CN101153053A

CN101153053A - 骨生肽、其制备方法和其药物组合物与用途

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Publication number: CN101153053A
Application number: CNA2006101134371A
Authority: CN
Inventors: 王德心; 刘喆; 田桂杰; 马芸
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2006-09-28
Filing date: 2006-09-28
Publication date: 2008-04-02
Anticipated expiration: 2026-09-28
Also published as: CN101153053B

Abstract

本发明的骨生肽是在内源性成骨生长肽(OGP)的结构改造中发现的一类对成骨细胞(OB)的增殖与生长具有明显活性的小肽化合物。在切除卵巢的大鼠体内可以显著改善骨质量。与临床药物Risedronate联合使用的效果比后者单独使用更理想，为治疗骨质疏松提供了新的方式。

Description

骨生肽、其制备方法和其药物组合物与用途

技术领域

本发明为一种促进骨合成活性肽，系OGPC端片段改造物。涉及肽及有机小分子领域。

背景技术

文献报导内源性成骨生长肽(OGP)作为一种基质细胞有丝分裂源，具有刺激骨形成和造血活性。其活性部分来自C-端五肽(10～14)，简称OGP5。本发明以OGP5为先导结构设计合成了权利要求1中结构特征的骨生肽，它在切除卵巢大鼠造成的骨质疏松模型实验中可以有效地防治骨丢失、改善骨质量。其中一些化合物的活性高于内源性结构OGP5。此外，本发明的骨生肽与利塞膦酸钠(Risedronate)合用时，防止骨丢失、改善骨质量的效果明显优于单独使用的利塞膦酸钠。小鼠急性毒性实验表明，骨生肽在有效剂量的200倍时未出现任何毒副作用。因而该类化合物可开发为安全无毒的，防治与骨丢失有关的骨质疏松、肿瘤并发的高钙血症和骨瘤、变形性骨炎、多发性骨髓瘤及外科骨移植相关的药物或配方组分。

发明内容

本发明的内容是基于对先导化合物OGP5的主链长度、芳环侧链及至少一个酚羟基的结构要求，设计出骨生肽的基本结构。它们具有防治骨丢失、改善骨质量的生物活性，所以取名为骨生肽。它们的结构通式为：

R¹-X¹-Tyr-X²-R²

其中酪氨酰为不变残基；

R¹，R²，X¹和X²为适当变换的基团；

其中R¹为苯丙氨酰基(Phe)，γ-羧基丙酰-苯丙氨酰基(HOOC(CH₂)₂CO-Phe)，N-丙酰基-苯丙氨酰(CH₃CH₂CO-Phe)，γ-羧基丙酰-酪氨酰基(HOOC(CH₂)₂CO-Tyr)，亚氨基二乙酸单酰-酪氨酰(Ida-Tyr)，ω-氨基已酰-酪氨酰(Aca-Tyr)，苄胺基(BnNH)，对羟基苯甲酰基(4-HOPhCO)和苄膦酸氨基(ArCH[PO(OH₂)]NH)结构；

R²为OH，NH₂，NHMe，NMe₂，NHEt，NHBu、甘氨醇(Gly-ol)及氨烷双膦酸；

X¹为甘氨酰，β-丙氨酰及丁二酰结构；

X²为4-氨基丁酰(Abu)及6-氨基已酰(Aca)残基结构。

本发明的骨生肽是通过化学合成的途径而制备的。其中有的产物由固相方式合成，有的产物由液相合成，有的产物由液/固相结合的方式合成。缩合剂为N-羟基苯并三唑(HOBt)与二环己基碳二亚胺(DCC)的等摩尔混合物。原料中有关的保护基及缩写分别为：叔丁氧羰酰基(Boc)，苯甲酰甲醇酯(OPac)。溶剂及试剂：DMF(二甲基甲酰胺)，DCM(二氯甲烷)，THF(四氢呋喃)，Ida(亚氨基二乙酸)，TEA(三乙胺)，NMM(N-甲基吗啉)，NH₂Me(甲胺)，NHMe₂(二甲胺)，NH₂Et(乙胺)。液相缩合完成后分别使用Zn/HOAc或氨解，脱除Pac。固相缩合完成后分别用不同的胺化合物进行氨解，切除树脂载体。粗产品分别经C-18滤层吸附及淋洗或适当溶剂重结晶进行纯化。终产物经ESI-MS分析证明结构。

本发明因此还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明的骨生肽经体外成骨细胞增殖实验、切除卵巢的大鼠体内防治骨质疏松实验及与利塞磷酸钠合用的防治大鼠骨质疏松实验，均证明骨生肽具有预防和/治疗骨质疏松、肿瘤并发的高钙血症和骨痛、变形骨炎、多发性骨髓瘤及外科骨移植的药物中的功效。

具体实施方式

下述实施例具体显示本发明的应用。但本实施例不限定本发明的使用范围。

实施例1：

H-Phe-Gly-Tyr-Aca-OH(I)的合成方法：

每步反应均由TLC监测，直至反应完全。每步产物由EtOAc-石油醚重沉淀或EtOAc-Et₂O重结晶纯化。终产物(I)总收率为51％，在薄板层析(TLC)上的迁移速率(Rf)为0.36(DCM∶MeOH∶HOAc＝5∶1∶0.3)，其结构由ESI-MS证明，分子峰为499.0(M+H)。

实施例2：

HOOC(CH₂)₂CO-Phe-Gly-Tyr-Aca-NH₂(II)的合成：

反应的监控及产物的纯化同实施例I。产物II在TLC上的Rf为0.41(DCM∶MeOH∶HOAc＝5∶1∶0.3)，经ESI-MS证明，分子峰为484.2(M+H)。

实施例3：

H-Phe-Gly-Tyr-Aca-NHMe(III)的合成：

反应及纯化条件同反应的监控及产物的纯化同实施例2。产物III在TLC上的Rf为0.51(DCM：MeOH：HOAc)，ESI-MS为512.3(M+H)。

实施例4：

HOOC(CH₂)₂CO-Tyr-Gly-Tyr-NH₂(IV)的合成：

反应及纯化条件同实施例1。产物(IV)的ESI-MS：501.2(M+H)

实施例5：

H-Tyr-Gly-Tyr-NHBu(V)的合成：

反应及纯化条件同实施例1。产物(V)的ESI-MS：457.1(M+H)

实施例6：

CH₃CH₂CO-Tyr-Gly-Tyr-NHBu(VI)的合成：

最后一次缩合用丙酸酐/NMM代替Boc-Tyr-OH/HOBt-DCC，其余条件同实施例5。产物VI的ESI-MS：513.2(M+H)。

实施例7：

H-Aca-Tyr-Gly-Tyr-Gly-ol(VII)的合成：

各步缩合后均用茚三酮颜色反应监测，确保阴性结果即缩合完全后再进行下一个循环(即脱保护及缩合)。反应后均用DCM、EtOH、DMF、Et₂O依次洗滤、抽干。最后一步的氨解反应得到的滤液经减压浓缩，加20倍体积的水稀释。此溶液移至C-18滤层，经C-18滤液吸附后再用大量水洗涤，除去过量的甘氨醇。最后用EtOH-HOAc(2∶1)洗脱。收集到的滤液浓缩至干后再用无水乙醚研磨得到粉状产物(VII)，总收率78％，ESI-MS：558.3(M+H)。

实施例8：

CH₃CH₂CO-Phe-Gly-Tyr-Aca-NH₂(VIII)的合成：

反应条件同实验例7。氨解液浓缩后用EtOH-HOAc重结晶，得纯产物(VIII)，ESI-MS：554.3(M+H)。

实施例9：

BnNH-CO(CH₂)₂CO-Tyr-Aca-NMe₂(IX)的合成

首先由苄胺与丁二酸酐在吡啶存在下经室温反应过夜，制得中间体BnNHCO(CH₂)₂COOH后者与实施例1的中间体H-Tyr-Aca-OPac缩合，再经二甲胺发生氨解反应，生成产物IX。最后用EtOH-HOAc重结晶，得纯产物，ESI-MS：511.2(M+H)。

实施例10：

BnNHCO(CH₂)₂CO-Tyr-Aca-OH(X)的合成：

将实施例9的中间体BnNHCO(CH₂)₂CO-Tyr-Aca-OPac经Zn/HOAc还原，制得目标产物X，ESI-MS：484.3(M+H)。

实施例11：

H-Ida-Tyr-Gly-Tyr-NH₂(XI)的合成：

实验条件同实施例1，产物的ESI-MS：516.3(M+H)。

生物活性实验方法及结果

1)成骨细胞体外培养：

出生24小时内的SD大鼠用70％EtOH浸泡5分钟。分离出颅盖骨骨片，加入0.25％胰蛋白酶37℃下电磁搅拌消化10分钟。再将骨片移入0.1％I型胶原酶溶液中。37℃下消化30分钟。反复三次。收集上清液经100目网过滤及1000r/min离心10分钟。取细胞沉淀，用a-MEM培养液(含20％FBS及1％青链霉素)悬浮细胞，接种于培养瓶中，在5％CO₂培养箱中37℃培养。

2)成骨细胞体外增殖率实验：

各浓度的合成产物分别与事先接种于96孔板上的第三代成骨细胞及10％FBS完全培养，以NaF为阳性对照，培养48小时后，每孔加入15μL MTT(C＝5mg/ml)，置于培养箱中孵育4小时。取上清液加入150μL DMSO使全溶。经酶标仪(λ＝600nm)测定各孔吸光度(OD)值，用于评价成骨细胞的增殖率。

结果如表1所示。

表1各产物抑制成骨细胞增殖的最佳浓度比较

实验分组	最佳抑制浓度(M)
实验分组	最佳抑制浓度(M)	空白成骨细胞对照NaF阳性对照HOOC(CH₂)₂CO-Tyr-Gly-Tyr-NH₂(IV)H-Tyr-Gly-Tyr-NHBu(V)H-Aca-Tyr-Gly-Tyr-Gly-ol(VII)BnNH-CO(CH₂)₂CO-Tyr-Aca-NMe₂(IX)BnNHCO(CH₂)₂CO-Tyr-Aca-OH(X)H-Tyr-Gly-Tyr-NH₂(XI)其它组	--10-510^-910^-810^-910^-1110^-1010^-8＞10^-8

3)大鼠体内实验

每组10只3月龄的SD大鼠，共设切除卵巢不给药组(OVX)、假手术组(SHAM)及术后给药各组。给药方式及剂量为手术后次日开始每天皮下注射10nmol/100g体重共12周。OVX及SHAM每天仅注射PBS缓冲液，同时设阳性对照组(Rise)：每天皮下注射5μg/Kg体重的利塞膦酸钠。12周处死动物后测定，评价大鼠胫骨干骨后端形态学参数。

结果表明多数骨生肽化合物均能显著改善患鼠的骨质量，其中下列几个化合物：

H-Aca-Tyr-Gly-Tyr-Gly-ol(VII)

BnNH-CO(CH₂)₂CO-Tyr-Aca-NMe₂(IX)

BnNHCO(CH₂)₂CO-Tyr-Aca-OH(X)

的活性最强，并接近利塞膦酸钠的水平。值得指出的是这几种化合物与利塞膦酸钠联合给药的几组治疗效果均优于单独的Rise组。表明以成骨细胞为靶点的骨生肽与以破骨细胞为靶点的双膦盐药物相配合的鸡尾酒式配方为有效防治骨质疏松、肿瘤并发的高钙血症和骨痛，变形性骨质及外科骨移植等提供了新的治疗手段。

急性毒性试验

本发明所述各肽经小鼠急性毒性试验表明在20μmol/Kg(体重)剂量(有效剂量的200倍)下未发现毒、副作用。

Claims

1.一种多肽，其特征在于，

R¹-X¹-Tyr-X²-R²

其中R¹＝Phe，Tyr，Ida-Tyr，HOOC(CH₂)₂COPhe，HOOC(CH₂)₂COTyr，BnNH，p-HO-Ph-CO，ArCH[PO(OH)₂]NH

R²＝OH，NH₂，NHMe，NHEt，NMe₂，NHBu，Gly-ol，NH(CH₂)_nC[PO(OH)₂]₂OH

X¹＝Gly，β-Ala，CO(CH₂)₂CO

X²＝Abu，Aca，Gly。

2.根据权利要求1的多肽，其特征在于，所述的多肽为

H-Phe-Gly-Tyr-Aca-OH

HCOOC(CH₂)₂CO-Phe-Gly-Tyr-NH₂

H-Phe-Gly-Tyr-Aca-NHMe

HCOOC(CH₂)₂CO-Tyr-Gly-Tyr-NH₂

H-Tyr-Gly-Tyr-NH-Bu

CH₃CH₂CO-Tyr-Gly-Tyr-NH-Bu

H-Aca-Tyr-Gly-Tyr-Gly-ol

H-Tyr-Gly-Tyr-Aca-OPac

H-Phe-Gly-Tyr-Gly-NHBu

CH₃CH₂CO-Phe-Gly-Tyr-Aca-NH₂

H-Ida-Tyr-Gly-Tyr-NH₂

BnNH-CO(CH₂)₂CO-Tyr-Aca-OH

BnNH-CO(CH₂)₂CO-Tyr-Aca-NMe₂

BnNH-CO(CH₂)₂CO-Tyr-Abu-OH

BnNH-CO(CH₂)₂CO-Tyr-Abu-NH₂

H-Tyr-Gly-Tyr-Aca-NH(CH₂)_nC[PO(OH)₂]₂OH

H-Tyr-Gly-Tyr-Abu-NH(CH₂)_nC[PO(OH)₂]₂OH

H-Tyr-Gly-Phe-Aca-NH(CH₂)_nC[PO(OH)₂]₂OH

H-Tyr-Gly-Phe-Abu-NH(CH₂)_nC[PO(OH)₂]₂OH

其中，Ar＝Ph-，4-MeO-Ph-，3-MeO-4-HO-Ph-

。

3.一种药物组合物，其特征在于，含有药物有效剂量的如权利要求1-3所述的任一多肽及药用载体。

4.根据权利要求3的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。

5.如权利要求1或2的多肽在制备预防和/治疗骨质疏松、肿瘤并发的高钙血症和骨痛、变形骨炎、多发性骨髓瘤及外科骨移植的药物中的应用。

6.如权利要求1或2的多肽与双磷酸盐类联合在制备预防和/治疗骨质疏松、肿瘤并发的高钙血症和骨痛、变形骨炎、多发性骨髓瘤及外科骨移植的药物中的应用。