CN101125223B

CN101125223B - 磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架的制备方法

Info

Publication number: CN101125223B
Application number: CN2007100597898A
Authority: CN
Inventors: 尹玉姬; 罗春晖; 李俊杰; 姚康德
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2007-09-27
Filing date: 2007-09-27
Publication date: 2010-10-27
Anticipated expiration: 2027-09-27
Also published as: CN101125223A

Abstract

本发明公开了一种磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架的制备方法。其过程包括：将α-磷酸三钙、一水合磷酸二氢钙、羟基磷灰石和碳酸钙按质量比混合研磨得磷酸钙骨水泥固相粉末；将磷酸氢二钠溶液与骨水泥固相粉末按质量比混合搅拌成糊状物，填入模具内，在真空固化，脱模，再固化得磷酸钙骨水泥多孔支架；将壳聚糖与明胶溶解于醋酸水溶液中，配制壳聚糖-明胶溶液，并加戊二醛水溶液；将磷酸钙骨水泥多孔支架放入壳聚糖-明胶溶液中，真空条件下向磷酸钙骨水泥多孔支架内灌注壳聚糖-明胶溶液后冷冻干燥，得到磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架。所制得的磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架，具有良好力学性能和生物学性能。

Description

磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架的制备方法

技术领域

本发明涉及一种磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架的制备方法，属于生物医学骨组织材料技术。

背景技术

在骨组织修复材料中，无机的磷酸钙类与骨组织组成相近，磷酸钙骨水泥(CPC)不仅与羟基磷灰石(HA)陶瓷一样具有极高的生物相容性，而且具有自固化、可降解性、操作方便、可塑性强等优点，CPC是一种很有应用前景的新一代骨修复材料。由于多孔支架具有微孔结构，可为细胞提供生存的三维空间，使细胞按预制形态的三维支架生长，因此，利用磷酸钙骨水泥制备多孔支架材料已成为近来研究的热点。

随着骨组织工程学的研究不断深入，近几年发展出了多种多样的多孔支架制备技术，它们都有各自的优点和发展前景，有研究发现，直径在100μm以上的大孔更有利于细胞的浸入和生长。因此，近年来对于如何在CPC中引入大孔的研究颇多，常用的方法有粒子滤沥法、气体发泡法、可吸收聚合物致孔法等。

气体发泡法作为一种常见的大孔制备技术已经广泛地应用于骨水泥的研究之中。这类制备技术的特点是整个过程温度为常温，使得最终制品与天然生物磷灰石的性质非常相似，表面更适于细胞黏附及正常的分化和增殖。另外，内在微孔与生成的大孔相结合得到了相对于烧结材料较好的互穿孔隙结构，提高了材料的吸收速率。但是，由这种方法制得的支架的孔均匀性难以控制、多孔结构使其机械性能大大下降，材料只能用于非承力部位。如Real等[Real R P，Woke J G.，Vallet-Regi M，et al.A new method to produce macropores incalcium phosphate cement.Biomaterials，2002，23：3673～3680]提出了利用NaHCO₃来制备大孔CPC支架材料的方法。在固相中加入NaHCO₃作为发泡剂，在液相中加入酸性的NaH₂PO₄与之反应生成CO₂来制备大孔的CPC支架。实验表明，所制备的CPC支架孔径尺寸(平均100μm以上)和总的孔隙率(50％以上)都有很大程度的提高。压缩强度可达到1.2～2.1MPa。而Almirall等[Almirall L G，Pelgado J A，Martinez S，et al.Fabrication oflow temperature macroporous hydroxyapatite scaffolds by foaming and hydrolysis of an α-TCPpaste.Biomaterials，2004，25：3671～3680]提出了利用H₂O₂来制备大孔CPC支架材料的方法。这种技术的基本原理是，通过在液相中加入H₂O₂然后加热使之分解产生O₂来制备大孔CPC支架。实验表明，所制备的CPC支架的孔隙率可达到45％～65％，压缩强度和拉伸强度分别可达到1.4～2.7MPa及1.5～2.6MPa。此外，Damien等[Damien L，Arnaud C，Ginebra M P.Micro-finite element models of bone tissue-engineering scaffolds.Biomaterials，2006，27：5326～5334]提出了利用蛋白做发泡剂制备大孔CPC支架材料的方法。将脱水蛋白与水以1∶7的比例混合，然后通过机械搅拌形成大量蛋白泡沫，将这些蛋白泡沫与固相粉末一起混合来制备出大孔CPC支架。实验表明通过这种方法制备的CPC支架孔隙率可达到45％。

粒子沥滤法原理简单，操作简便，孔隙率和孔径大小可通过改变致孔剂的百分含量和颗粒大小来调节，但用这种方法得到的孔形状不规则，孔间连通性差，且有颗粒残留。目前，通常使用的物质有甘露糖醇、蔗糖、磷酸钠、氯化钠等。甘露糖醇作为致孔剂，最早由Takagi和Chow等人提出，后来人们对其应用及完善进行了广泛的研究。Xu等人[Xu HH K，Michdel D W，Elena F B.Injectable and macroporous calcium phosphate cement scaffold.Biomaterials，2006，27：4279～4287]提出了甘露糖醇致孔、同时用纤维增强来制备具有可注射性能的大孔CPC支架。在磷酸钙骨水泥浆体中加入甘露糖醇晶体，通过晶体溶解得到形状很好的大孔结构，同时纤维的加入大大提高了支架的力学性能。研究表明，当甘露糖醇含量在0％～40％，纤维含量在0％～5％时，注射性能可达到100％，此时弯曲强度为(3.2±1.0)MPa，已经达到了烧结多孔骨修复材料的弯曲强度。Tadic等[Tadica D，BeckmannbF，Schwarz K，et al.A novel method to produce hydroxyapatite objects with interconnectingporosity that avoids sintering.Biomaterials，2004，25：3335～3340]采用氯化钠粒子(250～400μm)作为大孔致孔剂，可溶性的聚乙烯醇纤维(直径170μm，长度5～10mm)作为通孔剂，通过对致孔剂的水溶解，制得非烧结性的碳磷灰石多孔支架，取得了较好的连通性。实验表明，所制得的支架孔径在250～400μm，孔隙率达到47％，力学强度是致密骨水泥的1/10～1/20。Barralet等人[Barralet J E，Grover L，Gaunt T，et al.Preparation of macroporouscalcium phosphate cement tissue engineering scaffold.Biomaterials，2002，23：3063～3073]则提出了利用磷酸钠来制备大孔磷酸钙骨水泥的技术。骨水泥和冷冻的磷酸钠溶液冰晶粒子混合(加少量液氨以防解冻)在106MPa的压力下，磷酸钠溶液冰晶粒子熔化形成大孔时骨水泥已经固化，此方法制得的支架孔的大小及孔隙率都可控，且在这种情况下骨水泥基体的密度要比浆状体系的要大，支架可在低于室温下制备，实验表明，当骨水泥与冰晶颗粒之比为5∶2时，得到较为理想的支架材料，孔隙率可达到41％。

除了上述两种方法，通过可吸收性聚合物致孔，尤其是利用可吸收性纤维和纤维网状物也可以取得良好的效果。Xu等人[Xu H H K，Carl G，Simon Jr.Self-hardening calciumphosphate composite scaffold for bone tissue engineering.Journal of Orthopaedic Research，2004，22：535～543]发现，在CPC中掺入大直径的可吸收性纤维，短期内起到增强效果的同时，纤维的逐渐溶解吸收又提供了骨细胞生长所必须的大孔，特别是大量的互穿孔隙。这种方法通过控制纤维的直径和加入量就可以得到预想的孔形状和孔隙率。可吸收性纤维网状物的加入是对前者的一大改进。它不仅具有可吸收性纤维的所有特点，而且孔的形状和互穿孔隙率能够得到更为精确的控制。Von等[Von A S，Gonten J R.Load bearing behaviorof a simulated craniofacial structure fabricated from a hydroxyapatite cement and bioresorbablefiber-mesh.Journal of materials Science：Materials in Medicine，2000，11：95～100]对由CPC和可生物吸收编织纤维制成的类人工关节的承载行为进行了研究。他们将聚乳酸和聚乙醇酸共聚物的二维网状编织纤维同CPC复合，制成具有贝壳结构的CPC，表明编织纤维网在提高CPC的承载行为方面非常有效。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架的制备方法，以该方法制得的磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架，具有良好力学性能和生物学性能。

本发明是通过以下技术方案加以实现的，一种磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架的制备方法，其特征在于包括以下过程：

1.将粒径为2～10μm的α-磷酸三钙与一水合磷酸二氢钙及羟基磷灰石和碳酸钙按质量比：(50～80)∶(2～30)∶(2～20)∶(2～30)混合研磨制得磷酸钙骨水泥固相粉末。

2.以水为固化液，在20～25℃条件下，按固化液与磷酸钙骨水泥固相粉末的质量比为0.5～1.0∶1，将水加入到步骤1制得的磷酸钙骨水泥固相粉末中，搅拌均匀得到糊状物，将糊状物填入模具内，再将模具置于密封器内，在0.01MPa～0.05MPa真空下和60～100℃温度下固化2～5小时后，样品脱模，置于37℃、100％相对湿度下固化3～7天得到磷酸钙骨水泥多孔支架。

3.将壳聚糖与明胶按质量比为3∶7～7∶3溶解于体积浓度为1～3％的醋酸水溶液中，配制成质量浓度为1～5％的壳聚糖-明胶溶液，向壳聚糖-明胶溶液中滴加质量浓度为0.1～1.0％的戊二醛水溶液，戊二醛水溶液的体积量与壳聚糖-明胶溶液体积量的比为1∶5～10，进行搅拌制得含交联剂的壳聚糖-明胶溶液，备用。

4.将步骤2制得的磷酸钙骨水泥多孔支架放入步骤3制得的含交联剂的壳聚糖-明胶溶液中，以真空压为0.01～0.05MPa实施向磷酸钙骨水泥多孔支架内灌注壳聚糖-明胶溶液，灌注时间为30～60分钟，之后将灌注壳聚糖-明胶溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架在-60～-20℃的冷冻温度下预冻24～48小时，用冻干机在室温冻干48～72小时，得到磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架。

本发明的支架材料由磷酸钙和壳聚糖-明胶组成，而骨组织是主要由结晶度很差的缺钙羟基磷灰石与胶原纤维在纳米尺度上规则排列构筑的生物复合材料，因此磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架从材料组成上可以为细胞与组织提供一个近似活体的细胞外基质。从微观结构来看，多孔结构的无机/有机界面结合良好，有利于壳聚糖-明胶对骨水泥多孔支架的增强。

壳聚糖和明胶以其良好的生物相容性和生物降解性广泛应用于组织工程领域，但两者的强度相对都较低，力学性能不能满足临床使用要求。磷酸钙陶瓷的强度较高但为脆性材料，多孔支架的脆性更大。壳聚糖和明胶的引入将增强磷酸钙骨水泥材料的韧性，从而使复合材料既具有陶瓷的刚性又具有壳聚糖-明胶的韧性。磷酸钙骨水泥多孔支架由于存在大孔孔壁的塌陷，抗弯曲性能较弱。磷酸钙骨水泥复合多孔支架具有明显的韧性，受到较小的力就产生较大的形变，随着形变的不断增大，表现出较强的刚性，在最大承力点显示出应力屈服，并表现出一段受力平台期，不发生脆断，说明复合后的支架具有高聚物和无机材料的双重力学性能。用壳聚糖-明胶增强磷酸钙骨水泥支架，既可提高材料的机械性能，又能提高材料的生物活性及细胞信号识别性。

以往技术采用的气体发泡法制备大孔CPC支架主要是利用过氧化氢受热分解成氧或碳酸氢钠与磷酸二氢钠反应生成二氧化碳发泡，而过氧化氢具有强腐蚀性，碳酸氢钠与磷酸二氢钠反应生成的二氧化碳气体又较少。本发明以磷酸氢二钠水溶液为固化液，并在固相粉末中加入MCPM与CaCO₃，利用MCPM与CaCO₃发生中和反应生成大量CO₂的特点，在常温条件下制备大孔CPC支架。

附图说明

图1为本发明实施例1所制得的磷酸钙骨水泥支架的扫描电镜照片。

图2为本发明实施例1所制得的磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合支架的扫描电镜照片。

图3为本发明实施例1所制得的磷酸钙骨水泥支架固化3天后的X-射线衍射图谱。

图3中的骨水泥粉末中CaCO₃重量含量为：(a)18.5％；(b)13.5％；(c)8.5％。各标记代表的衍射峰是：▲缺钙羟基磷灰石(CDHA)，●二水合磷酸氢钙(DCPD)，◇碳酸钙(CaCO₃)。

具体实施方式

实施例1

取粒径为6.34μm的α-磷酸三钙6.3g、一水合磷酸二氢钙1.0g、羟基磷灰石0.85g、碳酸钙1.85g研磨制得磷酸钙骨水泥固相粉末。以质量浓度为0％的磷酸氢二钠溶液为固化液。将1g磷酸钙骨水泥固相粉末倒入洁净坩埚内，在室温条件下取0.9ml固化液水加入到磷酸钙骨水泥固相粉末中，用药勺迅速搅拌均匀，然后将糊状物填入模具内，尽量挤出其中的气体。将装有样品的模具放在真空瓶中抽真空至0.01MPa，而后把密封的真空瓶置于60℃烘箱中发泡固化2小时。取出模具，样品脱模，置于37℃、100％相对湿度下充分固化72小时得到磷酸钙骨水泥支架。将制得的磷酸钙骨水泥多孔支架放入抽滤瓶中，抽滤瓶上口连接分液漏斗，分液漏斗内装有用体积浓度为1％的醋酸水溶液配制的含质量浓度1％的壳聚糖-明胶的溶液30mL，其中壳聚糖用量为0.09g、明胶用量为0.21g、含质量浓度为0.25％的戊二醛溶液用量为3mL。用真空泵抽至压力为0.01 MPa30分钟以后，打开分液漏斗的旋钮，使壳聚糖-明胶溶液进入到抽虑瓶中，在真空条件下壳聚糖-明胶溶液将被灌入到磷酸钙骨水泥支架内部，保持时间为45分钟。将灌入壳聚糖-明胶溶液的支架在-60℃的冷冻温度下预冻24小时，用冻干机在室温冻干48小时，得到磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架。测得孔隙率为70％，压缩强度为1.2MPa，压缩模量为77MPa。

实施例2

本实施例的试验条件与过程与实施例1相同，只是改变了采用的壳聚糖-明胶溶液的质量浓度，配制成质量浓度3％的壳聚糖-明胶溶液，其中壳聚糖用量为0.27g、明胶用量为0.63g、含质量浓度为0.25％的戊二醛溶液用量为3mL。然后将磷酸钙骨水泥多孔支架加入该壳聚糖-明胶溶液中，本实施例所得到的磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架的孔隙率为66％，压缩强度为1.7MPa，压缩模量为124MPa。

实施例3

本实施例的试验条件与过程与实施例1相同，所制得的磷酸钙骨水泥多孔支架不加入到壳聚糖-明胶溶液中进行灌入，本实施例所得到的磷酸钙骨水泥支架的孔隙率为77％，压缩强度为0.33MPa，压缩模量为17MPa。

实施例4

本实施例的试验条件与过程与实施例1相同，只是改变了采用的壳聚糖-明胶溶液的质量浓度，配制成质量浓度2％的壳聚糖-明胶溶液，其中壳聚糖用量为0.18g、明胶用量为0.42g、含质量浓度为0.25％的戊二醛溶液用量为3mL。然后将磷酸钙骨水泥多孔支架加入该壳聚糖-明胶溶液中，本实施例所得到的磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架的孔隙率为67％，压缩强度为1.52MPa，压缩模量为109MPa。

实施例5

本实施例的试验条件与过程与实施例1相同，只是改变了采用的壳聚糖-明胶溶液的质量浓度，配制成质量浓度5％的壳聚糖-明胶溶液，其中壳聚糖用量为0.45g、明胶用量为1.05g、质量浓度为0.25％的戊二醛溶液用量为3mL。然后将磷酸钙骨水泥多孔支架加入该壳聚糖-明胶溶液中，本实施例所得到的磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架的孔隙率为65％，压缩强度为1.82MPa，压缩模量为129MPa。

Claims

1.一种磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架的制备方法，其特征在于：

1)使用粒径为2～10μm的α-磷酸三钙与一水合磷酸二氢钙及羟基磷灰石和碳酸钙按质量比：50～80∶2～30∶2～20∶2～30混合研磨制得磷酸钙骨水泥固相粉末；

2)以水为固化液，在20～25℃条件下，按固化液与磷酸钙骨水泥固相粉末的质量比为0.5～1.0∶1，将水加入到步骤1)制得的磷酸钙骨水泥固相粉末中，搅拌均匀得到糊状物，将糊状物填入模具内，再将模具置于密封器内，在0.01MPa～0.05MPa真空下和60～100℃温度下固化2～5小时后，样品脱模，置于37℃、100％相对湿度下固化3～7天得到磷酸钙骨水泥多孔支架；

3)将壳聚糖与明胶按质量比为3∶7～7∶3溶解于体积浓度为1～3％的醋酸水溶液中，配制成质量浓度为1～5％的壳聚糖-明胶溶液，向壳聚糖-明胶溶液中滴加质量浓度为0.1～1.0％的戊二醛水溶液，戊二醛水溶液的体积量与壳聚糖-明胶溶液体积量的比为1∶5～10，进行搅拌制得含交联剂的壳聚糖-明胶溶液，备用；

4)将步骤2)制得的磷酸钙骨水泥多孔支架放入步骤3)制得的含交联剂的壳聚糖-明胶溶液中，以真空压为0.01～0.05MPa实施向磷酸钙骨水泥多孔支架内灌注壳聚糖-明胶溶液，灌注时间为30～60分钟，之后将灌注壳聚糖-明胶溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架在-60～-20℃的冷冻温度下预冻24～48小时，用冻干机在室温冻干48～72小时，得到磷酸钙骨水泥/壳聚糖-明胶复合多孔支架。