CN101204391A - 通过增强胆固醇逆转运机制防治动脉粥样硬化的异黄酮类化合物及其组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及异黄酮类化合物红车轴草素(式1)和染料木素(式2)用于制备通过增强胆固醇逆转运机制治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物的用途，其中所述通过增强胆固醇逆转运机制治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物包括上调高密度脂蛋白受体CLA－1/SR－BI表达活性的药物和上调ATP结合盒转运子ABCA1表达活性的药物。本发明还涉及通过增强胆固醇逆转运机制治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物组合物，其含有治疗有效量的选自红车轴草素(式1)和染料木素(式2)的活性成分以及任选的药学可接受的载体。

Description

通过增强胆固醇逆转运机制防治动脉粥样硬化的异黄酮类化合物及其组合物

发明领域

本发明涉及异黄酮类化合物红车轴草素(式1)和染料木素(式2)用于制备通过增强胆固醇逆转运机制治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物的用途，其中所述通过增强胆固醇逆转运机制治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物包括上调高密度脂蛋白受体CLA-1/SR-BI表达活性的药物和上调ATP结合盒转运子ABCA1表达活性的药物。本发明还涉及通过增强胆固醇逆转运机制用于治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物组合物，其含有治疗有效量的选自红车轴草素(式1)和染料木素(式2)的活性成分以及任选的药学可接受的载体。

发明背景

心血管疾病已经成为当今世界危及人类生命的常见疾病，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是其主要病理基础。流行病学和临床研究表明，胆固醇在血浆中的浓度及在体内的代谢与动脉粥样硬化的发生与发展有密切的关系，血浆中低密度脂蛋白(low densitylipoprotein，LDL)胆固醇(LDL-C)水平与AS的发病率呈正相关，而高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)胆固醇(HDL-C)水平则与AS的发病率呈负相关[1，2，3]。

目前临床上成功应用的他汀类药物主要是通过抑制胆固醇的生物合成和增强外周细胞对胆固醇摄取的LDL受体调节通路来实现抗动脉粥样硬化作用的，但也仅可降低20％～40％的心血管事件[4]。近年来研究表明，高密度脂蛋白的抗动脉粥样硬化作用主要基于HDL参与的胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport，RCT)过程。

胆固醇正向转运是指胆固醇由肝脏出发，组成脂蛋白(主要是LDL)，进入血液循环，继而被外周细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)摄取，被组织细胞利用代谢的过程。

胆固醇逆转运则是指新生的圆盘状HDL摄取外周细胞(包括动脉壁细胞)中过剩的胆固醇，在血浆中经卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)酯化后，游离胆固醇转变成胆固醇酯并向HDL的内核转移，最终形成球状的成熟HDL，将胆固醇转运至肝脏，通过生成胆汁酸排出体外的过程。RCT主要有4个步骤：(1)胆固醇从外周组织细胞中流出，(2)HDL中胆固醇的酯化，(3)HDL胆固醇酯的转运，(4)HDL胆固醇酯的清除。这其中涉及多种受体、酶和脂质的相互作用，清道夫受体BI和ATP结合盒转运子ABCA1是RCT初始和终末步骤的主要参与者。

直到上世纪末，清道夫受体BI(scavenger receptor class B typeI，SR-BI)才被确定为体内功能性的HDL受体[5]。人类SR-BI(hSR-BI)是作为CD36膜蛋白超家族以及溶酶体整合膜蛋白相关蛋白被独立发现的，所以又称为CLA-1(CD36 and LIMPII Analogous-1)。研究表明，SR-BI参与外周组织中胆固醇的流出和肝脏及类固醇激素合成组织中胆固醇的选择性摄取，在胆固醇的流出和流入过程中都起着关键作用，被认为是发现新型心血管药物的潜在靶标[6]。RCT的增强将有利于AS病灶积蓄的胆固醇减少和病变的逆转，因此可以通过升高SR-BI的表达来加速RCT，促进机体特别是动脉壁脂纹病灶多余胆固醇的清除。

HDL受体表达上调剂可以通过增强胆固醇的逆转运过程，使泡沫细胞中过量的胆固醇外流，并通过逆转运机制转运到肝脏细胞或小肠及类固醇激素合成组织被利用和代谢，从而使已形成的动脉粥样硬化脂质斑块发生逆转。换言之，高密度脂蛋白受体表达的上调剂可以增强SR-BI对于HDL代谢的调节作用，尤其是可能使动脉血管壁业已形成的由大量胆固醇及胆固醇酯蓄积沉积而成的脂质斑块逐渐消退，从而起到预防和治疗动脉粥样硬化及冠心病的作用。

ABCA1是ATP结合盒转运子(ATP-binding cassette transporter)超家族成员之一，它们以ATP为能源转运各种底物，如离子、脂类和细胞毒素[7]。对ABCA1突变的研究使人们认识到ABCA1在胆固醇及磷脂转运中的重要作用。ABCA1的主要功能是参与RCT，ABCA1可将细胞内的胆固醇和磷脂转运至HDL前体apoA-I，而这是RCT的第一个限速环节，因此ABCA1对脂质代谢和AS的发生及发展具有重要影响。临床研究证实：ABCA1基因突变可导致Tangier病和家族性低α脂蛋白血症(FHA)，均表现为低高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)血症和早发冠心病。实验表明ABCA1基因的过度表达可促进胆固醇和磷脂的外流，增加血浆胆固醇、胆固醇酯、HDL-C等的浓度[8]。

胆固醇从组织的清除是预防动脉粥样硬化的关键步骤，ABCA1促进细胞内胆固醇流出而参与胆固醇的逆转运过程，从而清除外周组织细胞过量的胆固醇。转基因实验证实，ABCA1的过度表达促进胆固醇从巨噬细胞流出，并抑制AS斑块的形成。因此，ABCA1具有抗早期AS的功能。从外周流向肝脏的胆固醇逆转运过程，会使泡沫细胞中过量的胆固醇外流并被肝脏细胞利用，有利于清除多余胆固醇，从而防止动脉粥样硬化的发生。实验证明：胆固醇逆转运的增强有可能使动脉粥样硬化损伤发生逆转甚至消退。在此过程中起重要作用的ABCA1蛋白逐渐引起人们的重视，它已经成为治疗动脉粥样硬化心血管疾病的新的靶点，能提高ABCA1基因表达的化合物很有可能成为有效治疗动脉粥样硬化的新药。

过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisomeproliferators-activated receptors，PPARs)是一类能被内源性脂肪酸以及外源性过氧化物酶体增殖剂(peroxisome proliferators，PP)激活的甾体激素受体超家族成员，它作为脂质和脂蛋白代谢的调节物，可以调控血浆胆固醇及甘油三酯的水平、促进脂肪细胞分化、影响巨噬细胞内胆固醇内稳态、稳定AS斑块、抑制血小板聚积从而影响AS的发生和发展。研究表明，将无PPARγ的骨髓移植到低密度脂蛋白受体缺失的小鼠中会导致其动脉粥样硬化病变的显著增加。Malerod等的研究结果表明在肝细胞中PPARγ与视黄醇类X受体(RXR)形成异源二聚体后通过作用于SR-BI基因上游启动子区的PPRE元件而诱导SR-BI的表达[9]。近来的研究表明，PPAR对巨噬细胞的分化没有影响，但对巨噬细胞的胆固醇内稳态却起着重要作用，如PPARγ和PPARδ在高密度脂蛋白介导的巨噬细胞胆固醇流出中就起着重要的作用。肝X受体(LXR)是PPAR的靶基因，在巨噬细胞中PPARγ能够通过激活LXR的转录而诱导ABCA1的表达[10，11，12]，提示在胆固醇转运的细胞水平调节中存在着PPARγ-LXRα-ABCA1的途径。这些结果表明，PPARγ能够通过对ABCA1和/或SR-BI的调节促进胆固醇的逆转运，从而发挥抗动脉粥样硬化的作用。

红车轴草素(pratensein)和染料木素(genistein)为异黄酮类化合物。异黄酮类化合物因为具有类雌二醇的分子结构，而具有舒缓妇女更年期症状、预防骨质疏松等保健作用，同时由于其多酚的结构而具有抗氧化作用，从而具有清除氧自由基、抗癌活性及可能的预防心血管疾病作用[13]。

红车轴草素是红车轴草异黄酮的一种。红车轴草中的异黄酮化合物具有植物雌激素样作用和抗癌作用，目前红车轴草的提取物是国际上公认的治疗更年期综合征疗效确切的植物药。关于红车轴草素的分子药理作用没有深入研究的报道，仅有一篇文献报道红车轴草素能降低Triton-WR1339诱导的雄性大白鼠高血脂动物模型的血脂水平(总胆固醇和甘油三酯水平)[14]，但具体作用机理没有报道。

染料木素主要存在于豆科植物中，它通过多种机理抑制多种肿瘤细胞的生长。另外，染料木素具有良好的抗氧化、降血脂以及防治骨质疏松的作用。染料木素的抗脂质过氧化的作用，可提高低密度脂蛋白(LDL)受体的活性，降低胆固醇浓度，还可抑制脂肪细胞的基础脂质合成，浓度更高时还可促进脂质分解。相关研究提示，染料木素具有抗LDL氧化作用，且体内及体外抗氧化作用是一致的[15，16]。

迄今为止，临床上使用的抗动脉粥样硬化药物，主要是以他汀类药物主要代表的通过抑制胆固醇合成和增强LDLR的调节，和以吉非贝齐等为代表的增加肝外脂蛋白酶活性，以及影响胆固醇吸收如考来烯胺来实现其抗动脉粥样硬化作用的。尤其以增强LDLR的调节，降低血液中LDL-C的水平抗动脉粥样硬化药物占优势。这主要是对于由LDLR调节的胆固醇正向转运的机制最先被揭示，而被普遍接受，而与胆固醇逆转运过程相关的机制只是近年来才被陆续研究揭示，尚有许多调节机制至今尚未完全搞清楚。

本发明人借助高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型(中国专利申请号200410029902.4，2004年3月26日申请，2005年9月28日公开)，经过大量实验，筛选到高密度脂蛋白受体表达上调剂——红车轴草素和染料木素。发明人通过在分子水平上的研究，出人意料地发现红车轴草素和染料木素具有较强的高密度脂蛋白受体表达的上调作用、ATP结合盒转运子尤其是ABCA1表达的上调作用以及抑制巨噬细胞泡沫化的活性，实现通过增强胆固醇逆转运，而显示其新型机制的抗动脉粥样硬化作用。具体的，本发明人发现红车轴草素和染料木素通过提高胆固醇逆转运初始和终末步骤主要参与者清道夫受体BI和ATP结合盒转运子ABCA1的表达水平来促进胆固醇逆转运，进而实现其抗动脉粥样硬化作用。

发明内容

本发明一方面涉及异黄酮类化合物红车轴草素(式I)和染料木素(式II)用于制备通过增强胆固醇逆转运机制预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物的用途，其中所述通过胆固醇逆转运机制实现预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物包括具有上调高密度脂蛋白受体表达活性作用的药物和上调ATP结合盒转运子ABCA1表达活性的作用的药物。

异黄酮类化合物是指基本母核为3-苯基色原酮(3-phenylchromone)类化合物，包括例如染料木素(genistin)，红车轴草素(pratensein)，樱黄素(prunetin)，德鸢尾素(irilone)，鹰嘴豆芽素A(biochainin A)，芒柄花素(formononeitin)，毛蕊异黄酮(calycosin)，和大豆素(daidzein)等。

在本发明中，所述高密度脂蛋白受体表达的上调作用是指能在细胞体系中与空白对照相比使细胞中SR-BI/CLA-1的表达水平上调到150％以上，包括利用上述高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型测定的荧光强度增加到150％以上。

在本发明中，所述ATP结合盒转运子尤其是ABCA1表达的上调作用是指在细胞体系中与空白对照相比使细胞中ABCA1的表达水平上调到150％以上，包括利用本发明实施例中详述的ABCA1表达上调剂筛选模型测定的荧光强度增加到150％以上。

“抑制”巨噬细胞泡沫化的活性是指利用人或小鼠初代或永生单核细胞经诱导变性形成巨噬细胞后，在摄取大量的变性脂蛋白或负电性磷脂后形成的大量中性脂质的蓄积，经油红O染色后形成的大量的红色脂滴的显著减少。泡沫化巨噬细胞是动脉粥样硬化早期病灶的特征和成分组成，是中性脂质特别是胆固醇酯在巨噬细胞中蓄积的结果，胆固醇逆转运机制可以通过使巨噬细胞内的游离胆固醇流出细胞外，从而使更多的胆固醇酯水解成游离的胆固醇，并进一步通过逆转运机制减少巨噬细胞内的胆固醇酯的量，从而使巨噬细胞泡沫化程度减少，甚至消退。一般在显微镜下观察，红色油滴颗粒明显减少即为泡沫化抑制。巨噬细胞内中性脂质减少的定量方法可参照文献[17]中的同位素扫描定量方法。

从豆科植物红车轴草(Trifolium pratense L.)的干燥带花枝叶药材中提取到8种纯化合物，其中组分5(F5)在高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型中表现出良好的上调活性。对其进行了EI-MS和ESI-MS的测定；并分别以CD₃OD₃和CD₃COCD₃为溶剂，进行了¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC和NOESY的测定及相应的波谱解析，鉴定该化合物为4’-甲氧基-3’，5，7-三羟基异黄酮，即红车轴草素(式1)。

式1                                                    式2

借助于人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型，本发明人发现4’-甲氧基-3’，5，7-三羟基异黄酮(式1)，即红车轴草素和5，7，4’-三羟基异黄酮，即染料木素(购自西安冠宇生物技术有限公司，纯度≥98％，式2)具有高密度脂蛋白受体表达的上调活性。

红车轴草素和染料木素在人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型中，显示出对高密度脂蛋白表达较强的上调活性，且作用呈剂量依赖关系。将红车轴草素作用于肝癌细胞HepG2后，半定量RT-PCR结果显示高密度脂蛋白受体的RNA水平明显上调，Western Blot结果显示高密度脂蛋白受体蛋白水平明显上调。更进一步的，红车轴草素能够增加HepG2细胞中对荧光标记的HDL(DiI-HDL)的摄取。以上结果表明红车轴草素和染料木素可以通过上调人高密度脂蛋白受体在肝细胞上的转录活性和受体表达提高肝细胞对HDL-C的摄取，从而促进RCT的终末步骤。

在用含SR-BI上游调控序列的荧光素酶报告质粒对小鼠巨噬细胞Raw264.7的瞬时转染试验中，红车轴草素和染料木素亦能上调SR-BI的表达。在小鼠的巨噬细胞Raw264.7中的试验结果表明，红车轴草素具有较强的巨噬细胞泡沫化抑制活性。

在对胆固醇逆转运过程中另一个关键靶点ABCA1的相关研究中，将含有人ABCA1上游调控序列的报告基因载体稳定转染入人肝癌HepG2细胞，构建成稳定表达荧光素酶报告基因的细胞株ABCA1-LUCHepG2，荧光素酶活性的测定结果表明红车轴草素和染料木素均能够上调ABCA1的表达。以上结果表明红车轴草素和染料木素可以通过上调人ABCA1在巨噬细胞上的转录活性提高巨噬细胞中脂质的流出，从而促进RCT的初始步骤。

在小鼠的巨噬细胞Raw264.7中的试验结果表明，红车轴草素具有较强的巨噬细胞泡沫化抑制活性。

在与脂蛋白代谢相关的核受体PPARγ相关活性的研究中，红车轴草素和染料木素能够对PPARγ产生激动作用，从而提示红车轴草素和染料木素可能通过PPARγ激活其下游靶基因，包括人高密度脂蛋白受体和ABCA1的转录表达。

本发明另一方面，涉及通过增强胆固醇逆转运机制用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物组合物，其含有治疗有效量的选自红车轴草素(式1)和染料木素(式2)的活性成分以及任选的药学可接受的载体。

更具体而言，含有选自本发明所述红车轴草素和染料木素的药物组合物，可制成适于通过任何合适的途径治疗施用的形式，包括口服、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)等途径。

一般而言，对于本发明所述红车轴草素和染料木素合适剂量为，每天每千克受者体重约1mg到约100mg，优选地每天每千克体重约1mg到约50mg，最优选地每天每千克体重约1mg到约25mg。希望的剂量优选地为整个一天中以适当间隔施用的2、3、4、5、6或更多的亚剂量。这些亚剂量可以以单位剂型施用，例如，每单位剂型含有约1mg到约100mg、优选地约1mg到约25mg以上、最优选地约5mg到约25mg以上的有效成份。

应当理解，本发明的化合物和组合物的适当剂量可能取决于疾病的类型、严重程度和阶段，并且随患者各不相同。确定最佳剂量一般包括使治疗优点水平与本发明的治疗的任何危险或有害副作用相平衡。

含有本发明所述红车轴草素和染料木素的药物组合物包括适于口、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)施用的制剂。制剂可便利地作为单位剂型，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。这些方法包括使有效成份与组成一种或多种助剂的载体结合的步骤。通常，制剂的制备方法为，使有效成份与液体载体或磨碎的固体载体或此两者均匀且紧密地结合，然后必要时使该产品成形。

适用于口服的本发明的制剂可以是离散的单位，如胶囊、扁囊剂或片剂，每种含有预定量的有效成份；粉末或颗粒；在水或非水液体中的溶液或悬液；或是水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。有效成份也可以是大丸剂、药糖剂或糊剂。

通过任选地与一种或多种助剂一起压缩或模制可以制备片剂。压缩片剂的制备方法可以是，在合适的机器中压缩易流动形式如粉末或颗粒状的有效成份，该有效成份任选地与粘合剂(例如，聚烯吡酮、明胶、羟丙甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉乙醇酸钠、交联的聚烯吡酮、交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂的制备方法可以是，在合适的机器中模制一种用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物。片剂可任选地包被或划痕，并且可以配制使其中的有效成份缓慢或可控制地释放，例如，应用不同比例的羟丙甲基纤维素来得到希望的释放分布图。片剂可任选地包有肠溶衣，使之在肠而不在胃的部分中释放。

适于肠胃外施用的制剂包括：水及非水等渗无菌注射液，其中可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与受者血液等渗的溶质；水及非水无菌悬液，其中可含有悬浮剂和增稠剂，以及用来将化合物导向血液成分或一个或多个器官的脂质体或其它微粒系统。这些制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器如安瓿或小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，只需在使用前加入无菌液体载体如注射用水。临时注射液及悬液可由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备而成。

优选的单位剂量制剂含有如上所述的前体药物成份的每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分。

附图说明

图1红车轴草素增加CLAP-LUC HepG2细胞荧光素酶活性的量效关系曲线。

图2染料木素增加CLAP-LUC HepG2细胞荧光素酶活性的量效关系曲线。

图3红车轴草素增加HepG2细胞中高密度脂蛋白受体的mRNA水平。

图4红车轴草素增加HepG2细胞中高密度脂蛋白受体的蛋白水平。

图5红车轴草素增加HepG2细胞中对荧光标记的HDL(DiI-HDL)的摄取(采用流式细胞仪检测)。

图6红车轴草素增加Raw264.7细胞中高密度脂蛋白受体的表达。

图7染料木素增加Raw264.7细胞中高密度脂蛋白受体的表达。

图8红车轴草素抑制巨噬细胞泡沫化的镜检结果(油红O染色法)。

图9红车轴草素上调ABCA1表达的量效关系曲线。

图10染料木素上调ABCA1表达的量效关系曲线。

图11红车轴草素对PPARγ的活性。

图12染料木素对PPARγ的活性。

实施例

实施例1红车轴草素的制备及结构鉴定

A)红车轴草素的制备

豆科植物红车轴草(Trifolium pratense L.)的干燥带花枝叶药材购自湖南九汇现代中药有限公司，按照文献方法[18]分别得到化合物1(60mg)、2(52mg)、3(1.6g)、4(3.6g)、5(41mg)、6(52mg)、7(49mg)和8(38mg)。

其中组分5(称为F5)在高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型中表现出良好的上调活性，对其进行了EI-MS和ESI-MS的测定；并分别以CD₃OD₃和CD₃COCD₃为溶剂，进行了¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC和NOESY的测定及相应的波谱解析，鉴定该化合物为4’-甲氧基-3’，5，7-三羟基异黄酮，即红车轴草素。

化合物F5为白色粉末，都易溶于甲醇、丙酮、DMSO，难溶于水。其理化性质见表1。

表1F5的理化学性质

B)化合物F5的结构解析

F5的EI-MS的分子离子峰为300，ESI-MS中[M+1]⁺为301，[M+Na]⁺为323，[M+K]⁺为339，因此其分子量为300，高分辨ESI-MS给出分子式为C₁₆H₁₂O₆，不饱和度为11。其全去偶¹³C-NMR谱中共16个碳的信号，除δ56.4(3H，s)的甲氧基信号和δ182.1的羰基信号外，在δ94～166的范围内有14个苯环或双键碳的信号。其¹H-NMR谱共9个氢的信号，除δ3.82处的甲氧基信号外，其余6个氢的化学位移均在δ6.0-8.0之间。上述特征提示F5具有黄酮类化合物的基本结构特征。经光谱数据对比，F5的色原酮母核氢谱和碳谱的化学位移与异黄酮类化合物染料木素(genistein，4’，5，7-三羟基异黄酮)基本一致。所不同的是B环，除去色原酮母核上5，7位两个羟基，B环苯环上还应有一个甲氧基和一个羟基取代。

在以CD₃OD为溶剂的¹H-NMR谱中B环上存在3个芳氢信号，即δ6.98(1H，s)和δ6.91(2H，d，J＝1.0)，前者为单峰，积分面积为1个氢，后者是积分面积为2个氢的双峰，偶合常数仅为1.0Hz。但在以氘代丙酮为溶剂的¹H-NMR谱中，这三个芳氢的化学位移和偶合常数分别为δ7.13(1H，d，J＝2，H-2’)、δ7.04(1H，dd，J＝2，8.5，H-6’)和δ6.99(1H，d，J＝8.5，H-5’)，它们的偶合常数说明δ7.13氢与δ7.04氢处于间位，而δ7.04氢与δ6.99氢处于邻位，并且δ7.13氢与δ6.99氢不相邻，那么这三个芳氢在B环上的位置有三种可能。为了确定B环上取代基的位置及对化学位移进行归属，我们进行了NOESY分析。由NOESY谱中可以观察到：δ7.13氢和δ7.04氢分别与H-2有相关信号，说明这两个氢与H-2空间位置接近，δ7.13和δ7.04应分别为H-2’和H-6’，δ6.99处的氢为H-5’；δ3.82甲氧基与δ6.99的H-5’有相关信号，说明二者空间位置相近，因此甲氧基位于4’，羟基位于3’。在HMBC中还可以观察到δ3.82甲氧基对C-4’(δ149.3)的远程偶合。F5在CD₃OD和(CD₃)₂CO中的氢谱及与染料木素的碳谱比较见表2。

F5在(CD₃)₂CO中的氢谱以及碳谱与文献报道的红车轴草素在DMSO-d₆的氢谱和碳谱数据基本一致[18]，因此F5被确定为是红车轴草素(Pratensein)，化学名为4’-甲氧基-3’，5，7-三羟基异黄酮(3′，5，7-trihydroxy-4′-methoxyisoflavone)。

表2  F5和染料木素的氢谱和碳谱的化学位移和多重性比较

实施例2高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型测定红车轴草素和染料木素上调高密度脂蛋白受体表达活性

A)重组表达质粒pGL3-CLAP的构建

菌株和细胞株

E.coli DH5α用于质粒DNA的遗传操作。肝癌BEL-7402细胞株(购自上海午立生物技术有限公司)用于人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型的构建。

质粒

pGEM-T(购自Promega公司)用于PCR产物的克隆。pGL3-Basic(购自Promega公司)为报告基因载体，含有无启动子的萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶编码基因，用于人高密度脂蛋白受体调控序列的克隆。

pGL3-control(购自Promega公司)含有SV40启动子和增强子序列，用于荧光素酶表达的阳性对照。pRL-TK(购自Promega公司)包含编码海肾(Renilla reniformis)荧光素酶的cDNA，与实验载体共转染哺乳动物细胞，用于双荧光素酶报告基因体系的内对照。

高密度脂蛋白受体基因调控序列的获得

根据文献[3]报道的CLA-1基因序列，利用软件Primer Premier5.0设计PCR引物P1(5’-CCTCGAG TGG AGC CAT TGT GTG CAA AG-3’)(SEQ ID NO：2)和P2(5’-CAAGCTT CGG CGA CAG AGA CGA CAC AG-3’)(SEQ ID NO：3)，用于扩增人SR-BI基因上游_1055bp□62bp(以SR-BI基因起始密码子ATG的A为+1)长度为996bp的片段，其中P1引入了XhoI酶切位点，P2引入了HindIII酶切位点。

以人肝癌细胞BEL-7402总DNA为模板设立25μl PCR反应体系：1×PCR缓冲液，0.5μmol/L P1和P2，2.5μmol/L dNTPs，0.5U TaqDNA聚合酶。反应条件为94℃变性5min；94℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸1min 20s(30个循环)；72℃延伸10min。PCR扩增的目的片段用pGEM-T载体克隆后酶切鉴定并测定所得调控序列的序列，如SEQ ID NO：1所示。

依据分子克隆：实验室指南中所述的方法，将PCR产物与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α受体菌，用蓝白斑法挑选转化子。对转化子进行快速质粒提取后进行酶切鉴定，用XhoI，HindIII双切后含目的片段的转化子为克隆有目的片段的重组子，命名为pGEM-CLAP。

重组质粒pGL3-CLAP的构建

用XhoI，HindIII双切重组质粒pGEM-CLAP得到目的片段后，将目的片段与经过相同双酶切的pGL3-basic质粒相连，从而将人SR-BI基因上游调控序列定向插入到pGL3-basic的荧光素酶基因上游，构建成重组质粒pGL3-CLAP。

B)稳定转染细胞株CLAP-LUC HepG2的建立

①细胞培养

MEM-EBSS培养基(Hyclone)(含10％标准胎牛血清<Hyclone>)用于肝癌细胞HepG2的培养。上述培养基补加600μg/ml G418用于构建的稳定转染细胞CLAP-LUC HepG2的培养。

②转染

采用Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)介导的方法，将重组质粒pGL3-CLAP和pcDNA3共转染入HepG2细胞。经700μg/ml G418处理14天后，带有新霉素抗性的细胞克隆形成。对形成的细胞克隆进行一系列单克隆化操作，同时跟踪其荧光素酶活性。将高表达荧光素酶活性且呈现正常细胞周期的稳定细胞克隆命名为CLAP-LUC HepG2(G418维持浓度为600μg/ml)。

C)人高密度脂蛋白受体SR-BI上调剂的筛选

①荧光素酶表达活性的测定

细胞荧光素酶表达活性的测定采用荧光检测试剂盒LuciferaseAssay System(Promega)。用BMG Polarstar Galaxy紫外-可见-荧光台式培养板用分光光度计检测荧光素酶活性。

②筛选条件的优化及最终确定

将CLAP-LUC HepG2细胞以一定密度接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁约6小时后，即长至90％满时换为无血清的MEM-EBSS培养基(200μl/孔)，同时加入一定浓度的阴性对照(DMSO)、阳性对照(罗格列酮)和待测样品。继续于37℃，5％CO₂条件下培养18小时后。用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄，pH 7.3)漂洗细胞一次，每孔加入预先稀释好的1×CCLR(Cell Culture LysisReagent)20μl，37℃裂解细胞20min后，完全转移细胞裂解液至不透明白板中的相应各孔内，并采用荧光检测试剂盒LuciferaseAssay System测定细胞中荧光素酶的活性。

通过对筛选过程中DMSO的终浓度、样品作用于细胞的时间以及每孔接种的细胞数等条件进行优化，最终确定筛选条件如下：每孔接种5×10⁴个细胞，DMSO终浓度0.1％，样品作用时间为18小时。

待测样品对荧光素酶表达活性改变率的计算

用如下方程计算待测样品对荧光素酶表达活性的改变率：

改变率(％)＝A/B×100

其中，A为加入待测样品后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)，B为加入阴性对照样品(DMSO)后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)。

D)红车轴草素和染料木素增加CLAP-LUC HepG2细胞荧光素酶活性的量效关系曲线

按照C)中所述的方法，将CLAP-LUC HepG2细胞以5×10⁴个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁约6小时后，分别换为含系列稀释浓度的红车轴草素和染料木素的无血清MEM-EBSS培养基(200μl/孔)。注意保持各浓度孔中DMSO的终浓度为0.1％，另设含终浓度0.1％DMSO培养基的孔做空白对照。继续于37℃，5％CO₂条件下培养18小时后，按照上述处理方法测定细胞中荧光素酶的活性。

红车轴草素在0.4-6.7μM浓度范围内能够上调CLAP-LUC HepG2细胞荧光素酶的表达，在浓度为2.08μM时达到最高上调活性186.4％(测定结果见附图1)。染料木素在0.56-37.01μM浓度范围内能够上调CLAP-LUC HepG2细胞荧光素酶的表达，在浓度为4.63μM时达到最高上调活性155％(测定结果见附图2)。

实施例3红车轴草素对肝癌细胞HepG2中高密度脂蛋白受体的影响

A)采用半定量RT-PCR的方法研究红车轴草素作用于HepG2细胞前后，对人高密度脂蛋白受体在转录水平的影响

①细胞总RNA的提取

人肝癌细胞HepG2以5×10⁵个接种60mm细胞培养板，37℃，5％CO₂条件下培养24小时后，用冰预冷的PBS漂洗细胞2次，加入含2.08M(DMSO含量为0.1％)红车轴草素的无血清MEM-EBSS培养基，同时对照板加入含0.1％DMSO的相应培养基。37℃，5％CO₂条件下培养24小时后，用Trizol试剂(Invitrogen)进行细胞总RNA的提取(具体操作步骤按照试剂盒的说明书进行)。提取细胞总RNA后用琼脂糖凝胶电泳检测核糖体RNA(rRNA)的完整性并测定所提取RNA的浓度。

②逆转录反应——cDNA的合成

采用ThermoScript^TMRT-PCR System试剂盒(Invitrogen)进行，具体操作步骤按照试剂盒说明书所述。模板RNA各4μg分别与ThermoScript^TM和引物RTOligo(dT)₂₀混合，55℃保温60min进行逆转录反应，反应结束后于85℃加热5min以终止反应。所得cDNA于-20℃保存或继续行以下的PCR反应。

③PCR扩增

以上述逆转录反应所得cDNA为模板，扩增目的基因CLA-1，同时以人磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因为内对照。扩增CLA-1mRNA(672bp)和GAPDH mRNA(452bp)所使用的上下游引物均按照Huang等[19]所述的方法进行。PCR反应具体步骤为：94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性1min，60℃引物退火60sec，72℃延伸1min，最后于72℃延伸10min结束反应。其中目的基因CLA-1的扩增进行25个循环，内对照基因GAPDH的扩增进行20个循环，以保证它们的扩增分别处在线形范围内。

④琼脂糖凝胶电泳

上述各5μl的PCR产物行1.0％琼脂糖凝胶电泳。电泳结果凝胶成像后进行灰度扫描，将加入红车轴草素作用前后的CLA-1条带的灰度值标准化到各自的内对照GAPDH的灰度值进行定量化。

实验结果见附图3，红车轴草素在2.08μM浓度时能够上调HepG2细胞人高密度脂蛋白受体的转录水平。

B)采用Western印迹方法研究红车轴草素作用于HepG2细胞前后，对高密度脂蛋白受体在蛋白水平的影响

①蛋白样品的制备

细胞前期加药处理过程同细胞总RNA的提取步骤。红车轴草素作用24h后，以冰预冷的PBS漂洗细胞2次，各孔板分别加入200μl的裂解液(50mM Tris-HCL，pH7.4，150mM NaCl，1％NP40，0.1％SDS)，于冰上裂解细胞20min。收集各组细胞裂解液，于4℃，10,000g离心5min。收集上清用BCA试剂盒(PIERCE)对蛋白进行定量。加入一定量的5×蛋白上样缓冲液，于沸水浴中煮10min，冷却后于-20℃保存备用或进行随后的蛋白电泳。

②Western Blot

来自对照组和加药组的各30μg蛋白提取物进行12％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体胶的配置和电泳方法按照分子克隆进行。电泳完成后进行随后的转膜反应(0.45μm PVDF膜)和相应的用含0.1％Tween 20的PBS(PBST)配置的5％脱脂奶粉室温封闭1h，具体操作步骤也按照分子克隆进行。相对应分子量的PVDF膜分别与各自的一抗孵育过夜。目的蛋白为小鼠抗人的CLA-1单克隆抗体(BD公司产品)，内参为兔抗人的β-肌动蛋白(β-actin)的多克隆抗体(Santa Cruz公司产品)。二抗分别为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG(Santa Cruz公司产品)，室温孵育1h。采用增强型发光检测系统进行(Santa Cruz公司产品)凝胶成像后并行各条带的灰度扫描。用人的β-actin作为内对照来标准化CLA-1免疫反应的条带。

实验结果见附图4，红车轴草素在2.08μM浓度能够上调HepG2细胞人高密度脂蛋白受体的蛋白水平。

C)采用流式细胞仪研究红车轴草素作用于HepG2细胞前后，细胞对荧光标记的HDL(DiI-HDL)摄取的影响

人肝癌细胞HepG2以5×10⁴个接种24孔细胞培养板，37℃，5％CO₂条件下培养24小时后，用冰预冷的PBS漂洗细胞2次，加入含2.08μM(DMSO含量为0.1％)红车轴草素的无血清MEM-EBSS培养基，同时对照板加入含0.1％DMSO的相应培养基。37℃，5％CO₂条件下培养24小时后，每孔加入2g/ml DiI-HDL，37℃孵育4h。以冷PBS漂洗细胞1次，各孔分别加入1ml含有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS，于4℃放置1h。轻轻吹打并分散细胞，细胞悬液于4℃，800×g，离心3min。收集细胞重悬于0.5ml PBS中，过300目尼龙网后上流式细胞仪检测DiI的荧光值。

实验结果见附图5，红车轴草素在2.08μM浓度能够上调HepG2细胞人高密度脂蛋白受体对HDL的摄取。

实施例4红车轴草素和染料木素增加Raw264.7细胞中高密度脂蛋白受体的表达

DMEM-高糖培养基(Hyclone)[含10％标准胎牛血清(Hyclone)]用于小鼠巨噬细胞Raw264.7的培养。重组表达质粒pGL3-CLAP的构建同实施例1中所述。转染用质粒DNA pGL3-basic(不含SV40的启动子和增强子)、pGL3-control(含有SV40的启动子和增强子)和pGL3-CLAP的提取均采用PureYield Plasmid Midiprep System试剂盒(Promega)。采用LipofectAMINE^TM 2000Reagent(Invitrogen)转染试剂盒进行细胞转染。

以pGL3-basic为阴性对照质粒，pGL3-control为阳性对照质粒，与构建的质粒pGL3-CLAP同时分别瞬时转染小鼠巨噬细胞Raw264.7，对转染条件进行优化：每孔接种7×10⁴个细胞，200ng质粒DNA，0.5μl脂质体，转染时间为6小时，转染6小时后换为无血清的DMEM-高糖培养基，同时加入一定浓度的待测样品后继续温育18小时，空白对照加入与待测定样品相同浓度的DMSO的无血清DMEM-高糖培养基。测定Raw264.7细胞中荧光素酶活性(测定方法同实施例1中所述)。

待测样品对荧光素酶表达活性改变率间接反应了细胞中高密度脂蛋白受体表达的变化情况，用如下方程计算待测样品对荧光素酶表达活性的改变率：

改变率(％)＝A/B×100

其中，A为加入待测样品后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)，B为加入空白对照样品(DMSO)后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)。

红车轴草素在4.2-16.7μM浓度范围内能够上调Raw264.7细胞荧光素酶的表达，在浓度16.7μM时达到最高上调活性163.7％(测定结果见附图6)。染料木素在1.2-37μM浓度范围内能够上调Raw264.7细胞荧光素酶的表达，在浓度18.5μM时达到最高上调活性114.8％(测定结果见附图7)。

实施例5红车轴草素抑制巨噬细胞泡沫化活性的测定

A)氧化的低密度脂蛋白(OX-LDL)的制备

将低密度脂蛋白(LDL)溶于0.15mol/L，pH7.4的NaCl溶液中，然后放入透析袋中置于含10μmo l/L CuSO4的PBS中，37℃透析12小时后，在含0.1％EDTA的PBS中透析24小时，0.2μm微孔滤膜过滤除菌，备用。用硫代巴比妥酸反应物含量来鉴定LDL氧化程度。以四乙氧基丙烷为标准品，按丙二醛(MDA)测定试剂盒说明书操作，测定此批氧化后每毫克LDL的丙二醛含量。

B)将小鼠的巨噬细胞Raw264.7，置于37℃含0.5％CO₂培养箱中，倍增时间为24小时，在含10％胎牛血清的DMEM-高糖培养液中贴壁生长。细胞以6×10⁴个/孔接种于96孔细胞培养板上，于37℃，0.5％CO₂条件下过夜培养后，换为无血清培养液(200μl/孔)。将细胞分为对照组、泡沫细胞组和加样组，同时将泡沫细胞组加入OX-LDL，至每孔的终浓度为60mg/L，加样组同时加入一定浓度的待测样品。37℃，0.5％CO₂条件下培养30小时后，进行染色。

C)Raw264.7细胞油红O染色

①油红O染色液的配制方法：油红0.5克溶于100毫升异丙醇，60℃水浴30分钟，过滤。临用前取6毫升油红母液，加入4毫升双蒸水中，静置30分钟，用前过滤。

②Raw264.7细胞中性脂质的油红O染色法：按步骤B)提到的方法，将加好样的96孔培养板从二氧化碳孵箱中取出，10％甲醛固定液固定(15μl/孔)，10分钟后弃去溶液，水洗两次，再加入60％异丙醇(150μl/孔)放置5分钟，弃去溶液，用油红O染色液(150μl/孔)染色1小时，弃去溶液用60％异丙醇(150μl/孔)洗孔，然后水(150μl/孔)洗两次，最后每孔加150μl水放到显微镜下观察。

D)镜检结果

经油红O染色后，镜下观察不加OX-LDL的对照组细胞内无明显红色油滴状颗粒，而泡沫细胞组的细胞可见到细胞浆内有较多的红色油滴颗粒，并且由于个别细胞吞噬的油滴过多使得这些细胞体积增大，样品组中若有对巨噬细胞泡沫化有抑制作用的样品，其细胞中红色油滴颗粒明显减少。由附图8所示，2.08μM红车轴草素处理组能够有效抑制对巨噬细胞的泡沫化。

实施例6红车轴草素和染料木素增加ABCA1表达的量效关系曲线。

A)重组表达质粒pGL3-ABCA1的构建

①菌株和细胞株

E.coli DH5α用于质粒DNA的遗传操作。肝癌HepG2细胞株用于重组表达质粒pGL3-ABCA1的瞬时转染。

②质粒

pGEM-T(购自Promega公司)用于PCR产物的克隆。pGL3-Basic(购自Promega公司)为报告基因载体，含有无启动子的萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶编码基因，用于ABCA1调控序列的克隆。pGL3-control(购自Promega公司)含有SV40启动子和增强子序列，用于荧光素酶表达的阳性对照。

③ABCA1基因调控序列的获得

根据文献报道的ABCA1基因序列，利用软件Primer Premier 5.0设计PCR引物，用于扩增人ABCA1基因上游-819bp-+71bp(+1为ABCA1基因的转录起始位点)长度为890bp的片段。PCR扩增的目的片段用pGEM-T载体克隆后酶切鉴定并测定所得调控序列的序列。

依据分子克隆实验室指南中所述的方法，将PCR产物与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α受体菌，用蓝白斑法挑选转化子。对转化子进行快速质粒提取后进行酶切鉴定，用XhoI，HindIII双切后含目的片段的转化子为克隆有目的片段的重组子，命名为pGEM-ABCA1。

④重组质粒pGL3-ABCA1的构建

用XhoI，HindIII双切重组质粒pGEM-ABCA1得到目的片段后，将目的片段与经过相同双酶切的pGL3-basic质粒相连，从而将人ABCA1基因上游调控序列定向插入到pGL3-basic的荧光素酶基因上游，构建成重组质粒pGL3-ABCA1。

B)稳定转染细胞株ABCA1-LUC HepG2的建立

①细胞培养

MEM-EBSS培养基(Hyclone)(含10％标准胎牛血清<Hyclone>)用于肝癌细胞HepG2的培养。上述培养基补加500g/ml G418用于构建的稳定转染细胞ABCA1-LUC HepG2的培养。

②转染

采用Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)介导的方法，将重组质粒pGL3-ABCA1和pcDNA3共转染入HepG2细胞。经600μg/ml G418处理14天后，带有新霉素抗性的细胞克隆形成。对形成的细胞克隆进行一系列单克隆化操作，同时跟踪其荧光素酶活性。将高表达荧光素酶活性且呈现正常细胞周期的稳定细胞克隆命名为ABCA1-LUC HepG2(G418维持浓度为500μg/ml)。

C)量效关系曲线的测定

将ABCA1-LUC HepG2细胞以3×10⁴个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，过夜培养后(细胞贴壁≥12h)，换为含系列稀释浓度的待测样品的无血清MEM-EBSS培养基(200μl/孔)。注意保持各浓度孔中DMSO的终浓度为0.1％，另设含终浓度0.1％DMSO培养基的孔做空白对照。继续于37℃，5％CO₂条件下培养18小时后，按照实施例1中所述处理方法测定细胞中荧光素酶的活性。

待测样品对荧光素酶表达活性改变率间接反应了细胞中ABCA1表达的变化情况，用如下方程计算待测样品对荧光素酶表达活性的改变率：

改变率(％)＝A/B×100

其中，A为加入待测样品后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)，B为加入空白对照样品(DMSO)后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)。

红车轴草素在0.5-16.7μM浓度范围内能够上调ABCA1-LUCHepG2细胞荧光素酶的表达，在浓度为4.17μM时达到最高上调活性244.5％(测定结果见附图9)。染料木素在2.3-37μM浓度范围内能够上调ABCA1-LUC HepG2细胞荧光素酶的表达，在浓度为37μM时达到最高上调活性162.1％(测定结果见附图10)。

实施例7红车轴草素对PPARγ的活性。

利用核受体PPARγ的结构共有的两个主要结构域：配体结合结构域(LBD)和DNA结合结构域(DBD)各自具有独立的功能，将其结合结构域(LBD)与酵母细胞转录因子GAL4的DNA结合结构域(DBD)构建成融合蛋白载体，再通过与包含GAL4特异的反应元件的报告质粒共转染人肝癌HepG2细胞，通过测定荧光素酶的活性，评价待测物对PPARγ的活性。

具体的用PCR方法扩增的人PPARγ-LBD片段与pBIND载体(Promega)连接构建成表达质粒pBIND-PPARγ-LBD。pG5luc和构建的重组质粒pBIND-PPARγ-LBD经Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)介导共转染人肝癌细胞HepG2，对瞬时转染条件进行优化：每孔接种5×10⁴个细胞，200ng质粒DNA(报告质粒pG5luc与表达质粒pBIND-PPARγ-LBD的比例为10∶1)，0.5μl脂质体，转染时间为6小时，转染6小时后换为无血清的MEM-EBSS培养基，同时加入一定浓度的待测样品后继续温育18小时，空白对照加入与待测定样品相同浓度的MEM-EBSS培养基。测定HepG2细胞中荧光素酶活性(测定方法同实施例1中所述)。

待测样品对荧光素酶表达活性改变率间接反应了细胞中所加入的待测物对PPARγ的活性变化情况，用如下方程计算待测样品对荧光素酶表达活性的改变率：

改变率(％)＝A/B×100

其中，A为加入待测样品后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)，B为加入空白对照样品(DMSO)后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)。

红车轴草素在1.04-33.3μM浓度范围内能够激动PPARγ的表达，在浓度为8.33μM时达到最高激动活性，即激动活性为213.1％(测定结果见附图11)。染料木素在4.63-37μM浓度范围内能够激动PPARγ的表达，在浓度为37μM时达到最高激动活性，即激动活性为134.7％(测定结果见附图12)。

实施例8染料木素对高脂血症金黄地鼠血脂水平的影响

A)动物分组和模型的建立方法

将50只雄性金黄地鼠体重为70-90g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司。按照体重随机分为5组(A、B、C、D、E组)，每组10只。自由饮水，各组先饲以普通饲料1周为适应期，然后B、C、D、E四组给予高脂饲料(普通饲料加入1％胆固醇、10％猪油、10％蛋黄粉和0.5％甲基硫氧嘧啶)饲喂2周后，建立金黄地鼠高脂血症动物模型，A组继续饲喂普通饲料。以后B、C、D、E各组继续予以高脂饲料喂养，同时B组每日灌喂0.5％的羧甲基纤维素钠0.5ml/只，作为阴性对照组；C组每日灌喂50mg/kg体重染料木素(用0.5％的羧甲基纤维素钠配制成所需浓度的混悬液)；D组每日灌喂100mg/kg体重染料木素；E组每日灌喂舒降之3mg/kg体重，作为阳性对照。连续喂养4周。

B)检测指标及检测方法

各组地鼠在适应期、高脂饲料喂养2周及给药的1、2、3和4周分别禁食12h，前眦静脉丛取血，将采血以3000r/min离心10min，将分离的血清测定各鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。以上检测试剂盒均为北京北化康泰临床试剂公司产品。

结果显示：以100mg/kg体重染料木素给药组在给药4周后其平均HDL-C升高了36.6％，与不给药阴性对照组相比具有显著性差异。

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Claims (7)

1.异黄酮类化合物红车轴草素(式1)和染料木素(式2)

    式1                                               式2

用于制备通过增强胆固醇逆转运治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物的用途。

2.权利要求1所述的用途，其中所述通过增强胆固醇逆转运治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物为上调高密度脂蛋白受体表达活性的药物。

3.权利要求1所述的用途，其中所述通过增强胆固醇逆转运治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物为上调ATP结合盒转运子ABCA1表达活性的药物。

4.权利要求1所述的用途，其中所述通过增强胆固醇逆转运治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物为抑制巨噬细胞泡沫化的药物。

5.一种通过增强胆固醇逆转运用于治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物组合物，其中含有治疗有效量的选自红车轴草素(式1)和染料木素(式2)的活性成分

    式1                                           式2

以及任选的药学可接受的载体。

6.一种用于上调高密度脂蛋白受体表达活性实现增强胆固醇逆转运的药物组合物，其中含有治疗有效量的选自红车轴草素(式1)和染料木素(式2)的活性成分

    式1                                            式2

以及任选的药学可接受的载体。

7.一种用于上调ATP结合盒转运子ABCA1表达活性实现增强胆固醇逆转运的药物组合物，其中含有治疗有效量的选自红车轴草素(式1)和染料木素(式2)的活性成分

    式1                                              式2

以及任选的药学可接受的载体。

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