CN101184511A - 包括由核酸分子和胶原组成的络合物精细颗粒的制剂 - Google Patents

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Abstract

本方面涉及包括至少一种选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、组氨酸、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸及其盐的物质的添加剂，其用于防止核酸和胶原的精细颗粒络合物的聚集，还涉及适合用于将核酸转运入细胞的包括大小受控制的颗粒络合物的制剂的制备。

Description

包括由核酸分子和胶原组成的络合物精细颗粒的制剂
技术领域
本发明涉及包括受控大小的核酸分子和胶原的精细颗粒络合物的制剂，并且特别地涉及由添加某种添加剂形成的核酸分子和胶原的精细颗粒络合物，涉及包括精细颗粒络合物并可用于转移核酸分子进入细胞的制剂、用于制备其的方法等等。
背景技术
显示优良的生物相容性和在此以前已经用于可植入的医疗器械的胶原具有广泛的应用可能，包括再生医学、在生物学技术中的试剂或者试剂盒等等。此外，胶原的作用显示胶原通过静电相互作用形成核酸分子和胶原的络合物而稳定核酸分子并促进该核酸分子转移入组织，使用胶原的DDS被认为是有希望的该核酸分子的DDS(专利文件1、2和3)。特别地，缺乏抗原部分并且是可溶的端胶原(atelocollagen)作为医药物质具有高的应用价值。
通过在细胞中补充正常的基因并且通过修复或者修饰遗传缺陷等等治疗疾病的基因治疗中，编码靶标酶或者细胞因子的核酸分子被转移入患者的细胞，以便在体内由该核酸分子产生需要的物质以治疗该疾病。然而，当基因本身被使用时，基因转移到靶细胞的效率低。为了增加基因转移的效率并且为了改善疗效，已经使用采用诸如腺病毒的病毒作为载体的(非专利文件1-6以及在其中引用的参考文献)或者脂质体配方(非专利文件7-9)等等的方法。另外，已经开发了诸如碱性的脂质(非专利文献10以及许多其后开发的脂质)和碱性的基于聚合物的化合物(典型实例：聚乙烯亚胺(非专利文献11)等等)的基因载体。这些载体可应用到核酸配方，其中该核酸不仅包括用于基因治疗的基因，而且还包括调节细胞内基因表达的反义DNA、siRNA等等。
更进一步地，已经提供了一种方法，该方法使用核酸分子与胶原(生物聚合物)的络合物以增加基因转移效率和改善疗效(专利文献3)。由于优良的生物相容性，预计胶原适用于制药学。
从核酸分子的稳定性或者制药学上的应用的观点出发，优选在中性的pH条件中制备和维持络合物，然而从该观点出发，其对于胶原却颇成问题，在大约中性pH的水溶液中，胶原的特性是趋向于组装以形成沉淀物。特别地，在生理条件下胶原有规则地组装形成小纤维的事实或者通过核酸分子络合物的形成促进凝集的事实可能损害制备具有匀质性的药物的加工特征或者是制备具有匀质性的药物的障碍。虽然胶原和核酸分子络合物的巨大的不能溶解聚集物的形成可能有利地延长从贮存(depot)型缓释制剂的释放，但是当需要广泛的体内分布或者有效的传递入细胞时，其不是优选的。为了有效的进入细胞，优选的络合物的大小不大于几个μm，并且巨大的聚集物是不合需要的。据说，考虑到毛细血管的的直径(5-10μm)，为了达到在体内的广泛分布，优选的络合物的颗粒的大小不大于5μm。因此，优选的与核酸分子形成络合物的胶原以单一分子或者由几个至几十个胶原分子组成的细的小纤维形式存在。
在中性pH的0.9M-1.0M NaCl中，原纤维胶原(Fibrillary collagens)倾向于被溶解，根据“Collagen Jikken-ho”，Kodan-sha，第3页，通过添加对中性pH中的胶原纤维的形成具有抑制活性的葡萄糖或者蔗糖(0.25-0.5M)(连同加入的盐)而变得更有效。更进一步地，专利文献4描述了作为纤维分解试剂(其分解纤丝状的胶原为非纤丝状的胶原)的生物相容的酒精、氨基酸等等。然而，该专利文献4中公开的组合物不包含核酸分子，并且该文献与由胶原和核酸分子组成的络合物无关。
在加入核酸分子时，胶原可以自身分解为均一和澄清的，但是立即形成几微米或者较长的络合物，然后该络合物形成聚集物，通过加热到大约室温的温度，该聚集倾向被更大的促进。作为结果，10μm或者更大的聚集络合物容易形成为云雾状悬浮液，继之沉淀。更进一步地，通过保存和冻融方法将促进聚集。
本发明者第一次发现仅仅包括胶原时，通常被用来防止胶原聚集的上述方法(增溶作用或者使用纤维分解试剂)可能是有用的，但是当核酸分子参与在其中时，该方法对预防胶原的聚集或者巨大的颗粒的形成是无效的。因此强烈需要开发包括基本上由胶原和核酸分子组成的络合物的精细颗粒制剂，其能够稳定地维持均一的分散性，换言之，其是均一的并且显示优良的分散性并且适合于实际用途。
专利文献1：JP-A-H9-71542，
专利文献2：WO2001/97857，
专利文献3：WO2003/297
专利文献4：JP-A-H9-99052
非专利文献1：Cardiovascular Research，28，445(1994)
非专利文献2：Science，256，808(1992)
非专利文献3：Gastroenterology，106，1076(1994)
非专利文献4：TIBTECH，11，182(1993)
非专利文献5：J.Biol.Chem，266，3361(1991)
非专利文献6：Nature Medicine，1，583(1995)
非专利文献7：Biochem Biophys Acta，1097，1(1991)
非专利文献8：Human Gene Therapy，3，399(1992)
非专利文献9：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，11277(1992)
非专利文献10：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)
非专利文献11：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，7297(1995)
发明详述
本发明的目的是提供包括核酸分子的精细颗粒制剂，其能够稳定地维持均一的分散性，换言之，其显示优良的均一分散性并且适于实际用途。
特别地，本发明涉及包括作为必要组分的三种物质(即核酸分子/胶原/添加剂)的制剂，其包括大小受控制的络合物并且凭此解决通过简单地将胶原的纤维分解试剂应用到核酸分子和胶原的络合物中不能解决的技术问题。
本发明基于包括核酸分子和胶原的络合物的大小受控制的精细(fine)颗粒，具体的，本发明提供通过将某种添加剂加入到核酸分子和胶原而形成的络合物的精细颗粒，和用于转运(运送)核酸分子进入细胞中的包括所述精细颗粒络合物的制剂。本发明还提供用于制备所述精细颗粒络合物或者所述制剂的方法。不仅从可能的对体内动力学有影响或者有效果而且从特别是在药学领域的应用的质量控制角度考虑，不可避免的要控制络合物的颗粒大小。
本发明者集中地研究了上述问题，并且发现当某种有机碱或酸与胶原和核酸分子的络合物同时存在时，可以防止10μm大小或者更大的络合物的形成，同时维持这两种物质的亲合力。意外的发现即使当胶原与核酸形成络合物时，也可以防止聚集。
本发明涉及以下内容。
1.用于制造以大小受控制的以精细颗粒形式存在的核酸分子和胶原的络合物的添加剂，其包括至少一种选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、组氨酸、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸及其盐的物质。
2.包括在上述1中公开的添加剂和胶原的水溶液，其用于制造以大小受控制的精细颗粒形式存在的核酸分子和胶原的络合物；或者
包括在上述1中公开的添加剂和胶原的水溶液，其用于通过将核酸加入到该水溶液而制备包括核酸分子和胶原的大小受控制的络合物的精细颗粒。
3.根据上述的2的水溶液，其中
(1)添加剂的总浓度是1-20％，
(2)胶原的浓度是0.01％-2％，并且
(3)该添加剂选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、单乙醇胺、三乙醇胺、柠檬酸、酒石酸及其盐。
4.根据上述的2的水溶液，其中该添加剂选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸及其盐。
4-1.根据上述的2的水溶液，其中该添加剂选自精氨酸、赖氨酸及其盐。
4-2.包括在上述1中公开的添加剂的水溶液，用于将包括核酸分子和胶原的干燥配置剂重新构建为液体配置剂，其用于制造以大小受控制的精细颗粒形式存在的核酸分子和胶原的络合物。
5.根据上述4的水溶液，其中
(1)添加剂总浓度是1-10％，和/或
(2)该水溶液的pH是5-9和
(3)该添加剂选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、单乙醇胺、三乙醇胺、柠檬酸、酒石酸及其盐；优选该添加剂选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸及其盐；并且更优选该添加剂选自精氨酸、赖氨酸及其盐。
6.包括上述1中公开的添加剂、核酸分子和胶原的制剂，其中该核酸分子与胶原络合以形成大小受控制的精细颗粒络合。
7.根据上述6的制剂，其中
(1)该核酸分子的浓度是0.001-100mg/ml，优选0.001-50mg/ml，更优选0.001-10mg/ml，
(2)该胶原的浓度是0.01％-2％，
(3)添加剂的总浓度是1-10％，和/或
(4)该水溶液的pH是6-8。
8.根据上述6的制剂，其中该大小受控制的精细颗粒是络合物，以使得该络合物维持分散状态同时防止迅速沉降，并且其可以通过普通注射针毫无困难地给药。
9.根据上述8的制剂，其中该大小受控制的精细颗粒是络合物，其具有的大小适合于通过23至21规格(内径(“ID”)：大约0.4-0.6mm)注射针，其被用来在静脉或者在动脉给药或者肌肉内给药，更优选27至24规格(ID：大约0.2-0.4mm)注射针，其被用来在皮肤内或者在皮肤下给药。
10.根据上述6的制剂，其中该大小受控制的精细颗粒是不大于100μm的颗粒，优选不大于10μm。
11.根据上述6的制剂，其中大小受控制的精细颗粒的至少70％是不大于10μm的颗粒。
12.根据上述6的制剂，其中大小受控制的精细颗粒的至少80％是不大于10μm的颗粒。
13.根据上述6的制剂，其中大小受控制的精细颗粒的至少70％是不大于5μm的颗粒。
14.根据上述6的制剂，其中大小受控制精细颗粒的至少80％是不大于5μm的颗粒。
15通过冷冻干燥上述7所述的溶液获得的冻干配置剂。
16.用于核酸分子和胶原的精细颗粒络合物的聚集抑制剂，其包括至少一种选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、组氨酸、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺及其盐的物质。
17.包括至少一种选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、三乙醇胺及其盐的物质的添加剂，其是：
(1)用于制造以大小受控制的精细颗粒形式存在的核酸分子和胶原的络合物，
(2)用于防止精细颗粒在液体配置剂中聚集并且使得精细颗粒良好分散，该液体配置剂包括含有核酸分子和胶原的大小受控制的精细颗粒络合物，和/或
(3)用于维持精细颗粒的聚集的预防，并且用于维持该颗粒在从干燥配置剂重新构建的液体配置剂中的优良的分散性，其液体配置剂包括含有核酸分子和胶原的大小受控制的精细颗粒络合物。
18.包含在上述17所述的添加剂和胶原的水溶液，其用于制造以大小受控制的精细颗粒的形式存在的核酸分子和胶原的络合物。
19.根据上述18的水溶液，其中
(1)添加剂的总浓度是1-20％，和
(2)胶原的浓度是0.01％-2％。
20.包括上述17所述的添加剂的水溶液，用于将包括核酸分子和胶原的干燥配置剂重新构建为液体配置剂，其是：
(1)用于制造大小受控制的精细颗粒形式的核酸分子和胶原的络合物，和/或
(2)用于防止精细颗粒聚集并且使得该精细颗粒良好分散在重新构建的液体配置剂中，该液体配置剂包括含有核酸分子和胶原的大小受控制的精细颗粒络合物。
21.根据上述20的水溶液，其中
(1)添加剂的总浓度是1-10％，并且
(2)水溶液的pH是5-9。
22.包括上述17所述的添加剂、核酸分子和胶原的制剂，其中该核酸分子与胶原络合以形成大小受控制的精细颗粒。
23.根据上述18的液体配置剂，其中
(1)该核酸分子的浓度是0.001-100mg/ml，优选0.001-50mg/ml，更优选0.001-10mg/ml，
(2)该胶原的浓度是0.001％-10％，优选0.01％-2％，更优选0.01％-0.5％，
(3)添加剂的总浓度是1-10％，和/或
(4)该水溶液的pH是5-9，更优选6-8。
24.根据上述6的制剂，其中大小受控制的精细颗粒是络合物，其具有使得该络合物维持分散状态同时防止迅速沉降的大小，并且其可以通过普通注射针毫无困难地给药。
25.根据上述8的制剂，其中该大小受控制的精细颗粒是络合物，其具有适合于用于静脉内或者动脉内给药或者肌肉内给药的23至21规格(ID：大约0.4-0.6mm)注射针的大小，更优选适合于用于皮肤内或者皮肤下给药的27至24规格(ID：大约0.2-0.4mm)注射针。
26.根据上述8的制剂，其中大小受控制的精细颗粒是不大于100μm的颗粒，优选不大于10μm的颗粒。
27.根据上述8的制剂，其中大小受控制的精细颗粒络合物的至少70％不大于10μm。
28.根据上述8的制剂，其中大小受控制的精细颗粒络合物的至少80％不大于10μm。
29.根据上述8的制剂，其中大小受控制的精细颗粒络合物形式的胶原和核酸分子的络合物的至少70％不大于5μm。
30.根据上述8的制剂，其中大小受控制的精细颗粒络合物形式的胶原和核酸分子的络合物的至少80％不大于5μm。
31.根据上述7的制剂，其中大小受控制的核酸分子和胶原的精细颗粒络合物的聚集得到防止并且在大约从室温到体温的温度范围的非冷冻条件下良好分散而无聚集至少12小时。
32.用于传递核酸分子进入目的细胞的试剂，其包括在上述31中所述的制剂作为活性成分。
33.根据上述4的水溶液，其中该胶原是端胶原。
34.根据上述7的制剂，其中该胶原是端胶原。
35.根据上述7的制剂，其中该核酸分子选自下列的(1)至(6)：
(1)DNA寡核苷酸，
(2)质粒DNA，
(3)RNA寡核苷酸，
(4)RNA/DNA嵌合体寡核苷酸，
(5)反义DNA，及
(6)siRNA。
36.根据上述35的制剂，其中该核酸分子是反义DNA。
37.用于核酸分子和胶原的络合物的软涂层(soft coating)剂，其包括作为活性成分的至少一种选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、组氨酸、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸及其盐的物质。
38.用于核酸分子和胶原的络合物的软涂层剂，其包括作为活性成分的至少一种选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸及其盐的物质。
39.用于核酸分子和胶原的络合物的聚集抑制剂，包括作为活性成分的在上述37或者38中所述的软涂层剂。
40.制备包括具有100μm或者低于100μm的平均颗粒大小的核酸分子和胶原的精细颗粒络合物的制剂的方法，其包括在存在1所述的添加剂和pH5-9的情况下，使核酸分子和胶原进行络合(complexation)。
附图说明
图1是代替绘图的显微照片，其显示不同种类的添加剂对精细颗粒络合物的聚集的抑制效果。对比例3-5使用在专利文献4被公开为典型的“胶原纤维分解试剂”的甘油(丙三醇)，在胶原与DNA混合之后观察到聚集(＞10μm)，当静置在室温时其大小增加，表明甘油不具有抑制胶原和DNA的络合物聚集的效果。
图2是代替绘图的显微照片，其显示精氨酸对由于微粒化、温度、冻融处理的络合物聚集的抑制效果。
图3是代替绘图的显微照片，其显示不同种类的添加剂对络合物的微粒化的效果。在对比例7-5中，使用专利文献4中公开的作为典型的“胶原纤维分解试剂”的丙二醇，当胶原和DNA混合时，观察到许多巨大的聚集(＞100μm)，表明丙二醇不具有对胶原和DNA的络合物的微粒化效果。
图4是代替绘图的显微照片，其显示本发明的制剂对包含高浓度(40mg/ml)核酸分子的制剂中的络合物的聚集的抑制效果。比例尺：100m。
图5是柱状图，显示在敏化和给予制剂24小时之后的小鼠皮炎模型的耳肿胀(swelling)的程度。作为精细颗粒络合物的制剂的包括反义ICAM-1的本发明制剂，与单一给予反义ICAM-1相比，显示较高的抗炎效果(耳-肿胀-抑制效果)。
图6是柱状图，显示在敏化和给予制剂24小时之后的小鼠皮炎模型的耳肿胀(swelling)的程度。包括反义ICAM-1的本发明的冻干配置剂显示有效的抗炎效果(耳-肿胀-抑制效果)，表明本发明的精细颗粒络合物作为冻干配置剂也有用。
具体实施方式
(1)添加剂
本发明的制剂/配置剂的特征在于其包括特别的添加剂、核酸分子和胶原，并且核酸分子与胶原络合以形成大小受控制的精细颗粒。
本申请的发明人集中地研究并且发现精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、组氨酸、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸及其盐不仅能够防止胶原和/或核酸分子和胶原的络合物的聚集，而且能够制造大小受控制的精细颗粒的形式的核酸分子和胶原的络合物，而不抑制胶原与核酸分子的络合。
从此方面，作为第一个实施方案，本发明提供用于制造大小受控制的精细颗粒形式的核酸分子和胶原的络合物的添加剂，其包括至少一种选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、组氨酸、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸及其盐的物质。
本发明人更进一步地发现有机碱(即精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、组氨酸、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺及其盐)能够不仅制造处于大小受控制的精细颗粒形式的核酸分子和胶原的络合物，而且防止该精细颗粒聚集并且使得该精细颗粒良好地分散在液体配置剂中，该液体配置剂包括大小受控制的核酸分子和胶原的精细颗粒络合物，和/或维持对精细颗粒的聚集的防止和该精细颗粒甚至在从干燥配置剂重新构建的液体配置剂中的优良的分散性，其中该液体配置剂包括具有受控制的大小的核酸分子和胶原的精细颗粒络合物。
由此方面，本发明提供包括至少一种选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、三乙醇胺及其盐的物质的添加剂，其是：
(1)用于制造大小受控制的精细颗粒形式的核酸分子和胶原的络合物，
(2)用于防止精细颗粒聚集并且使得精细颗粒良好的分散在液体配置剂中，该液体配置剂包括大小受控制的核酸分子和胶原的精细颗粒络合物，和/或
(3)用于维持对于该精细颗粒聚集的防止及该颗粒的优良分散性，甚至在从干燥配置剂重新构建的液体配置剂中的优良的分散性，该液体配置剂包括大小受控制的核酸分子和胶原的精细颗粒络合物。
于此使用的“盐”包括上述有机碱与盐酸、磷酸或者有机酸的盐，该有机酸选自柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸和乙酸，以及这些酸与选自氢氧化钠、精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、组氨酸、单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的碱的盐。
不限于特定的理论，据信通过围绕胶原或者络合物的离子层，即软涂层(soft-coating)，本发明的添加剂有效地防止聚集并同时维持胶原和核酸分子亲合力。就通常用作胶原的纤维分解试剂的诸如NaCl、磷酸钠或者葡萄糖的盐而论，软涂层与离子的这种效果还没有被认识到。
本发明的添加剂可以更进一步地包含另外一种或多种成分，用于稳定、调节pH、等渗化(isotonization)等等。本发明的添加剂中的有机碱可以与盐酸、磷酸、诸如柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、乙酸等等的有机酸结合用作pH调节剂。
作为效果之一，本发明使得以冷冻状态保存制剂成为可能，或者将制剂转换为冻干(冷冻干燥)配置剂成为可能。低温贮藏为维持包括核酸分子和胶原的络合物的溶液长时间的稳定所必需的。本发明之前，当低温贮藏配置剂融解后，经常引起聚集并且产生巨大的颗粒。长期保存的其他方法的范例包括冷冻脱水以产生冻干配置剂。冻干配置剂的生产包括冷冻步骤和之后的干燥步骤。通常通过在使用的时候添加溶剂而溶解冻干配置剂，但是在一系列加工期间倾向于发生聚集，其经常损害溶解性。根据本发明，聚集得到防止并且精细颗粒良好的分散至如冷冻干燥之前相同的程度。更进一步地，除了稳定剂、pH调节剂和等渗剂，可以增添作为添加剂的赋形剂和增溶剂，并且可以使用糖类。
(2)包括添加剂和胶原的水溶液
本发明的制剂可以使用包括本发明的添加剂和胶原的水溶液制备，其中该制剂包括特定的添加剂、核酸分子和胶原(其特征在于该核酸分子与胶原络合以形成大小受控制的精细颗粒)。
在本实施方案中，本发明提供用于制造大小受控制的精细颗粒形式的核酸分子和胶原的络合物的水溶液，其包括本发明的添加剂和胶原。
该水溶液能被用于溶解冻干的核酸产品或者用于稀释核酸的水溶液。当应用于这样的核酸分子时，本发明的水溶液使得包含在其中的核酸分子和胶原形成大小受控制的精细颗粒络合物。如此，通过使用本发明的包括添加剂和胶原的水溶液(具体地，通过仅仅将该水溶液加入至核酸)而使获得大小受控制的包括核酸和胶原的精细颗粒络合物成为可能，其中该核酸已经被各自方便地合成或者分离，或者作为水溶液或者冻干制品或者以其上涂敷有核酸的片的形式被商业地提供。
本实施方案的水溶液优选如下的水溶液，其中，
(1)添加剂的总浓度是1-20％，和
(2)胶原的浓度是0.01％-2％。
更优选，所述添加剂选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、单乙醇胺、三乙醇胺、柠檬酸、酒石酸及其盐，进一步更优选，该添加剂选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸及其盐，并且最优选，该添加剂选自精氨酸、赖氨酸及其盐。
(3)用于将干燥配置剂重新构建为液体配置剂的水溶液
考虑到活性成分的稳定性，用于注射的药物通常以冻干制品提供，在使用的时候，使用用于注射的蒸馏水使其变为液体配置剂。发明人发现如果将本发明的添加剂等等包括在用于将干燥配置剂重新构建液体配置剂的溶液中，可制备处于期望的精细颗粒形式的核酸和胶原的络合物。
在本实施方案中，本发明提供用于将包括核酸分子和胶原的干燥配置剂重新构建为液体配置剂的包括本发明添加剂的水溶液，其溶液用于制造大小受控制的精细颗粒形式的核酸分子和胶原的络合物。
本实施方案的水溶液优选如下的水溶液，其中，
(1)添加剂的总浓度是1-10％，和/或
(2)水溶液的pH是5-9。
更优选，所述添加剂选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、单乙醇胺、三乙醇胺、柠檬酸、酒石酸及其盐，及进一步更优选，该添加剂选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸及其盐，及最优选，该添加剂选自精氨酸、赖氨酸及其盐。
(4)包括添加剂、核酸分子和胶原的制剂
本发明提供包括本发明的添加剂、核酸分子和胶原的制剂，其中该核酸分子与胶原络合以形成大小受控制的精细颗粒。
用于本发明的“核酸分子”只要其具有大约中性pH范围的聚阴离子(polyanion)的性质，则可以是任何核酸分子，包括多核苷酸、寡核苷酸、DNA和RNA，其是天然的或被修饰的类型，根据此观点，通过静电相互作用，核酸分子与在大约中性pH范围作为带正电荷的聚阳离子的胶原形成络合物。就DNA分子而论，其可以是质粒DNA、cDNA、基因组DNA或者合成物DNA。DNA和RNA可以是双链或单链分子。关于单链分子，其可以是编码或者非编码链。更进一步地，该“核酸分子”可以合成获得或者从细胞分离，并且从功能方面看，其实施例包括作为基因的质粒DNA(可以称为“pDNA”)，用于基因转换的RNA/DNA嵌合体寡核苷酸或者DNA寡核苷酸，用于调控基因表达的反义DNA，诸如siRNA(小干扰RNA)的寡核苷酸，剪切自身的核酶(ribozyme)或者其他的RNAs，诱骗(decoy)寡核苷酸(即具有作为转录因子结合部位的相同序列的双链DNA)等等。修饰的核酸分子包括DNA或者RNA衍生物，其中该衍生物指具有在核苷酸内的磷酸酯、糖或者碱基部分经过化学修饰的核酸，以避免酶的降解。实例包括为了改善对核酸酶的稳定性而具有化学修饰的核酸分子，特别地，那些其中磷酸二酯键的一个氧原子被硫原子(磷硫酰)、甲基(膦酸甲酯)或者氨基(磷酸酰胺化物(phosphoroamidate))替代的核酸分子，磷酸二酯键的两个氧原子被硫原子(二硫代磷酸酯)或者硫原子和甲基(甲基二硫代磷酸酯)替代的核酸分子。另外，实例包括那些其中糖部分被修饰的核酸分子，例如2′-O-甲基RNA、2′-O-甲氧乙基RNA或者封闭的核酸(商标)(LNA)等等。更进一步地，核酸分子包括诸如腺病毒、反转录病毒等等的病毒。
核酸分子不局限于特别的链长。就寡核苷酸或者核酶而论，链长优选从5mer至100mer，更优选从5mer至30mer。就用作反义或者siRNA的寡核苷酸而论，链长大约20mer，并且就用于基因转换的RNA/DNA嵌合体寡核苷酸或者DNA寡核苷酸而论，链长从数打至一百碱基对。用作本发明核酸的质粒DNA不局限于特别的大小并且适当地选自那些具有适于通过遗传工程被高效地制备的大小的那些分子，并且当被引入细胞时，可以有效地表达其编码的遗传信息。这样的质粒DNA通常是数千至数万的碱基对。
用于本发明的“核酸分子”不局限于特别的序列，因此包括那些可从市场上可买到的或者将来将被开发的核酸分子。“核酸分子”的实例包括下列目前用于临床上的反义DNA。
Isis Pharmaceuticals：
VitraveneTM：5′-GCG TTT GCT CTT CTT CTT GCG-3′，SEQ ID NO：1，
AffintakTM：5′-GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA-3′，SEQ ID NO：2，
Alicaforsen TM：ISIS2302(5′-GCC CAA GCT GGC ATC CGT CA-3′，SEQID NO：3)，ISIS2503(5′-TCC GTC ATC GCT CCT CAG GG-3′，SEQ IDNO：4)，ISIS14803(5′-GTG CTC ATG GTG CAC GGT CT-3′，SEQ ID NO：5)，ISIS104838(5′-GCT GAT TAG AGA GAG GTC CC-3′，SEQ ID NO：6).
GENTA Incorporated：
GenasenseTM：5′-TCT CCC AGC GTG CGC CAT-3′，SEQ ID NO：7，
Hybridon Inc.：
GEMTM 231：5′-GCG UGC CTC CTC ACU GGC-3′，SEQ ID NO：8，
Epigenesis Pharmaceuticals Inc.：
EPI-2010：5′-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3′，SEQ ID NO：9
用于本发明的“胶原”是哺乳动物中的主要蛋白质，其组成蛋白质总含量的大约三分之一。作为基本结构，三个胶原链形成三螺旋，并且有至少19种胶原分子和33种α链。其中之一的I型胶原是皮肤、骨和肌腱的主要成分，其具有大约300,000的分子量并且是棒状分子(长度：大约300nm；直径：1.5nm)，由两个α1多肽链(I型)和一个α2多肽链(I型)组成，每个多肽链具有大约100,000的分子量。每个胶原有规则地与相邻的分子相位滞后67nm地排列，形成微纤丝，该微纤丝然后一起组合形成不溶于水的小纤维(纤维)。在本发明中，胶原的特征在于其是单分子-分散状态或者精细纤丝状的状态，而且其在溶液状态中良好的分散。
关于胶原的起源或者分子种类(类型)没有特别的限制，只要维持作为的胶原基本物理性能，则可以使用包括衍生物的任何胶原。通常优选使用源自哺乳动物的I型胶原，该哺乳动物例如牛、猪或者人、鸟、鱼(包括培养细胞和遗传的修饰产品)。更进一步地，通过选择任意地三个α-链可制备作为遗传的修饰产品的新的胶原分子，但是制备和使用由相同种类的三个α-链组成的同源三聚物组成更为实际。虽然胶原自身是较少抗原性的蛋白质，但是当向人类给药异源的胶原时，更优选的胶原是端胶原，因为端胶原几乎无关于抗原性的问题。也就是说，在端胶原中，包含在胶原分子的两个终点的主要的抗原性范围的端肽部分被酶删去。
可用的胶原衍生物包括具有修饰的侧链的胶原或者交联的胶原。具有修饰侧链的胶原的实例包括甲基化的胶原，交联的胶原的实例包括那些用戊二醛、六亚甲基二异氰酸酯或者环氧化合物等等处理的胶原(Fragrance Journal，1989-12，104-109；JP-7-59522，B)。
据报导当结合在一起时，核酸分子和胶原静电和/或物理地相互作用以形成络合物，凭此有利于核酸分子转入细胞并持续地表达基因(非专利文献3)。
于此使用的术语“大小受控制的精细颗粒络合物/以大小受控制的精细颗粒形式存在的络合物”指具有这样大小的络合物，该大小使得在防止迅速沉降的同时维持分散状态，并且该络合物可以通过普通注射针毫无困难地给药。在具有30至16规格的普通注射针中，具体地，该络合物具有适合于通过23至21规格(内径(“ID”)：大约0.4-0.6mm)注射针的大小，该注射针用于静脉内或者动脉内给药或者肌肉内给药，更优选，27至24规格(ID：大约0.2-0.4mm)的注射针被用于皮肤内或者皮肤下给药。用于这种络合物的术语“大小受控制”指络合物为具有不大于100μm，优选不大于10μm的大小的颗粒，其中术语“不大于10μm的大小”指当通过显微镜观察时，其长轴是10μm或者低于10μm，或者该颗粒可以通过具有10μm的孔径大小的过滤器(例如，isopore过滤器，Millipore)。
因此，措辞“核酸分子与胶原络合以形成大小受控制的精细颗粒”指核酸分子和胶原的络合物是不大于100μm的颗粒形式，及没有大于100μm的聚集的络合物，或者大多数的络合物是不大于10μm的精细颗粒形式，具体地，至少70％，优选80％的络合物不大于10μm，更优选，制剂中的胶原和核酸的络合物的至少70％不大于5μm，并且特别地对于血管内的给药的络合物，至少80％不大于5μm。
术语“具有能够使得该络合物维持分散状态并同时防止迅速沉降的络合物”指该络合物具有适当的大小，以便在给药时，其可以毫无困难地通过普通注射针，并且根据注射针的规格，其可以通过23至21规格(内径：大约0.4-0.6mm)等等的注射针。据认为，这种络合物的多数不大于大约10μm。
具体地，本发明的制剂是包括添加剂、核酸分子和胶原的制剂，其中所述添加剂包含至少一种选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、组氨酸、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸及其盐的物质，其中所述核酸和胶原的络合物以大小受控制的精细颗粒的形式存在，例如精细颗粒的至少70％不大于10μm。特别优选的添加剂选自精氨酸、赖氨酸及其盐。
本发明的一个优选方案是液体配置剂，其中，
(1)核酸分子的浓度是0.001-100mg/ml，优选0.001-50mg/ml，更优选0.001-10mg/ml，
(2)胶原的浓度是0.001％-10％，更优选0.01％-2％，
(3)添加剂的总浓度是1-10％，和/或
(4)水溶液的pH是5-9，更优选6-8。
另一个实施方案中，本发明的制剂是包括添加剂、核酸分子和胶原的制剂，该添加剂包含至少一种选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、三乙醇胺及其盐的物质，其中核酸和胶原的络合物为大小受控制的精细颗粒的形式，例如，至少70％的精细颗粒不大于10μm。特别优选添加剂选自精氨酸、赖氨酸及其盐。
本制剂的实例包括液体配置剂和干燥配置剂。只要核酸的稳定性可以被维持，用于制备干燥配置剂的干燥方法不局限于任何特别的方法。实例包括冷冻干燥(冷冻脱水)方法、风干方法和喷雾干燥法。作为干燥配置剂，优选通过冰冻干燥法制备的冻干配置剂。
在本实施方案的液体配置剂中，核酸分子和胶原的大小受控制的精细颗粒络合物防止被聚集并且在本发明的上述有机碱添加剂的作用下良好的分散。通过重新构建，该干燥配置剂还被用于制备液体配置剂，其中防止了颗粒的聚集，并且维持了颗粒优良的分散性。
术语“精细颗粒......被防止了聚集并且被较好的分散”指阻止了颗粒的聚集并且维持10μm或者低于10μm的精细颗粒状态，并且在大约从室温到体温的温度范围的非冷冻条件下，3小时或者更长的时间及至少12小时无大于100μm的聚集。
冻干配置剂的特别的用途在于：当被重新构建(再水化(rewatered))时，维持了分散性而没有引起聚集。
如果需要，本发明的制剂除了核酸分子和胶原的精细颗粒络合物之外，还可以包括药学上可接受的添加剂。药学上可接受的添加剂的实例包括当该精细颗粒络合物用作注射剂时的等渗剂、pH调节剂、缓解剂等等；以及当该精细颗粒络合物用作固体制剂时的赋形剂、崩解剂等等，其在药品赋形剂的日文手册(Japanese Handbook of PharmaceuticalExcipients)(日本药品赋形剂委员会(Japan Pharmaceutical ExcipientsCouncil))中描述。具体的实例包括用于维持pH在6-8的盐及用于使得被导入的细胞等渗的糖类。
源于核酸分子与胶原的络合物具有受控制的大小的事实的效果不仅是络合物的颗粒的大小在给药之后影响生物分布和医学的效果，而且在药品试剂需要的质量控制中具有重要的意义，因为当制备或者使用制剂时，那些事实使防止聚集并且改善一致性成为可能。在本发明的配置剂中，当颗粒络合物被放置在室温或者体温下大约3小时或者更长时间时，其显示稳定的分散性并且维持稳定而无聚集。本特征除去了从生产该配置剂至给药该配置剂以来所必需的严格温度调节，并且使得其处理容易。制造过程中去除严格的温度调节在产业化上具有极大的优势。另一方面，不应用本申请的核酸分子和胶原的络合物的制剂具有缺点。例如：在温度升高之后经常立即形成大的聚集物，并且该制剂变成云雾状，其引起性质的重大变化以及使得通过注射难以给药或者难以确保在制造过程中的一致性。
源于核酸分子和胶原的络合物具有受控制的大小的事实的另一个效果是有可能获得适合于更进一步地用于配方处理的络合物。例如：当络合物将被包括在用于DDS的其他的药品载体，特别地精细颗粒中时，所述络合物必须为大小小于包封该络合物的精细颗粒的均一颗粒形式，该DDS例如是微胶囊或者微球体、纳米胶囊或者纳米球体、脂质体、乳剂等等。然而，传统的络合物并非均一并且具有大于用于包封的精细颗粒的大小，因此不能包括在其中。在本发明的精细颗粒络合物的情况下，例如，当Arg用作添加剂时，获得的络合物的大多数具有足够小的大小以至于能够通过400nm过滤器，并因此可以被包括在精细颗粒中。通过使用本发明水溶液状态或者干燥形式的络合物，可以将传统的配置剂处理方法应用于本产品。
(5)用于传递(运输)核酸分子进入想要细胞的制剂
本发明的制剂能被用于传递(运输)核酸分子进入想要的细胞。当本发明的制剂为固态形式时，在使用净化水、生理盐水或者与活体等渗的缓冲液转变为溶液之后，该制剂载入细胞。
想要的细胞的实例包括用于常规试验的动物细胞、充当基因治疗靶标的细胞、组织或者器官。当存在血清的情况下体外给药细胞时，核酸分子自身几乎不能传递进入细胞；然而在与胶原形成精细颗粒络合物之后，核酸第一次可以被高效地传递入细胞。如此本发明的制剂不仅用于筛选法或者其试剂，而且作为基因治疗的制剂。
当该核酸分子是质粒DNA或者载体，例如用于基因治疗的病毒时，当传递入细胞时，优选以适于表达编码的遗传信息的形式构造，具体地，优选以包括想要的基因表达所需的例如启动子的元件，或者使得能够整合入染色体所需要的元件的载体形式。
当将质粒DNA和反义DNA、siRNA等等导入细胞时，有必要使用对细胞具有最小的可能影响的方法。然而，据认为大多数的常规导入方法有高的细胞毒性。相反地，本发明使用天然存在于活体内并且与细胞接触的胶原的络合物，因此几乎不损害细胞。这使得无噪音(withoutnoise)地测量传递的核酸分子的功能成为可能。
在本发明制剂的特别使用方法中，本发明的制剂包括胶原与质粒DNA、表达功能将被阐明的基因的腺病毒载体、抑制功能将被阐明的基因表达的反义寡核苷酸，或者siRNA的精细颗粒络合物，该制剂被包被并且被排列在培养平板的固体表面上。于此使用的固体平板包括96孔多孔板和微培养板。当被包被的络合物颗粒被干燥并且固定在固体上之后，将细胞接种入并在板上培养几天。该包被的络合物颗粒(以颗粒形式存在的络合物，颗粒络合物)被有效地导入附着于该包被部分的细胞，并引起功能将被检测的基因表达很长的时间，或者抑制相同的基因表达很长的时间。几天之后，通过检测该细胞的形态学、在细胞中该基因表达的水平、或者该细胞产生的蛋白质的种类或者数量，而可以阐明靶基因的功能。
实施例
本发明更进一步地通过下列实施例加以说明，但是这些实施例不以任何方式限制本发明。
实施例1
精氨酸对寡核苷酸和胶原的络合物的微粒化效果
通过使用盐酸精氨酸作为添加剂，制备胶原和反义DNA的络合物，具有序列(5’-TGCATCCCCCAGGCCACCAT-3’，SEQ ID NO：10)的磷硫酰反义DNA，抗细胞粘着分子小鼠ICAM-1作为寡核苷酸，并且端胶原作为胶原(2％端胶原溶液)。它们混合在PBS(pH 7.4)中直到最后浓度的2％精氨酸、0.1mg/ml反义DNA和0.05％胶原，使该混合物在冰箱(4℃-10℃)中静置过夜直至获得胶原和反义DNA的络合物。
作为对比例，除了不包括精氨酸之外按照上述类似的方式通过混合寡核苷酸和端胶原制备络合物。
以同样方式，分别在有和没有2％精氨酸的条件下，使用具有序列(5’-AACCCATCGGCTGGCACCAC-3’，(SEQ ID NO：11)的磷硫酰反义DNA制备本发明的络合物和另一个对比例，该反义DNA是抗炎性细胞因子TNF-α的反义DNA。
获得的络合物通过isopore过滤器过滤(孔径大小：10μm，Millipore)以检测其大小，及测量滤液中的端胶原的量。结果在下表1中显示。
表1
Figure A20068001827200221
Ex.*：实施例
CEx*：对比例
如表1所示，根据实施例制备的样品1-1和1-3为透明溶液，并且大约90％的端胶原通过过滤器(孔径大小：10μm)。另一方面，根据对比例制备的样品1-2和1-4变得轻微白色混浊并且仅仅大约30％的端胶原通过过滤器(孔径大小：10μm)。
在实施例1的条件下，使用的反义DNA的摩尔浓度大约是高达端胶原的摩尔浓度的10倍，由此过量反义DNA可能是以游离形式存在；然而全部的端胶原被认为是与反义DNA形成络合物。因此，该结果表明在本发明的络合物的情况下，根据端胶原的量，其中大约90％为不大于10μm的精细颗粒形式；而在对比例的情况中，其中大约70％以大于10μm的巨大的聚集物形式存在。
实施例2
不同添加剂对寡核苷酸和胶原的络合物的微粒化影响
通过在中性水溶液中，使用本发明添加剂混合抗小鼠ICAM-1的磷硫酰反义DNA和端胶原制备络合物，所述添加剂为盐酸化物的形式或用不同的酸中和，并且使得混合物在冰箱(4℃-10℃)中静置过夜。使用的添加剂的种类和各自成分的最后浓度在表2中概括。
为了染色反义DNA，向各自的样品中添加单链核酸荧光染色剂YOYO(分子探针)，并且通过荧光显微镜观察样品。通过荧光显微镜可以区别大于几微米的颗粒。各个实施例产生均一的染色图谱，而没有观察到超过10μm的颗粒。
表2-1
Figure A20068001827200231
*PB：磷酸盐缓冲液
表2-2
Figure A20068001827200241
实施例3
各种添加剂对精细颗粒络合物关于温度的聚集的抑制效果
作为添加剂，使用精氨酸或者氨基丁三醇，其中前者以盐酸化物形式使用，并且在用盐酸中和之后，使用后者。通过混合添加剂、作为寡核苷酸的抗小鼠ICAM-1的磷硫酰反义DNA和端胶原在中性0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.5-7.9)中的端胶原，使得分别具有2％、0.125mg/ml和0.3％的最后浓度，并且使得该混合物在冰箱(4℃-10℃)静置二天，而制得络合物。作为对比例，除了不包括添加剂之外，用相同的方式制备络合物，或者选择并且使用尿素(蛋白质的变性剂和增溶剂)、甘油(丙三醇，专利文献4中公开的特有的胶原纤维分解剂)、乙酰色氨酸钠(蛋白质的稳定剂)或者吐温80(表面活性剂)。在实施例和对比例中的各自成分的最后浓度如表3所示。为了在室温下检验聚集的抑制效果，将各自的络合物在室温静置18小时并且比较静置前后的颗粒状态。在静置之后肉眼观察的结果(观测)在表3中显示。静置前后的荧光显微照片在图1显示。
图1显示在室温静置之前的冷藏条件下，在样品3-3(对比例)中有超过100μm的巨大络合物，而在使用精氨酸(实施例3-1)、氨基丁三醇(实施例3-2)、尿素(对比例3-4)或者乙酰色氨酸(对比例3-7)的情况中，几乎没有巨大的聚集物形成，表明存在微粒化的影响。然而，在尿素和乙酰色氨酸钠的情况中，在室温静置之后观察到颗粒的聚集。更进一步地，在甘油(对比例3-5)的情况中，在胶原与DNA混合之后，观察到聚集物(＞10μm)，其在室温静置之后变得更大。吐温80(对比例3-7)也没有效果，并且在室温静置之后，显示出颗粒的聚集更进一步地倾向于发展为巨大的颗粒。
另一方面，在包括精氨酸(实施例3-1)或者氨基丁三醇(实施例3-2)的样品中，在室温静置之后，维持精细和均一的络合物，表明它们甚至在室温下也发挥抑制聚集的效果。
表3
Figure A20068001827200261
实施例4
添加剂对冻融的影响
为了确定本发明的添加剂对在冻融时颗粒络合物的状态的影响，样品2-6(实施例)和样品1-2(对比例)在-20℃冷冻。在确认样品被完全冷冻之后，在室温下进行融解。融解之后，将样品冷藏在5℃，之后再回到室温，并且检查颗粒大小。重复两次这个程序。结果，样品2-6(实施例)中在冻融前后的荧光显微照片中没有发现大于10μm的络合物。当滤过过滤器(孔径大小：0.4μm)时，超过90％的胶原通过过滤器。显示该络合物甚至在冻融之后仍然维持精细颗粒状态。另一方面，样品1-2(对比例)中在冻融前后发现大于100μm的巨大的集合物。当滤过过滤器(孔径大小：10μm)时，在冷冻之前，大约20％的胶原通过过滤器，在冻融之后，百分比显示更大降低的倾向，并且10-17％胶原通过过滤器，表明经过冻融可能促进了络合物颗粒的聚集。
表4
Figure A20068001827200271
实施例5
添加剂对冷冻干燥的影响
为了检测添加剂对在冷冻干燥状态的颗粒的影响，通过用与实施例1相似的方法制备每个含有表5-1中显示的组合物的络合物。在实施例5-2，5-3中，加入作为赋形剂的糖类。
各个络合物制备之后，通过使用荧光显微镜观察在冷冻干燥前后络合物-颗粒的状态而进行评估。当加入水重新构建时，每个实施例的冷冻干燥配置剂迅速溶解并得到澄清的水性溶液。表5-2中显示显微镜观察的结果。
表5-1
Figure A20068001827200272
表5-2
Figure A20068001827200281
实施例6
微粒化对质粒DNA和胶原的络合物的影响，以及对温度和冻融处 理引起的聚集的抑制作用
使用与实施例1相同的方法，采用质粒DNA(pCMV-LacZ，4079kb，分子量大约2,500,000)替代反义DNA制备质粒DNA和胶原的络合物。各组合物在表6-1中显示。使得每个络合物在5℃或室温静置1天，或者在-40℃冷冻1天，然后在室温融化。通过荧光显微镜观察络合物的颗粒状态。使用picoGreen dsDNA Quantitation Reagent(MolecularProbes)对质粒DNA进行荧光染色。结果在表6-2和图2中显示。
表6-1
Figure A20068001827200282
表6-2
Figure A20068001827200283
据显示，在质粒DNA和胶原形成的络合物中，在对比例6-2中观察到大于10μm的络合物颗粒及其聚集物。然而，在实施例中防止了精细颗粒的聚集，并且获得良好分散的络合物。而且，在对比例中，通过1天室温静置或冻融处理，显示聚集的趋势被促进。在实施例中，通过这些处理之后，没有观察到聚集，显示维持精细颗粒状态的效果。
实施例7
多种添加剂对络合物聚集的影响
通过与实施例3相似的方法制备具有表7中显示的组成的络合物。作为添加剂，使用组氨酸(由盐酸中和)、酒石酸(由NaOH中和)或柠檬酸(Na盐)，通过在中性的0.1M磷酸缓冲液(pH 6.5-7.9)中混合添加剂、作为寡核苷酸的抗小鼠ICAM-1磷硫酰反义DNA和端胶原，并使得各自的终浓度分别为2％，0.125mg/ml和0.3％而制备络合物，然后将混合物在冰箱中(4℃-10℃)静置2天。作为对比例，以相同的方法制备络合物，但是不使用添加剂或者添加丙二醇(专利文献4中公开的典型的胶原的纤维分解试剂)。通过肉眼观察和通过荧光显微镜观察，评估络合物的状态。肉眼观察的结果在表7中显示，并且荧光显微镜的结果在图3中显示。
表7
Figure A20068001827200291
肉眼观察的结果显示样品7-1至7-3(实施例)都是澄清的，而样品7-4和7-5(对比例)是白色混浊并且是非均一的。
显微镜观察(图3)同样显示在不含有添加剂的样品7-4(对比例)中有超过100μm的巨大的络合物。相似地，对于专利文献4公开的典型的胶原的纤维分解试剂丙二醇(对比例7-5)而言，在与胶原和DNA混合后，观察到许多超过100μm的巨大的络合物。因此，对于胶原和DNA的络合物的微粒化效果没有被确认。与上述相反，对于本发明的组氨酸(实施例7-1)、酒石酸(实施例7-2)和柠檬酸(实施例7-3)而言，很难观察到巨大的络合物，并且微粒化效果得到确认。
实施例8
精氨酸对高浓度的寡核苷酸和胶原的络合物的微粒化效果
在下述条件下，采用表8中显示的添加剂等等，并使用与实施例2相似的方法制备制剂，并通过荧光显微镜检测是否有聚集。显微镜观察的结果在表8和图4中显示。显微镜显示均一的染色分布情况，并且没有超过10μm的巨大的聚集物。
表8
样品号     添加剂的种类浓度 用于中和的盐或酸   寡核苷酸种类浓度 端胶原 溶剂 荧光显微镜
Ex.8 精氨酸4％ HCl 反义ICAM-140mg/ml 0.05％ 水   未发现聚集物(＞10μm)
测试实施例1
在小鼠皮炎模型中的效果
为了评估本发明的制剂的医药效果，通过与实施例2相似的方法制备包括反义ICAM-1作为核酸分子(表9)的制剂，并给药于小鼠皮炎模型(参见，Hum Gene Ther.2004 Mar；15(3)：263中公开的评估系统)。然后评估抗炎效果。
表9
Figure A20068001827200311
根据下述方法对小鼠皮炎模型的医药效果进行评估。
通过电动理发推子和剃刀将小鼠(8周龄，BALB/c Cr Slc，
Figure A20068001827200312
)腹部剃毛。在剃毛部位连续2天施加0.5％2，4-二硝基氟苯(DNFB；溶剂，丙酮∶橄榄油＝4∶1)(25μL)以敏化小鼠。第二次敏化后6天，使用厚度计(Peacock)在麻醉状态下检测右耳的厚度，以获得在先数值。然后，在右耳施加0.2％ DNFB(15μL)以诱导皮炎，并且在15分钟之后，从尾静脉以10mL/kg剂量的反义ICAM-1的形式给药制剂(实施例9-1或9-2)。测试的对照组包括接受生理盐水的组、接受反义ICAM-1而没有端胶原的组(对比例9-3)和接受端胶原而无反义ICAM-1的组(对比例9-4)。施加DNFB 24小时之后，再次检测右耳的厚度，计算诱发皮炎前后之间的数值的不同，以获得耳肿胀指数(×10-3mm)。计算各个组(n＝5)的平均值(±S.E.)，其显示在图5中。
对小鼠皮炎模型的医药效果的评估显示单独给药反义ICAM-1(对比例9-3)或端胶原(对比例9-4)与接受生理盐水的组相比，对耳肿胀没有显示出显著的抑制效果。然而，接受本发明制剂的组(实施例9-1，9-2)显示出对耳肿胀显著的抑制效果。这些结果表明作为核酸分子和胶原的精细颗粒络合物的本发明的制剂与单独给药反义ICAM-1相比，具有较高的医药效果。
测试实施例2
为了检测本发明的冻干配置剂的医药效果，通过与实施例5相似的方法制备包括反义ICAM-1作为核酸分子(表10)的冻干制剂，给药于小鼠皮炎模型，并以与检测实施例1相同的方式检测抗炎剂效果。
表10
Figure A20068001827200321
根据下述方法评估对小鼠皮炎模型的医药效果。
通过电动理发推子和剃刀对小鼠腹部剃毛(8周龄BALB/c CrSlc，)。向剃毛的部位施加一次0.5％2，4-二硝基氟苯(DNFB；溶剂，丙酮∶橄榄油＝4∶1)(100μL)以敏化小鼠。敏化后6天，使用厚度计(Peacock)在麻醉状态下检测左、右耳的厚度，以获得在先数值。然后，在左、右耳施加0.2％DNFB(20μL)以诱导皮炎，并且在15分钟之后，从尾静脉以10mL/kg剂量的反义ICAM-1的形式给药先前通过加水而重新构建的冻干配置剂(实施例10-1)。测试的对照组接受生理盐水。施加DNFB 24小时之后，再次检测双耳的厚度，并计算诱发皮炎前后之间的数值的不同，以获得耳肿胀指数(×10-3mm)。计算各个组(n＝6)的平均值(±S.E.)，其显示在图6中。
对小鼠皮炎模型的医药效果的评估显示接受本发明冻干配置剂的组(实施例10-1)与接受生理盐水的组(对照组)相比，显示出对耳肿胀显著的抑制效果。这些结果表明作为冻干配置剂的本发明的精细络合物也有用。
工业实用性
根据本发明，提供了包括主要由核酸分子和胶原组成的络合物的精细颗粒的制剂，其能够维持分散的均一性，换句话说，其是均一的并显示极好的分散性，而且适合实际使用。特别地，本方面提供通过抑制胶原自身在中性水溶液中的聚集的而包括大小受控制的精细颗粒络合物的制剂，并且也防止了在络合物中胶原和核酸分子之间的进一步的聚集以导致巨大聚集物的进程，在胶原和核酸分子的络合过程中，通过在特定有机碱或酸作为胶原的添加剂共存的情况下，在核酸分子和胶原之间进行络合物的形成。本方面的制剂不仅应用于核酸制药产品，而且在核酸中具有潜在的应用。
序列表
<110>Dainippon Sumitomo Pharma Co.，Ltd.
<120>包括核酸和胶原的复合物的精细颗粒制剂
<130>666675
<150>JP 2005-086318
<151>2005-03-24
<160>11
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡聚物
<400>1
gcgtttgctc ttcttcttgc g    21
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡聚物
<400>2
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<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡聚物
<400>3
gcccaagctg gcatccgtca    20
<210>4
<211>20
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<220>
<223>反义寡聚物
<400>4
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<210>5
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<220>
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<211>20
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<220>
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<400>6
gctgattaga gagaggtccc    20
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<211>18
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<220>
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<213>人工序列
<220>
<223>反义寡聚物
<400>9
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<213>人工序列
<220>
<223>硫代磷酸酯反义寡聚物
<400>11
aacccatcgg ctggcaccac    20

Claims (20)

1.用于制备大小受控制的精细颗粒形式的核酸分子和胶原的络合物的添加剂，其包括至少一种选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、组氨酸、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸及其盐的物质。
2.根据权利要求1所述的添加剂，其用于制造包括浓度为至少1％的该添加剂的pH5-9的水溶液，所述水溶液能够以这样的方式调节大小：使得作为大小受控制的精细颗粒，至少70％的颗粒不大于10μm。
3.一种水溶液，其包括上述权利要求1所述的添加剂和胶原，其用于制备大小受控制的精细颗粒形式的核酸分子和胶原的络合物。
4.一种水溶液，其包括权利要求1所述的添加剂和胶原，其通过将核酸加入到该水溶液中而用于制备核酸分子和胶原的大小受控制的精细颗粒络合物。
5.一种水溶液，其包括权利要求1所述的添加剂，用于将包括核酸分子和胶原的干燥配置剂重新构建为液体配置剂，其用于制备大小受控制的精细颗粒形式的核酸分子和胶原的络合物。
6.一种水溶液，其pH为5-9，包括浓度为至少1％的权利要求1所述的添加剂，其能够以这样的方式调节大小：使得作为大小受控制的精细颗粒，至少70％的颗粒不大于10μm。
7.一种制剂，其包括权利要求1所述的添加剂、核酸分子和胶原，其中该核酸分子与胶原络合以形成大小受控制的精细颗粒。
8.根据权利要求7所述的制剂，其中大小受控制的精细颗粒络合物的至少70％尺寸不大于10μm。
9.根据权利要求7或8所述的制剂，其是液体配置剂。
10.一种添加剂，其包括至少一种选自精氨酸、氨基丁三醇、甲基葡胺、赖氨酸、三乙醇胺及其盐的物质，其为：
(1)用于制备大小受控制的精细颗粒形式的核酸分子和胶原的络合物，
(2)用于在含有核酸分子和胶原的大小受控制的精细颗粒络合物的液体配制剂中防止精细颗粒聚集并使得精细颗粒良好分散，和/或
(3)用于在从干燥配置剂重新构建的液体配置剂中维持对于精细颗粒聚集的防止以及精细颗粒在液体配置剂中的良好分散，该液体配置剂包括大小受控制的核酸分子和胶原的精细颗粒络合物。
11.一种水溶液，其包括权利要求10所述的添加剂和端胶原，其用于制备大小受控制的精细颗粒形式的核酸分子和胶原的络合物。
12.一种水溶液，其包括如权利要求10所述的添加剂，用于将包括核酸分子和胶原的干燥配置剂重新构建为液体配置剂，其为
(1)用于制备大小受控制的精细颗粒形式的核酸分子和胶原的络合物，和
(2)用于在包括核酸分子和胶原的大小受控制的精细颗粒络合物的重新构建的液体配置剂中防止精细颗粒聚集和使得精细颗粒良好分散。
13.一种制剂，其包括权利要求10所述的添加剂、核酸分子和胶原，其中该核酸分子与胶原络合以形成大小受控制的精细颗粒。
14.根据权利要求13所述的制剂，其中大小受控制的精细颗粒络合物的至少70％尺寸不大于10μm。
15.根据权利要求13或14所述的制剂，其是包括权利要求10所述的添加剂的液体配置剂，并且其中核酸分子和胶原的大小受控制的精细颗粒络合物被防止聚集并良好分散。
16.根据权利要求13或14所述的制剂，其是包括权利要求10所述的添加剂的干燥配置剂，并且其通过重新构建而形成液体配置剂，其中维持了对于精细颗粒聚集的防止和精细颗粒的良好分散。
17.根据权利要求7-9和13-16中任一项所述的制剂，其将核酸分子转运入目的细胞。
18.根据权利要求1、2和10中任一项的添加剂，其中胶原是端胶原。
19.根据权利要求3-6、11和12中任一项所述的水溶液，其中胶原是端胶原。
20.根据权利要求7-9和13-17中任一项所述的制剂，其中胶原是端胶原。
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