CN101215571A - 嗜热脂肪酶基因、工程菌和嗜热脂肪酶及应用 - Google Patents
嗜热脂肪酶基因、工程菌和嗜热脂肪酶及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101215571A CN101215571A CNA2008100502500A CN200810050250A CN101215571A CN 101215571 A CN101215571 A CN 101215571A CN A2008100502500 A CNA2008100502500 A CN A2008100502500A CN 200810050250 A CN200810050250 A CN 200810050250A CN 101215571 A CN101215571 A CN 101215571A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lipase
- thermophilic
- enzyme
- gene
- thermophile
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种来源于超嗜热细菌Fervidobacterium changbaicum CBS－1的嗜热脂肪酶基因、由该基因重组载体在常温宿主中表达的嗜热脂肪工程菌，利用该工程菌构建的嗜热脂肪酶及该嗜热脂肪酶在生物化工、生物柴油、油脂加工、工具酶等领域中的广泛应用。本发明所得嗜热脂肪酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，嗜热脂肪酶具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，嗜热脂肪工程菌于2007年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2195，分类命名大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种来源于超嗜热细菌Fervidobacterium changbaicum CBS-1的嗜热脂肪酶基因、由该基因重组载体在常温宿主中表达的嗜热脂肪工程菌，以及利用该工程菌构建的嗜热脂肪酶及该嗜热脂肪酶在工业中的应用。
背景技术
生物催化技术的深入研究与广泛应用，是继生物制药和生物科技农业之后，生物技术发展的“第三次浪潮”和重要支柱，这一技术的核心就是生物催化剂的开发。而酶作为生物催化剂已经广泛应用于化工、食品、医药、轻工业等领域。但是工业生产所需的苛刻条件和酶稳定性之间的矛盾，长久以一直在制约着酶技术的发展和应用。近些年来随着人们对极端环境和微生物的深入研究，发现来源于超嗜热微生物的嗜热酶在高温下显示了良好的热稳定性和活性。因此，嗜热酶的研究开发与应用可以很大程度的缓解现代工业中的苛刻反应条件和酶稳定性之间的矛盾。嗜热酶将在现代工业技术领域呈现巨大的应用潜力，将会大大推动生物技术产业的快速发展。自1985年第一种嗜热酶即TaqDNA聚合酶被成功地用于聚合酶链式反应(PCR)后，生长在特殊高热环境下的微生物正日益引起人们的重视。在美国、日本、德国等地有20多个研究课题组正活跃于寻找嗜极菌及极端酶。近些年来，许多水解酶类的嗜热酶相继得到了开发，并在许多领域发挥了重要作用。嗜热酶不仅具有化学催化剂无法比拟的优点，如催化效率高和底物专一性强，而且酶的稳定性极好。它可以克服中温酶(mesophilic enzyme，20-55℃)及低温酶(psychrophilic enzyme，-2-20℃)在应用过程中常常出现的生物学性质不稳定的现象，从而使很多高温化学反应得以实现，这将极大地促进生物技术产业的发展，带动技术水平和生活质量的提高。
利用嗜热酶作为生物催化剂有如下优点：(1)酶制剂的制备成本降低。因为嗜热酶的稳定性高，因而可以在室温下分离提纯和包装运输，并且能长久地保持活性；(2)加快动力学反应。随着反应温度的提高，分子运动速度加快，酶催化能力加强；(3)减少了能耗。因为在高温情况下反应，因此对反应器冷却系统的要求标准降低；(4)提高了产物的纯度。在嗜热酶催化反应条件下(超过70℃)，很少有杂菌生存，从而减少了细菌代谢物对最终产物的污染。由于嗜热酶的高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，使它在食品、医药、制革、石油开采及废物处理等方面都有广泛的应用潜力。
脂肪酶(lipase，E.C.3.1.1.3)全称为三酰基甘油酯水解酶(triacylglycerolacylhydrolase)，是指能在油水界面上水解脂肪的酶。脂肪酶催化三酰基甘油酯反应式：
因为脂肪酶在工农及医药等很多方面有十分重要的作用，脂肪酶基因的研究引起人们的关注，迄今为止，人们已经对多种脂肪酶的基因进行了克隆和研究。但不同菌属细菌的脂肪酶基因差别很大。即使同一属各种之间的同源性也很差。目前研究结果表明，脂肪酶是一种丝氨酸酶类，其发挥生物活性需要通过Ser，Asp和His或Ser，Glu和His组成的三联体电子中继网来完成。除此之外，有些种类的脂肪酶还需要一个额外的Ala的存在才能发挥高催化活性。虽然脂肪酶蛋白的氨基酸序列总体的同源性不高，但底物结合部位的氨基酸序列的同源性较高，绝大多数已知序列的脂肪酶蛋白均含有Gly-Xxx-Ser-Gly这样一小段保守序列，而有的如枯草杆菌的脂肪酶含有Ala-Xxx-Ser-Xxx-Gly这样一段序列。第一个Xxx为His或Gly，第二个Xxx为Met、Glu、Leu或是Ala。同时这五个氨基酸附近的十个氨基酸具有较高的同源性。
迄今为止，绝大多数脂肪酶都来源于常温微生物或一般嗜热微生物，很多脂肪酶尽管具有较好的催化活性，但是却无法适应工业上较高温度的反应体系，而来源于超嗜热微生物的脂肪酶具有良好的热稳定性和高温发挥催化活性的特性，因此，嗜热脂肪酶的开发研究具有非常好的工业应用前景。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有酯水解功能的嗜热脂肪酶基因；
本发明的另一个目的是利用上述嗜热脂肪酶基因通过生物工程技术构建一种嗜热脂肪酶工程菌；
本发明的再一个目的是利用上述嗜热脂肪酶工程菌制备一种稳定性好、耐热性强、催化效率高的嗜热脂肪酶；
本发明的最后一个目的是通过对嗜热脂肪酶的理化性质的研究，提供嗜热脂肪酶在工业生产中的多种用途。
超嗜热细菌Fervidobacterium changbaicum CBS-1来源于中国长白山温泉水的沉积物，最适生长温度为75～80℃。在前期工作中我们发现该菌在胞内和胞外所表达的蛋白都具有酯水解的活力，因此推断该菌的基因组中含有多个具有酯水解功能的基因。但是，由于超嗜热细菌属于高温厌氧型细菌，生长条件苛刻，人工培养困难，生长周期相对较长，而且其菌体密度低(OD600≤1.0)，表达的嗜热脂肪酶含量非常低，因此从成本上来讲直接利用超嗜热细菌培养物来生产嗜热脂肪酶是不可行的。然而，将嗜热脂肪酶基因转入可快速繁殖、培养条件简单的常温宿主如大肠杆菌内，能够有效地解决上述问题。
对来源于中国长白山温泉的超嗜热细菌Fervidobacterium changbaicumCBS-1通过菌体培养、目的基因钓取，则得到本发明所述的嗜热脂肪酶基因，我们委托宝上海生工生物技术有限公司进行基因测序，测序结果如图2所示，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
将本发明的嗜热脂肪酶基因与表达载体重组，形成重组表达载体，本发明不限于特定的表达载体(pET-11a，pET-28a或pET-20b等系列pET表达载体)，优选的表达载体采用真核或原核表达载体，进一步优选的为pET-15b表达载体。
上述重组表达载体可按生物学常规方法导入适宜的宿主细胞，适宜的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用E.coli BL21(DE3)codon plus(BLp，购买于Stratagene公司)菌株或E.coli BL21(DE3)菌株。
我们将上述嗜热脂肪酶基因装载在pET表达系统载体上，然后转入到大肠杆菌宿主中，得到一株工程菌FCL1。该工程菌菌株已于2007年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCC No.2195。分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
工程菌表达产物分为细胞可溶性蛋白和细胞膜结合蛋白两部分。有以下两种处理方法：一、通过细胞超声破碎和加热失活大肠杆菌杂蛋白即可分离纯化得到细胞可溶性嗜热蛋白，再以0.2％脱氧胆酸钠(DOC)溶解超声破碎后细胞碎片和加热失活大肠杆菌杂蛋白即可得到与膜结合的嗜热蛋白；二、通过大肠杆菌直接热破碎的方法释放嗜热蛋白，可以得到50％以上纯度的嗜热蛋白。在本专利工程菌发酵的后处理中，我们推荐第二种方法，操作简单可节约成本。
应用大肠杆菌工程菌(FCL1)表达的嗜热蛋白经活性实验鉴定，它具有水解系列甘油三酯和单酯活力，而且还具有催化聚酯合成和酯交换等多种脂肪酶相关的反应。该嗜热蛋白即为本发明所述的嗜热脂肪酶，它是首例报道的来自超嗜热微生物的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。相比一般来源的脂肪酶，它具有非常明显的稳定性优势，60℃保温48小时仍然保持90％以上活力，70℃的半衰期为8.5小时，而一般脂肪酶在70℃中的半衰期都小于2小时；另外该嗜热脂肪酶能在高温下(70～85℃)催化反应，运用到生产中，有储运成本低、加快动力学反应、对反应器冷却系统要求标准低等优点。
以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)。
本发明的嗜热脂肪酶催化反应所利用的底物范围不局限于任何指定的酯类和脂肪类、有机酸和醇类等物质，只要能参与酯水解、酯合成、转酯反应发生的化学物质都可以。在一优选实施方案中，本发明使用对硝基苯酚脂肪酸酯和三甘油脂肪酸酯作为底物，进一步优选的底物为对硝基苯酚癸酸酯和十二烷酸甘油三酯。
附图说明
图1：嗜热脂肪酶基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2：嗜热脂肪酶基因测序图谱；
图3：重组表达载体构建示意图；
图4：纯化得到的嗜热脂肪酶的SDS-PAG电泳图谱；
图5：嗜热脂肪酶的温度-活力曲线；
图6：嗜热脂肪酶的pH-活力曲线；
图7：嗜热脂肪酶的温度曲线；
图8：嗜热脂肪酶的8pH稳定性曲线。
如图1所示，左道为DNA分子Marker DL2000，右道为嗜热脂肪酶基因的PCR扩增产物，右道在分子量950bp处有明显亮带，与预期的分子量945bp相符，所以我们通过PCR方法所钓取的基因即为本专利所述嗜热脂肪酶基因。
如图2所示，此图为上海生工生物技术有限公司提供的嗜热脂肪酶基因的测序文件，图(a)为下游测序结果，图(b)为上游测序结果，测序时上游和下游各测一个反应(约600bp)，进一步可以用Gene-man软件组装得到全长的嗜热脂肪酶基因(945bp)。
如图3所示，将pET-15b载体(A)和嗜热脂肪酶基因的PCR产物(B)都用限制性内切酶Nde I，BamH I进行双酶切(载体另需去磷酸化)，然后在16℃应用T4DNA连接酶来连接己酶切的脂肪酶基因片段和载体片段，即得到含有嗜热脂肪酶基因的重组载体(C)。
如图4所示，从左往右依次：NI亲和层析所得的纯酶、蛋白质分子量Marker和热破碎粗酶。
具体实施方式
实施例1：嗜热脂肪酶工程菌的构建及其酶的表达
(1)超嗜热细菌Fervidobacterium changbaicum CBS-1的培养及其染色体DNA的提取。
每升Fervidobacterium changbaicum CBS-1的培养基组成成分如下：(NH4)2SO4，1.3g；KH2PO4，0.28g；MgSO4·7H2O，0.25g；CaCl2，0.07g；FeSO4·7H2O，0.028g；MnCl2，1.8mg；Na2B4O7，4.5mg；ZnSO4·7H2O，0.22mg；CuSO4·2H2O，0.05mg；NaMoO4·2H2O，0.03mg；CoCl2，0.01mg；酵母抽提物，1g；蛋白胨，2g；0.1％(v/v)刃天青(resazurin)。
培养基高温高压灭菌后分装，每100ml培养基中注射加入0.5ml已灭菌的10％Na2S(营养盐)溶液。
Fervidobacterium changbaicum CBS-1(菌种保藏号DSM17883，JCM13353)的干细胞加入1ml上述培养基，重悬后转移至装有10mL新鲜上述培养基的培养管中，稍微旋转培养管以混匀；通入氮气3分钟以除尽培养管内的氧气，之后置于高温培养箱中80℃静止培养2天。然后转移至装有100ml上述培养基的厌氧培养瓶中80℃静止培养2天，8000rpm离心20分钟收集上述嗜热菌体，-40℃保存菌体备用。
取0.2g上述收集的菌体，用200μL的25mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0，含50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA)重悬菌体，加入50μl的50mg/ml溶菌酶，4℃消化1小时；加入50μl的SDS溶液(终浓度为2％)反应10分钟；加入与上述溶液等体积(300μl)的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，上下颠倒充分混匀，12000rpm离心5分钟，将上清液转移到另一支离心管中；向上清中加入2倍体积的无水乙醇，沉淀菌体DNA，12000rpm离心5分钟，倒去上清后，用70％的乙醇洗涤DNA，再用95％乙醇洗涤DNA后37℃放置5分钟以除尽乙醇；最后用100ul pH8.0的1 ×TE溶液重新溶解，取5ul溶液用0.8％的琼脂糖核酸凝胶电泳鉴定所得染色体DNA的浓度和大小，在分子量20Kb左右有一条亮带，为所得的染色体DNA，即本专利所述的嗜热脂肪酶基因的PCR扩增模板，-20℃冰箱中备用。
(2)引物设计及用PCR法钓取酶的基因制备重组载体
本专利所述的嗜热脂肪酶基因通过PCR方法从步骤(1)所得染色体DNA中扩增而得到。两个引物是根据该基因的序列及表达载体的多酶切位点而设计的，委托上海生工生物技术有限公司合成。
上游引物：GCACTACATATGTCAAGAATAGTAGAGTATG，划线部分为NdeI位点；
下游引物：AGTCTAGGATCCTCACTCCAGAATATCGATGAG，划线部分为BamH I位点。
两个引物所设置的酶切位点与表达载体pET15b的NdeI和BamHI相匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。
PCR反应：在100μl反应体系中含1μl Ex-Taq DNA聚合酶，10μl Ex-Taq DNA聚合酶缓冲液，1.5μl dNTP混合物(每种核苷酸浓度25nmol/L)，4μl染色体DNA，1μl上游引物，1μl下游引物，81.5μl超纯水。每循环中94℃变性0.5分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，最后一次循环延至10min，共35个循环。用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分子量与预期的(945bp)一致，如图1所示。
使用PCR产物纯化试剂盒(Bay Gene公司生产的PCR Clean-up Kit，步骤如下：向PCR溶液中加入三倍体积的Buffer PCR-A，混匀；将上述溶液加入到DNA-prep柱子中，12000rpm离心30秒；向DNA-prep柱子中加入500μlBufferW2，12000rpm离心1分钟，再重复一次；把DNA-prep柱子转移到干净的1.5mlmicrofuge tube，加入30μl灭菌的去离子水，室温放置一分钟后12000rpm离心1分钟即得到纯化的PCR产物)对扩增产物进行纯化，-20℃保存备用。
将纯化的PCR产物用限制性内切酶BamH I酶切(20ul反应体系：10ul上述PCR产物，5ul去离子水，2ul 10×K缓冲液，1ul BamH I酶)，37℃下保温1小时后，直接加入1μl Nde I，再在37℃下保温1小时。酶切完毕，在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，应用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的DNA片段。1.0％的琼脂糖核酸凝胶电泳检测凝胶回收的DNA片段大小约950bp，与目的DNA片段945bp大小相符，说明所得DNA为目的DNA。
将pET-15b载体(大肠杆菌表达载体，含有T7强启动子、N-末端组氨酸标签以及氨苄青霉素抗性基因等)用限制性内切酶BamH I酶切(20ul反应体系：10ulpET-15b载体，5ul去离子水，2ul 10×K缓冲液，1ul BamH I酶)，37℃下保温1小时后，直接加入1μl Nde I，再在37℃下保温1小时。酶切完毕，再用碱性去磷酸化酶(CIAP)处理，在0.8％琼脂糖凝胶中检测线性载体并提纯酶切后的载体。在16℃应用T4DNA连接酶来连接己酶切的脂肪酶基因片段和载体片段，得重组载体。
将重组载体转入E.coli BL21(DE3)Codon Plus中，用含氨苄青霉素的琼脂糖平板进行单克隆菌株的筛选和鉴定。从菌落中提取重组子，用限制性内切酶NdeI和BamH I作用重组子质粒，得到不同大小两个片段，其分别与脂肪酶基因(945bp)和pET15b/NdeI+BamHI酶切(约5700bp)的片段大小一致，表明挑取的重组子为阳性转化菌，重组载体的构建过程如图3所示。
(3)重组载体在宿主细菌中的表达
重组载体可转化到E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21(DE3)Codon Plus等宿主细胞中，都能高效表达嗜热脂肪酶，其中在E.coli BL21(DE3)Codon Plus中表达的嗜热脂肪酶含量较高。大肠杆菌感受态细胞制备及其载体转化方法参照“分子克隆实验指南”一书。挑取步骤2中已经鉴定的阳性转化菌，置5ml含氨苄青霉素的2YT培养液(含1.6％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母抽提物和0.5％(w/v)NaCl)中37℃振荡培养过夜，次日接种到100ml新鲜2YT培养基中，37℃继续培养4h。将初步放大的种子液以1％(v/v)的比例接入2L的2YT培养液中，在空气摇床震荡培养(37℃，120rpm/min)。待菌体生长到OD600为0.6～1.0时，加入100mM的异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，降低培养温度至27℃，对菌体进行诱导使其产生大量目的蛋白，培养10-12小时后收获菌体，得到本发明所述工程菌。该工程菌菌株已于2007年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.2195。分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
本发明提供的CGMCC No.2195菌株的特征如下：
1.菌体形态特征：菌体为短杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢。
2.培养特征：菌落为白色，有明显突起，边缘整齐。液体培养可以在普通摇床中进行，发酵液浑浊，液面不产生膜。
3.生理生化特征：生长pH值为5.0～9.0；生长温度为10～42℃。可利用葡糖糖，麦芽糖，乳糖，甘露糖，山梨醇，甘露醇，玉米浆等糖醇类物质作为唯一碳源。
4.菌株培养条件：平板培养需在含1.5％琼脂糖的2YT培养基，液体培养可以在普通摇床中进行，最适培养温度37℃，最适pH 7.0。
5.培养基：
固体纯化培养基：2YT琼脂培养基，包括蛋白胨16.0g，酵母抽提物10.0g，NaCl 5.0g，15g琼脂糖，蒸馏水1000mL。
液体增殖培养基：2YT培养基，包括蛋白胨16.0g，酵母抽提物10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL。
根据“伯杰系统细菌学手册”(Bergy’s Manual of Systematic Bacteriology)第八版提供的鉴定方法和上述试验结果表明，上述菌株仍属大肠埃希氏种。
把菌体于-40℃冷冻1小时，融化，加入菌体6倍体积的50mM磷酸缓冲液(pH8.0)，重悬混匀；将菌液于70℃加热处理20分钟，离心除去变性的大肠杆菌杂蛋白(12000rpm，20min)，收集上清得重组酶的粗酶液。
因为重组嗜热酶N-末端含有His-Tag，应用镍亲和柱(Ni-Chelating Column)对重组蛋白进行分离，用100mM咪唑洗脱与层析柱结合得到纯的嗜热酶。应用SDS-PAGE(10％)电泳检测重组蛋白的纯度，可见在33000Da附近可见一电泳条带，结果如图4所示。
实施例2：重组嗜热脂肪酶的特性
(1)最适反应温度
反应温度是影响酶催化活力的重要因素。一般而言，嗜热脂肪酶在高温下的反应活力远远高于低温，但是在最适温度附近的稳定性却大大地降低，对本专利所述嗜热脂肪酶的催化活力检测的温度范围为20～90℃。
以对硝基苯酚辛酸酯作为反应底物，在20～90℃的温度范围内测定脂肪酶活力，以酶活的相对活力对温度作图。由图5可见，其活力在20～78℃温度范围内随温度的升高而提高，在78℃以上，活力下降，最适温度为78℃。
酶活性的检测：以对硝基苯酚辛酸酯作为脂肪酶水解底物，反应体系为1ml，缓冲体系为50mM磷酸缓冲液(pH8.0)，对硝基苯酚辛酸酯的终浓度为0.2mM，加入5ul 0.1mg/ml的酶，78℃测定1分钟内OD405的增加值，求出直线的斜率，即为酶的活力。1个酶活力单位定义为1分钟水解底物生成1μmol对硝基苯酚(ε＝0.016μM-1.cm-1)所需要的酶量。
(2)最适pH
环境pH值会影响酶分子中带电氨基酸的解离状态和酶的构象，进而影响酶的催化活力。酶的最适pH是在宽范围pH缓冲液体系中测定，其成分如下：乙酸、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、3-环己胺基丙磺酸(CAPS)和2-码啉乙磺酸(MES)。在78℃条件下精确配制100mM不同pH的缓冲液，以对硝基苯酚辛酸酯作为底物，在78℃下测定嗜热酶在pH 5.5-10范围内的活力，以酶活的相对活力对pH作图。实验结果如图6所示，在pH值7.0至8.5之间能够有效地催化对硝基苯酚辛酸酯的水解，且表明本专利所述的嗜热脂肪酶最适pH为8.0。
(3)底物特异性
称取各种对硝基苯酚脂肪酸酯，将它们分别溶于乙腈配成10mmol/L的底物溶液，参照(1)所述脂肪酶测定条件进行酶活力测定。
甘油三酯底物的测定方法如下：以4％的聚乙烯醇为乳化液，分别配制100mM的各种甘油三酯底物的溶液，在10ml反应体系中加入5ml乳化的底物溶液、4ml磷酸缓冲液(pH8.0)和1ml(浓度1.0mg/ml)酶液。70℃反应10分钟后，立即将反应液放入冰上并加入10ml乙醇终止反应，再加入100ul 0.1％酚酞溶液作为指示剂，以已标定的50Mm NaOH滴定到微红为止，记录消耗的NaOH体积，根据公式计算得出脂肪酶的活力。1个酶活力单位定义为1分钟水解底物生成1μmol脂肪酸所需要的酶量。
由表1可知，嗜热脂肪酶对系列对硝基酯和甘油三酯都表现出不同程度的活力，相对偏嗜中长碳链的底物，以对硝基苯酚辛酸酯和十二烷酸甘油三酯作为底物是催化活力最高。因此可见，中长链的脂肪酸酯是酶的适宜底物。中长链的脂肪酸酯广泛存在于油脂及化工产品中，因此本发明所述酶在生物化工、生物柴油、油脂加工、工具酶等领域中具有广泛的应用。
表1.嗜热酶的底物特异性
| 底物 | 相对活力(％) |
| 对硝基苯酚己酸酯对硝基苯酚辛酸酯对硝基苯酚癸酸酯对硝基苯酚月桂酸酯对硝基苯酚肉豆蔻酸酯对硝基苯酚软脂酸酯对硝基苯酚硬脂酸酯丁酸三甘油酯己酸三甘油酯辛酸三甘油酯癸酸三甘油酯十二烷酸三甘油酯十四烷酸三甘油酯十六烷酸三甘油酯橄榄油 | 3.081.0329.421004.321.02--10.5715.6925.2059.3510019.5124.965.36 |
注：对硝基苯酯底物以对硝基苯酚月桂酸酯为100％，甘油三酯底物以十二烷酸三甘油酯为100％。
(4)温度及pH稳定性
将浓度为0.5mg/ml的纯酶液置于不同温度(60℃，70℃和75℃)下缓冲液(50mM pH8.0磷酸缓冲液)保温，测定不同保温时间的残余活力。结果如图7所示，表明该酶在60℃保温10小时后仍然保持100％活力，而且70℃的半衰期也达到8.5小时，而75℃保温3小时后活力基本消失。这说明该酶在70℃以下具有非常好的热稳定性。
将浓度为0.5mg/ml的纯酶液放置于50mM不同pH的宽范围缓冲液(乙酸、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、3-环己胺基丙磺酸(CAPS)和2-码啉乙磺酸(MES)中，在室温放置1小时，70℃测其残余活力。由图8可以看出，该酶在pH 5-10范围内稳定性较高，残余酶活力在80％以上。
本发明所公开的内容，相信本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。本领域研究人员在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。
附：本发明所涉及嗜热脂肪酶基因核苷酸序列表和由该基因表达的嗜热脂肪酶氨基酸序列表
(1)SEQ ID N0.1 嗜热脂肪酶基因核苷酸序列表
<110>吉林大学
<120>嗜热脂肪酶基因、工程菌和嗜热脂肪酶及应用
<160>2
<210>1
<211>945
<212>DNA
<213>真细菌(Anaerobic Hyper-thermophilic bacterium，Fervidobacterium changbaicum CBS-1)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(945)
<400>1
ATG GAG AAT AAT ACC TTC GTG AGC TTT CTC AAA GTT TTG TTA CTA GGA
Met Glu Asn Asn Thr Phe Val Ser Phe Leu Lys Val Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
ACG ATT GTG TTT TAC ATC TCA ACA CAC CTA TCA ACA TCA AGA ATA GTA
Thr Ile Val Phe Tyr Ile Ser Thr His Leu Ser Thr Ser Arg Ile Val
20 25 30
GAG TAT GTT TCA CAA GAT GCA AAA AAA CTC ACA ATC GAG GGA ATT CAA
Glu Tyr Val Ser Gln Asp Ala Lys Lys Leu Thr Ile Glu Gly Ile Gln
35 40 45
GTT GCT TAC AGA GAA TAC GGA AAA GGT AAC TTT GAA ACT ATA GTG TTC
Val Ala Tyr Arg Glu Tyr Gly Lys Gly Asn Phe Glu Thr Ile Val Phe
50 55 60
CTA CAT GGA TTC GCC GGT TCT TCT TAC GAT TGG AAG GTG CTA ATT GAT
Leu His Gly Phe Ala Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Lys Val Leu Ile Asp
65 70 75 80
GTG CTT TCG GAA AAT TAT CAC TGC ATA GCA TTT GAT ATA CCA CCA TTT
Val Ler Ser Glu Asn Tyr His Cys Ile Ala Phe Asp Ile Pro Pro Phe
85 90 95
GGT TTA TCT GAA AAG AAA AAC GAC TTT GAT TAT TCT GAC GAA TCG ATT
Gly Leu Ser Glu Lys Lys Asn Asp Phe Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Ile
100 105 110
GTA AGA CTC TTA ATA AAG TCT TTA GAT TCC CTG GGA ATA GAG CAA TTC
Val Arg Ler Ler Ile Lys Ser Ler Asp Ser Ler Gly Ile Glu Gln Phe
105 120 125
ACT CTC GTT GGT CAT TCG ATG GGT GGA TAC CTT TCA CTT GCG ATA GCA
Thr Leu Val Gly His Ser Met Gly Gly Tyr Leu Ser Leu Ala Ile Ala
130 135 140
AGC ATT ATT CCA AAA AGA GTG GAA AGG CTC ATT TTA TTT GAC GCT GCG
Ser Ile Ile Pro Lys Arg Val Glu Arg Ler Ile Leu Phe Asp Ala Ala
145 150 155 160
TAC GAT GTT AAC AGT GAA GAT TTA CAA AAC CCA GGC CCT CCG TTT AAG
Tyr Asp Vla Asn Ser Glu Asp Leu Gln Asn Pro Gly Pro Pro Phe Lys
165 170 175
CTA AAA GAC GAG CAC CTA CTT AAG TTT TAC CAA ATA TTT CTG GAT GTA
Leu Lys Asp Glu His Leu Leu Lys Phe Tyr Gln Ile Phe Leu Asp Vla
180 185 190
GGT TTG AAA ACC TAT CCG CTG TTC AAA TTC GTT TAC CGA AAT TCA TTA
Gly Leu Lys Thr Tyr Pro Leu Phe Lys Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu
195 200 205
GCA GAA GGT GAG ATT CTG AAT GCC GAA CAC TTC GAC TAC TTG TTT TCA
Ala Glu Gly Glu Ile Leu Asn Ala Glu His Phe Asp Tyr Leu Phe Ser
210 215 220
CAA AAT TAC TTT CTA CCT GCG GAA ATA CTC ATA AAG TTC ACA AAA GAC
Gln Asn Tyr Phe Leu Pro Ala Glu I1e Leu Ile Lys Phe Thr Lys Asp
225 230 235 240
AAA GCA GCA CAG AAA CCT TTA AAA ATT GAT CTT GAG GGT ATA ACC GCC
Lys Ala Ala Gln Lys Pro Leu Lys Ile Asp Leu Glu Gly Ile Thr Ala
245 250 255
AAA ACT CTT ATT ATT TAC GGT GAA AAA GAT CAG ATA ACC CCT CCG TCG
Lys Thr Leu Ile Ile Tyr Gly Glu Lys Asp Gln Ile Thr Pro Pro Ser
260 265 270
ATA GGT GAG TAT TTA TCC AAA TCA ATA AAG AAC TCG AAA TTT ATG TTG
Ile Gly Glu Tyr Leu Ser Lys Ser Ile Lys Asn Ser Lys Phe Met Leu
275 280 285
ATT CCA AAC GAA GGG CAC ATG CCT TTA TCA AAC AGA TTA GTT ATA GAA
Ile Pro Asn Glu Gly His Met Pro Leu Ser Ash Arg Leu Val Ile Glu
290 295 300
VTG GTC AGG AAA TTC CTC ATC GAT ATT CTG GAG TAG(945)
Leu Val Arg Lys Phe Leu Ile Asp Ile Leu Glu*
305 310 315
(2)SEQ ID NO.2嗜热脂肪酶氨基酸序列表
<210>2
<211>157
<212>PRT
<213>古生菌(Aerobic Hyper-thermophilic crenarchaeon，Aeropyrum pernix K1)
<400>2
Met Glu Asn Asn Thr Phe Val Ser Phe Leu Lys Val Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ile Val Phe Tyr Ile Ser Thr His Leu Ser Thr Ser Arg Ile Val
20 25 30
Glu Tyr Val Ser Gln Asp Ala Lys Lys Leu Thr Ile Glu Gly Ile Gln
35 40 45
Val Ala Tyr Arg Glu Tyr Gly Lys Gly Asn Phe Glu Thr Ile Val Phe
50 55 60
Leu His Gly Phe Ala Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Lys Val Leu Ile Asp
65 70 75 80
Val Ler Ser Glu Asn Tyr His Cys Ile Ala Phe Asp Ile Pro Pro Phe
85 90 95
Gly Leu Ser Glu Lys Lys Asn Asp Phe Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Ile
100 105 110
Val Arg Ler Ler Ile Lys Ser Ler Asp Ser Ler Gly Ile Glu Gln Phe
105 120 125
Thr Leu Val Gly His Ser Met Gly Gly Tyr Leu Ser Leu Ala Ile Ala
130 135 140
Ser Ile Ile Pro Lys Arg Val Glu Arg Ler Ile Leu Phe Asp Ala Ala
145 150 155 160
Tyr Asp Vla Asn Ser Glu Asp Leu Gln Asn Pro Gly Pro Pro Phe Lys
165 170 175
Leu Lys Asp Glu His Leu Leu Lys Phe Tyr Gln Ile Phe Leu Asp Vla
180 185 190
Gly Leu Lys Thr Tyr Pro Leu Phe Lys Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu
195 200 205
Ala Glu Gly Glu Ile Leu Asn Ala Glu His Phe Asp Tyr Leu Phe Ser
210 215 220
Gln Asn Tyr Phe Leu Pro Ala Glu Ile Leu Ile Lys Phe Thr Lys Asp
225 230 235 240
Lys Ala Ala Gln Lys Pro Leu Lys Ile Asp Leu Glu Gly Ile Thr Ala
245 250 255
Lys Thr Leu Ile Ile Tyr Gly Glu Lys Asp Gln Ile Thr Pro Pro Ser
260 265 270
Ile Gly Glu Tyr Leu Ser Lys Ser Ile Lys Asn Ser Lys Phe Met Leu
275 280 285
Ile Pro Asn Glu Gly His Met Pro Leu Ser Asn Arg Leu Val Ile Glu
290 295 300
Leu Val Arg Lys Phe Leu Ile Asp Ile Leu Glu *
305 310 315
Claims (8)
1.一种嗜热脂肪酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的嗜热脂肪酶基因，其特征在于：与表达载体pET-11a、pET-28a或pET-20b重组，构成重组表达载体。
3.如权利要求2所述的嗜热脂肪酶基因，其特征在于：表达载体为pET-15b。
4.如权利要求2或3所述的嗜热脂肪酶基因，其特征在于：重组表达载体导入E.coli BL21(DE3)codon plus宿主细胞或E.coli BL21(DE3)宿主细胞，得到嗜热工程菌。
5.如权利要求4所述的嗜热脂肪酶基因，其特征在于：宿主细胞为E.coliBL21(DE3)codon plus。
6.如权利要求5所述的嗜热脂肪酶基因，其特征在于：得到的嗜热工程菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，其于2007年10月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2195。
7.一种嗜热脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.权利要求7所述的嗜热脂肪酶在中长链的脂肪酸酯催化中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008100502500A CN101215571A (zh) | 2008-01-14 | 2008-01-14 | 嗜热脂肪酶基因、工程菌和嗜热脂肪酶及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008100502500A CN101215571A (zh) | 2008-01-14 | 2008-01-14 | 嗜热脂肪酶基因、工程菌和嗜热脂肪酶及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101215571A true CN101215571A (zh) | 2008-07-09 |
Family
ID=39622080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2008100502500A Pending CN101215571A (zh) | 2008-01-14 | 2008-01-14 | 嗜热脂肪酶基因、工程菌和嗜热脂肪酶及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101215571A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104745508A (zh) * | 2015-03-20 | 2015-07-01 | 常州大学 | 一种用嗜热细菌处理含油脂废水生产耐高温脂肪酶的培养基 |
| CN114317491A (zh) * | 2022-01-04 | 2022-04-12 | 西南科技大学 | 一种新型脂肪酶AjLip970及其应用 |
-
2008
- 2008-01-14 CN CNA2008100502500A patent/CN101215571A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104745508A (zh) * | 2015-03-20 | 2015-07-01 | 常州大学 | 一种用嗜热细菌处理含油脂废水生产耐高温脂肪酶的培养基 |
| CN114317491A (zh) * | 2022-01-04 | 2022-04-12 | 西南科技大学 | 一种新型脂肪酶AjLip970及其应用 |
| CN114317491B (zh) * | 2022-01-04 | 2023-05-23 | 西南科技大学 | 一种新型脂肪酶AjLip970及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102286441B (zh) | 一种低温酯酶及其编码基因与应用 | |
| CN102120971B (zh) | 一种普鲁兰酶产生菌及其所产生的耐热普鲁兰酶及编码基因 | |
| Lo et al. | Characterization and high-level production of xylanase from an indigenous cellulolytic bacterium Acinetobacter junii F6-02 from southern Taiwan soil | |
| CN106916752B (zh) | 制备纤维素酶和/或木聚糖酶的方法及其专用菌株 | |
| CN102559718B (zh) | 嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建及其酶的应用 | |
| Mahato et al. | Thermostable, solvent, surfactant, reducing agent and chelator resistant α-amylase from Bacillus strain IBT108: a suitable candidate enables one-step fermentation of waste potato for high butanol and hydrogen production | |
| CN102559567A (zh) | 嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建及其酶的应用 | |
| CN102816728A (zh) | β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建及其酶的应用 | |
| CN101691579A (zh) | 海洋低温α-淀粉酶基因工程菌、重组酶及应用 | |
| CN101372693A (zh) | 耐热纤维素酶基因、重组工程菌、耐热纤维素酶及应用 | |
| CN100445387C (zh) | 从嗜冷菌分离的低温脂肪酶基因序列及其表达重组菌株 | |
| CN101215571A (zh) | 嗜热脂肪酶基因、工程菌和嗜热脂肪酶及应用 | |
| CN102102093B (zh) | 一种高温脂肪酶突变体的制备及其用途 | |
| CN101353649B (zh) | 一种酯酶及其编码基因与应用 | |
| CN101148651B (zh) | 一种梭菌及其培养方法与应用 | |
| CN104278004B (zh) | 表达脂肪酶的埃希氏菌f6，f6脂肪酶及其生产和应用 | |
| CN103382464B (zh) | 来源于超嗜热古菌的酰胺酶及其编码基因与应用 | |
| CN102174422B (zh) | 一种耐有机溶剂脂肪酶生产菌及该脂肪酶的基因和应用 | |
| CN101942427B (zh) | 一种烷基型硫酸酯酶及其制备方法 | |
| CN101735967A (zh) | 一种耐有机溶剂脂肪酶、其应用及其产生菌株 | |
| CN101691576A (zh) | 热稳定的高温酸性α-淀粉酶基因、工程菌、重组酶及应用 | |
| CN100587072C (zh) | 嗜热酯酶/磷脂酶基因、工程菌、酶及其应用 | |
| CN105969751A (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶基因及其应用 | |
| CN101629180A (zh) | 嗜温多功能淀粉酶基因和嗜温多功能淀粉酶及其应用 | |
| CN101824401B (zh) | 葡聚糖酶、其编码核酸及其表达 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080709 |