CN101138578B - 杜仲木脂素及其提取物在防治糖尿病并发症上的应用 - Google Patents

Abstract

杜仲木脂素及其提取物在防治糖尿病并发症上的应用，将杜仲木脂素及其提取物是以杜仲为原料提取制备而成，用于制备防治糖尿病并发病的药物。用于制备醛糖还原酶抑制剂。可以较好防治糖尿病慢性并发症，及可以很好地抑制醛糖还原酶。

Description

杜仲木脂素及其提取物在防治糖尿病并发症上的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域中将杜仲木脂素及其提取物在治糖尿病并发病上的应用。

背景技术

糖尿病慢性并发症(DCC)是糖尿病(DM)致死致残的主要原因，通过对几种糖尿病实验动物模型20年来的广泛研究已清楚地表明：糖代谢的多元醇通路与糖尿病血管病变、肾脏病变、视网膜病变及外周神经病变等糖尿病慢性并发症密切相关。而醛糖还原酶(Aldose reductase，AR)是多元醇通路的限速酶，高血糖可激活AR，激活的AR对葡萄糖的亲和力明显上升(其km值减少近10倍)，对葡萄糖的转化能力亦增强，造成山梨醇在细胞内的蓄积和还原剂如NAD(P)H的缺失，导致细胞膜的结构和功能受损而干扰细胞的正常代谢。因此，许多学者认为AR活性增高是导致DCC的主要原因之一，AR基因也被认为是II型DM发病的主要候选基因之一。

现在日、美、英等国竞相开发了多种醛糖还原酶抑制剂(ARI)，并已运用于DCC临床治疗，取得了一定的疗效。已经上市的ARI品种大约有10余种。①海因类：索比尼尔(sorbinil)及衍生物M-16209、非达司他，其中索比尼尔是最早的合成类ARI。②羧酸类：阿司他丁(alrestatin)、依帕司他(epalrestat)、泊那司他(ponalrestat)、托瑞司他(tolrestat)、GP-1447、SG-210等。

此外，富含黄酮类及其相关的香豆素类化合物、酚类、苯丙酸衍生物、萜类、生物碱等多种天然成分以及来源于微生物的某些成分具有AR抑制作用。

杜仲(Eucommia ulmoides)，又名思仙、丝棉树，属杜仲科(Eucommiaulmoides)，主要分布于陕西、河南、湖北、湖南、四川、云南、贵州、浙江、甘肃等省。其皮茎、叶均可入药，具有补肝肾、强筋骨、降血压、安胎、轻身耐老等功效。现代研究表明杜仲含有多种活性成分，具有降压、利尿、降糖、降脂、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎、镇静、止血、镇痛等作用。在我国，杜仲常常单独或与其它药物一起用来治疗高血压。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种杜仲木脂素及其提取物的应用，可以较好防治糖尿病慢性并发症，及可以很好地抑制醛糖还原酶。

本发明将杜仲木脂素及其提取物用于制备防治糖尿病的药物，所述的杜仲木脂素提取物是由杜仲提取制备而成。

本发明还将杜仲木脂素及其提取物用于制备醛糖还原酶的抑制剂。

目前国内外对杜仲木脂素的药理作用研究较少。我们的研究发现杜仲木脂素除了具有较强的降血压作用外，还具有较强的AR抑制作用，这为将杜仲木脂素开发成为一种具有防治糖尿病并发症的新型降压药物提供了实验依据。

到目前为止已从杜仲中分离提取了70余种单体，主要有木脂素类、苯丙素类、环烯醚萜类、黄酮类等。木脂素是植物体中由双分子苯丙素聚合而成的化合物，按其结构特点木脂素类包括双环氧林脂素类，单环氧木脂素类、环木脂素类、新木脂素类等及甙类。

杜仲木脂素提取物是一种混合物。

杜仲木脂素提取物中的木脂素成分优选占提取物重量的30％-90％。

杜仲木脂素提取物中木脂素类有效成分松脂醇二葡萄糖苷的含量优选占提取物重量的1-15％，最优选为3-7.5％。

所述的杜仲木脂素及其提取物可以通过采用选自粉碎、压榨、煅烧、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇提、水沉、醇沉、酯提、酮提、层析、过滤等方法得到。以该提取物为活性物质可制成药物制剂，所述提取物可以是浸膏形式的物质，可以是干浸膏也可以是流浸膏，可以是粉末状物质，根据制剂的不同需要制成不同的状态。

本发明还提杜仲木脂素及其提取物经过加工制备的适合服用的任何单位剂量形式的药物制剂，这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂，需要时可以制成缓释制剂、肠溶制剂。

本发明的杜仲木脂素及其提取物，在制备成药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：抗氧剂、鳌合剂表面活性剂填充剂崩解剂润湿剂分散剂润滑剂溶剂缓释材料肠溶材料pH调节剂、矫味剂、色素等，常用的载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素及纤维素衍生物、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的杜仲木脂素及其提取物的药物制剂，是通过将杜仲原料经过提取或其他方式加工，制成药物活性物质，随后，以该活性物质为原料，需要时加入药物可接受的载体，按照制剂学的常规技术制成药物制剂。

本发明还提供以下的杜仲木脂素提取物制备方法，该方法包括以下步骤：

1.取中药杜仲皮，用含水乙醇回流提取，提取液过滤，药液浓缩；

2.将浓缩的药液通过大孔树脂柱，依次用水、醇溶液洗脱。

3.收集醇洗脱液，浓缩，干燥，得到提取物粉末。

本发明还提供以下的杜仲木脂素提取物的优选的制备方法：

1.中药杜仲皮去外皮后，切成3-5cm的小段。用含水乙醇溶液加热回流提取2次，每次1-2h，提取液减压浓缩至0.5-1.5倍药材量体积；

2.将浓缩的药液通过大孔吸附树脂柱进行有效成分富集，依次用水，15-25％甲醇或乙醇，45-55％甲醇或乙醇溶液洗脱。

3.收集45-55％甲醇或乙醇洗脱液，浓缩，干燥得提取物粉末，即为具降压作用的植物提取物。

另外，收集水洗脱液，浓缩，干燥，粉碎，粉末用甲醇溶解，弃去不溶物，回收甲醇并干燥得环烯醚萜类部位。

在步骤1中的提取溶剂为含水乙醇，优选为40-95％的乙醇。

在步骤2中大孔吸附树脂柱为HP系列、D101、AB-8等弱极性树脂。

在步骤3中的浓缩液采用的干燥技术可以是多种，如真空干燥、喷雾干燥、冻干，优选冻干技术。

附图说明

图1：杜仲木脂素与阳性对照组AR酶抑制率。

图2：杜仲木脂素对糖尿病大鼠心肌组织AR活性的影响。注：#表示与正常对照组比较P＜0.05；*表示与阴性对照组比较P＜0.05；&与阳性对照组比较P＜0.05。

图3：杜仲木脂素对SHR大鼠心肌组织AR活性的影响。注：#表示与正常对照组比较P＜0.05；*表示与阴性对照组比较P＜0.05

具体实施方式

实施例1

杜仲木脂素抑制醛糖还原酶的实验研究

1.体外实验：

1.1实验方法

用新鲜牛晶状体提取醛糖还原酶(AR)。

酶促反应体系：总体积为200μl，其组成为：50mM磷酸盐缓冲液(pH＝6.2)、400mM硫酸锂、5mM β-巯基乙醇、0.15mM NADPH、1mg酶、5mM DL-甘油醛，用蒸馏水补足体积。

酶活力测定：DL-甘油醛最后加入以启动酶促反应，在25℃下连续监测340nm处反应体系吸光度的变化5分钟。规定25℃下反应体系吸光度每分钟下降0.001为一个酶活力单位。以不含底物的样品为空白对照。

分组：阴性对照：酶促反应体系不加入任何其它物质；阳性对照：酶促反应体系内加入适量Epalrestat(ARI)；待测样品孔：酶促反应体系内加入适量待测样品；空白对照：酶促反应体系内不加底物。

AR酶抑制率的计算：AR酶抑制率(％)＝[(AR酶活力-加入样品后的AR粗酶活力)/AR酶活力]×100％。

1.2实验结果

体外实验结果显示：杜仲木脂素对AR有抑制作用，该抑制作用略小于醛糖还原酶抑制剂Epalrestat(P＜0.05)。

2.对糖尿病大鼠心肌组织AR活性的影响

2.1实验方法

II型糖尿病大鼠采用链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)+高热量饮食制备。

分组：10周龄SD正常大鼠8只作为正常对照，糖尿病大鼠18只随机分为3组，每组6只：蒸馏水(阴性对照)、Epalrestat(阳性对照组，100mg·kg^-1·d^-1)、木脂素(300mg·kg^-1·d^-1)。

给药方法：灌胃给药，1天2次，连续8周。

心肌组织AR活性测定方法：反应体系：0.1M磷酸缓冲液(pH6.2)，含80μg蛋白的组织匀浆上清液(根据上清液的蛋白浓度计算需要加入的体积)，75μMNADPH，5mM DL-甘油醛。室温反应3min在紫外分光光度计上测定340nm吸光值，对照组不加DL-甘油醛。按含80μg蛋白的AR酶3min吸光值的变化为酶的活性。

2.2实验结果

18周龄SHR心肌AR活性较对照组增强(P＜0.05)；Epalrestat组AR活性较阴性对照组、正常对照组降低(P＜0.05)。木脂素组AR活性较阴性对照组降低(P＜0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)但高于阳性对照组(P＜0.05)。(见图2)

3.对高血压大鼠心肌组织AR活性的影响

3.1实验方法

高血压(SHR)大鼠，及WKY大鼠直接购买。

分组：10周龄WKY正常大鼠8只作为正常对照，SHR18只随机分为3组，每组6只：蒸馏水(阴性对照)、卡托普利(50mg·kg^-1·d^-1)、木脂素(300mg·kg^-1·d^-1)。

给药方法：灌胃给药，1天2次，连续8周。

心肌组织AR活性测定方法：反应体系：0.1M磷酸缓冲液(pH6.2)，含80μg蛋白的组织匀浆上清液(根据上清液的蛋白浓度计算需要加入的体积)，75μMNADPH，5mM DL-甘油醛。室温反应3min在紫外分光光度计上测定340nm吸光值，对照组不加DL-甘油醛。按含80μg蛋白的AR酶3min吸光值的变化为酶的活性。

3.2试验结果

18周龄SHR心肌AR活性较对照组增强(P＜0.05)；卡托普利组AR活性较阴性对照组降低(P＜0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。木脂素组AR活性较阴性对照组降低(P＜0.05)，但高于正常组(P＜0.05)。(图3)

4.结论

杜仲木脂素具有醛糖还原酶抑制作用。

实施例2

取杜仲树皮(去外皮)2Kg，用8L 65％乙醇回流提取两次，每次1h，过滤，合并两次提取液浓缩至800ml。用D101大孔树脂拌样上样(大孔树脂柱体积3L)，水洗3倍柱体积，1％氨水继续洗3倍柱体积，再水洗至中性。用20％乙醇洗脱2倍柱体积，用45％乙醇洗2.5倍柱体积。45％乙醇洗脱液浓缩至600ml。洗脱液浓缩后干燥成粉末。用松脂醇二葡萄糖苷作为对照，提取物经紫外检测木脂素成分含量为85％，经HPLC检测松脂醇二葡萄糖苷含量为12.5％。

实施例3

杜仲皮(去外皮)粉碎后，加60％乙醇9L回流提取1h，过滤，滤渣再加60％乙醇7L提取1h，过滤，合并两次提取液，浓缩至无醇味，得浓缩液约3L。浓缩液经AB-8大孔吸附树脂柱，先用5L水洗脱，再用7L 60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，浓缩至150ml，缓慢加到450ml水中，过滤，浓缩，得干燥固体粉末。用松脂醇二葡萄糖苷作为对照，提取物经紫外检测木脂素成分含量为51％，经HPLC检测松脂醇二葡萄糖苷含量为3.5％。

实施例2和实施例3所得到的杜仲木脂素提取物分别用于制备醛糖还原酶抑制剂，具有良好醛糖还原酶抑制作用。

实施例4

杜仲树皮(去外皮)切碎后，用65％的乙醇回流提取1h，过滤，提取液浓缩。经过HPD100大孔树脂吸附后，水洗3倍柱体积，20％乙醇洗2倍柱体积，45％乙醇洗2倍柱体积，45％乙醇洗脱液收集并浓缩，冻干，得到提取物粉末。取粉末60g，加入微晶纤维素230g，PVP10g，混匀，加入乙醇适量制软材，制粒，烘干，整粒，加少量硬脂酸镁，压片，制成1000片。

Claims (2)

1.杜仲木脂素在制备防治糖尿病并发症的药物中的应用，其特征在于：所述的杜仲木脂素是以杜仲为原料提取制备而成，用于制备防治糖尿病并发病的药物。

2.杜仲木脂素在制备防治糖尿病并发症的药物中的应用，其特征在于：所述的杜仲木脂素是以杜仲为原料提取制备而成，用于制备醛糖还原酶抑制剂。

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