CN101220371B - 重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体及其口服疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体及其口服疫苗。所要解决的技术问题为构建hRV病毒VP4蛋白的双歧杆菌表达载体。本发明重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体，装载有人A组轮状病毒的病毒蛋白VP4的编码基因序列。本发明表达载体可转入双歧杆菌，发酵培养后进一步制备成转hRV-VP4基因的双歧杆菌-hRV-VP4重组载体口服活疫苗制剂。主要用于预防和辅助治疗人轮状病毒的感染引起的小儿腹泻，具有很好的市场前景。

Description

重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体及其口服疫苗

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体及其口服疫苗。

背景技术

人A组轮状病毒(human rotavirus，hRV)是引起新生儿严重腹泻的主要病原体，约60％的严重腹泻由RV引起的，全球每年有大约50万的婴幼儿因感染RV而死亡，因此，WHO将RV疫苗的研究放在优先发展的位置^[1]。

目前，RV疫苗研究的主要方向是人工重配减毒口服活疫苗，其中影响最大的为Wyeth-Ayerst公司生产的口服疫苗，但由于安全问题很快退出市场(商品名Rotashield？，1999年6月因接种者出现肠套叠而主动撤回^[1])。近2年又有RIX4414^[12-13]和RotaTeq^[14]相继进行了临床3期试验的报道。在中国，目前只有兰州生物制品所的羊轮状病毒株P[8]G10于1998年获准生产应用[1]，这也是我国目前唯一获国家批准的RV疫苗，但据临床反映，其免疫效果并不理想。此外，第三军医大学吴玉章教授正在开展hRV/VP7转基因马铃薯疫苗的尝试，但离临床应用还有时日。象流感病毒一样，自然界轮状病毒不同株之间的基因组节段重配和基因内部突变引起RV的保护性抗原发生很高的变异，导致疫苗研究大大滞后于临床上流行病毒的变异，给疫苗研究带来很大的困难^[10]，因此，模拟病毒自然重配(reassortant)的规律发展RV疫苗是最合理和有效的策略。但RV重配株的构建与筛选工作难度很大，花费大，耗时长，而最终产品带有大量非免疫必需的活病毒成分，接种增殖后难免有一定的副作用如发热、腹泻、肠套叠等，Rotashield的败北就是最好的例子。但是，人工模拟病毒自然重配方式的疫苗发展思路和较理想的免疫保护效果，无疑为RV疫苗的研究指明了方向。但具体的模拟和重组方案要有全新的思维。用自然病毒重配研制减毒活疫苗的老路，一方面，无法克服减毒活疫苗毒力回复的安全性问题，以及减毒RV对HIV感染者等免疫缺陷患者的致命危险。另一方面，无论是Rotashield、RotaTeq还是RIX4414，都无法回避婴幼儿接种后疫苗增殖导致的肠套叠、发热、腹泻、呕吐等副作用，而且也很难及时获得符合临床预防要求的新变异株疫苗。因此，hRV疫苗的研制工作仍然任重而道远。

动物模型研究表明，用VP4的病毒样颗粒肌肉免疫小鼠，血液中虽然产生病毒特异性中和抗体，却对小鼠没有保护作用，只有通过粘膜免疫系统接种的RV疫苗才有免疫保护作用[1-6]。因此，最有效的RV疫苗必然是有能力刺激肠道产生消化道局部免疫的疫苗。由此决定了RV疫苗的最佳剂型可能是引起粘膜免疫的口服疫苗。

hRV基因工程载体疫苗就是利用载体系统表达病毒保护性抗原构建新型疫苗的一种模式，其优点是避免了病毒身的毒副作用，缺点是难以找到理想的载体菌(表达系统)，即使有表达，免疫原性也较弱。hRV的主要保护性抗原是病毒蛋白(Virus Protein)VP4和病毒蛋白VP7。VP4蛋白是hRV一个重要的外壳蛋白，为线型抗原，不需要糖基化，无论在原核表达系统(如大肠杆菌)还是真核表达系统(如腺病毒)中均能表达出有免疫原性的VP4抗原，实验证明，口服hRV疫苗后婴儿产生的抗VP4抗体要比抗VP7抗体多[1]。但天然病毒中VP4的含量非常低，要获得足以产生有效保护性免疫反应的抗原，只有通过基因工程疫苗表达VP4来实现。

更值得注意的是：以VP7分型(G血清型)的主要流行的hRV(G1-4)，如果以VP4(P血清型)分型，则G1、G3和G4都属于P1A型^[1]。亦即，VP4的保护范围要比VP7的保护范围广泛的多。据统计，在我国人群中流行的主要RV有：G1(P1A[8])占72.7％、G2(P1B[4])12.1％、G3(P1A[8])14.2％和G4(P1A[8])2.5％，可见，hRV流行株以P1A[8]血清行为主^[11]，占临床流行病毒株的89.4％。

目前，未见有单独把VP4作为亚单位侯选疫苗的报道。至于国内的王明忠等用pGEX-4T-2融合表达载体在大肠杆菌BL21中实现了hRV VP4蛋白的表达^[15]；孙茂盛等在大肠杆菌或腺病毒中表达的则是猴轮状病毒的VP4基因^[16-18]；孔华等则进行的是VP4的转基因植物试验，目前的研究均没有做到口服疫苗的程度。

RV的感染和复制仅局限在小肠上皮细胞中，因此，肠道粘膜免疫在防止RV感染中有举足轻重的作用，在抵御肠道病原体感染中，肠道粘膜免疫系统是执行消化道免疫的第一道防线。双歧杆菌(Bifidobacterium sp.下文简写为B)属于革兰氏阳性菌^[8]，是人类肠道的正常菌群，能通过细胞表面的磷壁酸吸附在小肠上皮细胞表面的受体上，本身不会被肠道清除，能在肠道内稳定定植，也对机体无害，具有很高的安全性，用它做重组载体活疫苗的表达系统，不存在载体菌产生外毒素、无致热原和毒力返祖等潜在的致病危险，有利于直接把抗原表达在粘膜淋巴细胞表面而被识别和提呈，此外，双歧杆菌还可能发挥粘膜免疫增效剂和辅助治疗作用，临床研究表明，在感染RV期间服用双歧杆菌制剂，对儿童RV腹泻有一定辅助功效^[9]。Qiao等的工作证明^[7]，用猴RV(RRV)感染小鼠5天后，实验组(B+RRV)在病毒感染后每天饲喂一定量的双歧杆菌，对照组(RRV)饲喂等量的盐水，阴性对照不感染病毒，也不给双歧杆菌，只饲喂等量的盐水，结果发现，实验组血清和粪便中的RRV特异性IgG和IgA均高于对照组，实验组的病愈期也比对照组有所提前。

目前，将双歧杆菌用于表达重组RV病毒蛋白并制备活疫苗在国内外均未见报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体。

本发明重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体装载有人A组轮状病毒的病毒蛋白VP4的编码基因序列。

其中，上述的双歧杆菌表达载体为大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体。

进一步的，上述的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步的，上述人A组轮状病毒VP4亚单位具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

进一步的，上述重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种含有上述的重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体的宿主细胞。

其中，上述的宿主细胞为双歧杆菌。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述的重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体或上述的宿主细胞在制备预防或治疗人A组轮状病毒引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂中的用途。

本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种预防或治疗人A组轮状病毒引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂。该口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂是由上述的宿主细胞添加药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的。

进一步的，上述的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂的剂型为口服液、口服溶液、片剂或胶囊剂。

本发明用人轮状病毒VP4重组载体构建重组双歧杆菌口服活疫苗的研究方案就是“扬长避短”的一种新尝试，即模拟病毒自然变异之道，研制“保护性抗原重组”疫苗，该方案使疫苗研制工作能够及时根据临床流行株的抗原变异而改变疫苗抗原的重组方式，达到以变应变的主动效果因此，特别是用P1A[8]型的VP4做重组疫苗的抗原，可以预防90％的RV感染，临床应用前景非常广阔。

本发明中涉及使用的现有核苷酸序列均能在已发表的本领域学术刊物及GenBank中检索而得，本领域普通技术人员均能在参考本领域教科书或试验手册的基础上完成本发明涉及的分子生物学和细胞生物学试验。

本发明的有益效果为：.

1、安全高效。双歧杆菌是人类肠道的正常菌群，能通过细胞表面的磷壁酸吸附在小肠上皮细胞表面的受体上，本身不会被肠道清除，能在肠道内稳定定植，也对机体无害，具有很高的安全性，用它做重组载体活疫苗的表达系统，不存在载体菌产生外毒素、无致热原和毒力返祖等潜在的致病危险，有利于直接把抗原表达在粘膜淋巴细胞表面而被识别和提呈。本发明双歧杆菌活疫苗不仅无副作用，还有助于RV的治疗和肠道微生态的恢复；该疫苗安全性高，表达抗原肽亚单位没有感染性，还可能发挥粘膜免疫增效剂和辅助治疗作用。

2.模块化研制，模块化组合。可将不同血清型的hRV流行株的VP4基因克隆到不同的双歧杆菌中，建成hRV流行株的VP4亚单位疫苗库，当临床上出现不同的hRV流行株时，可根据实际情况，从菌种库中调取相应的VP4亚单位的双歧杆菌疫苗，随时组合出能够有效应对临床需要的疫苗，使hRV亚单位疫苗的研制走向模块化发展道路，彻底改变目前hRV疫苗研制周期长、花费大、保护范围窄的不利局面。

3.快捷重组。该方案使疫苗研制工作能够及时根据临床流行株的抗原变异而改变疫苗抗原的重组方式，达到以变应变的主动效果，以现有的基因克隆和测序技术，一个星期就可完成载体的构建工作，是hRV重组载体口服活疫苗研制的理想方案。

4.经济实惠，口服方便。与重组减毒活疫苗相比，本发明活疫苗发明具有经济适用的特点，发酵产品不需要进一步的纯化，其研制费用不足前者的十分之一。而剂型可以使乳酸发酵品或胶囊等剂型，便于儿童服用。

综上所述，与现有技术的方案相比，本发明双歧杆菌-人轮状病毒VP4口服重组载体活疫苗效果好，安全性强，使用方便，成本低，具有很好的使用前景。

附图说明

图1为pBEX-VP4，其中的VP4表示hVP4基因片段，pAymO表示双歧杆菌的α-淀粉酶(amylase)基因pAymO，RepB表示长双歧杆菌KJ36质粒复制元件序列，bla表示氨苄青霉素抗性基因编码序列。

图2为VP4的PCR产物电泳图，其中的1为VP4片段(2338bp)，2为DNA Marker。

图3为本发明pBEX-hRV VP4表达载体的构建过程示意图。

图4为本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的构建过程示意图。

具体实施方式

以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。

实施例一本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的构建

一.以双歧杆菌的α-淀粉酶(amylase)基因(GenBank No：AY240946)的启动子AmyO(位置：599-690nt)替换pGEX-5x-1上的Ptac启动子(183-932)，同时用PCR方法删除pGEX-5x-1上的LacIq片段(位置：3301-4420nt)。

具体步骤如下：

1.以pGEX-5x-1质粒为模板，用高保真Taq DNA聚合酶通过PCR扩增获得载体基本骨架。

PCR引物F为pGEX-5x-1上的多克隆位点(MCS)序列，引物R为LacIq上游序列。是删除pGEX-5x-1上LacIq的的引物序列。

引物序列如下：pF1：

ggatccccgaattcccg(SEQ ID NO.4)(位置：pGEX-5x-1934-949，含添加的BamHI酶切位点)；

pR1：

ccgcggattcaccaccctgaattgac(SEQ ID NO.5)(位置：pGEX-5x-13320-3301，含添加的SacII酶切位点)；

PCR扩增条件：95℃ 4min，(95℃ 40Sec、52℃ 30Sec、72℃ 1min)×30次循环。

结果：获得2387bp的pGEX-5x-1上包括氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌复制起始位点在内的骨架片段(过程示意图见附图4)。

2.用BamHI和SacII酶切切取由上海生物工程技术公司合成的α-淀粉酶基因AmyO(启动子)序列110个碱基对，其5’端添加了M13反向测序引物序列taaaacgacggccagt(SEQ IDNO.6)以便于测序。

其构建路线如下：

(1)双歧杆菌α-淀粉酶基因的启动子序列：599  ta aaataaacag catacgttcgcaatagtgca aacgctatca aagaagatga acccccgtta aagggattga agaaaaggaa taaagga

(2)

ccgcggtaaaacgacggccagt(SEQ ID NO.8)是加在599前的M13测序引物序列及SacII酶切位点(下划线)和保护碱基(方框)；

(3)在690号碱基后加BamHI酶切位点和保护碱基序列ggatcc

因此，最后合成的α-淀粉酶基因的启动子序列为：tcgaccgcggtaaaacgacggccagttaaaataaacagcatacgttcgcaatagtgcaaacgctatcaaagaagatgaacccccgttaaagggattgaagaaaaggaataaaggagccggatccatc(127bp)(SEQ ID NO.9)

(如无特别标注，本发明中说明书中核苷酸序列的默认书写方式均为由从5’端到3’端的方向)。

PCR产物用BamHI和SacII双酶切后与AmyO酶切产物连接转化，在氨苄青霉素抗性平板上挑取单克隆，质粒用电泳鉴定，命名pGEX-pAymO，本次改造所得的质粒明显要比第一步所得到的质粒pGEX-5x-1小1000多个碱基对，测序确认后以Aat II酶切备用。

二.合成长双歧杆菌KJ36质粒(GenBank No：AF139129)的复制蛋白B序列(SEQ IDNO.12所示，在两端添加Aat II酶切位点及保护碱基)，序列片段由上海生工合成，测序确认无误。用PCR大量扩增该序列，

正向引物为：pR1：gcgacgtcgtacttagtacaaaagggga(SEQ ID NO.10)(1-20nt，添加Aat II酶切位点)。

反向引物为：pR2：gcgacgtcatgatgttcgcggttgcg(SEQ ID NO.11)(1020-1002nt，添加Aat II酶切位点)。

PCR扩增条件为：95℃ 3min，再经95℃ 50Sec、54℃ 40Sec、72℃ 1min的30次循环。

pKJ36复制元件(rep B)序列如SEQ ID NO.12所示，其中第5～1018位碱基序列为载入本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的序列。

PCR产物经Aat II酶切后连接到第一步所得的质粒对应的Aat II酶切位点。连接，转化，在氨苄青霉素抗性平板上挑取单克隆，质粒用电泳检测后测序确认，命名为pBEX。

至此，本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体构建成功，命名为pBEX。全长3509bp(附图4中3个片段的核苷酸之和本应为120+1014+2387＝3521bp，因有2个酶切位点重复，所以应减去重复计算的酶切位点，即减去12个碱基，特此注明)，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。以sacII酶切位点起始序列记作1，该穿梭表达载体的主要序列特征如下：

(1)1-108bp为M13测序引物和α-淀粉酶基因的启动子序列区。

(2)114-150bp为多克隆位点，依次有BamHI，EcoRI，SmaI，SalI，XhoI和NotI五个单酶切位点。

(3)1569-2429bp为beta-lactamase(bla，氨苄青霉素酶)的编码序列。

(4)559-1410bp为长双歧杆菌的RepB(复制蛋白B)的编码序列。

实施例二构建pBEX-hRV VP4表达载体(过程示意图见附图3)

1.用RT-PCR方法从Wa株hRV病毒的基因组中扩增病毒蛋白VP4基因(GENBANK NO.L34161，编码位置：10-2337nt，如SEQ ID NO.2所示)。

引物如下：

Vp4F：ggatccggctataaaatggcttcact(SEQ ID NO.13)(加入BamHI位点)。

Vp4R：gtcgaccacatcctcaatagcgttct(SEQ ID NO.14)(加入SalI位点)。

方法如下：

取提取的RNA 10μl，100℃加热2分钟，使双链RNA变性，冰浴2分钟后瞬时离心，再加入5×AMV Bufer 4μl，dNTPs 2μl，下游引物lμl(30μM/μl)，RNasin lμl，反转录酶AMV 2μl，加ddH20补齐25μl的反应体系。

42℃反转录1个小时。取一洁净灭菌的PCR管，在50μl反应体系中加人：10×PCR Bufer5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，上游引物1μl，下游引物lμl，cDNA 2μl，Taq酶0.2μl，ddH20 36.8μl。反应条件为：94℃ 5min，(94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 100s)×30个循环，72℃ 7min。反应结束后取3μl PCR产物在l％琼脂糖凝胶上进行电泳，纯化的PCR产物与pEASY-T1进行T-A连接，测序无误后记作pEASY-hVP4保存备用。

用BamHI和SalI同时酶切pEASY-hVP4和pBEX，凝胶电泳后回收VP4片段和pBEX片段，按2∶1体积比连接，转化大肠杆菌DH5a，在氨苄青霉素抗性LB平板上挑取单克隆，摇菌后提取质粒，用VP4引物进行PCR鉴定(见附图2)，阳性克隆测序后命名为pBEX-hRV VP4(序列如SEQ ID NO.3所示)。

实施例三本发明含pBEX-hRV-VP4重组载体的双歧杆菌种子菌的制备

转化双歧杆菌的过程如下：

1.筛选OD值0.6的双歧杆菌为受体菌，经去离子水配制的灭菌10％甘油处理后，用电转化法将质粒载体转化到受体菌中；转化条件为：15KV、200Ω、25μF。

2.将转化处理后的双歧杆菌先在无抗菌素的MRS液体培养基中复苏60-120min，然后在含50μg/ml氨苄青霉素的MRS固体培养基上培养，选择抗性菌落，从而获得转hRV-VP4基因的双歧杆菌，PCR和SDS-PAGE鉴定后的阳性克隆即为含有pBEX-hRV VP4重组载体的双歧杆菌种子菌。

实施例四本发明种子菌的大规模液体接种扩增培养

将实施例三构建的双歧杆菌种子菌复苏后涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的双歧杆菌MRS培养基上厌氧培养48-72小时，然后挑取单一的抗性菌落于抗性双歧杆菌液体培养基中增菌培养，经PCR证实VP4阳性的双歧杆菌单菌落再次涂布接种于含氨苄青霉素的抗性培养基平板上厌氧培养48-72小时，然后再挑取单一菌落于常规液体培养基中培养，如此反复接种培养至继代培养不低于15代时PCR检测证实VP4仍然阳性的克隆作为大规模液体接种扩增培养的种子菌，保藏待用。

实施例五本发明双歧杆菌-hRV-VP4重组载体口服活疫苗制剂的制备及该疫苗的药效验证

1、本发明双歧杆菌-hRV-VP4重组载体口服活疫苗具体制备过程如下：

a)配方：鲜牛奶52％、白砂糖7.8％、磷酸二氢钠0.2％、水40％、卡那霉素0.005％；操作时先用热水溶解白糖和磷酸二氢钠，搅拌均匀，随后与鲜奶混合，通过双联过滤器进入离心净乳机，除去杂质。

b)120℃瞬时杀菌，时间10秒，为最大限度地保持牛奶的养分，物料进入平衡缸，经离心式卫生泵送人板式热交换器，经过预热、高温杀菌、保温、冷却，达到杀菌的目的。

c)在高压均质机中进行均质，两次均质均采用两段均质。一段均质压力为70kgf/cm2，二段均质压力为30kgf/cm2。

d)接种及发酵：首先接种5％转化双歧杆菌发酵菌种液(由实施例四制备)，37℃培养9小时左右，终止酸度为800T。

e)罐装：按5mL规格进行玻璃安培罐装，真空封口，4℃保藏，即得。

上述的双歧杆菌-hRV-VP4重组载体口服活疫苗微生物指标：活性双歧杆菌数≥10⁷cfu/mL，大肠菌群数＜30cfu/100mL，致病菌不得检出。

2、口服活疫苗的药效验证

1)试验分组(20日龄雄性昆明大鼠30只，随机分成下述3组)：

疫苗免疫组、无重组载体的双歧杆菌对照组和PBS对照组。

2)昆明大鼠灌胃免疫试验(4.0×10⁹细菌/只)：

无重组载体的双歧杆菌对照组：用不含VP4的pBEX转化的双歧杆菌灌胃，在第0d，7d，14d和第21d灌胃共4次；

PBS对照组：用PBS分别灌胃，在第0d，7d，14d和第21d灌胃共4次；

疫苗免疫组：用上述双歧杆菌-hRV-VP4重组载体口服活疫苗灌胃，在第0d，7d，14d和第21d灌胃共4次；

第28d后检测VP4特异的抗体。

3)试验结果：

疫苗免疫组9只(90％)大鼠的抗体滴度为1∶256，有一只(10％)为1∶128，而无重组载体的双歧杆菌对照组和PBS对照组则没有特异性抗体产生。证明本发明重组口服活疫苗对hRV感染有较强的免疫效应。

参考文献：

1.李忠明主编.当代新疫苗.北京：高等教育出版社，2000，475-486.

2.Choi AH，Basu M，Rae MN，et al.Particle-bombardment-mediated DNAvaccination with rotavirus VP4 or VP7 induces high levels of serum rotavirus IgGbut fails to protect mice against challenge.1998.Virology 250，230-240

3.Hermann JE，Chen SC，Jines DH，et al.Immune responses and protectionobtained by oral immunization with rotavirus VP4 and VP7 DNA vaccinesencapsulated in microparticles.Virology.1999，259(1)：148-53.

4.Coste A，Sirard JC，Johensen K，et al.Nasal immunization of mice withvirus-like particles protects offspring against rotavirus diarrhea.J Virol.2000，74(19)：8966-8971.

5.Wu YZ，Li JT，Mou ZR，et al.Oral immunization with rotavirus VP7expressed in transgenic potatoes induced high titers of mucosal neutralizingIgA.Virology.2003 Sep 1；313(2)：337-42.

6.Subbotina MD，Timchenko VN，Vorobyov MM，et al.Effect of oraladministration of tormentil root extract(Potentilla tormentilla)on rotavirusdiarrhea in children：a randomized，double blind，controlled trial.PediatrInfect Dis J.2003，22(8)：706-11.

7.Qiao HP，Duffy，LC，Griffiths，E，et al.Immune responses in Rhesusrotavirus-challenged Balb/c mice treated with Bifidobacteria and prebioticsupplements.Pediatr Res.2002，51(6)：750-755.

8.李兰娟主编，感染微生态.北京：人民军医出版社，2002.p740.

9.Fujimori M，Amano J & Taniguchi S.The genus Bifidobacterium for cancergene therapy.Curr Opin Drug Discov Devel.2002 Mar；5(2)：200-3.

10.方肇寅，齐锦，杨辉，等.我国1998-1999年流行的婴儿腹泻轮状病毒的分型研究.病毒学报，2001，17(1)：17-22.

11.Ciarlet M，Conner ME，Finegold MJ，et al.Group A rotavirus infection andage-dependent diarrheal disease in rats：a new animal model to study thepathophysiology of rotavirus infection.J Virol.2002，76(1)：41-57.

12.Ruiz-palacios，G M，prez-Schael I，velazquez FR，et al.Evaluation ofsafety，immunogenicity and efficacy of an attenuated rotavirus vaccine.N Engl JMed.2006，354(1)：11-22.

13.Bernstein DI，Ward RL.RIX4414：A randomized，placebo-controlled trialin Latin American infants.Pediatr Ann.2006，35(1)：38-43.

14.Offit PA，Clark HF.RotaTeq：a pentavalent bovine--human reassortantrotavirus vaccine.Pediatr Ann.2006，35(1)：29-34.

15.王明忠，朱进，人A组轮状病毒地方株外壳蛋白VP4的原核表达，2004，14(1)：6-7

16.刘馨，孙茂盛，轮状病毒VP4基因的原核表达、蛋白纯化及动物免疫试验，动物医学进展，2006，27(12)：88-90

17.孙茂盛，昝云红，马雁冰，张光明，杜秋江，戴长柏，重组腺病毒表达轮状病毒SA11毒株VP4蛋白及其糖基化，中国医科学院学报，2000，22(1)：52-56

18.刘馨，张光明，李鸿钊，谢天宏，孙茂盛，表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒对新生小鼠的被动免疫保护作用，中国生物制品学杂志，2007，20(1)：33-36

19.孔华，郭安平，郭运玲，刘恩平，章霄云，贺立卡，轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因转化苎麻的研究，安徽农业科学，2006，24(24)：6460-6462，6464

SEQUENCE LISTING

<110>重庆医科大学

<120>重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体及其口服疫苗

<130>A080010K

<160>14

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>3509

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>1

ccgcggtaaa acgacggcca gttaaaataa acagcatacg ttcgcaatag tgcaaacgct    60

atcaaagaag atgaaccccc gttaaaggga ttgaagaaaa ggaataaagg agccggatcc    120

ccgaattccc gggtcgactc gagcggccgc atcgtgactg actgacgatc tgcctcgcgc    180

gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt    240

gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg    300

ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat aattcttgaa    360

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt    420

cttagacgtc gtacttagta caaaagggga gcgaacttag tacaaaaggg gagcgaactt    480

agtacaaaag gggagcgaac ttagtacaaa aggggagcga acttagtaaa taaataaact    540

ttgtactagt atggagtcat gtccaatgag atcgtgaagt tcagcaacca gttcaacaac    600

gtcgcgctga agaagttcga cgccgtgcac ctggacgtgc tcatggcgat cgcttcaagg    660

gtgagggaga agggcacggc cacggtggag ttctcgttcg aggagctgcg cggcctcatg    720

cgattgagga agaacctgac caacaagcag ctggccgaca agatcgtgca gacgaacgcg    780

cgcctgctgg cgctgaacta catgttcgag gattcgggca agatcatcca gttcgcgctg    840

ttcacgaagt tcgtcaccga cccgcaggag gcgactctcg cggttggggt caacgaggag    900

ttcgcgttcc tgctcaacga cctgaccagc cagttcacgc gcttcgagct ggccgagttc    960

gccgacctca agagcaagta cgccaaggag ttctacaggc gcgccaagca gtaccgcagc    1020

tcgggaatct ggaagatcag ccgcgatgag ttctgccgac tgcttggcgt atccgattcc    1080

acggcaaaat ccaccgccaa cctgaacagg gtcgtgctga agacgatcgc cgaagagtgt    1140

gggcctctcc ttggcctgaa gatcgagcgc cagtacgtga aacgcaggct gtcgggcttc    1200

gtgttcacgt tcgcccgcga gacccctccg gtgatcgacg ccaggcccgt ggaggcgagg    1260

aagacggacg gcgacggcaa gggccattgg acgagcgtgg cggggtacgg cgaggtgttc    1320

acgaccacgg agctgttcga cgtgacggcc gcgcgtgacc acttcgacgg caccgtggag    1380

gccggggaat gccgtttcct gcgcgtttga cgcgcgcaac cgcgaacatc atgacgtcag    1440

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt    1500

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa    1560

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt    1620

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt    1680

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt    1740

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg    1800

tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga    1860

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa    1920

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga    1980

caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa    2040

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca    2100

ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta    2160

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac    2220

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc    2280

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag    2340

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga    2400

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt    2460

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata    2520

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag    2580

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa    2640

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt    2700

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc    2760

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa    2820

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa    2880

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc    2940

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa    3000

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa    3060

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg    3120

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc    3180

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg    3240

ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg    3300

agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg    3360

aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc    3420

gcataaattc cgacaccatc gaatggtgca aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc    3480

cggaagagag tcaattcagg gtggtgaat                                      3509

<210>2

<211>2328

<212>DNA

<213>Human rotavirus

<400>2

atggcttcac tcatttatag acagcttctc actaattcat attcagtaga tttacatgat    60

gaaatagagc aaattggatc agaaaaaact caaaatgtaa ctataaatcc gagtccattt    120

gcacagacta gatatgctcc agtcaattgg ggtcatggag agataaatga ttcgactaca    180

gtagaaccaa tgttagatgg tccttatcag ccaactacat ttactccacc taatgattat    240

tggatactta ttaattcaaa tacaaatgga gtagtatatg aaagtacaaa taatagtgac    300

ttttggactg cagtcgttgc tattgaaccg cacgttaacc cagtagatag acaatatacg    360

atatttggtg aaagtaagca atttaatgtg agtaacgatt caaataaatg gaagttttta    420

gaaatgttta gaagcagtag tcaaaatgaa ttttataata gacgtacatt aacttctgat    480

actagatttg taggaatatt gaaatatggt ggaagagtat ggacatttca tggtgaaaca    540

ccaagagcta ctactgacag ttcaagtact gcaaatttaa ataatatatc aattacaatt    600

cattcagaat tttacattat tccaaggtcc caagaatcta aatgtaatga atatattaat    660

aatggtctgc caccaattca aaatactaga aatgtagttc cattgccatt atcatctaga    720

tcgatacagt ataagagagc acaagttaat gaagacatta tagtttcaaa aacttcatta    780

tggaaagaaa tgcagtataa tagggatatt ataattagat ttaaatttgg taatagtatt    840

gtaaaaatgg gaggactagg ttataaatgg tctgaaatat catataaggc agcaaattat    900

caatataatt acttacgtga cggtgaacaa gtaaccgcac acaccacttg ttcagtaaat    960

ggagtgaaca attttagcta taatggaggg tttctaccca ctgattttgg tatttcaagg    1020

tatgaagtta ttaaagagaa ttcctatgta tatgtagact attgggatga ttcaaaagca    1080

tttagaaata tggtatatgt tagatcatta gcagctaatt tgaattcagt gaaatgtaca    1140

ggtggaagtt ataattttag tataccagta ggtgcatggc cagtaatgaa tggtggcgct    1200

gtttcgttgc attttgccgg agttacatta tccacgcaat ttactgattt tgtatcattg    1260

aattcactac gatttagatt tagtttgaca gttgatgaac cacctttctc aatattgaga    1320

acacgtacag tgaatttgta cggattacca gccgctaatc caaataatgg aaatgaatac    1380

tacgaaatat caggaaggtt ttcactcatt tatttagttc caactaatga tgattatcag    1440

actccaatta tgaattcagt gacagtaaga caagatttag agcgccaact tactgatttg    1500

cgagaagaat ttaactcatt gtcacaagaa atagctatgg cacaattgat tgatttagca    1560

ctgttgcctc tagatatgtt ttccatgttt tcaggaatta aaagtacaat tgatttaact    1620

aaatcaatgg cgactagtgt aatgaagaaa tttagaaaat caaaattagc tacatcaatt    1680

tcagaaatga ctaattcatt gtcagatgct gcttcatcag catcaagaaa cgtttctatt    1740

agatcgaatt tatctgcgat ctcaaattgg actaatgttt caaatgatgt gtcaaacgta    1800

actaattcat tgaacgatat ttcaacacaa acgtctacaa ttagtaagaa atttagatta    1860

aaagaaatga ttactcaaac tgaaggaatg agctttgacg acatttcagc agctgtacta    1920

aaaacaaaaa tagatatgtc tactcaaatt ggaaaaaata ctttacctga catagttaca    1980

gaggcatctg agaaatttat tccaaaacga tcatatcgaa tattaaagga tgatgaagta    2040

atggaaatta atactgaagg aaaattcttt gcatacaaaa ttaatacatt tgatgaagtg    2100

ccattcgatg taaataaatt cgctgaacta gtaacagatt ctccagttat atcagcgata    2160

atcgatttta agacattgaa aaatttaaat gataattatg gaatcactcg tacagaagcg    2220

ttaaatttaa ttaaatcgaa tccaaatatg ttgcgtaatt tcattaatca aaataatcca    2280

attataagga atagaattga acagttaata ctacaatgta aattgtga                 2328

<210>3

<211>5825

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>3

ccgcggtaaa acgacggcca gttaaaataa acagcatacg ttcgcaatag tgcaaacgct    60

atcaaagaag atgaaccccc gttaaaggga ttgaagaaaa ggaataaagg agccggatcc    120

atggcttcac tcatttatag acagcttctc actaattcat attcagtaga tttacatgat    180

gaaatagagc aaattggatc agaaaaaact caaaatgtaa ctataaatcc gagtccattt    240

gcacagacta gatatgctcc agtcaattgg ggtcatggag agataaatga ttcgactaca    300

gtagaaccaa tgttagatgg tccttatcag ccaactacat ttactccacc taatgattat    360

tggatactta ttaattcaaa tacaaatgga gtagtatatg aaagtacaaa taatagtgac    420

ttttggactg cagtcgttgc tattgaaccg cacgttaacc cagtagatag acaatatacg    480

atatttggtg aaagtaagca atttaatgtg agtaacgatt caaataaatg gaagttttta    540

gaaatgttta gaagcagtag tcaaaatgaa ttttataata gacgtacatt aacttctgat    600

actagatttg taggaatatt gaaatatggt ggaagagtat ggacatttca tggtgaaaca    660

ccaagagcta ctactgacag ttcaagtact gcaaatttaa ataatatatc aattacaatt    720

cattcagaat tttacattat tccaaggtcc caagaatcta aatgtaatga atatattaat    780

aatggtctgc caccaattca aaatactaga aatgtagttc cattgccatt atcatctaga    840

tcgatacagt ataagagagc acaagttaat gaagacatta tagtttcaaa aacttcatta    900

tggaaagaaa tgcagtataa tagggatatt ataattagat ttaaatttgg taatagtatt    960

gtaaaaatgg gaggactagg ttataaatgg tctgaaatat catataaggc agcaaattat    1020

caatataatt acttacgtga cggtgaacaa gtaaccgcac acaccacttg ttcagtaaat    1080

ggagtgaaca attttagcta taatggaggg tttctaccca ctgattttgg tatttcaagg    1140

tatgaagtta ttaaagagaa ttcctatgta tatgtagact attgggatga ttcaaaagca    1200

tttagaaata tggtatatgt tagatcatta gcagctaatt tgaattcagt gaaatgtaca    1260

ggtggaagtt ataattttag tataccagta ggtgcatggc cagtaatgaa tggtggcgct    1320

gtttcgttgc attttgccgg agttacatta tccacgcaat ttactgattt tgtatcattg    1380

aattcactac gatttagatt tagtttgaca gttgatgaac cacctttctc aatattgaga    1440

acacgtacag tgaatttgta cggattacca gccgctaatc caaataatgg aaatgaatac    1500

tacgaaatat caggaaggtt ttcactcatt tatttagttc caactaatga tgattatcag    1560

actccaatta tgaattcagt gacagtaaga caagatttag agcgccaact tactgatttg    1620

cgagaagaat ttaactcatt gtcacaagaa atagctatgg cacaattgat tgatttagca    1680

ctgttgcctc tagatatgtt ttccatgttt tcaggaatta aaagtacaat tgatttaact    1740

aaatcaatgg cgactagtgt aatgaagaaa tttagaaaat caaaattagc tacatcaatt    1800

tcagaaatga ctaattcatt gtcagatgct gcttcatcag catcaagaaa cgtttctatt    1860

agatcgaatt tatctgcgat ctcaaattgg actaatgttt caaatgatgt gtcaaacgta    1920

actaattcat tgaacgatat ttcaacacaa acgtctacaa ttagtaagaa atttagatta    1980

aaagaaatga ttactcaaac tgaaggaatg agctttgacg acatttcagc agctgtacta    2040

aaaacaaaaa tagatatgtc tactcaaatt ggaaaaaata ctttacctga catagttaca    2100

gaggcatctg agaaatttat tccaaaacga tcatatcgaa tattaaagga tgatgaagta    2160

atggaaatta atactgaagg aaaattcttt gcatacaaaa ttaatacatt tgatgaagtg    2220

ccattcgatg taaataaatt cgctgaacta gtaacagatt ctccagttat atcagcgata    2280

atcgatttta agacattgaa aaatttaaat gataattatg gaatcactcg tacagaagcg    2340

ttaaatttaa ttaaatcgaa tccaaatatg ttgcgtaatt tcattaatca aaataatcca    2400

attataagga atagaattga acagttaata ctacaatgta aattgtgagt cgactcgagc    2460

ggccgcatcg tgactgactg acgatctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc    2520

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca    2580

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc    2640

agtcacgtag cgatagcgga gtgtataatt cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc    2700

tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcgtac ttagtacaaa    2760

aggggagcga acttagtaca aaaggggagc gaacttagta caaaagggga gcgaacttag    2820

tacaaaaggg gagcgaactt agtaaataaa taaactttgt actagtatgg agtcatgtcc    2880

aatgagatcg tgaagttcag caaccagttc aacaacgtcg cgctgaagaa gttcgacgcc    2940

gtgcacctgg acgtgctcat ggcgatcgct tcaagggtga gggagaaggg cacggccacg    3000

gtggagttct cgttcgagga gctgcgcggc ctcatgcgat tgaggaagaa cctgaccaac    3060

aagcagctgg ccgacaagat cgtgcagacg aacgcgcgcc tgctggcgct gaactacatg    3120

ttcgaggatt cgggcaagat catccagttc gcgctgttca cgaagttcgt caccgacccg    3180

caggaggcga ctctcgcggt tggggtcaac gaggagttcg cgttcctgct caacgacctg    3240

accagccagt tcacgcgctt cgagctggcc gagttcgccg acctcaagag caagtacgcc    3300

aaggagttct acaggcgcgc caagcagtac cgcagctcgg gaatctggaa gatcagccgc    3360

gatgagttct gccgactgct tggcgtatcc gattccacgg caaaatccac cgccaacctg    3420

aacagggtcg tgctgaagac gatcgccgaa gagtgtgggc ctctccttgg cctgaagatc    3480

gagcgccagt acgtgaaacg caggctgtcg ggcttcgtgt tcacgttcgc ccgcgagacc    3540

cctccggtga tcgacgccag gcccgtggag gcgaggaaga cggacggcga cggcaagggc    3600

cattggacga gcgtggcggg gtacggcgag gtgttcacga ccacggagct gttcgacgtg    3660

acggccgcgc gtgaccactt cgacggcacc gtggaggccg gggaatgccg tttcctgcgc    3720

gtttgacgcg cgcaaccgcg aacatcatga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc    3780

gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac    3840

aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt    3900

tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag    3960

aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg    4020

aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa    4080

tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc    4140

aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag    4200

tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa    4260

ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc    4320

taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg    4380

agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgca gcaatggcaa    4440

caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa    4500

tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg    4560

gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag    4620

cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg    4680

caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt    4740

ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt    4800

aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac    4860

gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag    4920

atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg    4980

tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca    5040

gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga    5100

actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca    5160

gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc    5220

agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca    5280

ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa    5340

aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc    5400

cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc    5460

gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg    5520

cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat    5580

cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca    5640

gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt    5700

attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat aaattccgac accatcgaat    5760

ggtgcaaaac ctttcgcggt atggcatgat agcgcccgga agagagtcaa ttcagggtgg    5820

tgaat                                                                5825

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>4

attaggatcc ccgaattccc g                                              21

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>5

tcgaccgcgg attcaccacc ctgaattgac                                     30

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>6

taaaacgacg gccagt                                                    16

<210>7

<211>92

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>7

taaaataaac agcatacgtt cgcaatagtg caaacgctat caaagaagat gaacccccgt    60

taaagggatt gaagaaaagg aataaaggag cc                                  92

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>8

tcgaccgcgg taaaacgacg gccagt                                         26

<210>9

<211>127

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>9

tcgaccgcgg taaaacgacg gccagttaaa ataaacagca tacgttcgca atagtgcaaa    60

cgctatcaaa gaagatgaac ccccgttaaa gggattgaag aaaaggaata aaggagccgg    120

atccatc                                                              127

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>10

gcgacgtcgt acttagtaca aaagggga                                       28

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>11

gcgacgtcat gatgttcgcg gttgcg                                         26

<210>12

<211>1020

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>第5～1018位碱基序列为载入本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的序列

<400>12

ggccgacgtc gtacttagta caaaagggga gcgaacttag tacaaaaggg gagcgaactt    60

agtacaaaag gggagcgaac ttagtacaaa aggggagcga acttagtaaa taaataaact    120

ttgtactagt atggagtcat gtccaatgag atcgtgaagt tcagcaacca gttcaacaac    180

gtcgcgctga agaagttcga cgccgtgcac ctggacgtgc tcatggcgat cgcttcaagg    240

gtgagggaga agggcacggc cacggtggag ttctcgttcg aggagctgcg cggcctcatg    300

cgattgagga agaacctgac caacaagcag ctggccgaca agatcgtgca gacgaacgcg    360

cgcctgctgg cgctgaacta catgttcgag gattcgggca agatcatcca gttcgcgctg    420

ttcacgaagt tcgtcaccga cccgcaggag gcgactctcg cggttggggt caacgaggag    480

ttcgcgttcc tgctcaacga cctgaccagc cagttcacgc gcttcgagct ggccgagttc    540

gccgacctca agagcaagta cgccaaggag ttctacaggc gcgccaagca gtaccgcagc    600

tcgggaatct ggaagatcag ccgcgatgag ttctgccgac tgcttggcgt atccgattcc    660

acggcaaaat ccaccgccaa cctgaacagg gtcgtgctga agacgatcgc cgaagagtgt    720

gggcctctcc ttggcctgaa gatcgagcgc cagtacgtga aacgcaggct gtcgggcttc    780

gtgttcacgt tcgcccgcga gacccctccg gtgatcgacg ccaggcccgt ggaggcgagg    840

aagacggacg gcgacggcaa gggccattgg acgagcgtgg cggggtacgg cgaggtgttc    900

acgaccacgg agctgttcga cgtgacggcc gcgcgtgacc acttcgacgg caccgtggag    960

gccggggaat gccgtttcct gcgcgtttga cgcgcgcaac cgcgaacatc atgacgtcgc    1020

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>13

ggatccggct ataaaatggc ttcact                                         26

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>14

gtcgaccaca tcctcaatag cgttct                                         26

Claims (6)

1.一种重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体，其特征在于：在双歧杆菌表达载体的多克隆位点上连接有人A组轮状病毒的病毒蛋白VP4的编码基因序列，其核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示。

2.含有权利要求1所述的重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体的宿主细胞。

3.根据权利要求2所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)。

4.权利要求1所述的重组双歧杆菌hRV-VP4表达载体或权利要求2所述的宿主细胞在制备预防或治疗人A组轮状病毒引起的疾病的口服疫苗粘膜免疫佐剂或口服疫苗中的用途。

5.一种预防或治疗人A组轮状病毒引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂，其特征在于：是由权利要求2或3所述的宿主细胞添加药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的。

6.根据权利要求5所述的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂，其特征在于：所述的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂的剂型为口服液、口服溶液、片剂或胶囊剂。

Images