CN101171020A

CN101171020A - 植物抗癌制剂

Info

Publication number: CN101171020A
Application number: CNA2006800149132A
Authority: CN
Inventors: S·F·彭; S·陆; S·L·E·刘; 刑洪涛
Original assignee: Ultra Biotech Ltd
Current assignee: Ultra Biotech Ltd
Priority date: 2005-05-03
Filing date: 2006-05-03
Publication date: 2008-04-30
Also published as: WO2006117566A8; US20070020346A1; WO2006117566A3; WO2006117566A2; EP1888093A2; CA2609791A1; AU2006242999A1

Abstract

本发明涉及一种制备五味子属、栝楼属、大豆属或丝兰属植物提取物的方法。也公开了包含至少两种上述提取物的组合物，和使用该组合物诱导细胞凋亡或细胞周期停滞以及抑制血管生成或肿瘤细胞转移的方法。

Description

植物抗癌制剂

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.第119节，本申请要求于2005年3月3日申请的序列号为60/677,055的美国临时申请的优先权，其内容在此引入作为参考。

背景技术

天然植物产物用于医药领域有着悠久的历史。它们通常作用缓和、副作用少。相比而言，常规用于癌症治疗的化学疗法常引起恶心、呕吐、口腔炎、食管炎或腹泻。因此，存在开发植物抗癌制剂的需要。

发明内容

一方面，本发明提供了五味子属(Schizandra)植物(如五味子(Schizandra chinensis))、栝楼属(Trichosanthes)植物(如栝楼(Trichosanthes kirilowii maxim))、大豆属(Glycine)植物(如大豆(Glycinemax-(L.)Merr.))、或丝兰属(Yucca)植物(如丝兰(Yucca schidigera))提取物的制备方法。这些方法包括首先在升高的温度(例如55℃～65℃)下较长时间(例如0.5～24小时)地孵育包含[i]五味子属植物的一部分(如果实)、栝楼属植物的一部分(如果实)、大豆属植物的一部分(如果实)或丝兰属植物的一部分(如枝干)和[ii]萃取溶剂的混合物，以获得包含不可溶物质的孵育混合物。

优选地，五味子属植物或栝楼属植物的一部分与萃取溶剂以1∶1wt./vol.～1∶10wt./vol.(如1∶2wt./vol.～1∶5wt./vol.)的比例混合，大豆属植物或丝兰属植物的一部分与萃取溶剂以1∶1wt./vol.～1∶20wt./vol.(如1∶5wt./vol.～1∶10wt./vol.)的比例混合。萃取溶剂可以是水或极性有机溶剂，也可以是它们的混合物(如30％～90％的乙醇水溶液)。可任选地调整这样获得的孵育混合物使pH值在4和10之间(如6和8之间)。

孵育后，无论是否调整，均可除去混合物中的不可溶物质，获得粗提取物。由五味子属植物或栝楼属植物的一部分得到的粗提取物置于基质中，如包含在固相萃取柱(如C18反相柱)中的分离介质或结合树脂，然后使洗脱溶剂(如乙醇)通过该基质，得到洗脱液，收集为五味子属或栝楼属植物提取物以备用，如用于制备本发明的组合物(见下文)。相比而言，由大豆属植物或丝兰属植物的一部分得到的粗提取物在使用时可经过该处理也可不经过该处理。

另一方面，本发明提供了一种组合物，该组合物至少包含两种选自五味子属植物提取物、栝楼属植物提取物、大豆属植物提取物、丝兰属植物提取物的提取物。例如，该组合物可以包含以1-10∶1-10∶1-10∶1-10(如1∶1∶1∶1、1∶2∶3∶4、7∶8∶9∶5或10∶1∶5∶6)的比例混合的所有4种提取物。五味子属植物提取物、栝楼属植物提取物、大豆属植物提取物和丝兰属植物提取物可依照上述方法制备。

另一方面，本发明还提供了一种通过使上述组合物与细胞接触而诱导细胞凋亡或细胞周期停滞的方法。

另一方面，本发明还提供了一种抑制血管生成或肿瘤细胞转移或治疗细胞增殖紊乱的方法。这种方法包括给需要的受试者施用有效量的上述组合物。

本发明还提供了上述组合物在诱导细胞凋亡或细胞周期停滞、抑制血管生成或肿瘤细胞转移、或治疗细胞增殖紊乱中的应用，和该组合物在制备实现上述目的的药物中的应用。

本发明的一个或多个实施方式的详细情况在下面的描述中阐明。通过说明书和权利要求书的记载，本发明的其他特征、目的和优点将是显而易见的。

详细描述

本发明涉及一种制备栝楼属植物、五味子属植物、大豆属植物或丝兰属植物提取物的方法。本发明范围内也包括包含至少两种上述提取物的组合物及应用这些组合物诱导细胞凋亡或细胞周期停滞、抑制血管生成或肿瘤细胞转移、或治疗细胞增殖紊乱的方法。

栝楼属植物、五味子属植物、大豆属植物或丝兰属植物的提取物可从其每种植物的一部分中获得。这些部分可以是叶子、果实、茎、根或枝干。五味子属，也称为“magnolia vine”和“fruit of five flavors”，属五味子科，攀援藤本，藤上有很多小而鲜红的浆果，成簇状排列。五味子科原产于中国北方。栝楼属，也称为葫芦，属于葫芦科，主要见于亚洲热带和亚热带地区。大豆属，其种子称为大豆，属于豆科，原产于亚洲热带和温带地区。丝兰属，属于龙舌兰科，是在墨西哥和美国普遍生长的一种沙漠树种。这些草本植物都可通过商业渠道获得，如MJ Puehse&Company，El Dorado Hills，CA。

为了制备提取物，首先将五味子属、栝楼属、大豆属或丝兰属植物的一部分物理碎裂(如切开)，然后干燥。任选地，可在提取之前先发酵。得到的五味子属、栝楼属、大豆属或丝兰属植物的一部分与萃取溶剂在升高的温度下孵育。萃取溶剂可以是水、极性有机溶剂，或其按任意合适比例混合的混合物。术语“极性有机溶剂”指任何包含极性分子的有机溶剂，通常可溶于水。其实例包括但不限于乙醇、乙腈及其混合物。

五味子属或栝楼属植物的一部分和萃取溶剂可以按1∶1wt./vol.～1∶10wt./vol.(如1∶2wt./vol.～1∶5wt./vol.)的比例混合。大豆属或丝兰属植物的一部分和萃取溶剂可以按1∶1wt./vol.～1∶20wt./vol.(如1∶5wt./vol.～1∶10wt./vol.)的比例混合。混合物可在超声发生器(用于小规模生产)或萃取容器(用于大规模生产)中，在超声处理/搅拌下，在升高的温度下(如55℃～65℃或58℃～62℃)孵育0.5～48小时(如1～24小时或3～5小时)，从而得到孵育混合物。

任选地，可在孵育过程中或孵育后加入碱性物质调整孵育混合物的pH值为介于4和10之间(如6.5和7.5之间)。例如，可在孵育一段时间后向孵育混合物内加入碱性物质。孵育过程可在pH调整后继续进行一段时间。合适的碱性物质的实例包括但不限于氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠。

孵育完成后，孵育混合物(经或不经pH调整)中的不溶性物质可通过适当方法(如倾析、过滤或离心)去除，得到粗提物。小规模生产时，混合物可通过粗滤布或医用纱布过滤得到滤液。滤液中剩余的任何不溶性物质可通过离心进一步去除。大规模生产时，混合物可通过金属筛过滤器(如100～400筛目)过滤。

在使用水和极性有机溶剂(如乙醇)的混合液作为萃取溶剂用于植物孵育时，这样得到的粗提物任选地可通过去除有机溶剂而浓缩(如使用旋转式蒸发器)。粗提物可进行两次液-液提取。初次提取可采用非极性有机溶剂(如正己烷)，以去除任何污染物(如颜料、脂质、脂肪酸或蜡状物)。进一步可采用极性有机溶剂(如乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿)提取，以将所需组分转移到有机溶剂中，并在有机溶剂中得到粗提物。

五味子属或栝楼属植物的一部分的粗提物(经过或未经过液-液提取)可进一步进行固相萃取，即，首先将提取物装填入基质中，后用溶剂洗脱该基质。小规模生产时，基质可以是包含在C18反相柱、正相柱、离子交换柱或大小排阻柱中的分离介质。大规模生产时，基质可以是结合树脂(如D101，D1300、X-5、AB-8、H103、D204或DM11)。任一情况下，洗脱溶剂随后都通过基质，得到洗脱液。合适的洗脱溶剂的实例包括乙醇、甲醇、异丙醇、水、乙腈及其混合物。洗脱液收集为五味子属或栝楼属植物提取物，它们可用于制备本发明的组合物。相比而言，大豆属或丝兰属植物的一部分的粗提取物(经过或未经过液-液提取)在使用时可不必经过上述处理。

其他可用于纯化上述获得的粗提物的方法包括但不限于，薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法和高效液相色谱法。

熟练的技术人员可以理解，上述内容中没有明确提到的溶剂、分离方法和洗脱方法都可成功用于实施本发明，并且这些替代材料和方法不需过多的实验即可确定。

上述得到的五味子属、栝楼属、大豆属和丝兰属植物提取物中的两种或多种可按合适比例混合得到混合物，即本发明的组合物。例如，四种提取物可以按1∶1∶1∶1(干重)的比例混合。必要时，混合物中的溶剂可被去除，如采用冻干法或喷雾干燥法去除。

本发明也包括用本发明的组合物接触细胞来诱导细胞凋亡或细胞周期停滞。还包给受试者施用有效量的组合物，以抑制血管生成或肿瘤细胞转移，或治疗细胞增殖紊乱。“有效量”指对受试者产生治疗效果所需要的量。本领域技术人员应当了解，有效剂量将根据所治疗的疾病的类型、给药途径、赋形剂使用及与其他治疗共同使用的可能性而改变。组合物可口服或局部给药。

用于口服的组合物可以是任何口服可用的剂型，包括胶囊、片剂、乳剂和水混悬液、分散剂和溶液。对于片剂，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常也添加润滑剂，如硬脂酸镁。对于口服胶囊型，有用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当口服水混悬液或乳剂时，有效成分可以悬浮或溶解在与乳化剂或悬浮剂结合的油相中。必要时，也可加入特定的甜味剂、调味剂或着色剂。

可采用体外分析(如以下实施例3-7中所述)初步筛选上述组合物，用于诱导细胞凋亡或细胞周期停滞，抑制血管生成或肿瘤细胞转移，或治疗细胞增殖紊乱，然后通过动物实验(如以下实施例8中所述)和临床试验确定。其他方法对于本领域技术人员来说也是显而易见的。

下面的具体实施例只是用于说明，而不应视为以任何方式限制本发明的其余内容。可以相信，不经过进一步说明，本领域技术人员也可根据此处描述，最大范围地利用本发明。

实施例1：五味子属、栝楼属、大豆属和丝兰属植物四种提取物的混合物的小规模生产。

将900g五味子属植物果实烘干，并研磨成粉末。在10L瓶中，向五味子属植物粉末中加入40％乙醇(～1kg植物∶～4L乙醇)。将混合物放于60℃超声发生器中孵育1小时。加入碳酸钠将混合物的pH调整为接近7。将混合物放于60℃超声发生器中在不时的超声处理下孵育过夜。然后使混合物通过粗滤布，将其中的不溶性物质去除。通过离心沉淀收集澄清滤液。采用C18反相柱通过固体萃取法将滤液进一步纯化。C18反相柱通过乙醇洗脱后，将洗脱液收集在样品收集管中，得到五味子属植物提取物。

将10kg栝楼属植物果实压成小碎片并烘干。在50L瓶中，向栝楼属植物中加入40％乙醇(～1kg植物∶～3L乙醇)。将混合物放于60℃超声发生器中在不时的超声处理下孵育过夜。加入碳酸钠将混合物的pH调整为接近7。然后使混合物通过粗滤布，将其中的不溶性物质去除。通过离心沉淀收集澄清滤液。采用C18反相柱通过固体萃取法将滤液进一步纯化。C18反相柱通过乙醇洗脱后，将洗脱液收集在样品收集管中，得到栝楼属植物提取物。

将32g大豆属植物烘干，并研磨成粉末。在1L瓶中，向大豆属植物粉末中加入40％乙醇(～1g植物∶～10mL乙醇)。将混合物放于60℃超声发生器中在不时的超声处理下孵育过夜，使混合物通过粗滤布，将其中的不溶性物质去除。通过离心沉淀收集澄清滤液，得到大豆属植物提取物。

将32g丝兰属植物枝干烘干，并研磨成粉末。在1L瓶中，向丝兰属植物粉末中加入40％乙醇(～1g植物∶～10mL乙醇)。将混合物放于60℃超声发生器中在不时的超声处理下孵育过夜。加入碳酸钠将混合物的pH调整为接近7。然后使混合物通过粗滤布，将其中的不溶性物质去除。通过离心沉淀收集澄清滤液，得到丝兰属植物提取物。

在制备提取物后，确定四种提取物的干重(五味子属植物18g，栝楼属植物20g，大豆属植物15g，丝兰属植物26g)。四种提取物以1∶1∶1∶1(干重)的比例混合，然后将最终的混合物使用旋转式蒸发器脱水。将浓缩物冷冻或冻干，形成四种提取物的混合物(1∶1∶1∶1)。

实施例2：五味子属、栝楼属、大豆属和丝兰属植物四种提取物的混合物的大规模生产。

将8.6kg五味子属植物果实烘干。在提取容器内，向五味子属植物粉末中加入40％乙醇(～1kg植物∶～4L乙醇)。将提取温度保持在60℃左右，恒定搅拌24小时。提取后加入碳酸钠将混合物的pH调整为接近6.5～7.5。然后使混合物通过金属筛(＜100目)，将其中的不溶性物质去除。将溶液进一步通过另一筛网过滤器(100～400目)，收集澄清滤液。使澄清滤液通过C18反相柱。用乙醇洗脱柱后，收集洗脱液，得到五味子属植物提取物。

将99kg栝楼属植物果实压成小碎片并烘干。在提取容器内，向栝楼属植物中加入40％乙醇(～1kg植物∶～3L乙醇)。将提取温度保持在60℃左右，恒定搅拌24小时。提取后加入碳酸钠将混合物的pH调整为接近6.5～7.5，然后使混合物通过筛网过滤器(＜100目)，将其中的不溶性物质去除。将溶液进一步通过另一金属筛(100～400目)，收集澄清滤液。使滤液通过C18反相柱。用乙醇洗脱柱后，收集洗脱液，得到栝楼属植物提取物。

将300g大豆属植物烘干，并研磨成粉末。在提取容器内，向大豆属植物粉末中加入40％乙醇(～1g植物∶～10mL乙醇)。将提取温度保持在60℃左右，恒定搅拌24小时。然后使混合物通过金属筛(＜100目)，将其中的不溶性物质去除。使溶液进一步通过另一筛网过滤器(100～400目)，收集滤液，得到大豆属植物提取物。

将250g丝兰属植物枝干烘干，并研磨成粉末。在提取容器内，向丝兰属植物粉末中加入40％乙醇(～1g植物∶～10mL乙醇)。将提取温度保持在60℃左右，恒定搅拌24小时。然后使混合物通过金属筛(＜100目)，将其中的不溶性物质去除。使溶液进一步通过另一筛网过滤器(100～400目)，收集滤液，得到丝兰属植物提取物。

确定四种提取物的干重(五味子属植物170g，栝楼属植物200g，大豆属植物140g，丝兰属植物210g)。四种提取物以1∶1∶1∶1(干重)的比例混合，然后将混合物浓缩为10L左右。将浓缩物喷雾干燥，获得四种提取物的混合物(1∶1∶1∶1)。

实施例3：五味子属、栝楼属、大豆属和丝兰属植物提取物的混合物对人癌细胞系产生细胞毒性效应

应用61个人类白血病、黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、CNS、卵巢癌和肾癌细胞系确定五味子属、栝楼属、大豆属和丝兰属植物提取物混合物的细胞毒性效应。在添加有胎牛血清和1％青霉素/链霉素的合适的培养基中，在5％CO₂，37℃条件下对上述细胞系进行培养。

应用磺酰罗丹明B(SRB)分析确定提取物组合对细胞的抑制效应。SRB是一种染料，可与细胞蛋白质结合，可溶于碱。利用读板器于520nm测定总蛋白质的生物量。

将细胞接种在96-孔微量滴定板中，包括“时间零点”(Tz)板，每孔100μl，细胞浓度为每孔5,000～40,000个细胞。将细胞在37℃下孵育24小时，然后将提取物组合溶解在二甲基亚砜中，并加入细胞中，终浓度范围是0.977～500μg/ml，在5％CO₂、37℃下孵育48小时。向粘附细胞中加入终浓度为10％(w/v)的冷三氯乙酸(TCA)，向悬浮细胞中加入16％(w/v)的冷TCA，在4℃下细胞固定至少60分钟。弃上清液，将滴定板在自来水中冲洗5次并风干。加入SRB溶液(0.4％(w/v))，将细胞在室温下染色10分钟，将滴定板用1％乙酸冲洗5次并风干。用每孔100～200μl的10mM氨基丁三醇(Trizma)碱溶解结合的SRB，并测定520nm波长时的吸光度。

生长抑制百分比计算如下：

生长抑制％＝100-{[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100}

其中：Ti＝处理孔的校正吸光度

Tz＝时间零点孔的校正吸光度

C＝对照孔的校正吸光度

应用Prism软件从抑制百分比相对于剂量的剂量应答曲线中得到50％的生长抑制(GI₅₀)。

不同的五味子属、栝楼属、大豆属和丝兰属植物提取物混合物对61个肿瘤细胞系的生长抑制是不同的。栝楼属植物提取物的GI₅₀值在2.38μg/ml到60.23μg/ml之间变化，远远低于五味子属、大豆属和丝兰属植物提取物的GI₅₀值。以2∶1或2∶3的比例混合的栝楼属和丝兰属植物提取物混合物在肝癌细胞中的GI₅₀值分别为17.7μg/ml和12.7μg/ml。以1∶3或1∶9的比例混合的栝楼属和丝兰属植物提取物混合物在胃癌细胞中的GI₅₀值分别为13.5μg/ml和20μg/ml。以9∶4∶6或35∶7∶34的比例组合的五味子属、栝楼属和丝兰属植物提取物抑制肝癌细胞生长，GI₅₀值分别为24.3μg/ml和67.3μg/ml。另外，以9∶1∶3或35∶27∶15的比例组合的五味子属、栝楼属和丝兰属植物提取物抑制胃癌细胞生长，GI₅₀值分别为39.6μg/ml和29.1μg/ml。四种提取物的混合物(1∶1∶1∶1)以剂量依赖性方式抑制癌细胞增殖。该混合物对61种细胞系的GI₅₀值为4.4～259.7μg/ml。

实施例4：四种提取物的混合物诱导THP-1、Jurkat和28SC细胞分泌细胞因子

单核细胞系(THP-1和28SC)和T-淋巴细胞系(Jurkat)购买自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。在加入胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的适当的培养基中，在5％CO₂和37℃条件下培养这些细胞。

TNF-α、IL-1β和IL-8的分泌在Jurkat细胞(THP-1、IFN-γ和IL-2)和28SC细胞(IL-6)中测定。将细胞(5×10⁵细胞/孔)与四种提取物的混合物(1∶1∶1∶1)孵育4小时，然后按照OptEIA ELISA SET子册(BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)进行细胞因子测定。将孔用每孔100μl在包被缓冲液中稀释的捕获抗体包被，4℃孵育过夜。将溶液吸出后，用洗涤缓冲液将孔清洗3次。以每孔200μl的测定稀释液封闭滴定板，并在室温下孵育一小时。用测定稀释液将细胞因子标准稀释到适当浓度。在每个孔中加入100μl标准溶液或样品溶液。每个孔内的溶液经混合后在室温下孵育2小时。吸出孔中溶液后将孔用洗涤缓冲液清洗5次。在每个孔中加入制备好的工作检测剂，室温下孵育1小时。随后抽吸，清洗，加入100μl底物试剂，室温下在黑暗中孵育30分钟。加入50μl终止溶液终止反应。在反应停止后30分钟内测得450nm和570nm(本底校正)的吸光度。绘制吸光度相对于标准浓度的图，并以标准曲线为基础得到样品中的蛋白质量。

用混合物处理4小时诱导细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-8。THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和IL-8的增加呈剂量依赖性。混合物诱导不同细胞因子的最佳剂量是不同的。诱导TNF-α、IL-1β和IL-8分泌的最佳剂量分别是200μg/ml、50μg/ml和100μg/ml。

实施例5：四种提取物的混合物使人癌细胞系产生细胞周期停滞

利用混合物处理人白血病细胞系(SUP-T1、HL60、THP-1和Jurkat)、结肠癌细胞系(Caco2)、乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和MCF-7)、前列腺癌细胞系(PC-3、DU145和LNCap)、肺癌细胞系(A549、H1437和H83)、胃癌细胞系(AGS和NCI-N87)和肝癌细胞系(HepG2)。

不同类型的细胞以5×10⁴～2×10⁵细胞/烧瓶的密度接种在25cm²的培养瓶中。24小时后，或(对于悬浮细胞来说)立刻，使接种的细胞与终浓度小于、等于或大于特定细胞系IC₅₀值的混合物一起孵育48小时。收集细胞后，在1ml80％乙醇中固定，并在4℃下孵育15分钟。孵育后，以453r.c.f.离心细胞5分钟，并将细胞沉淀物在包含300μg/ml RNA酶的500μl碘化丙锭(10μg/ml)中再次悬浮。将细胞在冰中孵育30分钟，并用53μm的尼龙筛过滤。通过ModFit LT^TM软件(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)利用FACScaliber(BDBiosciences，San Jose，CA，USA)计数10,000个细胞，计算细胞周期分布。

混合物显示有剂量依赖性的细胞周期停滞作用。经混合物处理48小时后，除AGS和LNCap(轻微增加)和Jurkat(没有变化)以外，所有癌细胞系的G2/M期群体细胞均比对照显著增加。混合物对不同癌细胞系的影响呈剂量依赖性。对SUP-T1白血病细胞用三个不同浓度(即5、10和20μg/ml)的混合物处理48小时。在10μg/ml和20μg/ml浓度时发现了非整倍性。对DU145前列腺细胞用四个不同浓度(即7、14、28和40μg/ml)的混合物处理48小时。在7μg/ml浓度时发现了非整倍性。

实施例6：四种提取物的混合物对Jurkat、THP-1和DU145细胞系诱导细胞凋亡

以1.0×10⁶细胞/孔的密度将Jurkat、THP-1和DU145细胞接种到6-孔板上。采用九个不同浓度(即2.5、5、7、10、14、20、28、40和60μg/ml)的混合物处理48小时后，用胰蛋白酶消化细胞。然后用PBS冲洗细胞两次，并将5×10⁵个细胞在500ml结合缓冲液中再次悬浮。取100μl细胞悬液，转入5ml培养管中，并与10μl膜联蛋白V抗体和10μl包含300μg/ml RNA酶的碘化丙锭(10μg/ml)一起孵育。将细胞慢慢涡旋混合，并在室温下黑暗环境中孵育15分钟。然后在每个管中加入400μl结合缓冲液，在1个小时内用流式细胞仪分析细胞。

与对照组相比，该混合物诱导Jurkat、THP-1和DU145细胞凋亡。请注意，该混合物以剂量依赖性方式诱导细胞凋亡。

实施例7：四种提取物的混合物抑制乳腺癌细胞转移

使用对细胞外基质(如Matrigel、纤连蛋白和层粘连蛋白)粘附的乳腺癌细胞系DMA-MB-231研究四种提取物的混合物(1∶1∶1∶1)对癌细胞粘附和侵入的抑制效应。用Matrigel(250μg/cm²)、纤连蛋白(10μg/cm²)或层粘连蛋白(5μg/cm²)将孔包被。在3.9、7.8、15.6、31.2、62.5、125或250μg/ml混合物存在下使细胞(1×10⁵每孔)在孔内再悬浮1～2小时。孵育结束后，弃去孔内的培养基，用0.1％结晶紫将附着在板底的细胞染色。然后读取570nm的吸光度，测定在混合物存在时的细胞粘附。

将MDA-MB-231(2.5×10⁴细胞/孔)加入到用250μg/ml Matrigel包被的侵入室内进行细胞侵入能力测定。将测定用混合物与七种不同浓度(即3.9、7.8、15.6、31.2、62.5、125和250μg/ml)的四种提取物的混合物一起孵育24小时。孵育完成后，将通过侵入室迁移的细胞用胰蛋白酶消化，用CyQuant GR染色剂(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)染色。然后测定480/520nm处的荧光，确定细胞侵入率。

该混合物在大于31.25μg/ml的剂量时显著抑制癌细胞对Matrigel、纤连蛋白和层粘连蛋白的粘附。请注意，该混合物以剂量依赖性方式抑制细胞侵入。

实施例8：四种提取物的混合物抑制裸鼠中前列腺癌和乳腺癌异种移植物的生长

利用人前列腺癌细胞系PC-3进行雄性balb/c nu/nu小鼠(SIPPR/BK实验动物有限公司，上海，中国)的异种移植物植入。将100μl含有5×10⁶个细胞的溶液皮下注入裸鼠右胁。细胞接种七天后，每只小鼠每天经口给予0.5、1或2mg的四种提取物的混合物(1∶1∶1∶1)，共35天。每隔7～8天用测径器测量肿瘤大小一次。将该肿瘤大小与只用载体治疗组的数据进行比较。

利用人乳腺癌细胞系MCF-7进行雌性balb/c nu/nu小鼠的异种移植物植入。将雌二酮丸剂(pellet)(Innovative Research of America，Sarasota，FL，USA)皮下插入裸鼠左胁。一个星期后，将100μl含有5×10⁶个细胞的溶液皮下注入裸鼠右胁。细胞接种七天后，每只小鼠每天经口给予0.5、1或2mg的该混合物，共28天。每隔7～8天用测径器测量肿瘤大小。将该肿瘤大小与只用载体治疗组的数据进行比较。

该混合物在每只小鼠每天0.5、1和2mg剂量时，显著抑制裸鼠前列腺肿瘤生长。在每只小鼠每天2mg剂量时，显著抑制乳腺肿瘤生长。

其他实施方式

本说明书中公开的所有特征都可以任一组合形式组合。本说明书公开的每个特征都可被具有相同、等同或相似目的的替代特征所替代。因此，除非特别说明，本说明书公开的各特征仅是一系列等同或相似特征的一个例子。

通过上面的描述，本领域技术人员可较容易地确定本发明的基本特征，并且在不偏离其精神和范围的情况下，为适应各种用法和条件，可以对本发明作各种改变和更改。因此，其他具体实施方式也包含在下述权利要求的范围内。

Claims

1.一种组合物，其至少包含选自五味子属植物提取物、栝楼属植物提取物、大豆属植物提取物和丝兰属植物提取物中的两种提取物。

2.权利要求1的组合物，其中该组合物包含五味子属植物提取物、栝楼属植物提取物、大豆属植物提取物和丝兰属植物提取物。

3.权利要求2的组合物，其中所述提取物以1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合。

4.权利要求3的组合物，其中所述提取物以1∶1∶1∶1的比例混合。

5.一种诱导细胞凋亡的方法，包括使权利要求1的组合物与细胞接触。

6.权利要求5的方法，其中所述组合物包含五味子属植物提取物、栝楼属植物提取物、大豆属植物提取物和丝兰属植物提取物。

7.权利要求6的方法，其中所述提取物以1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合。

8.权利要求7的方法，其中所述提取物以1∶1∶1∶1的比例混合。

9.一种诱导细胞周期停滞的方法，包括将权利要求1的组合物与细胞接触。

10.权利要求9的方法，其中所述组合物包含五味子属植物提取物、栝楼属植物提取物、大豆属植物提取物和丝兰属植物提取物。

11.权利要求10的方法，其中所述提取物以1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合。

12.权利要求11的方法，其中所述提取物以1∶1∶1∶1的比例混合

13.一种抑制血管生成的方法，包括给需要的受试者施用有效量的权利要求1的组合物。

14.权利要求13的方法，其中所述组合物包含五味子属植物提取物、栝楼属植物提取物、大豆属植物提取物和丝兰属植物提取物。

15.权利要求14的方法，其中所述提取物以1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合。

16.权利要求15的方法，其中所述提取物以1∶1∶1∶1的比例混合。

17.一种抑制肿瘤细胞转移的方法，包括给需要的受试者施用有效量的权利要求1的组合物。

18.权利要求17的方法，其中所述组合物包含五味子属植物提取物、栝楼属植物提取物、大豆属植物提取物和丝兰属植物提取物。

19.权利要求18的方法，其中所述提取物以1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合。

20.权利要求19的方法，其中所述提取物以1∶1∶1∶1的比例混合。

21.一种治疗细胞增殖紊乱的方法，包括给需要的受试者施用有效量的权利要求1的组合物。

22.权利要求21的方法，其中所述组合物包含五味子属植物提取物、栝楼属植物提取物、大豆属植物提取物和丝兰属植物提取物。

23.权利要求22的方法，其中所述提取物以1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合。

24.权利要求23的方法，其中所述提取物以1∶1∶1∶1的比例混合。