분자는 서열 번호 49 및 62 내지 80의 폴리펩타이드를 암호화한다.
또한, 변이체 디포신이 제공된다. 변이체 디포신은 서열 번호 4 내지 16, 18, 19 및 66 내지 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 디포신을 포함한다. 다른 실시형태에서, 변이체 디포신은 서열 번호 4 내지 16, 18, 19 및 66 내지 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드와 85%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 심지어 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 변이체 디포신은 이종 기저판 부착 영역(BPAR)을 포함할 수 있으며, 여기서, BPAR은 서열 번호 16, 54 내지 56 및 78 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 80% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, BPAR은 서열 번호 16, 54 내지 56 및 78 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 85% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, BPAR은 서열 번호 16, 54 내지 56 및 78 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 89% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, BPAR은 서열 번호 16, 54 내지 56 및 78 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 90% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, BPAR은 서열 번호 16, 54 내지 56 및 78 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 95% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, BPAR은 서열 번호 16, 54 내지 56 및 78 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 98% 이상 동일하다. 추가의 실시형태에서, BPAR은 서열 번호 16, 54 내지 56 및 78 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 99% 이상 동일하다.
추가의 실시형태에서, 변이체 디포신은 이종 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함할 수 있으며, 여기서, RBD는 서열 번호 17 및 49 내지 53 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 80% 이상 동일하거나 서열 번호 54 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD)을 함유하는 폴리펩타이드와 80% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, RBD는 서열 번호 17 및 49 내지 53 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 85% 이상 동일하거나 서열 번호 54 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD) 영역을 함유하는 폴리펩타이드와 85% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, RBD는 서열 번호 17 및 49 내지 53 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 89% 이상 동일하거나 서열 번호 54 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD) 영역을 함유하는 폴리펩타이드와 89% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, RBD는 서열 번호 17 및 49 내지 53 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 90% 이상 동일하거나 서열 번호 54 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD) 영역을 함유하는 폴리펩타이드와 90% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, RBD는 서열 번호 17 및 49 내지 53 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 95% 이상 동일하거나 서열 번호 54 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD) 영역을 함유하는 폴리펩타이드와 95% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, RBD는 서열 번호 17 및 49 내지 53 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 98% 이상 동일하거나 서열 번호 54 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD) 영역을 함유하는 폴리펩타이드와 98% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, RBD는 서열 번호 17 및 49 내지 53 중 하나 이상의 해당하는 세그먼트와 99% 이상 동일하거나 서열 번호 54 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 도메인(RBD)을 함유하는 폴리펩타이드와 99% 이상 동일하다. 일부 실시형태에서, 수용체 결합 도메인(RBD) 영역은 서열 번호 54, 55 또는 56의 아미노산 잔기 51 내지 카르복시-말단 잔기를 포함한다.
다른 실시형태에서, 디포신은 파지 테일 RBD를 디포신 ORF1373의 생성물에 융합시킴으로써 변경된 살균 스펙트럼을 갖도록 엔지니어링될 수 있다. ORF1374가 천연 디포신의 일차 스펙트럼 결정인자 또는 RBD를 암호화하지만, 이러한 매우 큰 단백질은 ORF1373 단백질과 복합체화되고, ORF1373 단백질은 BPAR을 제공하는데, 다시 말하면, 이는 ORF1374 단백질의 RBD를 디포신 기저판 구조에 부착시킨다. ORF1373은 마이오비리대 박테리오파지, 예컨대 ΦCD2(서열 번호 54), ΦCD119(서열 번호 55) 및 ΦCD27(서열 번호 56)의 테일 섬유 유전자뿐 아니라 R-형 피오신의 테일 섬유와 유사하고, 이와 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 디포신의 ORF1373(예컨대 서열 번호 16 또는 78)은 특히, BPAR 또는 N-말단 부분의 처음 160개 아미노산에서 클로스트리듐 디피실리 마이오비리대 파지, ΦCD2(서열 번호 54)의 테일 섬유와 유의미한 서열 동일성을 공유한다. 그러나, 파지 테일 섬유는 디포신 ORF1373 단백질보다 더 길고, 그들의 세균 표적을 인식하기 위한 C-말단 RBD를 함유한다. 디포신의 ORF1373 단백질은 이러한 후자 도메인을 함유하지 않으며, 그의 RBD 기능은 ORF1374에 의해 암호화되는 별개의 폴리펩타이드에 의해 대체된다. 따라서, ORF1374는 디포신 클러스터로부터 완전히 결실될 수 있으며, 파지 테일 섬유, 예컨대 ΦCD2의 RBD는 ORF1373에 의해 암호화되는 디포신 BPAR에 융합되어, 파지 테일 섬유-유사 단백질을 가지며 이에 따라 공여자 파지의 숙주 범위와 관련된 살균 스펙트럼을 갖는 디포신을 생성할 수 있다. 중요한 것은, 클로스트리듐 디피실리 파지 테일 섬유와 ORF1373 단백질 간의 아미노산 서열 상동성의 영역이 둘 사이의 성공적인 기능적 융합을 가능하게 할 수 있기 때문에, 돌연변이되거나 돌연변이되지 않은 클로스트리듐 디피실리 파지로부터의 숙주-범위 변이체를 선택할 수 있으며, 이것은 이어서 신규한 살균 스펙트럼을 갖는 변형된 디포신을 생성하기 위한 신규한 RBD의 공급원일 수 있다는 점이다.
엔지니어링된 디포신의 일 실시형태에서, RBD가 다른 균주의 클로스트리듐 디피실리의 RBD 또는 클로스트리듐 디피실리를 감염시키는 박테리오파지로부터의 RBD로 대체된 디포신이 제공된다. 일 예에서, 핵산 분자는 서열 번호 16 또는 78을 암호화하는 서열을 포함하나, 해당하는 천연의 RBD(즉, 각각 서열 번호 17 또는 49를 암호화하는 서열)는 함유하지 않으며; 대신에, 천연의 RBD는 천연 R-형 박테리오신을 암호화하는 클로스트리듐 디피실리와 상이한 균주의 클로스트리듐 디피실리로부터의, 또는 클로스트리듐 디피실리를 감염시키는 박테리오파지로부터의 동일하지 않은 이종 RBD 를 암호화하는 서열로 대체된다. 특정 실시형태에서, 핵산 분자는 천연 R-형 박테리오신을 암호화하는 클로스트리듐 디피실리와 상이한 균주의 클로스트리듐 디피실리로부터의 동일하지 않은 이종 수용체 결합 도메인(RBD)을 암호화하는 서열을 함유한다. 일 태양에서, 핵산 분자는 서열 번호 16 또는 78을 암호화하는 서열 및 서열 번호 49 내지 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 54 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 영역을 암호화하는 서열을 함유한다. 다른 태양에서, 핵산 분자는 서열 번호 2 내지 16 및 18 내지 23 또는 서열 번호 62 내지 80을 암호화하는 서열 및 서열 번호 17 및 49 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드로부터의 RBD를 암호화하는 이종 서열로 이루어진다.
엔지니어링된 디포신의 다른 실시형태에서, 디포신의 RBD는 천연 RBD의 변형된 형태로 대체될 수 있다. "천연 RBD"는 클로스트리듐 디피실리의 균주로부터 또는 클로스트리듐 디피실리를 감염시키는 박테리오파지로부터 분리되거나 클로닝된 RBD와 동일한 아미노산 서열을 갖는 RBD를 지칭한다. 많은 클로스트리듐 디피실리 균주로부터의 예시적인 천연 RBD에는 서열 번호 17 및 49 내지 53이 포함된다. 클로스트리듐 디피실리를 감염시키는 박테리오파지로부터의 예시적인 천연의 RBD에는 서열 번호 54 내지 56(예컨대, 아미노산 잔기 51 내지 카복시 말단 잔기)이 포함된다. 일부 실시형태에서, 변형된 RBD는 천연 RBD에 비한 RBD의 아미노산 서열의 변화를 포함한다. 아미노산 서열의 변화의 비제한적인 예에는 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입(또는 부가), 또는 결실이 포함된다. 추가의 실시형태에서, 디포신은 미국 특허 출원 공개 제US2006-0121450호(공개일: 2006년 7월 8일)(본 명세서에 전체가 기재된 것처럼 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 다양성 생성 레트로엘리먼트(Diversity Generating Retroelement, DGR)를 배치함으로써 구조를 다양화한 유기체로부터 유래된 RBD로의 치환 또는 이의 삽입을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 형태는 해당하는 변형되지 않은 RBD 또는 천연 RBD와 상이한 살균 스펙트럼을 갖는다. 특정 실시형태에서, 변형된 형태는 천연 RBD와 80% 이상 동일하다. 다른 실시형태에서, RBD는 서열 번호 17 및 49 내지 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드, 또는 서열 번호 54 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 수용체 결합 영역과 85%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 심지어 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지며, 변형된 RBD는 해당하는 변형되지 않은 RBD 또는 천연 RBD와 상이한 살균 스펙트럼을 갖는다.
표적 세균
환자로부터 분리된 클로스트리듐 디피실리 균주는 펄스 겔 전기영동에 의해 광범위하게 달라지며, 그들의 병원성이 매우 다양하다. 독소를 과다생성하는 BI/NAP1 또는 리보타입(ribotype) 027 균주는 특히 독소 A 및 독소 B의 발현 수준을 음으로 조절하는 유전자 tcdC의 기능을 소실하는 것의 결과로서 독성이다(문헌[McDonald et al., 2005]).
사실상, tcdC 유전자의 특정 돌연변이 대립형질을 지니는 클로스트리듐 디피실리 균주는 건강관리 시설 내에서, 그리고 그 사이에 유행성으로 퍼지는 것으로 보인다. 이들 유행병 및 고도의 독성 균주는 통상적인 항생제 요법의 시작 전에 또는 직후에 디포신의 경구 적용에 의해 보균 환자의 위장관으로부터 예방적으로 제거될 수 있는 특히 중요한 표적 세균이다. 야생형 수준의 독소 A 및 B를 생성하는 클로스트리듐 디피실리 세균이 중요한 표적 병원체인데, 이는 그들이 또한 특히 50세가 넘거나 병존 질환이 있는 환자에게 잠재적으로 치명적이기 때문이다(문헌[Bartlett JG, 2002]).
과다생성자(hyperproducer)이든지 아니든지, 클로스트리듐 디피실리 균주에서 일반적인 표면 접근가능한 독성 인자 또는 적합 인자, 예컨대, S-층 단백질을 표적화하는 것은 이러한 병원체가 그들이 표적화된 R-형 박테리오신에 내성이 있는 것으로 생겨난다면, 그들의 독성 또는 적합성을 절충하게 만드는 매력적인 수단을 제공한다. 디포신의 RBD의 높은 특이성 때문에, 클로스트리듐 디피실리를 제외한 유기체는 표적이 아니며, 그들이 위장관의 공생 세균(정상의 위장 기능 및 우수한 건강에 필요한 세균)에 대한 부수적인 손상을 야기하지 않을 것이기 때문에 독특한 강력한 디포신의 이점이 있다.
"감염"은 예컨대 대상체 또는 조직 또는 비-세균 세포에서의 세균의 성장을 말하며, 여기서, 세균은 대상체, 조직 또는 비-세균 세포에서 질환 또는 징후를 실제적으로 또는 잠재적으로 야기할 수 있다. 감염의 치료는 디포신, 예컨대 dif43593을 생성할 수 있는 비독성화된 클로스트리듐 디피실리 세균의 기질, 물질, 생성자 세포 또는 포자를 사용한 예방적 처치를 포함할 수 있다. 처치되는 대상체의 비제한적인 예에는 기증된 기관, 조직 및 세포; 인공호흡기 또는 투석 장치와 같은 의료 기구; 또는 상처, 예컨대 수술 동안 또는 수술 후의 상처가 포함된다. 다른 용도에는 추가의 성장 시에 문제를 야기할 수 있는 표적 세균의 제거가 포함된다. 추가의 실시형태에서, hmw 박테리오신을 사용하여, 세균 감염 또는 오염이 있는 음식물, 공장 또는 공장의 수집된 파트를 처치하거나 또는 예컨대 병원 또는 상업의 환경에서 표적 세균의 환경적 존재를 처치한다.
본 명세서에서 기재된 항균 R-형 박테리오신을 사용하여 특정 세균의 성장, 생존 또는 복제를 억제할 수 있다. 세균은 병원성 또는 환경적으로 유해한 균주이거나 예방적 방식으로 처치될 수 있다. 병원성 미생물은 일반적으로 때때로 특정 환경에서만 질환을 야기한다.
디포신의 제조 및 용도
디포신은 대략 1000만 달톤의 입자이며, 이에 따라 분별 원심분리, 분별 여과, 수성 2-상 분리, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전 및/또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여, 생물 약제학적 등급의 경구 항균제를 생성할 수 있다. R-형 박테리오신은 동결-융해에 안정적인 것으로 밝혀졌으며, 분무 건조되어 안정적인 제형을 생성할 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, R-형 hmw 박테리오신의 생성 방법이 제공된다. 상기 방법은 생성자 세포를 R-형 박테리오신의 발현을 유발하는 농도의 유도제에 대하여 감수성인 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 R-형 hmw 박테리오신을 암호화하는 핵산 서열에 노출시키고, 발현된 R-형 박테리오신을 정제하는 것을 포함한다. 일 태양에서, R-형 고분자량(hmw) 박테리오신은 서열 번호 2 내지 23 또는 서열 번호 49 및 62 내지 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 함유한다. 핵산 분자는 생성자 세포의 천연의 핵산에 대하여 이종이며, 생성자 세포의 염색체에 함유될 수 있거나, 에피솜 발현 벡터 내에 함유될 수 있다.
표적화된, 유력한 항균제인 디포신을 인간 및 다른 동물의 하부 위장관으로부터 클로스트리듐 디피실리를 제거하거나 탈집락화시키기 위하여 사용하여, CDAD를 예방할 것이다. 넓은 스펙트럼의 항생제로 치료된 동물 및 인간은 그들에 클로스트리듐 디피실리가 집락화된다면, 유력한 치사의 CDAD가 발생할 위험이 높다. 탈집락화는 그들이 건강한 위장 미생물상을 남기기 때문에, 특히 매력적인 디포신의 용도이다. 또한, 디포신은 투여된 생성자 세포 또는 디포신을 생성할 수 있는 탈독소화된 클로스트리듐 디피실리 세균의 포자를 통하여 직접적으로 또는 간접적으로 투여되어, 급성 CDAD에서의 병원체 로드를 감소시키고/거나 다른 양상에 의한 성공적인 치료 후에 CDAD의 높은 발병 또는 재발 또는 반복을 감소시킬 수 있다.
투여 방식
R-형 박테리오신은 위 및 십이지장 상부에 공급되는 정상적으로 기능하는 산성도인 pH 4.0 이하에 의해 불활성화된다. 그러나, 디포신은 상부 위장관을 통과하여 하부 위장관에 주로 집락화된 표적화된 세균 병원체에 도달해야 한다. 따라서, 디포신은 상부 위장관의 산 및 프로테아제로부터 취약한 작용제를 보호하고 활성 상태의 이러한 작용제를 원위의 상부 위장관 또는 하부 위장관에 전달하는 하나 또는 몇몇의 공지되어 있는 방법에 의해 제형화될 수 있다. 또한, 동물을 항히스타민, 예컨대 시메티딘 또는 양성자 펌프 억제제로 처치하여, R-형 박테리오신의 경구 투여 전에 위 산성화를 예방할 수 있다. 따라서, 적절하게 제형화된 디포신, 디포신을 생성할 수 있는 생성자 세포 또는 디포신을 생성하는 탈독소화된 클로스트리듐 디피실리 세균의 포자의 정상의 위가 있는 인간 또는 동물 또는 산성화가 약제학적으로 예방된 인간 또는 동물로의 경구 투여는 집락화된 장의 부분으로의 전달을 가능하게 하여, 효능을 가능하게 할 것이다. 장 통과 시간에 기초하여, 무증상 사람 또는 동물을 탈집락화시키기 위한 직접적인 또는 간접적인 디포신의 경구 투여의 빈도는 매 6시간, 매 12시간, 매 18시간, 매 24시간, 매주 또는 매달일 수 있다. 디포신은 또한 CDAD가 있는 환자 또는 최근에 CDAD가 "치유"된 환자에게 동일하거나 더 빈번한 빈도로 투여될 수 있다. 특히, 활성이 있는 CDAD의 관리를 위하여, 디포신을 제형화하고 좌제, 관장 또는 결장 관류에 의해 직장에 대하여 직접적으로 또는 간접적으로 투여할 수 있다.
본 개시내용의 엔지니어링된 디포신을 디포신에 감수성인 세균에 의한 감염 또는 오염을 앓거나, 이를 앓는 것으로 진단되거나, 또는 이를 앓는 것으로 의심되는 임의의 대상체에게 투여할 수 있다. 이러한 대상체의 비제한적인 예에는 동물(포유류, 파충류, 양성류, 조류 및 어류) 종뿐 아니라 곤충, 식물 및 진균류가 포함된다. 포유류 종의 대표적인 비제한적인 예에는 인간; 비-인간 영장류; 농업상 관련된 종, 예컨대 소, 돼지, 염소 및 양; 설치류, 예컨대, 마우스 및 랫트; 교제, 전시 또는 쇼를 위한 포유류, 예컨대, 개, 고양이, 기니아 돼지, 토끼 및 말; 및 노동을 위한 포유류, 예컨대 개 및 말이 포함된다. 조류 종의 대표적인 비제한적인 예에는 교제 또는 쇼를 위한 닭, 오리, 거위 및 새, 예컨대 앵무새 및 잉꼬가 포함된다. 본 개시내용의 엔지니어링된 디포신으로 처치된 동물 대상체는 또한 네발동물, 두발동물, 수생 동물, 척추동물 또는 곤충을 포함하는 무척추동물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 처치될 대상체는 아직 성숙하지 않은 소아 또는 다른 어린 동물이다. 따라서, 본 개시내용은 본 개시내용의 디포신에 감수성인 세균 또는 다른 미생물로의 감염을 포함하는 소아과 병상의 치료를 포함한다.
본 개시내용은 또한 기회 감염, 예컨대, 인간 대상체 또는 비-인간 동물의 미생물 총에 존재하는 세균의 원치않는 성장으로부터 야기되는 기회 감염의 치료 또는 예방을 위해 제공된다. 기회 감염은 대상체에서의 면역억제된 병상의 결과 또는 비뇨생식기(GU) 또는 위장(GI)관의 공생 미생물총을 변경시키는 항생체 처리의 결과일 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 또한 면역억제된 대상체 및 다른 약제에 노출된 대상체의 치료 또는 예방을 위해 제공된다. 항균성이 있는 디포신을 다른 항균제 또는 항미생물제, 예컨대 비제한적인 예로서 항생제 또는 항진균제와 병용하여 사용할 수 있다. "항미생물제"는 단일 세포의 유기체의 성장을 억제하거나 사멸시키는데 사용할 수 있는 작용제 또는 화합물이다. 항미생물제는 항생제, 화학치료제, 항체(보체가 있거나 없는), DNA, RNA, 단백질, 지질 또는 세포벽 합성 또는 기능의 화학적 억제제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 디포신, 생성자 세포 또는 디포신을 생성할 수 있는 탈독소화된 클로스트리듐 디피실리 세균의 포자를 "약제학적으로 허용되는" 부형제, 장용 코팅제 또는 담체와 함께 제형화한다. 이러한 성분은 과도한 부작용 없이 인간, 동물 및/또는 식물에 사용하기에 적절한 것이다. 부작용의 비제한적인 예에는 독성, 자극 및/또는 알러지 반응이 포함된다. 부형제 또는 담체는 전형적으로 합리적인 이익/위험 비에 적합한 것이다. 비제한적인 약제학적으로 적절한 담체는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 예에는 표준 약제학적 부형제, 예컨대 인산염 완충된 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 유/수 에멀젼 및 다양한 유형의 습윤화제(wetting agent)가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 비-수성 용매의 예에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 야채유, 예컨대 올리브유 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸올레에이트가 있다. 수성 담체는 염수 및 완충된 매질을 포함하는 물, 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이티드 링거 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제(예컨대, 링거 덱스트로스를 기반으로 한 것) 등을 포함한다.
본 명세서에 개시된 추가의 제형 및 약제학적 조성물은 세균성 병원체에 특이적인 분리된 디포신; 동일한 세균성 병원체를 표적화하는 2, 3, 5, 10 또는 20개 이상의 상이한 디포신의 혼합물, 동일한 세균성 병원체를 표적화하는 디포신을 생성할 수 있는 생성자 세포 또는 탈독소화된 클로스트리듐 디피실리 세균의 포자; 및 상이한 세균성 병원체 또는 동일한 세균성 병원체의 상이한 균주를 표적화하는 2, 3, 5, 10 또는 20개 이상의 혼합물을 포함한다.
임의로, 본 개시내용의 디포신 또는 생성자 세포를 포함하는 조성물을 또한 해당 분야에 잘 알려져 있는 방식을 사용하여 분무 건조시키거나 동결건조시킬 수 있다. 이후의 재구성 및 사용은 해당 분야에 알려져 있는 바와 같이 실시할 수 있다.
디포신은 전형적으로 "안전하며 효율적인" 양 또는 농도로 사용되며, 이는 상술된 것과 같은 과도한 불리한 부작용 없이 원하는 치료적 반응을 생성하는데 충분한 양을 지칭한다. 디포신은 또한 "치료적으로 유효한" 양 또는 농도로 사용될 수 있으며, 이는 비제한적으로, 세균 세포 분열 속도를 늦추거나, 세균 세포 분열의 중단을 야기하거나 세균 집단 성장의 사망을 야기하거나 그 속도를 감소시키는데 유효한 양과 같은 목적하는 치료적 반응을 제공하는데 유효한 양을 지칭한다. 안전하고 유효한 양, 또는 치료적 또는 예방적 유효량은 다양한 인자에 따라 달라질 것이나, 과도한 실험 없이, 숙련자가 용이하게 결정할 수 있다. 비제한적인 인자의 예에는 치료될 특정 병상, 대상체의 신체 조건, 치료될 대상체의 유형, 치료 기간, 병행 치료법의 성질(존재한다면) 및 사용되는 특정 제형이 포함된다.
이제 본 발명의 대상 물질은 일반적으로 기재되었으며, 본 발명의 대상 물질은 예시로 제공된 하기의 실시예를 참조하여 더욱 용이하게 이해될 것이며, 달리 특정되지 않는 한 개시내용을 제한하고자 하지 않는다.
실시예
1. 디포신의 살균성의 결정.
클로스트리듐 디피실리 배양물을 10% CO2, 10% H2, 80% N2의 분위기가 있는 포르마 사이언티픽(Forma Scientific) 환경 챔버 내에서 엄격한 혐기성 조건 하에서 성장시켰다. 모든 배지, 완충액 및 플레이트를 사용 전에 24시간 이상 동안 이러한 분위기에서 탈산소화시켰다. 배양물을 클로스트리듐 디피실리 선택적 아가 플레이트(비디 디아그노스틱스(BD Diagnostics), BBL 카달로그 번호 222228)에 스트리킹(streaking)시키고, 37℃에서 2일 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 이들 플레이트를 스톡(stock)으로서 주위 온도에서 혐기적으로 보관하였다.
디포신을 유도하기 위하여, 클로스트리듐 디피실리 세균을 브루셀라(Brucella) 배지(디프코(Difco))를 사용하여 액체 배양물에서, 쉐이킹하지 않고 37℃에서 성장시켰다. 대략 0.2의 OD600에서, 미토마이신 C를 3㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 이어서, 배양물을 3 내지 16시간 동안 인큐베이션시켰다. 배양물의 가시적인 밝아짐에 의해 세균 용해를 검출하였다.
배양물을 혐기성 챔버로부터 제거하고, 세포 데브리스(debris)를 5,000 xg에서의 원심분리에 의해 제거하였다. 이어서, 상층액을 0.2㎛ 셀룰로스 아세테이트 주사기 필터를 통과시켰다. 여액을 90,000 xg에서 2시간 동안 원심분리하여, 디포신 입자를 펠렛화시켰다. 펠렛을 1/50의 원래 배양 부피로 10 mM Tris pH 7.5, 50 mM NaCl, 3% 만니톨에 재현탁화시켰다.
표적 균주를 37℃에서 브루셀라 브로쓰(broth)에서 하룻밤 성장시켰다. 100㎕의 배양 부피를 5㎖의 예열되고 환원된 브루셀라 오버레이 아가(0.5% 아가)에 첨가하고, 브루셀라 아가 플레이트(1.5% 아가)에 붓고, 정치시켰다. 디포신 제제의 5㎕의 시료를 플레이트 상에 스폿팅하고, 공기 건조되게 하였다(약 30분). 이어서, 플레이트를 37℃에서 하룻밤 혐기적으로 인큐베이션하였다. 살균성을 시료를 론에 적용한 위치 또는 스폿에서의 밝아짐 또는 세균 성장의 결여에 의해 결정하였다.
2. Cd16 디포신 유전자좌의 클로닝.
클로스트리듐 디피실리 균주 Cd16의 드래프트(draft) 게놈 서열을 게놈 DNA의 454 기기 서열 분석에 의해 수득하였다. 전체 dif16 유전자좌 또는 클러스터(서열 번호 1)를 균주 Cd630(상기 참조)과의 비교에 의해 동정하였다.
백본 BAC 벡터의 제조. 출발 벡터는 pETcoco1(노바겐(Novagen))이었다. 이를 변형시켜, BbsI 말단을 갖는 프라이머 AV1419(서열 번호 24) 및 AV1420(서열 번호 25)을 사용하여 2개의 XhoI 부위를 제거하였다. 이를 행하기 위하여, 특정 영역을 이들 프라이머를 사용하여 pETcoco1 DNA로부터 증폭시키고, 이어서, PCR 생성물을 BbsI으로 절단하고, 사전에 XhoI으로 절단한 더 큰 pETcoco1 벡터 단편에 다시 라이게이션시켰다. 이러한 라이게이션에 의해 pETcoco1의 2개의 XhoI 부위를 파괴하였다. 이어서, 후자의 플라스미드를 유사한 전략에 의해 추가로 변형시켜, 프라이머 AV1416(서열 번호 26) 및 AV1245(서열 번호 27)를 사용하여 EcoRI 부위를 파괴하였다. 생성된 벡터를 SW251로 명명하였다.
디포신 클러스터의 단편을 수용하기 위한 pUC19 벡터의 제조. pUC19(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs))의 폴리링커(polylinker)를 EcoRI 및 HindIII으로의 분해 및 올리고 AV1372(서열 번호 28), AV1373(서열 번호 29), AV1374(서열 번호 30) 및 AV1375(서열 번호 31)에서의 라이게이션에 의해 변형하였다. 이는 폴리링커를 NotI-NheI-KpnI-XhoI-EcoRV-BstBI-BbsI-EcoRI-NsiI-SphI-BamHI-AscI로 변경시켰다. 이를 SW232로 명명하였다.
디포신 클러스터의 SW232로의 클로닝. 디포신 클러스터, 서열 번호 1의 3개의 단편을 Cd16 DNA로부터 PCR에 의해 개별적으로 증폭시켰다. 5' 단편(서열 번호 32)을 각각 NotI 및 XhoI 말단을 갖는 프라이머 1368(서열 번호 35) 및 1289(서열 번호 36)를 사용하여 증폭시켰다. 중간의 단편(서열 번호 33)을 각각 XhoI 및 EcoRI 말단을 갖는 프라이머 AV1288(서열 번호 37) 및 AV1366(서열 번호 38)을 사용하여 증폭시켰다. 3' 단편, 서열 번호 34를 각각 EcoRI 및 BamHI 말단을 갖는 프라이머 AV1367(서열 번호 39) 및 AV1300(서열 번호 40)을 사용하여 증폭시켰다. 이들 3개의 PCR 단편을 개별적으로 SW232 내로 클로닝하고, 각각 5', 중간 및 3' 부분에 대하여 SW241, SW242 및 SW243으로 명명하였다.
디포신 클러스터의 BAC SW251 내로의 클로닝. 이. 콜라이에서의 클로닝에 의해 증식되고, 정제된 각각의 디포신 클러스터의 3개의 단편(SW241, SW242 및 SW243 내의)을 SW241, SW242 및 SW243 벡터로부터 잘라냈다. SW241을 NotI 및 XhoI로 분해하고, SW242를 XhoI 및 EcoRI로 분해하고, SW243을 EcoRI 및 AscI로 분해하였다(이러한 AscI 부위가 상술된 변형 SW232 폴리링커의 부분이었음을 주의한다).
이들 3개의 단편을 먼저 NotI 및 AscI으로 분해한 SW251 내로 조합하였다. 얻어진 플라스미드를 DG461로 명명하였으며, 이에는 전체 dif16 클러스터가 함유되어 있다. 이를 이. 콜라이에서 증폭시켰다.
바실러스 서브틸리스에서의 발현을 위한 디포신 통합 벡터의 제조. 클로닝/프로모터 영역 및 스펙티노마이신-내성 유전자를 플랭킹하는 amyE 유전자의 부분을 포함하는 바실러스 서브틸리스 통합 벡터, pDR111을 사용하였다.
pDR111 폴리링커를 HindIII 및 SphI을 사용하여 벡터를 분해시키고, 올리고 DG1(서열 번호 41) 및 DG2(서열 번호 42)에서 라이게이션시킴으로써 변형시켰다. 이에 의해, NotI 및 AscI 부위가 pDR111에 부가되었다. 이어서, 변형된 폴리링커를 갖는 전체 amyE 프론트(front) 및 백(back) 영역을 함유하는 영역을 프라이머 DG9(서열 번호 43) 및 DG10(서열 번호 44)을 사용하여 증폭시켰으며, 이 프라이머는 둘 모두 BsaI 말단을 갖는다. 이러한 단편을 SW251의 NotI 및 AscI 부위 내로 라이게이션시키고(두 부위의 파괴를 야기), DG487을 생성하였다. pDR111-유래의 삽입물의 변형된 폴리링커에 의하여 DG487 내로 도입된 새로운 NotI 및 AscI 부위가 존재함을 주목하길 바란다.
이. 콜라이에서의 DG487의 증식 후에, 이어서, DG461로부터의 디포신 클러스터를 함유하는 NotI/AscI 단편을 잘라내고, DG487의 NotI/AscI 부위 내로 클로닝하였다. 이러한 새로운 작제물을 DG488로 명명하였으며, 이는 전체 디포신 유전자 클러스터를 바실러스 서브틸리스에 도입하는데 사용된 벡터였다(하기).
3. 바실러스 서브틸리스에서의 디포신 유전자 클러스터의 발현.
천연의 디포신 생성자는 편성 혐기성 생물인 클로스트리듐 디피실리이다. 클로스트리듐 디피실리 세균은 심지어 미량의 산소에 노출된다면, 포자를 형성하고 즉시 죽는다. 배양된 클로스트리듐 디피실리로부터 심지어 미량의 디포신을 생성하는 능력은 어렵고 아주 힘든 것이며, 예방 또는 치료적 응용에 유용한 양의 디포신의 생성은 요구되는 엄격한 혐기성 조건에 따라 실용적이지 못하다. 따라서, 클로스트리듐 디피실리로부터의 전체 디포신 유전자 클러스터를 먼저 동정한 다음, 분자적 클로닝에 의해 분리하고, 추가의 엔지니어링 및 생성을 위하여 이 클러스터를 호기성 그람 양성 세균, 즉, 바실러스 서브틸리스에 도입시켰다.
바실러스 서브틸리스 통합 벡터, 즉, DG488을 실시예 2에 기재된 바와 같이 만들었으며, 이는 전체 22,827개 염기 디포신 유전자좌(서열 번호 1)를 포함한다. 이러한 벡터를 사용하여 디포신 유전자좌를 바실러스 서브틸리스 게놈 내로 재조합시켰다.
수여자 바실러스 서브틸리스 균주는 BDR123이었으며, 이는 amyE 유전자 내에 삽입된 클로람페니콜 내성 마커를 가졌다. 이러한 균주를 DG488로 형질전환시키는 경우, 벡터 내의 프론트 및 백 amyE 서열과 게놈 amyE 서열 사이에 재조합이 발생하였다. 이는 디포신 유전자좌 및 스펙티노마이신 내성 유전자를 포함하는 DG488의 프론트 및 백 amyE 영역 사이의 서열 모두의 BDR123 게놈 내로의 삽입을 야기하였다. 성공적인 재조합체는 스펙티노마이신 내성이었으나, 재조합 사건의 결과로서 게놈 마커의 소실 때문에, 클로람페니콜-감수성이 되었다. 이러한 바실러스 서브틸리스 균주를 BDR123-488로 명명하였다.
전체 디포신 유전자좌를 DG488 벡터 내로 삽입하였기 때문에(실시예 2), 이에 따라 그 전체가 BDR123-488 내로 삽입되었다. 클로스트리듐에서의 정상적인 발현에 필요한 조절 유전자 및 구조적 디포신 입자 유전자 모두를 포함하는 이러한 삽입된 디포신 유전자좌는 이들 유전자 및/또는 조절 요소의 제어 하에 있었다. 바실러스와 클로스트리듐이 관련있는 세균이기 때문에, 이들 디포신 조절 요소가 바실러스 백그라운드에서 작용할 것이며, 그들의 천연 상태에서, RecA-매개의 메커니즘을 통한 DNA 손상에 의해 유도될 것으로 예상되었다. 이는 사실이었으며, DNA 손상제(damaging agent) 미토마이신 C와의 접촉에 의해 디포신 입자 생성을 BDR123-488에서 유도하였으며, 균주 Cd19099를 사멸시켰으며, 도 7을 참조하길 바란다.
디포신 조절 유전자(ORF1359, 1360, 1361)는 구조 유전자와 비교하여 유전자좌의 5' 영역 내에 위치하였다. 또한, 구조 유전자와 비교하여 다운스트림, 3'에 위치한 조절 유전자(ORF1377(서열 번호 20), 1378(서열 번호 21) 및 1379(서열 번호 23))도 존재하였다. 이들 후자의 조절 유전자를 제거하기 위하여, 단일의 3원 라이게이션에서 DG491을 DG488로부터 생성하였다. 하나의 PCR 단편을 프라이머 DG13(서열 번호 45) 및 DG14(서열 번호 46)를 사용한 PCR 증폭에 의하여 DG488로부터 만들고, 다른 하나를 프라이머 DG15(서열 번호 47) 및 DG16(서열 번호 48)을 사용한 PCR 증폭에 의해 만들었다. 둘 모두의 PCR 단편을 AscI 및 SphI으로 분해하였다. 이어서, DG488을 SphI으로 분해하고, 2개의 분해된 PCR 단편을 SphI-분해된 DG488로부터의 큰 벡터 단편 내로 라이게이션시켜, DG491을 생성하였다. DG491을 BDR123 내로 형질전환시켜(BDR123-491), orf1377(서열 번호 20), 1378(서열 번호 21) 및 1379(서열 번호 23)가 결여된 디포신 유전자 클러스터를 함유하는 재조합 바실러스 서브틸리스를 생성하였다. 이들 ORF가 결여된 변형된 디포신 클러스터는 BDR123-488에서 야생형 디포신 클러스터가 그러한 것처럼, 미토마이신 C에 대한 노출 시에 활성 디포신을 발현하였다(도 7).
4. 다수의 디포신으로부터의 살균 스펙트럼-결정 서열의 특성화
Cd16 디포신 유전자좌(서열 번호 1)와 Cd630뿐 아니라 시퀀싱된 다른 Cd 균주(QCD-66c26; QCD-23m63; QCD-32g58; QCD-63q42) 및 Cd4(서열 번호 61)의 디포신 유전자좌의 비교에 의해, 하나의 예외를 제외하고, 모든 전사해독틀(서열 번호 1 및 61)이 89 내지 100% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 것으로 나타났다. 상기의 예외는 ORF1374였다. 이러한 예외 서열은 모든 시퀀싱된 디포신 간에 가변적이었으며, 크기가 유사함에도 불구하고, 30%만큼 적은 서열 동일성을 공유하였다. 디포신 클러스터 내의 ORF1374의 위치는 수용체 결합 도메인의 위치와 일치하였다. 분리된 활성 디포신의 ORF1374의 서열을 결정하고, 이들의 서열이 매우 고도로 가변적인 것을 알아냈다(서열 번호 17, 49 내지 53). 이들 서열의 비교는 도 8에 나타내었다. 더욱이, 분리된 디포신의 스펙트럼(도 2)은 ORF1374 아미노산 서열의 유사성 또는 차이점을 반영하였으며, 도 8을 참조하길 바란다. 예를 들어, dif16(서열 번호 17) 및 dif126(서열 번호 52)의 ORF1374의 서열은 오직 1개의 아미노산만이 상이하며, 그들의 살균 스펙트럼은 거의 동일하였다. dif16(서열 번호 17) 및 dif108(서열 번호 50)의 서열은 188개의 아미노산이 상이한 반면, 그들의 살균 스펙트럼은 거의 중첩되는 것 없이 매우 달랐다. 이러한 이유로, 그리고 ORF1374가 유전자 클러스터 내의 유일한 가변 단백질이었기 때문에, ORF1374가 표적 인식 결정인자이며, 각각의 특정 디포신의 독특한 스펙트럼의 원인이 되는 것으로 결론지었다.
5. 바실러스 서브틸리스에서의 Dif4의 클로닝 및 발현.
디포신 4 유전자좌를 디포신 16에 대한 방법과 유사한 방법으로 Cd4로부터 클로닝하였다. 그러나, dif4 유전자 클러스터, 서열 번호 61 내의 EcoRI 부위의 부재 때문에, 일부 변형이 필요하였다. 플라스미드 SW251(상기 실시예 2 참조)을 올리고 DG211, 서열 번호 57 및 DG212, 서열 번호 58을 사용하여 폴리링커 내에 XhoI 부위를 갖도록 변형시켜, 각각 NotI 및 AscI 부위를 도입하였다. 이에 의해 벡터 DG577을 생성하였다.
Cd4 DNA로부터 디포신 클러스터를 3개의 단편으로 증폭시켰다. 제1 단편은 프라이머 DG210(서열 번호 59) 및 AV1288(서열 번호 37)을 사용하여 XhoI 및 NcoI 부위를 도입하였다. 제2 단편은 프라이머 DG209(서열 번호 60) 및 DG15(서열 번호 47)를 사용하여 NcoI 및 AscI 부위를 도입하였다. 이들 2개의 단편을 사전에 XhoI/ AscI으로 절단한 DG577 내로 클로닝하여, DG578을 생성하였다. 제3 단편을 AV1368(서열 번호 35) 및 AV1289(서열 번호 36)를 사용하여 증폭시켜, XhoI 및 NotI 부위를 도입하고, 사전에 XhoI 및 NotI으로 절단한 DG578 내로 클로닝하여 DG579를 생성하였다. dif4 클러스터(서열 번호 61)를 함유하는 이러한 후자의 작제물은 dif16를 위한 DG491의 등가물이었으며, 다시 말하면, 이것은 orfl377, orfl378 및 orfl379, 즉, 디포신에 대한 구조 유전자의 불필요한 추정의 다운스트림 조절 서열이 결여되어 있었다. dif4 클러스터를 바실러스 서브틸리스로 도입하기 위한 통합 벡터는 DG579로부터 NotI AscI 단편을 취하고, 이를 DG487 내로 클로닝함으로써 만들었다(상기 실시예 2 참조). 이러한 작제된 플라스미드는 DG580이었다.
바실러스 서브틸리스에서 dif4를 발현하기 위하여, orfl377-1379 없이 dif4 유전자좌를 함유하는 DG580(서열 번호 61)을 바실러스 서브틸리스 게놈 내로 재조합시켰다. 수여자 바실러스 서브틸리스 균주는 BDR123이었으며, 이는 amyE 유전자 내에 삽입된 클로람페니콜 내성 마커를 가졌다. 이러한 균주를 DG580으로 형질전환시키는 경우, 벡터 내의 프론트 및 백 amyE 서열과 게놈 amyE 서열 사이에 재조합이 발생하였다. 이는 디포신 유전자좌 및 스펙티노마이신 내성 유전자를 포함하는 DG580의 프론트 및 백 amyE 영역 사이의 서열 모두의 BDR123 게놈 내로의 삽입을 야기하였다. 성공적인 재조합체는 스펙티노마이신 내성이었으나, 재조합 사건의 결과로서 게놈 마커의 소실 때문에, 클로람페니콜-감수성이 되었다. 이러한 바실러스 서브틸리스 균주를 BDR123-580으로 명명하였다.
이러한 통합된 dif4 유전자좌는 클로스트리듐 디피실리에서의 정상의 디포신의 발현에 필요한 모든 조절 유전자를 포함하였으며, 예상되는 바와 같이, 그리고 바실러스 서브틸리스에서 dif16에 대하여 이전에 나타낸 바와 같이, dif4 입자 생성은 미토마이신 C와의 접촉에 의해 BDR123-580에서 유도되었으며, 도 9를 참조하길 바란다. 따라서, 본 발명의 실시예는 dif4 및 dif16 둘 모두에 대한 유전자좌의 클로닝 및 비-병원성 호기성 생성 세균의 일 예인 바실러스 서브틸리스에서의 각각의 발현을 제공한다.
6. Orf1374는 디포신의 살균 스펙트럼을 결정한다.
ORF1374는 질량 분석법에 의해 정제된 디포신 구조의 부분인 것으로 보이는 예측된 큰 폴리펩타이드(약 200 kDa)를 암호화한다. 디포신 16 및 디포신 4의 유전자 클러스터를 비교하는 경우, 대부분의 유전자 생성물, 특히 구조적 성분인 것으로 예상되는 것은 아미노산 수준에서 거의 동일하다. 2가지 클러스터 간의 주요한 아미노산 서열 차이는 orf1374이다. 이러한 이유 및 후술되는 다른 이유로, 이러한 유전자 생성물이 디포신의 표적 특이성을 부여하는 것으로 추측하였다. 이를 시험하기 위하여, dif4의 ORF1374(즉, 서열 번호 49를 암호화하는 서열)를 DG580에서, Cd16으로부터의 ORF1374(즉, 서열 번호 17을 암호화하는 서열)로 대체하여, DG587을 생성하였다. DG587을 바실러스 서브틸리스 BDR123의 게놈 내로 통합하여, dif16 및 dif4에 대하여 상기에 제공된 바와 같이 BDR123-587 재조합체를 만들었다. 얻어진 BDR123-587을 미토마이신에 노출시키고, 용해물을 처리하여, 디포신을 제조하였다. 얻어진 디포신 입자는 디포신 16에 대하여 감수성인 클로스트리듐 디피실리 균주 19145에 대하여 살균성을 가졌으며, dif4에 대하여 감수성인 균주 19137를 사멸시키는 능력을 소실하였다(도 9).
이러한 실험을 추가로 개선하였다. DG587의 작제는 Cd4 및 Cd16의 키메라인 Orf1373을 야기하였다. DG587의 ORF1373이 원래 Cd41373, 서열 번호 78과 100% 동일하게 복원되도록 작제물을 만들어, 이에 따라, 오직 ORF1374, 서열 번호 17만을 정확하게 대체한 작제물을 생성하였다. 이러한 작제물을 DG603으로 명명하였다. 이러한 작제물을 바실러스 서브틸리스 BDR123 게놈 내로 통합하고, 상술된 바와 같이 미토마이신 C로 유도하였다. 얻어진 디포신 입자는 균주 19099 및 19145에 대하여 살균성을 가졌으며, 19137을 사멸시키는 능력을 소실하였다. 이에 따라, 디포신의 살균 스펙트럼을 ORF1374에 의해 암호화된 단백질에 의해 결정하였으며, 본 명세서에서 증명된 바와 같이, ORF1374의 변화에 의해 디포신의 살균 스펙트럼이 변경되었다.
7. RecA가 활성화되는 경우 용해되지 않는 PBSX가 없는 생성자 세포.
PBSX 프로파지는 야생형 바실러스 서브틸리스에서 아주 흔하다. 유도되는 경우, 프로파지는 그것이 저해된(stunted) 헤드(head) 구조를 가지며, 오직 작은 무작위 DNA 단편을 함유한다는 점에서 결함이 있다. 이는 RecA의 조절 하에 있으며, 이에 따라, 이는 DNA 손상제, 예컨대 미토마이신 C 및 세균에 대한 다른 형태의 심각한 스트레스에 의해 유도된다. 유도되는 경우, 이는 세균의 용해를 야기하고 PBSX 입자를 분비한다. 배양 배지의 PBSX 입자로의 오염을 피하고, 바실러스 서브틸리스 생성자 세균의 용해를 없애기 위하여, 디포신의 발현이 recA 또는 dinR/lexA 활성의 변형에 의해 조절되는 경우, PBSX 유전자 클러스터를 바실러스 서브틸리스 BDR11 세균으로부터 제거하였다.
PBSX 낙아웃(knockout)을 리우(Liu) 등에 의해 약술된 절차를 따라 작제하였다. 약술하면, 리우 논문에 사용된 프라이머 및 오버랩핑 연장 PCR 기법을 사용하여, 모 균주 BDR11의 araR 유전자를 결실시키고, 바실러스 아라비노스 프로모터 하의 네오마이신/카나마이신-내성 유전자, ParaA-neoR로 대체하여, 균주 BDG2를 만들었다. 이러한 araR 유전자의 결실을 PCR 및 카나마이신에 대한 내성의 부여에 의해 확인하였다.
다음으로, PBSX 유전자좌 그 자체를 결실시켜 DNA 작제물을 만들었다. 이러한 작제물을 만들기 위하여, 하기의 5개의 PCR 생성물을 오버랩핑 연장 PCR에 의해 하나의 큰 생성물로 스플라이싱시켰다: BDR11로부터 증폭된 xylB 유전자의 5' 서열 1kb; BDR11로부터 증폭된 xylA 유전자의 3' 서열 1kb; 플라스미드 pJW034로부터 증폭된 클로람페니콜 내성 유전자, cat; BDR11로부터 증폭된 araR; 및 마지막으로, BDR11로부터 증폭된 xylB 유전자를 함유하는 서열 1kb. 오버랩핑 연장 PCR 생성물을 pUC19의 XmaI 및 SpeI 부위 내로 클로닝하였다. 이어서, 이러한 작제물을 SacII를 사용하여 선형화시키고, 균주 BDG2 세균 내로 형질전환시켰으며, 5㎍ 클로람페니콜/㎖이 보충된 LB 아가 플레이트 상에 도말하였다. 이러한 플레이트로부터 콜로니를 고르고, 5㎍ 클로람페니콜/㎖ 또는 20㎍ 카나마이신/㎖ 중 어느 하나가 보충된 LB 아가 플레이트 상에 패치(patch)시켰다. 클로람페니콜 내성이며 카나마이신 감수성이었던 균주를 항생제 선택 없이 LB 브로쓰에서 4시간 동안 성장시킨 다음, 20㎍ 카나마이신/㎖이 보충된 LB 아가 플레이트 상에 도말하였다. 이들 플레이트 상에서 성장시킨 콜로니를 PBSX 유전자의 존재에 대하여 콜로니 PCR에 의해 시험하였다. PBSX 유전자 클러스터의 결실을 야생형 균주 BD123 내의 PBSX 유전자의 부위를 스패닝하는 PCR 생성물의 시퀀싱에 의해 균주 BDG9에서 확인하였다. 추가의 분석에 의해 BDG9가 바실러스 서브틸리스 균주 BD123 또는 BDG2와 달리, 3㎍ 미토마이신 C/㎖의 존재 하에서 PBSX 입자를 용해시키거나 생성하지 않음이 나타났다.
PBSX 결실 균주, BDG9를 플라스미드 DG580으로 형질전환시켜, BDG27을 생성하였다. Cd4 디포신 클러스터의 통합을 스펙티노마이신 내성에 의해 확인하였다. BDG27을 성장시키고, 상술된 바와 같이 미토마이신 C로 유도하였다. 16시간 후에, 세포를 수집하고, 본 발명자들은 PBSX 없이 디포신이 세포 내로 축적될 것으로 예상하였기 때문에, 버그버스터(BugBuster)(노바젠)를 사용하여 세포를 용해시켜, 세포를 파괴하였다. 세포를 버그버스터로 용해시킨 후에, 데브리스를 원심분리에 의해 제거하고, 상층액을 균주 19137에 대한 살균성에 대하여 시험하였다. BDG27에 의해 생성된 디포신은 Cd19137에 대하여 활성을 보였으나, Cd19099에 대해서는 그렇지 않았으며, 이에 따라, 디포신 4가 이러한 비-용해성, PBSX 결실된 균주에서 생성되었음이 나타났다.
"구비하는", "함유하는" 또는 "특징으로 하는"과 상호교환적으로 사용되는 용어 "포함하는"은 포괄적이거나 한정적이지 않은 언어이며, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 어구 "~로 이루어진"은 특허청구범위에 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 어구 "본질적으로 ~로 이루어진"은 특허청구범위의 범주를 특정 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이며 신규한 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들로 제한한다. 본 개시내용에서, 본 발명의 실시형태를 각각의 이러한 어구의 범주에 해당하는 조성물 및 방법으로 고려한다. 따라서, 기재된 요소 또는 단계를 포함하는 조성물 또는 방법은 특정 실시형태를 고려하며, 여기서, 조성물 또는 방법은 그들 요소 또는 단계로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
특허, 특허 출원서 및 공보를 포함하는 본 명세서에 기재된 모든 참고문헌은 이전에 구체적으로 포함되든지 아니든지 간에, 그들 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
이제 본 발명이 완전히 기재되었으며, 본 발명이 과도한 실험 없이, 본 발명의 목적 및 범주로부터 벗어나지 않고, 넓은 범위의 동등한 파라미터, 농도 및 조건 내에서 수행될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다.
본 발명이 본 발명의 특정 실시형태에 관하여 기재되지만, 본 발명이 추가로 변형될 수 있음이 이해될 것이다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따르고, 본 발명이 속한 기술분야의 지식 또는 일반실무 범위 내에서 일어나고 본 명세서에 개시된 필수적인 특징들에 적용될 수 있는 바와 같이, 본 개시내용으로부터의 출발하는 것을 포함하는, 본 발명의 임의의 변이, 용도 또는 응용을 포괄하고자 한다.
본 발명이 상기 실시예를 참고로 기재되었으나, 본 발명의 목적 및 범주 내에서 변형 및 변이가 포함되는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 하기의 특허청구범위에 의해서만 제한된다.
[참고 문헌]
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Claims (15)

  1. 클로스트리듐 디피실리(Clostridium Difficile) 균주에 의해 암호화된 천연 R-형 박테리오신으로부터 만들어지는 변형된 R-형 박테리오신으로서,
    여기서 상기 천연 R-형 박테리오신은 살균성을 갖고,
    여기서 천연 R-형 박테리오신의 수용체 결합 도메인(RBD) 폴리펩티드가, 상기 변형된 R-형 박테리오신에서,
    상기 천연 R-형 박테리오신을 암호화하는 클로스트리듐 디피실리와 상이한 균주의 클로스트리듐 디피실리로부터의 동일하지 않은 이종 RBD 폴리펩티드 또는
    클로스트리듐 디피실리를 감염시키는 박테리오파지로부터의 동일하지 않은 이종 RBD 폴리펩티드로 대체되고,
    여기서 상기 변형된 R-형 박테리오신은 RBD 폴리펩티드 대체로 인하여, 상기 천연 R-형 박테리오신과 상이한 살균 스펙트럼(bactericidal spectrum)을 갖고,
    여기서 상기 변형된 R-형 박테리오신의 기저판(base plate) 부착 영역(BPAR) 폴리펩티드가 서열 번호 16 또는 78 의 50 개 이상의 인접한 아미노산을 포함하는 변형된 R-형 박테리오신.
  2. 제 1 항에 따른 변형된 R-형 박테리오신을 암호화하는 분리된 핵산 분자로서,
    여기서 변형된 R-형 박테리오신이 하기를 포함하는 핵산 분자:
    (a) 서열 번호 4-16, 18 및 19 의 폴리펩티드; 또는
    (b) 서열 번호 66-80 폴리펩티드.
  3. 제 2 항의 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트.
  4. 제 3 항에 있어서, 핵산 분자가 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 발현 카세트.
  5. 제 4 항에 있어서, 프로모터가 유도가능하거나 억제가능한 발현 카세트.
  6. R-형 박테리오신을 발현시킬 수 있는 세포로서, 상기 세포는 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 또는 그의 염색체 내에 제 2 항의 핵산 분자를 포함하는 세포.
  7. 제 6 항에 있어서, 세포가 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus) 및 리스테리아(Listeria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 세균의 속으로부터의 종의 세균인 세포로서, 상기 세균은 비-병원성이면서 편성 혐기성이 아닌 세포.
  8. 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 제 2 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 세포를 R-형 박테리오신의 발현을 유도하는데 유효한 농도의 유도제(inducing agent)에 노출시키는 단계, 및
    발현된 R-형 박테리오신을 정제하는 단계를 포함하는, R-형 박테리오신의 생성 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, R-형 박테리오신이 생성되는 경우 세포가 용해되지 않는 방법.
  10. 병원성 세균을 제 1 항의 변형된 R-형 박테리오신과 접촉시켜, 변형된 R-형 박테리오신이 병원성 세균에 결합하고 이를 사멸시키는 것을 포함하는, 클로스트리듐 디피실리의 생체외(in vitro) 사멸 방법.
  11. 동물에서의 클로스트리듐 디피실리의 감염의 치료 방법에 사용되는, 제 1 항의 변형된 R-형 박테리오신.
  12. 동물에서의 클로스트리듐 디피실리의 감염의 치료 방법에 사용되는, 제 7 항의 세포.
  13. 제 2 항에 있어서, 이종 RBD 폴리펩티드 대체에 더하여, 변형된 R-형 박테리오신이 서열 번호 4-15 와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  14. 제 5 항에 있어서, 프로모터가 소분자 유도자 또는 탈억제자에 의해 유도되는 발현 카세트.
  15. 제 8 항에 있어서, 핵산 분자가 세포의 게놈에 대하여 이종이고, 핵산 분자가 세포의 염색체 내에 포함되거나 또는 세포 내의 염색체외 발현 벡터에 포함되는 방법.
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