CN101157611B - 一种多氯联苯(PCBs)同系物半抗原及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多氯联苯(PCBs)同系物半抗原及其制备方法，多氯联苯半抗原，结构式如下：
其中，R＝Cl，R1＝H或Cl，n＝1、2、3，R3＝COCH2CH2COOH，制备包括：(1)二氯苯胺熔化，加入浓盐酸搅拌，用20-40ml的水加热熔化后，用25-33％的亚硝酸钠重氮化；(2)在0-5℃的条件下，加入60-80ml芳香烃溶剂搅拌，滴加浓碱，搅拌反应1-3小时；(3)水蒸气蒸出反应产物，或者通过非极性有机溶剂萃取的方法，得棕黄色粗产品。加入1-3g锌粉和1-3ml的浓盐酸，体系中不再有气体生成，趁热过滤，晶体析出；(4)多氯联苯，琥珀酸酐和无水AlCl3的摩尔比为：1∶1-2∶1-3。冰水浴条件下无水AlCl3在1-2h内分次加入。密封搅拌16-56h，停止反应。本发明步骤简单，速度快，产率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种多氯联苯及其制备，特别是涉及一种多氯联苯(PCBs)同系物半抗原及其制备方法。
背景技术
多氯联苯(PCBs)作为一种受到世界各国环境工作者广泛关注的环境激素类污染物，其检测方法的研究成为一个研究热点。近年来，采用酶联免疫法测定多氯联苯的研究成为其快速监测方法的改进研究方向。中国国内的几个大学发表的研究文章，其多氯联苯的半抗原均来自国外研究机构的馈赠[1，2]。国内迄今为止还没有见到多氯联苯半抗原制备方法的报道。PCBs同族体的物理、化学、生物和毒物学的性质不同。因此有关前沿研究要求PCBs的分析必须由测定总量的水平提高到测定同类物和异构体的水平上来，因此单个PCBs同族体的定性和定量分析是十分必要的。多氯联苯同系物及其衍生物的制备对其毒理学性质，迁移转化，生态效应等研究具有重要意义。多氯联苯半抗原是采用免疫方法测定多氯联苯的基础，因此，对于多氯联苯及其半抗原的制备就具有重要的应用价值和理论价值。
当前市场上销售的多氯联苯单体，都是从工业混合物中通过色谱分离得到。虽然纯度比较高，但标准品的含量一般都低于1mg/ml，而且由于处理程序的复杂价格都很昂贵。这样的标准品是不适于用来作为反应原料制备半抗原。因此，国内外关于多氯联苯免疫分析的半抗原以及抗原的制备，都是通过一定的不对称合成方法，制备出多氯联苯单体，然后再进一步修饰为半抗原。对于多氯联苯同系物的制备方法，已有多种方法和原理被报道，例如利用Sandmeyer reaction[3]用氯化亚铜还原联苯胺的方法制备多氯联苯，应用Ullmann法的碘苯偶联反应等。这些方法的局限性在于只能制备对称的多氯联苯。在对原来方法改进的基础上，Hans-Joachim Lehmhler[4]研究小组多年来采用金属钯催化的不对称合成方法，制备了一系列的多氯联苯单体，为多氯联苯的毒理等研究奠定了良好的基础。但此方法使用的催化剂成本较高，而且反应时间长，且后处理程序复杂，产率也不高。本发明在对传统的Gomberg-Bachmann法[5]进行机理分析的基础上，设计出了采用重氮化法制备对称和不对称多氯联苯同系物的方法，此方法使用的试剂价格低，反应时间短，方法后处理简单易操作，同时也能够得到纯度较好的多氯联苯同系物。
在对半抗原的制备方法方面，Yu-Wen Chiu等[6]采用把联苯环上的甲氧基还原为羟基后，采用活化酯法进一步引入含有6个碳的羧基基团，用来作为官能团和蛋白质偶联。MilanFránek等[7，8]采用了还原甲氧基的方法和在联苯环上引入氨基然后进一步重氮化的方法，引入含有6个碳的羧基官能团。这些文献上的方法采用多步反应，才得到相应的半抗原。岂今为止，尚未见国内多氯联苯及其半抗原的制备。
发明内容
本发明提供了一种多氯联苯同系物半抗原及其制备方法，该方法步骤简单，速度快，产率高。
本发明的多氯联苯同系物半抗原，结构式如下：
其中，R＝Cl，R1＝H或Cl，n＝1、2、3，R3＝COCH2CH2COOH。
本发明的一氯取代联苯，二氯取代，三氯取代，四氯取代联苯及其半抗原，具有如下的结构式：
一氯联苯半抗原 二氯联苯半抗原
三氯联苯半抗原 四氯联苯半抗原
其中二氯、三氯、四氯苯胺半抗原的熔点分别为154-156℃、162-164℃或272-274℃。其结构和纯度可以通过元素分析，核磁共振，红外光谱等检测手段分析鉴定。
本发明的方法的反应式可以描述如下：
其中，R＝Cl，n＝1，2，3，R1＝H或Cl，R2＝H或Cl，R3＝COCH2CH2COOH。
本发明的一种多氯联苯(PCBs)同系物半抗原衍生物的制备方法，包括下列步骤：
(1)将0.05摩尔的1，2-二氯苯胺和5-10ml水温热至1，2-二氯苯胺熔化，然后加入10-20ml浓盐酸搅拌，用20-40ml的水加热溶化后，冷之室温，然后在1-4℃冰浴的条件下用25-33％的亚硝酸钠重氮化，得到产物(1)。
(2)在0-5℃的条件下，加入60-80ml芳香烃溶剂(苯，氯苯，二氯苯)，搅拌，同时滴加浓碱溶液。当溶液呈强碱性时(PH12-14)，停止滴加。室温继续搅拌反应1-3小时。
(3)产物的后处理可以采用水蒸气蒸馏的方法蒸出反应产物，或者通过非极性有机溶剂萃取的方法，得棕黄色粗产品。粗产物用50-100ml热无水乙醇溶解，加入1-3g锌粉和1-3ml的浓盐酸，等体系中不再有气体生成，趁热过滤，晶体便析出，得到产物(2)。
(4)称取多氯联苯同系物，搅拌溶解于装有20-40mL非质子性有机溶剂(二氯甲烷或硝基苯等)的容器中，加入琥珀酸酐，搅拌溶解，在冰浴(0-4℃)的条件下，加入无水AlCl3，多氯联苯，琥珀酸酐和无水AlCl3的摩尔比为：1∶1-2∶1-3。无水AlCl3在1-2h内分次加入。隔水密封搅拌16-56h，停止反应。
反应产物的后处理方法为：反应液倾入50-100ml2M的盐酸溶液中，用50-100ml极性有机溶剂(乙醚，二氯甲烷)萃取，用50-100ml2M的盐酸洗涤萃取液，干燥，过滤，蒸去溶剂，得粗品。粗品用非极性溶剂(正己烷，乙醚，丙酮等洗涤，得纯品(3)。
本发明采用一步反应，根据原料氯苯胺上的氯原子的位置，和相应的溶剂苯上的氯原子的个数和位置，在苯环上引入含有4个碳原子的羧基官能团，制得相应的多氯联苯同系物半抗原。
本发明经过(1)苯胺的重氮化反应，(2)亲电加成反应；(3)后处理以及纯化，合成出多种多氯联苯同系物。再用傅克酰基化反应的方法，在苯环上修饰上一个含四个碳的羧基偶联臂，制得含有羧基活性基团的半抗原。
附图说明
图1二氯联苯半抗原红外光谱。
图2三氯联苯半抗原红外光谱。
图3四氯联苯半抗原红外光谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
3，4-二氯联苯的制备：
(1)在100ml烧杯中，将0.05摩尔的1，2-二氯苯胺(8.101g)和5ml水温热至氯苯胺熔化，然后加入10ml浓盐酸，剧烈搅拌，加入20ml水，加热到混合物几乎完全溶解。然后加入5ml水，搅拌到形成均匀的乳状悬浊液，此时有3，4-二氯苯胺盐酸盐呈细的晶体析出。放冷至室温，加入数块小冰，外面以冰水浴冷却，在4℃条件下用30％的亚硝酸钠重氮化，用PH试纸控制反应的酸度为2-3。用淀粉碘化钾试纸监测终点。
(2)将重氮化后的溶液倒入预先用冰水冷却的60ml苯中，在4℃的条件下，滴加5mol/L的KOH溶液。加碱时生成黄色沉淀活化物质，与苯作用生成3，4-二氯联苯。体系反应到强碱性为止。然后室温下继续搅拌反应1小时，停止反应。
(3)把反应物转移至250ml三口烧瓶中，蒸去苯，然后通入水蒸气，进行水蒸气蒸馏。多氯联苯与水蒸气一同蒸出。得黄棕色油状粗品。粗品用正己烷萃取，蒸去多余溶剂，溶于100ml无水热乙醇，加入锌粉1g和浓盐酸2ml，等容器中气体不再生成，过滤除去不溶物，产品即析出，为白色的针状晶体。产物经红外光谱仪和核磁共振等分析来鉴定其化学结构。测熔点为：48-50℃。表征数据如下：IR(cm-1)：1583，1485，1470，1067，848，810，1HNMRb(CDCl3，400MHz)δ7.40(1H)，7.48(J，＝8Hz，3H)，7.56(J，＝8Hz，3H)，and 7.68(s，1H).元素分析：实测值(计算值)％：C12H8Cl2C 62.3(64.5)，H 3.684(3.587)N＜0.030(0)。
(4)3，4-二氯联苯半抗原制备
称取3，4-二氯联苯5mmol，溶解于装有20mL CH2Cl2的烧瓶中，加入5mmol的琥珀酸酐，搅拌溶解，在冰浴的条件下，加入12.5mmol的无水AlCl3。在1.5h内分次加入。密封搅拌16h后，停止反应，把反应液倾入60ml2M的盐酸中，然后用30ml×3的CH2Cl2萃取，用50ml2M的盐酸洗涤萃取液，干燥，过滤，蒸除溶剂，得粗品。粗品用正己烷洗涤，可得纯品，为棕黄色晶体，熔点：154-156℃。产物经红外，核磁和元素分析进行鉴定，认为是所合成产物。IR(cm-1)3059，2928，1675，1468，1413，1186，990，809，778，648；1H NMRb(CDCl3，400MHz)δ2.50(d，J，＝8.4J，＝2.0Hz，2H，-CH2)，3.2(J，＝8.2，3H)，7.760(d，J，＝8.4Hz，2Hph-H)，7.9(d，J，＝8.44Hz，2H)，8.0(d，J，＝12Hz，3H)，12.1(s，1H)；元素分析：实测值(计算值)％C16H12Cl2O3C 59.58(55.44)，H 3.732(3.715).N＜0.030(0)
实施例2
半抗原的应用
本发明制备的多氯联苯半抗原，主要应用在环境中多氯联苯的免疫检测中。它的主要用途之一，就是可以用来直接和蛋白质大分子偶联，制备出用来免疫动物的免疫原，进而制备出相应的单克隆或多克隆抗体。下面就3，4-二氯联苯半抗原的使用做以应用举例：
称取0.4mmol半抗原4-(3，4-二氯联苯基)-4-氧-丁酸，置于洁净干燥的小锥形瓶中，加入400μL DMF使之溶解。称取64.8mg DCC与38.8mg NHS溶于300μLDMF，在磁力搅拌下逐滴加到小锥形瓶中，室温搅拌反应8h，4℃过夜。将反应后产物置于低温高速离心机9000r/min，经15min分离出上清液。称取160mg BSA溶于10mL 0.02mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，逐滴加入600μL上述清液，于冰浴条件下反应4h。反应毕，将溶液装入透析袋，自来水冲洗48h，，0.9％生理盐水透析3d，离心分出上清液，即得PCB-BSA偶联物。偶联物经紫外可见分光光度计扫描鉴定后，从偶联物PCB-BSA的紫外吸收光谱图可以看到，3，4-二氯联苯在300nm波长处有最大吸收峰，BSA在波长280nm处有最大吸收峰，PCB-BSA最高吸收峰出现前移，符合PCB和BSA吸收峰叠加特征。说明半抗原已和蛋白质发生反应，生成新的偶联物。
实施例3
3，4，4’-三氯联苯及其半抗原的制备
(1)在100ml烧杯中，将0.05摩尔的1，2-二氯苯胺(8.101g)和10ml水温热至熔化，然后加入15ml浓盐酸，搅拌，加入30ml水，加热搅拌到形成均匀的乳状悬浊液。放冷至室温，加入数块小冰，外面以冰水浴冷却，在5℃条件下用25％的亚硝酸钠重氮化，用PH试纸控制反应的酸度为2-3。用淀粉碘化钾试纸监测终点。
(2)将重氮化后的溶液倒入预先用冰水冷却的80ml氯苯中，在5℃的条件下，滴加5mol/L的NaOH溶液。加碱时生成黄色沉淀活化物质，与氯苯作用生成3，4，4’-三氯联苯。反应到强碱性为止。然后室温下继续搅拌反应2小时，停止反应。
(3)把反应物转移至250ml三口烧瓶中，通入水蒸气蒸去氯苯，三氯联苯与水蒸气一同蒸出。得黄棕色固体。粗品用石油醚萃取，蒸去多余溶剂，溶于50ml无水热乙醇，加入锌粉1.5g和浓盐酸2ml，等容器中气体不再生成，过滤除去不溶物，产品即析出，为白色的针状晶体。测熔点为：54-56℃，产物经红外光谱仪和核磁共振等分析来鉴定其化学结构。表征数据如下：IR(cm-1)1545，1463，1134，878，828，765，1HNMRb(CDCl3，400MHz)δ7.26(d，J，＝8.4Hz，1H，H-6)，7.30(dd，J，＝8.4Hz，J，＝2.0Hz，1H，H-5)，7.33(AA′XX′system，2H，H-3′，5′)，7.49(AA′XX′system，2H，H-2′，6′)，7.54(d，J，＝2.0Hz，1H，H-3).元素分析(Elemental analysis)：实测值(计算值)％C12H7Cl3C 55.69(55.92)，H 2.701(2.718)，N＜0.030(0)。
(4)称取3，4，4’-三氯联苯5mmol，溶解于装有30mL CH2Cl2的烧瓶中，加入5mmol的琥珀酸酐，搅拌溶解，在冰浴的条件下，加入10mmol的无水AlCl3。在2h内分次加入。密封搅拌28h后，停止反应，把反应液倾入100ml2M的盐酸中，然后用40ml×3的CH2Cl2萃取，用80ml 2M的盐酸洗涤萃取液，干燥，过滤，蒸除溶剂，得粗品。粗品用石油醚洗涤，可得纯品，为红棕色晶体，熔点：162-164℃。产物经红外，核磁和元素分析进行鉴定，认为是所合成产物。数据如下：IR(cm-1)3090，2933，1721，1694，1590，1463，1310，1186，1032，881，820，1H NMRb(CDCl3，400MHz)δ2.58(dd，J，＝8.4J，＝2.0Hz，2H，-CH2)，7.50(d，J，＝8.4Hz，1H，H-6)，7.77(d，J，＝2.0Hz，2H，H-2，2′0).8.0(d，J，＝2.0Hz，2H，H-3)，12.1(s，1H)，元素分析(Elemental analysis)：实测值(计算值)％
C16H11Cl3O3C 51.9(53.7)，H 3.071(3.076)，N＜0.030(0)。
实施例4
3，3’，4，4’-四氯联苯及其半抗原的制备
(1)在100ml烧杯中，将0.05摩尔的1，2-二氯苯胺(8.101g)和10ml水温热至熔化，然后加入20ml浓盐酸，搅拌，加入25ml水，加热搅拌到形成均匀的乳状悬浊液。放冷至室温，加入数块小冰，外面以冰水浴冷却，在0℃条件下用33％的亚硝酸钠重氮化，用PH试纸控制反应的酸度为2-3。用淀粉碘化钾试纸监测终点。
(2)将重氮化后的溶液倒入预先用冰水冷却的80ml二氯苯中，在0℃的条件下，滴加3mol/L的NaOH溶液。加碱时生成黄色沉淀活化物质，与二氯苯作用生成3，3’，4，4’-四氯联苯。用PH试纸检测PH为12。停止加碱。然后室温下继续搅拌反应3小时，停止反应。
(3)把反应物转移至250ml三口烧瓶中，通入水蒸气蒸去二氯苯，四氯联苯与水蒸气一同蒸出。得黄棕色固体。粗品用苯萃取，蒸去多余溶剂，溶于70ml无水热乙醇，加入锌粉2g和浓盐酸3ml，等容器中气体不再生成，过滤除去不溶物，产品即析出，为白色的针状晶体。测熔点为：174-176℃，产物经红外光谱仪和核磁共振等分析来鉴定其化学结构。表征数据如下：IR(cm-1)1546，1475，1445，1135，828，671；1HNMRb(CDCl3，400MHz)：δ7.34(dd，J，＝8.4J，＝2.0Hz，2H，H-6，6′)，7.50(d，J，＝8.4Hz，2H，H-5，5′)，7.60(d，J，＝2.0Hz，2H，H-2，2′)；元素分析(Elemental analysis)：实测值(计算值)％C12H6Cl4：C 47.59(49.3)，H2.122(2.0548)，N 0(＜0.030)。
(4)3，3’，4，4’-四氯联苯半抗原制备
称取四氯联苯5mmol，溶解于装有30mL CH2Cl2的烧瓶中，加入5mmol的琥珀酸酐，搅拌溶解，在冰浴的条件下，加入15mmol的无水AlCl3。在2h内分次加入。密封搅拌56h后，停止反应，把反应液倾入100ml2M的盐酸中，然后用40ml×3的CH2Cl2萃取，用60ml2M的盐酸洗涤萃取液，干燥，过滤，蒸除溶剂，得粗品。粗品用正己烷洗涤，可得纯品，为棕褐色晶体，熔点：272-274℃。产物经红外，核磁和元素分析进行鉴定，认为是所合成产物。IR(cm-1)：3065，2929，1711，1545，1363，1134，1030，878，818；1H NMRb(CDCl3，400MHz)：δ2.58(dd，J，＝8.4J，＝2.0Hz，2H，-CH2)，7.43(d，J，＝8.4Hz，1H，H-6)，7.72(d，J，＝2.0Hz，2H，H-2，2′0).8.0(d，J，＝2.0Hz，1H，H-5)，12.1(s，1 H)；
元素分析(Elemental analysis)：实测值(计算值)％：C16H10Cl4O3C 48.73(48.97)，H2.431(2.551)，N 0.312(0)。
Claims (7)
1.一种多氯联苯PCBs同系物半抗原的制备方法，包括下列步骤：
(1)将0.05摩尔的1，2-二氯苯胺和5-10ml水温热至1，2-二氯苯胺熔化，然后加入10-20ml浓盐酸搅拌，用20-40ml的水加热溶化后，冷至室温，在0-4℃冰水浴的条件下，用25-33％的亚硝酸钠重氮化；
(2)在0-5℃的条件下，加入60-80ml芳香烃溶剂，搅拌，同时滴加浓碱溶液，当溶液pH达到12-14时，停止滴加，室温继续搅拌反应1-3小时；
(3)水蒸气蒸出反应产物，或者通过非极性有机溶剂萃取的方法，得棕黄色粗产品，粗产物用50-100ml热无水乙醇溶解，加入1-3g锌粉和1-3ml的浓盐酸，体系中不再有气体生成，趁热过滤，多氯联苯晶体析出；
(4)称取多氯联苯同系物，搅拌溶解于装有20-40mL非质子性有机溶剂的容器中，加入琥珀酸酐，搅拌溶解，在0-4℃冰浴的条件下，加入无水AlCl3，在1-2h内分次加入，在无水条件下搅拌16-56h，停止反应；其中，多氯联苯同系物半抗原结构式如下：
其中，R＝Cl，R1＝H或Cl，n＝1、2、3，R3＝COCH2CH2COOH；
反应产物的后处理方法为：反应液倾入50-100ml2M的冰盐酸溶液中，用50-100ml极性有机溶剂萃取，用50-100ml 2M的盐酸洗涤萃取液，干燥，过滤，蒸去溶剂，得粗品，非极性溶剂洗涤或过柱分离，得纯品。
2.根据权利要求1所述的多氯联苯PCBs同系物半抗原的制备方法，其特征在于：步骤2所述的芳香烃溶剂是苯、氯苯或二氯苯。
3.根据权利要求1所述的多氯联苯PCBs同系物半抗原的制备方法，其特征在于：步骤3所述的非极性有机溶剂是石油醚或正己烷。
4.根据权利要求1所述的多氯联苯PCBs同系物半抗原的制备方法，其特征在于：步骤4所述的非质子性有机溶剂是二氯甲烷或硝基苯。
5.根据权利要求1所述的多氯联苯PCBs同系物半抗原的制备方法，其特征在于：步骤4所述的极性有机溶剂为二氯甲烷或乙醚。
6.根据权利要求1所述的多氯联苯PCBs同系物半抗原的制备方法，其特征在于：步骤4所述的非极性溶剂是正己烷或石油醚。
7.根据权利要求1所述的多氯联苯PCBs同系物半抗原的制备方法，其特征在于：步骤4所述的多氯联苯、琥珀酸酐和无水AlCl3的摩尔比为：1∶1-2∶1-3。
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