CN101683329A - 组蛋白去乙酰化酶抑制剂在治疗动脉粥样硬化中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及组蛋白去乙酰化酶抑制剂化合物在制备用于通过增强胆固醇逆转运机制治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物的用途，其中所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为式1所示的曲古抑菌素A或式2所示的辛二酰苯胺异羟肟酸。

Description

组蛋白去乙酰化酶抑制剂在治疗动脉粥样硬化中的用途

发明领域

本发明涉及组蛋白去乙酰化酶抑制剂类化合物曲古抑菌素A(Trichostatin A，TSA)和辛二酰苯胺异羟肟酸(Suberoylanilidehydroxamicacid，SAHA)用于制备通过增强胆固醇逆转运机制治疗和/或预防动脉粥样硬化药物的用途，其中所述通过增强胆固醇逆转运机制治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物包括上调高密度脂蛋白受体CLA-1/SR-BI表达活性的药物和上调ATP结合盒转运子ABCA1表达活性的药物。

发明背景

心血管疾病已经成为当今世界危及人类生命的常见疾病，而动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是其主要病理基础。流行病学和临床研究表明，胆固醇在血浆中的浓度及在体内的代谢与动脉粥样硬化的发生与发展密切相关，血浆中低密度脂蛋白(low densitylipoprotein，LDL)胆固醇(LDL-C)水平与动脉粥样硬化的发病率呈正相关，而高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)胆固醇(HDL-C)水平则与动脉粥样硬化的发病率呈负相关[1-3]。

目前临床上成功应用的他汀类药物主要是通过抑制胆固醇的生物合成和增强外周细胞对胆固醇摄取的LDL受体调节通路来实现抗动脉粥样硬化作用的，但也仅可降低20％～40％的心血管事件[4]，因此亟需研发具有新作用机制的新型抗动脉粥样硬化药物。

近年来研究表明，高密度脂蛋白的抗动脉粥样硬化作用主要基于HDL参与的胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport，RCT)过程。胆固醇逆转运是指新生的圆盘状HDL摄取外周细胞(包括动脉壁细胞)中过剩的胆固醇，在血浆中经卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lecithin cholesterol acyltransferase，LCAT)酯化后，游离胆固醇转变成胆固醇酯并向HDL的内核转移，最终形成球状的成熟HDL，将胆固醇转运至肝脏，通过生成胆汁酸排出体外的过程。胆固醇逆转运主要有4个步骤：(1)胆固醇从外周组织细胞中流出；(2)HDL中胆固醇的酯化；(3)HDL胆固醇酯的转运；(4)HDL胆固醇酯的清除。实验证明，胆固醇逆转运的增强有可能使动脉粥样硬化损伤发生逆转甚至消退。这其中涉及多种受体、酶和脂质的相互作用，B族I型清道夫受体(scavenger receptor class B type I，SR-BI)和ATP结合盒转运子A1(ATP binding cassette transporterA1，ABCA1)是胆固醇逆转运初始和终末步骤的主要参与者。

直到上世纪末，SR-BI才被确定为体内功能性的HDL受体[5]。人类SR-BI(hSR-BI)是作为CD 36膜蛋白超家族以及溶酶体整合膜蛋白相关蛋白被独立发现的，所以又称为CLA-1(CD 36and LIMPIIAnalogous-1)。研究表明，SR-BI参与外周组织中胆固醇的流出和肝脏中胆固醇的选择性摄取。胆固醇选择性摄取是指肝细胞摄取HDL中胆固醇酯，而不摄取HDL的蛋白成份，这一途径是通过SR-BI介导的，通过选择性的摄取，可将HDL胆固醇转运到肝脏。外周细胞中的胆固醇在浆膜双层上的分布是不对称的，胆固醇外流是胆固醇以游离的形式进行转移，胆固醇的外流可通过弥散或受体介导的方式进行。在受体介导的胆固醇外流过程中，HDL与细胞上的高密度脂蛋白受体SR-BI结合，激活蛋白激酶C介导的信号系统从而诱导胆固醇的外流，胆固醇从内质网转移到细胞表面。SR-BI/CLA-1在胆固醇/胆固醇酯的流出和流入(摄取)过程中都起着关键作用，被认为是发现新型心血管药物的潜在靶标[6]。胆固醇逆转运的增强将有利于动脉粥样硬化病灶积蓄的胆固醇减少和病变的逆转，因此可以通过升高SR-BI的表达来加速胆固醇逆转运，促进机体特别是动脉壁脂纹病灶中多余胆固醇的清除。

SR-BI的表达调控是种属和细胞类型依赖性的，在不同的组织和细胞中，多种转录因子互相配合，形成一个复杂的调控体系，具体调控机制仍有待进一步深入研究。过氧化物酶体增殖激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)是一类能被内源性脂肪酸以及外源性过氧化物酶体增殖剂(peroxisomeproliferators，PP)激活的甾体激素受体超家族成员，它作为脂质和脂蛋白代谢的调节物，可以调控血浆胆固醇及甘油三酯的水平、促进脂肪细胞分化、影响巨噬细胞内胆固醇内稳态、稳定AS斑块、抑制血小板聚集从而影响AS的发生和发展。研究表明，将无PPARγ的骨髓移植到低密度脂蛋白受体缺失的小鼠中会导致其动脉粥样硬化病变的显著增加。Malerod等的研究结果表明在肝细胞中PPARγ与类视黄酸X受体(retinoid X receptor，RXR)形成异源二聚体后通过作用于SR-BI基因上游启动子区的PPRE元件而诱导SR-BI的表达[7]。另外，固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element bindingproteins，SREBP)在SR-BI的调控过程中也发挥着重要的作用。SREBP是重要的核转录因子之一，是一类固定于内质网和核膜上的膜连接蛋白，具有“碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链”(basicHelix-Loop-Helix-Leucine Zipper，bHLH-Zip)结构，属于bHLH-Zip超家族的一员。它能与脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)等基因的启动子/增强子的固醇调节元件结合，激活靶基因转录，特异性调控胆固醇和脂肪酸代谢，而胆固醇调节肝脏SR-BI表达主要通过SREBP在转录水平进行调控[8]。与其它一些胆固醇敏感基因相似，SREBP通过结合到SR-BI启动子的固醇调节元件(SRE)来促进转录，介导胆固醇对SR-BI的调控作用。

通过药物筛选获得的HDL受体表达上调剂可以通过增加CLA-1的转录水平而增加CLA-1的表达，从而增强胆固醇的逆转运过程，使泡沫细胞中过量的胆固醇外流，并通过逆转运机制转运到肝脏细胞及类固醇激素合成组织被利用和代谢，有可能使动脉血管壁业已形成的由大量胆固醇及胆固醇酯蓄积而成的脂质斑块逐渐消退，从而起到预防和/或治疗动脉粥样硬化及冠心病的作用。

ABCA1是ATP结合盒转运子(ATP-binding cassette transporter)超家族成员之一，它们以ATP为能源转运各种底物，如离子、脂类和细胞毒素等[9]。对ABCA1突变的研究使人们认识到ABCA1在胆固醇及磷脂转运中发挥重要作用。ABCA1的主要功能是参与胆固醇逆转运，ABCA1可将细胞内的胆固醇和磷脂转运至HDL前体载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，apoA-I)，而这是胆固醇逆转运的第一个限速环节，因此ABCA1在脂质代谢和AS的发生及发展中具有重要影响。临床研究证实：ABCA1基因突变可导致丹吉尔(Tangier)病和家族性低α脂蛋白血症(FHA)，两种疾病均表现为低高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)血症和早发冠心病。实验表明ABCA1基因的过度表达可促进胆固醇和磷脂的外流，增加血浆胆固醇、胆固醇酯、HDL-C等的浓度[10]。

胆固醇从组织的清除是预防动脉粥样硬化的关键步骤，从外周流向肝脏的胆固醇逆转运过程，会使泡沫细胞中过量的胆固醇外流并被肝脏细胞利用，有利于清除多余胆固醇，从而防止动脉粥样硬化的发生。ABCA 1促进细胞内胆固醇流出而参与胆固醇的逆转运过程，从而清除外周组织细胞过量的胆固醇。转基因实验证实，ABCA1的过度表达促进胆固醇从巨噬细胞流出，并抑制动脉粥样硬化斑块的形成。因此，ABCA1具有抗早期动脉粥样硬化的功能，已经成为治疗动脉粥样硬化心血管疾病的新靶点，能提高ABCA1基因表达的化合物很有可能成为有效治疗动脉粥样硬化的新药。近来的研究表明，PPAR对巨噬细胞的分化没有影响，但对巨噬细胞的胆固醇内稳态却起着重要作用，如PPARγ和PPARδ在高密度脂蛋白介导的巨噬细胞胆固醇流出中就起着重要的作用。肝X受体(LXR)是PPAR的靶基因，在巨噬细胞中PPARγ能够通过激活LXR的转录而诱导ABCA1的表达[11-13]，提示在胆固醇转运的细胞水平调节中存在着PPARγ-LXRα-ABCA1的途径。

迄今为止，临床上使用的抗动脉粥样硬化药物，主要是通过抑制胆固醇合成来增强LDLR表达的以他汀类为主要代表的药物，增加肝外脂蛋白酶活性的以吉非贝齐等为代表的药物，以及影响胆固醇吸收的药物如考来烯胺，其中尤其以增强LDLR的表达、降低血液中LDL-C水平的抗动脉粥样硬化药物占优势。LDLR调节的胆固醇正向转运的机制最先被揭示，而与胆固醇逆转运过程相关的机制只是近年来才被陆续研究揭示，仍有许多调节机制有待进一步阐明。

曲古抑菌素A(Trichostatin A，TSA)属于组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone Deacetylase inhibitors，HDACi)类化合物。组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)通过对组蛋白N端氨基酸残基进行乙酰化或去乙酰化，调节组蛋白的乙酰化水平，调控基因表达。目前常见的组蛋白去乙酰化酶抑制剂以含有羟肟酸结构的化合物为主，以曲古抑菌素A(TSA，式1)及辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA，式2)为代表；另外，还有环肽类、丙烯酸类及苯甲酰胺类等化合物也具有组蛋白去乙酰化酶抑制剂的活性[14]。曲古抑菌素A最早是在抗真菌模型上筛选得到，从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中分离纯化得到的抗生素[15]。后证实曲古抑菌素A为组蛋白去乙酰化酶的特异性抑制剂[16]。曲古抑菌素A等组蛋白去乙酰化酶抑制剂现在主要作为抗癌药物研究较多，辛二酰苯胺异羟肟酸已进入I/II期临床实验。组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过结合在组蛋白去乙酰化酶分子的催化中心，可逆或不可逆地抑制组蛋白去乙酰化酶活性，阻断由于组蛋白去乙酰化酶功能紊乱而导致的相关基因表达紊乱。

发明人借助高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型(中国专利申请号200410029902.4，2004年3月26日申请，2005年9月28日公开)，经过大量实验，筛选到高密度脂蛋白受体表达上调剂一一曲古抑菌素A。发明人发现另一个组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)也具有类似的SR-BI/CLA-1上调活性。通过在分子水平上的研究，证实曲古抑菌素A具有较强的高密度脂蛋白受体表达的上调作用、ATP结合盒转运子尤其是ABCA1表达的上调作用以及增强肝细胞对胆固醇的选择性摄取和巨噬细胞对胆固醇的摄取及外流能力，实现通过增强胆固醇逆转运而显示其抗动脉粥样硬化作用。具体的，发明人发现曲古抑菌素A通过提高胆固醇逆转运初始和终末步骤的主要参与者清道夫受体BI和ATP结合盒转运子ABCA1的表达水平来促进胆固醇的逆向转运，进而实现其抗动脉粥样硬化作用。

在本发明中，所述高密度脂蛋白受体表达的上调作用是指能在细胞体系中与空白对照相比使细胞中SR-BI/CLA-1的表达水平上调到200％以上，包括利用上述高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型[17]测定的荧光强度增加到200％以上。

在本发明中，所述ATP结合盒转运子ABCA1表达的上调作用是指在细胞体系中与空白对照相比使细胞中ABCA1的表达水平上调到200％以上，包括利用本发明实施例中详述的ABCA1表达上调剂筛选模型[18]测定的荧光强度增加到200％以上。

发明内容

本发明一方面涉及组蛋白去乙酰化酶抑制剂类化合物曲古抑菌素A(TSA)和辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)用于制备通过增强胆固醇逆转运机制预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物的用途，其中所述通过胆固醇逆转运机制实现预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物包括具有上调高密度脂蛋白受体SR-BI/CLA-1表达活性作用的药物和上调ATP结合盒转运子ABCA1表达活性的作用的药物。

利用人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型[17]对中国药用微生物菌种保藏管理中心微生物次级代谢产物库(发酵液或粗提物)进行了大规模筛选，得到阳性菌株04-9179，经鉴定为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，对其进行大量发酵，采用大孔树脂吸附、碳十八烷基键合硅胶(Octa Decyltrichloro Silane，ODS)反相层析等技术从发酵上清液中提取到3种纯化合物(分别命名为9179A、9179B和9179C)，其中9179A在高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型中表现出良好的上调活性。对其进行了ESI-MS的测定；并分别以CD₃OD₃和CD₃COCD₃为溶剂，进行了¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC和¹H-¹H COSY的测定及相应的波谱解析，鉴定该化合物为7-(4-(二甲氨基)苯基)-N-羟基-4，6-二甲基-7-氧-2，4-庚二烯酰胺，即曲古抑菌素A(TSA，式1)。利用HPLC对化合物9179A与曲古抑菌素A标准品进行了比较，9179A的保留时间(7.899min)与曲古抑菌素A标准品的保留时间(7.918min)及UV图谱基本一致，且混和进样时9179A与曲古抑菌素A标准品色谱峰叠加，确证9179A为已知化合物曲古抑菌素A(附图1)。利用高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型[17]对9179A与曲古抑菌素A标准品的量效关系进行了测定，其量效关系曲线基本一致，EC₅₀分别为0.37μM和0.38μM(附图2)。此结果表明9179A与已知化合物曲古抑菌素A(TSA)的生物学活性一致。

式1

借助于人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型，发明人发现7-(4-(二甲氨基)苯基)-N-羟基-4，6-二甲基-7-氧-2，4-庚二烯酰胺，即曲古抑菌素A(式1)显示出对高密度脂蛋白表达较强的上调活性，且作用呈剂量依赖关系(附图2)。

曲古抑菌素A(TSA)是一种已知的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂[14]。选择另2个已知的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA，式2)和丁酸钠(Sodium butyrate，NaBu)，利用高密度脂蛋白受体上调剂筛选模型考察它们对CLA-1启动子的上调作用。实验结果表明3种组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A、辛二酰苯胺异羟肟酸和丁酸钠都具有类似的上调CLA-1启动子转录活性的能力(附图3)。因此抑制组蛋白去乙酰化可能是CLA-1基因的启动子活性上升的机制之一。

式2

将曲古抑菌素A作用于人肝癌细胞HepG2后，实时定量RT-PCR结果显示高密度脂蛋白受体CLA-1的RNA水平明显上调(附图4)，流式细胞技术结果显示高密度脂蛋白受体CLA-1蛋白水平明显上调(附图5)。更进一步的，曲古抑菌素A能够增加HepG2细胞对荧光标记的HDL(DiI-HDL)的选择性摄取(附图6)。以上结果表明曲古抑菌素A可以通过上调人高密度脂蛋白受体CLA-1在肝细胞上的转录活性和受体表达提高肝细胞对HDL-C的摄取，从而促进胆固醇逆转运的终末步骤。

曲古抑菌素A亦能上调小鼠巨噬细胞RAW 264.7中SR-BI的表达。将曲古抑菌素A作用于小鼠巨噬细胞RAW 264.7后，实时定量RT-PCR结果显示高密度脂蛋白受体SR-BI的RNA水平明显上调(附图7)，Western印迹结果显示高密度脂蛋白受体SR-BI蛋白水平明显上调(附图8)。更进一步的，曲古抑菌素A能够增加RAW 264.7细胞对荧光标记的HDL(DiI-HDL)的摄取(附图9)以及促进HDL介导的放射性标记的胆固醇([³H]cholesterol)的外流(附图10)。以上结果表明曲古抑菌素A可以通过上调高密度脂蛋白受体SR-BI在巨噬细胞上的转录活性和受体表达提高巨噬细胞对HDL-C的摄取及胆固醇的外流，从而促进胆固醇逆转运的起始步骤。

在对胆固醇逆转运过程中另一个关键靶点ABCA1的相关研究中，将含有人ABCA1上游调控序列的报告基因载体稳定转染入人肝癌细胞HepG2，构建成稳定表达荧光素酶报告基因的细胞株ABCA1-LUCHepG2[18]，荧光素酶活性的测定结果表明曲古抑菌素A能够上调ABCA1的表达(附图11)。将曲古抑菌素A作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7后，实时定量RT-PCR(附图12)及Western Blot结果(附图13)显示ABCA1表达水平明显上调。以上结果表明曲古抑菌素A可以上调人ABCA 1在巨噬细胞上的转录活性和蛋白水平，从而提高巨噬细胞中脂质的流出，促进胆固醇逆转运的初始步骤。

对曲古抑菌素A分子作用机制的进一步研究提示，曲古抑菌素A通过调控含有SRE/SP1等顺式元件的启动子区域发挥上调CLA-1/SR-BI转录的作用(附图14)。申请人构建了含有不同长度的CLA-1启动子片段的重组质粒，通过比较曲古抑菌素A处理前后不同质粒瞬时转染的HepG2细胞的荧光素酶活性改变，发现-419～-232bp区域对曲古抑菌素A的作用敏感，该区域含有顺式元件SRE和SP1，分别由反式因子SREBP和SP1所调控。申请人以该区域片段为探针，提取HepG 2细胞核蛋白进行电泳迁移率变动实验(electrophoreticmobility shift assay，EMSA)检测，发现随着曲古抑菌素A浓度上升，迁移条带的量增加，提示曲古抑菌素A可能通过上调可结合SRE/SP1元件的反式因子的表达或通过调控反式因子与顺式元件的结合来影响CLA-1的转录。进一步的，通过与PPARγ激动剂罗格列酮(rosiglitazone，ROS)联合用药(PPRE顺式元件位于-1055～-419bp)，发现两药合用有一定的累加效应，提示曲古抑菌素A与罗格列酮通过不同的作用机制调控CLA-1的表达。

本发明另一方面，涉及通过上调高密度脂蛋白受体SR-BI/CLA-1的表达增强胆固醇逆转运机制，用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物组合物，其含有治疗有效量选自曲古抑菌素A和辛二酰苯胺异羟肟酸的活性成分以及任选的药学可接受的载体。

更具体而言，含有选自本发明所述曲古抑菌素A和辛二酰苯胺异羟肟酸的药物组合物，可制成适于通过任何合适的途径治疗施用的形式，包括口服、胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)等途径。

一般而言，对于本发明所述曲古抑菌素A和辛二酰苯胺异羟肟酸合适剂量为，每天每千克受者体重约1mg到约100mg，优选地每天每千克体重约1mg到约50mg，最优选地每天每千克体重约1mg到约25mg。希望的剂量优选地为整个一天中以适当间隔施用的2、3、4、5、6或更多的亚剂量。这些亚剂量可以以单位剂型施用，例如，每单位剂型含有约1mg到约100mg、优选地约1mg到约25mg以上、最优选地约5mg到约25mg以上的有效成份。

应当理解，本发明的化合物和组合物的适当剂量可能取决于疾病的类型、严重程度和阶段，并且随患者各不相同。确定最佳剂量一般包括使治疗优点水平与本发明的治疗的任何危险或有害副作用相平衡。

含有本发明所述曲古抑菌素A和辛二酰苯胺异羟肟酸的药物组合物包括适于口、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)施用的制剂。制剂可便利地作为单位剂型，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。这些方法包括使有效成份与组成一种或多种助剂的载体结合的步骤。通常，制剂的制备方法为，使有效成份与液体载体或磨碎的固体载体或此两者均匀且紧密地结合，然后必要时使该产品成形。

适用于口服的本发明的制剂可以是离散的单位，如胶囊、扁囊剂或片剂，每种含有预定量的有效成份；粉末或颗粒；在水或非水液体中的溶液或悬液；或是水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。有效成份也可以是大丸剂、药糖剂或糊剂。

通过任选地与一种或多种助剂一起压缩或模制可以制备片剂。压缩片剂的制备方法可以是，在合适的机器中压缩易流动形式如粉末或颗粒状的有效成份，该有效成份任选地与粘合剂(例如，聚烯吡酮、明胶、羟丙甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉乙醇酸钠、交联的聚烯吡酮、交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂的制备方法可以是，在合适的机器中模制一种用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物。片剂可任选地包被或划痕，并且可以配制使其中的有效成份缓慢或可控制地释放，例如，应用不同比例的羟丙甲基纤维素来得到希望的释放分布图。片剂可任选地包有肠溶衣，使之在肠而不在胃的部分中释放。

适于胃肠外施用的制剂包括：水及非水等渗无菌注射液，其中可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与受者血液等渗的溶质；水及非水无菌悬液，其中可含有悬浮剂和增稠剂，以及用来将化合物导向血液成分或一个或多个器官的脂质体或其它微粒系统。这些制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器如安瓿或小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，只需在使用前加入无菌液体载体如注射用水。临时注射液及悬液可由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备而成。

优选的单位剂量制剂含有如上所述的前体药物成份的每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分。

附图说明

图1：HPLC分析9179A与曲古抑菌素A标准品(TSA)分别及混和进样。

图2：曲古抑菌素A增加CLAP-LUC HepG2细胞荧光素酶活性的量效关系曲线。

图3：组蛋白去乙酰化酶抑制剂(曲古抑菌素A、辛二酰苯胺异羟肟酸和丁酸钠)上调CLA-1启动子活性。

图4：曲古抑菌素A增加HepG2细胞中高密度脂蛋白受体的mRNA水平。

图5：曲古抑菌素A增加HepG2细胞中高密度脂蛋白受体的蛋白水平。

图6：曲古抑菌素A增加HepG2细胞中对荧光标记的HDL(DiI-HDL)的摄取(采用流式细胞仪检测)。

图7：曲古抑菌素A增加RAW 264.7细胞中高密度脂蛋白受体的mRNA水平。

图8：曲古抑菌素A增加RAW 264.7细胞中高密度脂蛋白受体的蛋白水平。

图9：曲古抑菌素A增加RAW 264.7细胞对荧光标记的HDL(DiI-HDL)的摄取(采用流式细胞仪检测)。

图10：曲古抑菌素A增加RAW 264.7细胞对放射性标记的胆固醇([³H]cholesterol)的外流。

图11：曲古抑菌素A上调ABCA1表达的量效关系曲线。

图12：曲古抑菌素A增加RAW 264.7细胞中ABCA1的mRNA水平。

图13：曲古抑菌素A增加RAW 264.7细胞中ABCA1的蛋白水平。

图14：曲古抑菌素A的调控机制研究。

实施例

实施例19179A的制备及结构鉴定

A)9179A的制备

链霉菌04-9179来自中国药用微生物菌种保藏管理中心，对其发酵液上清提取分离，其中组分A(9179A)在人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型中表现出良好的上调活性。

菌种04-9179的发酵

将保藏的04-9179菌种接种到YM斜面，在28℃恒温箱中培养一周后，复壮一次。将种子斜面挖块，碾碎接种于100ml的9179发酵培养基，28℃振摇培养48h，5％(v/v)接种于100ml发酵培养基中，28。℃，200rpm振摇培养48h，然后将发酵液10％(V/V)接种于1000ml发酵培养基中，28℃，200rpm振摇发酵96h后收获。

04-9179活性组分的提取分离

(1)04-9179发酵液4000rpm离心20min，合并上清，挥干后用二甲亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)重新溶解，利用人高密度脂蛋白受体上调剂筛选模型进行活性测定，菌体用丙酮浸泡过夜，过滤后取样，挥干并检测活性。

(2)活性上清液以10∶1的比例进行X-5大孔吸附树脂层析，每分钟流速1/50柱体积，弃滤过液。

(3)以2倍柱体积的20％丙酮洗脱，弃流出液。随后，用2倍柱体积50％丙酮洗脱，收集流出液组分1(Fraction1)。最后以2倍柱体积80％丙酮洗脱，收集流出液组分2(Fraction2)。将收集的组分1、2分别置入高速真空旋转蒸发仪，蒸干丙酮后冷冻干燥，-20℃保存。最后100％丙酮洗脱处理树脂柱，弃流出液。以上步骤流速均为每分钟1/100柱体积。

(4)以20％甲醇平衡ODS柱1-2个柱体积。

(5)将组分1溶于50％甲醇，每克干品约用12-15ml溶剂，必要时超声1-2min。溶液上ODS柱，分别以20％、50％、80％甲醇洗脱2个柱体积，HPLC检测，通过人高密度脂蛋白受体上调剂筛选模型检测活性，分别合并相应的不同活性部分，得到活性组分B和C(FractionB和C)，挥干，-20℃保存。

(6)将组分2溶于80％甲醇，每克干品约用12-15ml溶剂，必要时超声1-2min。溶液上ODS柱，分别以30％、60％、85％甲醇洗脱2个柱体积，收集不同洗脱条件的流出液，HPLC检测，模型测活，分别合并相应的不同活性部分，得到活性组分A(Fraction A)，挥干，-20℃保存。

(7)用HPLC制备柱进一步分离活性组分A、B和C

化合物9179A为白色粉末，都易溶于甲醇、丙酮和DMSO，难溶于水。其理化性质见表1。

表1：9179A的理化学性质

外观	白色粉末
		溶解性	溶于甲醇，丙酮，DMSO
分子量	302
		分子式	C17H22N2O3
UVλmax EtOH nm(ε)	266nm，351nm
		IR(KBr)v max(cm-1)	3215，2976，2927，1655，1597，1547，1529，1446，1375，1334，1244，1188，1171，1059，976，945，825，771，596
ESI-MS(m/z)	303[M+H]+，325[M+Na]+，341[M+K]+

B)化合物9179A的结构解析

对其进行了ES I-MS的测定；并分别以CD₃OD₃和CD₃COCD₂为溶剂，进行了¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC和¹H-¹H COSY的测定及相应的波谱解析，鉴定该化合物为7-(4-(二甲氨基)苯基)-N-羟基-4，6-二甲基-7-氧-2，4-庚二烯酰胺，即曲古抑菌素A。9179A的ESI-MS给出其分子量为302。碳谱中δ131.9(C-2，6)和δ111.9(C-3，5)处的两个芳香碳信号明显高于其它芳香碳，DEPT谱表明为CH，氢谱中对应的δ7.80(H-2，6)和δ6.67(H-3，5)的两组芳香氢积分面积均为2个氢，因此分子中存在1，4-对位取代的苯环结构，H-2与H-3以及H-5与H-6均为邻位耦合(J＝9Hz)。氢谱中δ3.00处的单峰积分面积为6个氢，很明显为芳香环上的N(CH₃)₂的信号。HMBC中可以观察到氮上的甲基与苯环C-4(δ155.5)和H-2、H-6与C-1’羰基(δ201.5)的远程耦合信号，因此苯环上1，4位分别为羰基和二甲氨基取代。¹H-¹H COSY中可以观察到H-8’和H-2’，H-2’和H-3’以及H-5’和H-6’的相关信号，H-5’(δ7.12，J＝15.5)和H-6’(δ5.80，J＝15.5)之间15.5Hz的耦合常数说明双键为反式。HMBC中可以观察到H-3’与C-5’，H-5’与C-3’，H-6’与C-4’的远程耦合，因此两个双键相互共轭。HMBC中还可以找到H-2’和H-8’分别与C-1’羰基的远程耦合，以及H-5’和H-6’与C-7’(δ166.8)羟肟酸羰基的远程耦合，因此两个羰基基团分别连于侧链的两端。经检索化合物并与相关文献比较，最终确定9179A的结构式如图9所示，其结构为已知，与曲古抑菌素A(TSA)相同，化学名为7-(4-(二甲氨基)苯基)-N-羟基-4，6-二甲基-7-氧-2，4-庚二烯酰胺。9179A在CD₃OD和(CD₃)₂CO中的氢谱及与曲古抑菌素A的碳谱比较见表2。

9179A在(CD₂)₂CO中的氢谱以及碳谱与文献报道的曲古抑菌素A在DMSO-d₆的氢谱和碳谱数据基本一致，因此9179A被确定为是曲古抑菌素A，化学名为7-(4-(二甲氨基)苯基)-N-羟基-4，6-二甲基-7-氧-2，4-庚二烯酰胺。

表29179A和曲古抑菌素A的氢谱和碳谱的化学位移和多重性比较

(a)500MHz，在CD₃OD中；(b)125MHz，在CD₃OD中；(c)15MHz，在CDCl₂+CD₃OD中。

C)9179A与曲古抑菌素A标准品的HPLC比较

为进一步确定9179A结构与曲古抑菌素A的一致性，分别对曲古抑菌素A标准品、9179A及两者混合样品进行HPLC分析。利用SHIMADZUVP-ODS分析柱(150×4.6mm，5μm)，甲醇/水/三氟醋酸(甲醇∶水∶TFA，50∶50∶0.1)洗脱，流速1ml/min，柱温40℃，352nm紫外下检测。

实验结果见附图1，9179A保留时间(7.899mi n)与曲古抑菌素A标准品保留时间(7.918min)及UV图谱基本一致，且混和进样时9179A与曲古抑菌素A标准品色谱峰叠加，说明9179A确为已知化合物曲古抑菌素A(式1)。

实施例2高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型测定9179A和曲古抑菌素A标准品上调高密度脂蛋白受体表达活性

A)重组表达质粒pGL3-CLAP的构建

菌株和细胞株

E.coli DH5α用于质粒DNA的遗传操作。人肝癌细胞株HepG2(购自上海午立生物技术有限公司)用于人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型的构建。

质粒

pGEM-T(购自Promega公司)用于PCR产物的克隆。pGL3-Basic(购自Promega公司)为报告基因载体，含有无启动子的萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶编码基因，用于人高密度脂蛋白受体调控序列的克隆。

pGL3-control(购自Promega公司)含有SV40启动子和增强子序列，用于荧光素酶表达的阳性对照。pRL-TK(购自Pr omega公司)包含编码海肾(Renilla reniformis)荧光素酶的cDNA，与实验载体共转染哺乳动物细胞，用于双荧光素酶报告基因体系的内对照。

人高密度脂蛋白受体基因调控序列的获得

根据文献报道的CLA-1基因序列，利用软件Primer Premier 5.0设计PCR引物P1(5’-CCTCGAG TGG AGC CAT TGT GTG CAA AG-3’)(SEQ ID NO：2)和P2(5’-CAAGCTT CGG CGA CAG AGA CGA CAC AG-3’)(SEQ ID NO：3)，用于扩增CLA-1基因上游-1055bp-62bp(CLA-1基因起始密码子ATG中的A为+1)长度为996bp的片段，其中P1引入了XhoI酶切位点，P2引入了Hind III酶切位点。

以人肝癌细胞BEL-7402总DNA为模板设立25μl PCR反应体系：1×PCR缓冲液，0.5mol/L P1引物和P2引物，2.5μmol/L dNTPs，0.5U Taq DNA聚合酶。反应条件为94℃变性5min，94℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸1min 20s(30个循环)，72℃延伸10min。PCR扩增的目的片段用pGEM-T载体克隆后酶切鉴定并测定所得调控序列的序列，如SEQ ID NO：1所示。

依据分子克隆中所述的方法[19]，将PCR产物与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5受体菌，用蓝白斑法筛选转化子。对转化子进行快速质粒提取后，用XhoI和HindIII双酶切鉴定，鉴定正确的转化子命名为E.coli DH5α/pGEM-CLAP。

重组质粒pGL3-CLAP的构建

用XhoI和HindIII双切重组质粒pGEM-CLAP得到目的片段后，将目的片段与经过相同双酶切的pGL3-basic质粒相连，从而将人SR-BI基因上游调控序列定向插入到pGL3-basic的荧光素酶基因上游，构建成重组质粒pGL3-CLAP。

B)稳定转染细胞株CLAP-LUC HepG2的建立

(1)细胞培养

MEM-EBSS培养基(Hyclone公司)(含10％标准胎牛血清，Hyclone公司)用于肝癌细胞HepG2的培养。上述培养基补加600μg/ml的新霉素G418用于构建的稳定转染细胞CLAP-LUC HepG2的培养。

(2)转染

采用Lipofectamine^TM2000(Invitrogen公司)介导的方法，将重组质粒pGL3-CLAP和pcDNA3共转染入HepG2细胞。经700μg/ml的新霉素G418处理14天后，带有新霉素抗性的细胞克隆形成。对形成的细胞克隆进行一系列单克隆化操作，同时跟踪其荧光素酶活性。将高表达荧光素酶活性且呈现正常细胞周期的稳定细胞克隆命名为CLAP-LUC HepG2(G418维持浓度为600μg/ml)。

C)人高密度脂蛋白受体SR-BI上调剂的筛选

(1)荧光素酶表达活性的测定

细胞荧光素酶表达活性的测定采用荧光检测试剂盒LuciferaseAssay System(Promega公司)。用BMG公司的Polarstar Galaxy紫外-可见-荧光台式培养板用分光光度计检测荧光素酶活性。

(2)筛选条件的优化及最终确定

将CLAP-LUC HepG2细胞以一定密度接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁约6小时后，即长至90％满时换为无血清的MEM-EBSS培养基(200μl/孔)，同时加入一定浓度的阴性对照(溶剂DMSO)、阳性对照(罗格列酮)和待测样品。继续于37℃，5％CO₂条件下培养。18小时后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)(137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄，pH 7.3)漂洗细胞一次，每孔加入预先稀释好的1×CCLR(Cell Culture Lysis Reagent)裂解液20μl，37℃裂解细胞20min后，完全转移细胞裂解液至不透明白板中的相应各孔内，并采用荧光检测试剂盒Luciferase AssaySystem测定细胞中荧光素酶的活性。

通过对筛选过程中溶液DMSO的终浓度、样品作用于细胞的时间以及每孔接种的细胞数等条件进行优化，最终确定筛选条件如下：每孔接种5×10⁴个细胞，DMSO终浓度0.1％，样品作用时间为18小时。

待测样品对荧光素酶表达活性改变率的计算

用如下方程计算待测样品对荧光素酶表达活性的改变率：

改变率(％)＝A/B×100

其中，A为加入待测样品后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)，B为加入阴性对照样品(溶剂DMSO)后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)。

D)9179A和曲古抑菌素A标准品增加CLAP-LUC HepG2细胞荧光素酶活性的量效关系曲线

按照C)中所述的方法，将CLAP-LUC HepG2细胞以5×10⁴个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁约6小时后，分别换为含系列稀释浓度的9179A和曲古抑菌素A标准品的无血清MEM-EBSS培养基(200μl/孔)。注意保持各浓度孔中DMSO的终浓度为0.1％，另设含终浓度0.1％DMSO培养基的孔做空白对照。继续于37℃，5％CO₂条件下培养18小时后，按照上述处理方法测定细胞中荧光素酶的活性。

9179A和曲古抑菌素A标准品在0.03-1.33μM浓度范围内能够上调CLAP-LUC HepG2细胞荧光素酶的表达，在浓度为1.33μM时达到最高上调活性2000％(测定结果见附图2)。

E)组蛋白去乙酰化酶抑制剂类化合物对CLA-1启动子活性的影响

检测曲古抑菌素A、辛二酰苯胺异羟肟酸和丁酸钠对CLAP-LUCHepG2细胞荧光素酶活性的影响。实验结果见附图3，曲古抑菌素A、辛二酰苯胺异羟肟酸和丁酸钠在一定浓度下均能够上调CLAP-LUCHepG2细胞荧光素酶的表达。

实施例3：曲古抑菌素A对肝癌细胞HepG2高密度脂蛋白受体CLA-1的影响

A)HepG2细胞培养

MEM-EBSS培养基(Hyclone公司)(含10％标准胎牛血清<Hyclone公司>)用于肝癌细胞HepG2的培养。

B)采用实时定量RT-PCR的方法研究曲古抑菌素A对CLA-1转录水平的影响

(1)细胞总RNA的提取

人肝癌细胞HepG2以5×10⁵个接种60mm细胞培养板，37℃，5％CO₂条件下培养24小时后，用冰预冷的PBS漂洗细胞2次，分别加入含0.03、0.3、0.6μM(DMSO含量为0.1％)曲古抑菌素A的无血清MEM-EBSS培养基，同时对照板加入含0.1％DMSO的相应培养基。37℃，5％CO₂条件下培养24小时后，用Trizol试剂(Invitrogen公司)进行细胞总RNA的提取(具体操作步骤按照试剂盒的说明书进行)。提取细胞总RNA后用琼脂糖凝胶电泳检测核糖体RNA(rRNA)的完整性并测定所提取RNA的浓度。

(2)逆转录反应——cDNA的合成

采用ThermoScript^TMRT-PCR System试剂盒(Invitrogen公司)进行，具体操作步骤按照试剂盒说明书所述。模板RNA各4μg分别与ThermoScript^TM和引物RT Oligo(dT)₂₀混合，55℃保温60min进行逆转录反应，反应结束后于85℃加热5min以终止反应。所得cDNA于-20℃保存或继续行以下的PCR反应。

(3)Real-time PCR检测

采用SYBR Green PCR Master Mix和RT-PCR(ABI公司)

将获得的cDNA样品分别配制Real-Time PCR反应体系。体系配置如下：

2×PCR Master Mix缓冲液12.5μl；上、下游引物(2μM)各2.5l；模板7.5μl；总体积25μl。将溶液混合，5000rpm短暂离心。

将PCR反应液置于Real-time PCR仪上，按下列反应条件进行PCR反应。

95℃，10分钟，1个循环；95℃，15秒，60℃，30秒，78℃，15秒(收集荧光)，40个循环；55℃，1分钟，95℃，1分钟，1个循环；55到95℃，每5秒升高1℃，81个循环检测溶解曲线(MeltingCurve)。

检测目的基因及作为内对照的持家基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的引物各自的扩增曲线(将模板倍比稀释后对阈值[Ct值]进行线性拟合)，R²均大于0.98；对引物进行溶解曲线检测，结果均呈现单峰，且2％琼脂糖凝胶电泳验证扩增片段大小正确，说明无非特异扩增，符合采用Real-time PCR实验进行定量的要求。

各样品的目的基因和持家基因磷酸甘油醛脱氢酶(内参)分别进行Real-time PCR反应。各样品的阈值由iQ5 Optical System version1.1.1442.0软件(Bio-Rad公司)给出。每个样品中目的基因的相对含量利用ΔΔCt法计算，计算公式为：

实验结果见附图4，曲古抑菌素A可剂量依赖性地上调HepG 2细胞中CLA-1基因的mRNA水平，0.3μM及0.6μM曲古抑菌素A作用后，其上调率分别为47.6％和51.6％。

C)采用流式细胞仪检测曲古抑菌素A对CLA-1蛋白水平的影响

(1)HepG 2细胞按5×10⁵个/孔接种6孔板；

(2)37℃，5％CO₂条件下培养24h后以PBS漂洗细胞2次，每孔加入一定浓度以相应无血清培养基稀释的待测化合物，同时做无化合物对照；

(3)24h后以胰酶消化各孔细胞，用冷PBS漂洗细胞1次；

(4)以4％(w/v)多聚甲醛(用PBS配制，65℃水浴不断搅拌至完全溶解，0.22μm滤膜过滤，4℃保存，2周内有效)2ml，4℃固定细胞过夜或室温固定40min；

(5)固定结束后，1000rpm离心5min，弃多聚甲醛，并用PBS漂洗细胞1次；

(6)用1ml含5％FBS的PBS重悬细胞，4℃放置15min；

(7)1ml PBS洗细胞1次，将细胞均分为两份；

(8)一抗孵育(1∶50稀释)：相应的对照管不加一抗稀释液，只加入相同体积的PBS，混匀，4℃放置50min后，1ml PBS洗细胞2次；

(9)二抗孵育(FITC标记，1∶100-1∶150稀释)：加入二抗稀释液后将细胞混匀，4℃放置50min(此步开始尽量避光操作)后，1ml PBS漂洗细胞2次；

(10)每管样品加入0.5ml PBS重悬细胞，300目尼龙膜过滤，流式细胞仪检测。

实验结果见附图5，曲古抑菌素A可剂量依赖性地上调HepG2细胞中CLA-1蛋白水平，0.3μM及0.6μM9179A作用后，其上调率分别为48.0％和53.7％。

D)采用流式细胞仪检测曲古抑菌素A对细胞摄取DiI-HDL的影响

人肝癌细胞HepG2以5×10⁴个接种24孔细胞培养板，37℃，5％CO₂条件下培养24小时后，用冰预冷的PBS漂洗细胞2次，分别加入含0.03、0.3、0.6μM(DMSO含量为0.1％)曲古抑菌素A的无血清MEM-EBSS培养基，同时对照孔加入含0.1％DMSO的相应培养基。37℃，5％CO₂条件下培养24小时后，每孔加入2μg/ml DiI-HDL，37℃孵育4h。以冷PBS漂洗细胞1次，各孔分别加入1ml含有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS，于4℃放置1h。轻轻吹打并分散细胞，细胞悬液于4℃，800×g，离心3min。收集细胞重悬于0.5ml PBS中，过300目尼龙网后上流式细胞仪检测荧光值。

实验结果见附图6，曲古抑菌素A对HepG2细胞摄取胆固醇的能力具有一定的上调作用，0.03μM、0.1μM和0.3μM的曲古抑菌素A对HepG2细胞摄取DiI-HDL分别上调了50.5％、386.3％和70.9％。其中0.1μM的曲古抑菌素A对细胞摄取DiI-HDL的作用最强。0.6μM曲古抑菌素A作用时对DiI-HDL的摄取有一定程度的下降，可能与在此浓度下曲古抑菌素A表现出一定的细胞毒作用有关。

实施例4曲古抑菌素A对RAW 264.7细胞中高密度脂蛋白受体SR-BI的影响

A)RAW 264.7细胞的培养

DMEM-高糖培养基(Hyclone公司)(含10％标准胎牛血清<Hyclone公司>)用于小鼠巨噬细胞RAW 264.7的培养。

B)Real-time PCR测定曲古抑菌素A对RAW 264.7细胞SR-BImRNA水平的影响

如实施例3中A)所述，实验结果见附图7，曲古抑菌素A可剂量依赖性地上调RAW 264.7细胞中SR-BI基因mRNA水平，0.3μM及0.6μM曲古抑菌素A作用后，其上调率分别为45.0％和64.8％。

C)Western blot方法测定曲古抑菌素A对RAW 264.7细胞SR-BI蛋白水平的影响

(1)蛋白样品的制备

小鼠巨噬细胞RAW 264.7以7×10⁵个/ml接种60mm细胞培养板，37℃，5％CO₂条件下培养24h后，用冰预冷的PBS漂洗细胞2次，加入含0.03、0.3、0.6μM(DMSO含量为0.1％)曲古抑菌素A的无血清MEM-EBSS培养基，同时对照板加入含0.1％DMSO的相应培养基。曲古抑菌素A作用24h后，以冰预冷的PBS漂洗细胞2次，各孔板分别加入200μl的裂解液(50mM Tris-HCL，pH7.4，150mM NaCl，1％NP40，0.1％SDS)，于冰上裂解细胞20min。收集各组细胞裂解液，于4℃，10,000g离心5min。收集上清用BCA试剂盒(PIERCE公司)对蛋白进行定量。加入一定量的5×蛋白上样缓冲液，于沸水浴中煮10min，冷却后于-20℃保存备用或进行随后的蛋白电泳。

(2)Western Blot

来自对照组和加药组的各30g蛋白提取物进行12％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体胶的配制和电泳方法按照分子克隆[19]进行。电泳完成后进行随后的转膜反应(0.45μm PVDF膜)，转模完成后以含0.1％Tween 20的PBS(PBST)配制的5％脱脂奶粉对膜进行室温封闭1h。相对应分子量的PVDF膜分别与各自的一抗孵育过夜。目的蛋白为小鼠抗人的CLA-1单克隆抗体(BD公司产品)，内参为兔抗人的β-肌动蛋白(β-actin)的多克隆抗体(Santa Cruz公司产品)。二抗分别为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG(Santa Cruz公司产品)，室温孵育1h。采用增强型发光检测系统进行(Santa Cruz公司产品)凝胶成像后并行各条带的灰度扫描。用人的β-肌动蛋白作为内对照来标准化CLA-1免疫反应的条带。

实验结果见附图8，曲古抑菌素A可剂量依赖性地上调RAW 264.7细胞中SR-BI蛋白质水平，0.3μM及0.6μM曲古抑菌素A作用后，其上调率分别为133.6％和160.2％。

D)采用流式细胞仪检测曲古抑菌素A对RAW 264.7细胞摄取DiI-HDL能力的影响

方法见实施例3的C)，实验结果见附图9，曲古抑菌素A对RAW264.7细胞摄取胆固醇的能力具有一定的上调作用，其中0.1μM、0.3μM和0.6μM的曲古抑菌素A对HepG2细胞摄取DiI-HDL的量分别上调85.2％、189.9％和169.6％，呈一定的量效关系。

E)利用放射性氚标记的胆固醇([³H]cholesterol)检测曲古抑菌素A对RAW 264.7细胞胆固醇外流能力的影响

(1)液闪液的配制

1000ml甲苯中溶解5g PPO(2，5-二硝基恶唑，5-Diphenyloxazole)和150mg POPOP(1.4-双-[2-(5-苯基恶唑)]-苯，1，4-Bis-[5-phenyl-oxazoyl-2]-benzene)；

(2)RAW 264.7细胞接种96孔板，待细胞汇合度至50％；

(3)加入5μCi/ml[1，2-³H]胆固醇，37℃孵育24h；

(4)用含1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗细胞3次；

(5)加入含1mg/ml BSA的培养基及不同剂量的曲古抑菌素A(0，0.03，0.3，0.6μM)，37℃孵育18-24h；

(6)用含1mg/ml BSA的PBS洗细胞3次；

(7)加入100μg/ml HDL(溶于含1mg/ml BSA的培养基)，37℃孵育24h；

(8)收集培养基上清，10,000g离心5min；

(9)细胞部分溶于己烷∶异丙醇＝3∶2的溶液中萃取过夜；

(1O)将收集的液体分别转移至1.5cm×1.5cm的3M滤纸上(做好标记)，75℃烘干；

(11)将纸片放在液闪杯中，加入10ml液闪液，闪烁计数仪计数(Beckman LS6000)。

实验结果见附图10，曲古抑菌素A在0.6μM浓度能够上调RAW264.7细胞胆固醇的外流。

实施例5曲古抑菌素A增加RAW 264.7细胞ABCA1的表达

A)曲古抑菌素A增加ABCA1表达的量效关系曲线

(1)重组表达质粒pGL3-ABCA1的构建

菌株和细胞株

E.coli DH 5α用于质粒DNA的遗传操作。人肝癌HepG 2细胞株用于重组表达质粒pGL3-ABCA1的瞬时转染。

质粒

pGEM-T(Promega公司)用于PCR产物的克隆。pGL3-Basic(Promega公司)为报告基因载体，含有无启动子的萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶编码基因，用于ABCA1调控序列的克隆。pGL3-control(Promega公司)含有SV40启动子和增强子序列，用于荧光素酶表达的阳性对照。

ABCA1基因调控序列的获得

根据文献报道的ABCA1基因序列，利用软件Primer Premier 5.0设计PCR引物，用于扩增人ABCA1基因上游-819bp-+71bp(+1为ABCA1基因的转录起始位点)长度为890bp的片段。PCR扩增的目的片段用pGEM-T载体克隆后酶切鉴定并测定所得的序列。

依据分子克隆实验指南中所述的方法[19]，将PCR产物与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5受体菌，用蓝白斑法挑选转化子。对转化子进行快速质粒提取后，用XhoI和HindIII双酶切鉴定，鉴定正确的转化子命名为E.coli DH5α/pGEM-ABCA1。

重组质粒pGL3-ABCA1的构建

用XhoI和HindIII双切重组质粒pGEM-ABCA1得到目的片段后，将目的片段与经过相同双酶切的pGL3-basic质粒相连，从而将人ABCA1基因上游调控序列定向插入到pGL3-basic的荧光素酶基因上游，构建成重组质粒pGL3-ABCA1。

(2)稳定转染细胞株ABCA1-LUC HepG2的建立

细胞培养：MEM-EBSS培养基(Hyclone公司)(含10％标准胎牛血清<Hyclone公司>)用于肝癌细胞HepG2的培养。上述培养基补加500μg/ml新霉素G418用于构建的稳定转染细胞ABCA1-LUC HepG2的培养。

转染：采用Lipofectamine^TM2000(Invitrogen公司)介导的方法，将重组质粒pGL3-ABCA1和pcDNA3共转染入HepG2细胞。经600g/ml G418处理14天后，带有新霉素抗性的细胞克隆形成。对形成的细胞克隆进行一系列单克隆化操作，同时跟踪其荧光素酶活性。将高表达荧光素酶活性且呈现正常细胞周期的稳定细胞克隆命名为ABCA1-LUC HepG2(G418维持浓度为500g/ml)。

(3)量效关系曲线的测定

将ABCA1-LUC HepG2细胞以3×10⁴个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，过夜培养后(细胞贴壁≥12h)，换为含系列稀释浓度的待测样品的无血清MEM-EBSS培养基(200l/孔)。注意保持各浓度孔中DMSO的终浓度为0.1％，另设含终浓度0.1％DMSO培养基的孔做空白对照。继续于37℃，5％CO₂条件下培养18小时后，按照实施例1中所述处理方法测定细胞荧光素酶的活性。

待测样品对荧光素酶表达活性改变率间接反应了细胞中ABCA1表达的变化情况，用如下方程计算待测样品对荧光素酶表达活性的改变率：改变率(％)＝A/B×100

其中，A为加入待测样品后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)，B为加入空白对照样品(溶剂DMSO)后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)。

曲古抑菌素A在0.1-10M浓度范围内能够上调ABCA1-LUCHepG2细胞荧光素酶的表达，在浓度为1.66μM时达到最高上调活性248.3％(测定结果见附图11)。

B)曲古抑菌素A对RAW 264.7细胞ABCA1基因mRNA水平的影响

Real-time RT-PCR方法测定曲古抑菌素A对RAW 264.7细胞ABCA1基因mRNA水平的影响，如实施例3中A)所述。实验结果见附图12，曲古抑菌素A可剂量依赖性上调RAW 264.7细胞中ABCA1的mRNA水平，0.3μM及0.6μM曲古抑菌素A作用后，其上调率分别为632.9％和750.4％。

C)曲古抑菌素A对RAW 264.7细胞ABCA1基因蛋白水平的影响

Western印迹方法测定曲古抑菌素A对RAW 264.7细胞SR-BI基因蛋白水平的影响，如实施例4中B)所述。实验结果见附图13，曲古抑菌素A对RAW 264.7细胞中ABCA1的蛋白水平也有一定的上调作用，0.3μM及0.6μM曲古抑菌素A作用后，其上调率分别为47.6％和42.8％。

实施例6曲古抑菌素A作用机制研究

参照实施例2中方法，为进一步揭示曲古抑菌素A上调CLA-1基因启动子活性的作用区域，除原有的pGL 3-CLAP(-1055～-62bp)重组质粒外，构建了不同长度的CLA-1启动子区域与荧光素酶报告基因相连的重组质粒，包括：pGL3-CLAP1(-1195～-62bp)，pGL3-CLAP3(-419～-62bp)，pGL3-CLAP4(-232～-62bp)，pGL3-CLAP5(-182～-62bp)四个质粒，并对转染了不同质粒的HepG2细胞中荧光素酶活性进行了比较，如附图14A所示，CLAP1、CLAP、CLAP3重组质粒表现出较高的转录活性，提示包含SRE/SP1元件的区域(-419～-232bp)及包含PPRE元件的区域(-1055～-419bp)对CLA-1基因的转录活性影响较大。

检测曲古抑菌素A对转染了不同重组质粒的HepG2细胞中荧光素酶报告基因活性的影响，结果如附图14B所示，曲古抑菌素A对含有SRE/SP1元件的区域(-419～-232bp)存在与否敏感，当该区域缺失时，对CLA-1上调的活性即失去，而其他区域对曲古抑菌素A的加入与否不敏感。说明曲古抑菌素A可能通过含有SRE/SP1元件的区域调控CLA-1的转录。

用PCR方法扩增含有SRE/SP1元件的CLA-1启动子区域(-419～-232bp)，以该片段为探针，利用电泳迁移率变动实验(electrophoreticmobility shift assay，EMSA)的方法检测不同浓度曲古抑菌素A处理HepG2细胞后，对HepG2细胞核蛋白提取物与该探针结合的影响，如附图14C所示，不同浓度曲古抑菌素A使核蛋白结合探针片段的量逐渐上升，而加入过量的(10倍)非标记的该探针片段后，结合条带明显减弱，说明该条带是核蛋白与探针特异性结合形成。结果表明曲古抑菌素A可能直接或间接上调SREBP或SP1转录因子的表达或活性，通过结合含有SRE/SP1元件的区域(-419～-232bp)发挥上调CLA-1转录的作用。

有文献报道，在肝细胞中PPARγ与类视黄醇X受体(RXR)形成异源二聚体后通过作用于SR-BI基因上游启动子区的PPRE元件而诱导SR-BI的表达。本工作以上实验结果也表明PPRE元件对CLA-1的启动子活性非常重要(附图14A)，因此利用已知的PPARγ特异性激动剂罗格列酮(Rosiglitazone，ROS)，检测曲古抑菌素A、罗格列酮分别及联合用药后对CLA-1启动子活性的影响，结果显示二者联合应用具有累加效应(如附图14D所示)，也说明曲古抑菌素A和罗格列酮是通过不同的作用机制影响CLA-1的转录。

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Claims (9)

1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备用于通过增强胆固醇逆转运治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为式1所示的曲古抑菌素A或式2所示的辛二酰苯胺异羟肟酸：

式1

式2。

3.权利要求1所述的用途，其中组蛋白去乙酰化酶抑制剂与PPARγ激动剂联合应用。

4.权利要求3所述的用途，其中PPARγ激动剂是罗格列酮。

5.权利要求1所述的用途，其中所述通过增强胆固醇逆转运治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物为上调高密度脂蛋白受体SR-BI/CLA-1表达活性的药物。

6.权利要求1所述的用途，其中所述通过增强胆固醇逆转运治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物为上调ATP结合盒转运子ABCA1表达活性的药物。

7.一种通过增强胆固醇逆转运用于治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物组合物，其中含有治疗有效量的曲古抑菌素A或辛二酰苯胺异羟肟酸作为活性成分，以及任选的药学可接受的载体。

8.一种用于上调高密度脂蛋白受体SR-BI/CLA-1表达活性实现增强胆固醇逆转运的药物组合物，其中含有治疗有效量的曲古抑菌素A或辛二酰苯胺异羟肟酸作为活性成分，以及任选的药学可接受的载体。

9.一种用于上调ATP结合盒转运子ABCA1表达活性实现增强胆固醇逆转运的药物组合物，其中含有治疗有效量的曲古抑菌素A或辛二酰苯胺异羟肟酸作为活性成分，以及任选的药学可接受的载体。

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