CN101850133B - 一种自固化磷酸钙微球及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自固化磷酸钙微球及其制备方法与应用。本发明通过将明胶和去离子水混合，得到明胶溶液；将多糖胶和去离子水混合，得到多糖胶溶液；再将完全溶解后的明胶溶液和多糖胶溶液混合，得到明胶/多糖胶溶液；接着将明胶/多糖胶溶液与磷酸钙骨水泥充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再将自固化磷酸钙浆体搅拌分散于大豆油中，搅拌，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球，得到湿微球；将湿微球养护水化，干燥，得到自固化磷酸钙微球。本发明所述的制备方法无需经过烧结处理，可实现制备过程中同步载入药物、生长因子或其它活性功能成分，得到的自固化磷酸钙微球粒径为0.12～2.61mm，可保持6～32h不发生崩解。
Description
技术领域
本发明属于骨缺损修复医用材料领域，特别涉及一种自固化磷酸钙微球及其制备方法与应用。
背景技术
牙科手术领域所用到的微球的粒径通常在0.25～1mm，在整形外科手术所用到的微球直径通常在1～2mm。为满足牙科和整形外科手术中填充和修复的临床要求，需要开发一种粒径介于0.25～2mm，具有生物相容性好、可降解性好、可填充性、易于操作和方便载入功能性成分的骨修复材料微球。
表面光洁的Ca-P盐微球(常见的有HA、β-TCP或者双相磷酸钙陶瓷微球)，由于具有良好的流动性，便于填充，其规则的球形结构，使其填充于骨缺损部位后，不易引发炎症反应，且其堆积后形成较多微米级的孔隙结构，有利于新生骨组织的长入，在骨缺损填充修复和药物缓释体系等领域有着明显的优势，在拔牙窝充填、牙槽骨的扩充及牙周修复等临床口腔手术中得到了实际的应用。
通常Ca-P盐微球在成球后需要进行烧结才能具有良好的强度，不至于容易碎裂和崩解。然而，磷酸钙微球在经过烧结后，难以在微球制备过程中加入功能性组分(如载药、生长因子等)。因此，有效提高微球在水溶液中的抗崩解性，同时方便复合功能性成分，对于充分发挥微球的骨缺损填充修复和药物控制释放功能，实现微球在临床上的广泛应用是十分重要的。
为了改善材料在临床操作中需要的强度和易用性，目前关于Ca-P盐微球的制备，绝大部分都采用了烧结步骤，限制了微球的载药性能，影响到材料的降解性能。Liu等(Fabrication and characterization of porous hydroxyapatite granules，D M Liu，Biomaterials，1996，17：1955-1957)以PVB作为成孔剂，制备了粒径为0.7～4mm的Ca-P盐微球，为了增加微球的强度，在1200℃烧掉微球中的PVB。Rodriguez-Lorenzo等(Fabrication of porous hydroxyapatite bodies by a new directconsolidation method：starch consolidation，L M Rodriguez-Lorenzo，M Vallet-Regi，J M F Ferreira，Journal of Biomedical Material Research.2002，60：232-240)利用淀粉的溶胀成孔，制备了包含可溶性淀粉的磷酸钙悬浮液，随后在1100℃进行烧结成球。Vladimir S等(A method to fabricate porous spherical hydroxyapatitegranules intended for time-controlled drug release，Vladimir S Komleva，Serguei M，et al.Biomaterials，2002，23：3449-3454.)通过引入明胶作为粘结剂，制备了羟基磷灰石(HA)载药微球，为了防止HA载药微球在水中崩解，对微球进行烧结以提高其强度，导致其载药性能不佳。Junping Zhang等(In situ generation ofsodium alginate/hydroxyapatite nanocomposite beads as drug controlled releasematrices，Junping Zhang，Qin Wang，Aiqin Wang，et al.Acta Biomaterialia，2009，6：445-454.)通过HA/海藻酸钠体系中的海藻酸钠(SA)的溶胶-凝胶转化原位合成HA的方法制得HA微球，有效避免了烧结，但由于该体系主要依靠HA-SA之间微弱的交联键合，HA颗粒之间并未形成有效的结合力，导致该体系在水中3小时内便发生崩解失效。
上述所有的Ca-P盐微球在进行烧结处理前，都主要是靠有机粘结剂的结合力来实现成球，Ca-P盐颗粒之间并无有效的化学键合。这种微球若不经烧结处理，在水溶液中很快便由于有机物溶胀而发生崩解，导致体系失效；经过烧结处理后，微球的抗崩解性得到提高，体系可靠性增强，但其可降解性能变差，且作为药物载体时，只能通过将微球烧结体浸泡在药液中进行物理吸附载药，其载药量和包封率会受到严重的影响。
综上所述，目前国际上关于Ca-P盐微球的研究，都无法很好地将微球的抗崩解性和可降解性同时结合起来，也无法实现高的载药量和包封率。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术中的Ca-P盐微球无法很好的将微球的抗崩解性和可降解性同时结合起来的缺点与不足，提供一种自固化磷酸钙微球的制备方法。通过该制备方法得到的自固化磷酸钙微球能较好地将微球的抗崩解性和可降解性同时结合起来。
本发明的另一目的在于提供通过所述制备方法得到的自固化磷酸钙微球。
本发明的再一目的在于提供所述自固化磷酸钙微球的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种自固化磷酸钙微球的制备方法，包含以下步骤：
(1)将明胶和去离子水混合，于39～60℃、搅拌，直至明胶完全溶解，得到明胶溶液；
(2)将多糖胶和去离子水混合，于39～80℃、搅拌，直至多糖胶完全溶解，得到多糖胶溶液；
(3)将步骤(1)得到的明胶溶液和步骤(2)得到的多糖胶溶液混合，得到明胶/多糖胶溶液，作为磷酸钙骨水泥调和液，其中明胶和多糖胶的浓度分别为2～10％(w/v)和0.1～5％(w/v)；
(4)将步骤(3)得到的明胶/多糖胶溶液与磷酸钙骨水泥按液固比1.5～3.0mL/g充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再以100～500r/min的搅拌速度将自固化磷酸钙浆体搅拌分散到-15～10℃的大豆油中，搅拌10～90min后，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球，初步得到湿微球；将湿微球置于25～70℃、相对湿度为95％～100％(空气中水蒸气的百分比)的环境中养护水化2～7d，干燥，得到自固化磷酸钙微球。
所述的多糖胶优选变性淀粉、魔芋胶、黄原胶、槐豆胶、瓜尔豆胶或可溶性壳聚糖中的至少一种；
所述的变性淀粉为氧化淀粉、羧甲基淀粉、羟丙基淀粉、磷酸酯淀粉或醋酸酯淀粉中的至少一种；
所述的磷酸钙骨水泥指的是本领域中通常使用的磷酸钙骨水泥，为“磷酸四钙-磷酸氢钙”系统骨水泥、“磷酸二氢钙-α-磷酸三钙-碳酸钙”系统骨水泥、“磷酸四钙-α-磷酸三钙”系统骨水泥、“磷酸四钙-β-磷酸三钙-磷酸二氢钙”系统骨水泥、“无定形磷酸钙-磷酸氢钙”系统骨水泥或“磷酸氢钙-α-磷酸三钙-碳酸钙”系统骨水泥中的任一种；
步骤(1)中所述的明胶和去离子水优选按4～20g/100mL混合，得到的明胶溶液的浓度为4～20％(w/v)；
步骤(2)中所述的多糖胶和去离子水优选按0.2～10g/100mL混合，得到的多糖胶溶液为0.2～10％(w/v)；
步骤(4)所述洗涤的次数优选为至少三次；
一种自固化磷酸钙微球，由上述制备方法得到；所述自固化磷酸钙微球的粒径为0.12～2.61mm；所述自固化磷酸钙微球在体外抗崩解性试验中可以保持6～32h不发生崩解，远高于非烧结同类Ca-P微球的抗崩解时间；体外降解试验表明，第一阶段为明胶和多糖胶的降解，时间约1～4周；第二阶段为磷酸钙骨水泥水化产物的降解，在第3周后降解明显，最长18周后微球完全降解，自固化磷酸钙微球的可降解性能优于经烧结处理的Ca-P微球。在微球制备过程中还可对微球进行同步复合药物或其他功能性成分，研究表明，水溶性药物的载药量可达7.91％，包封率可达94.5％；脂溶性的药物的载药量可达3.58％，包封率可达71.5％；生长因子的包封率可达80％。
所述的自固化磷酸钙微球可作为各种原因引起的骨缺损、骨组织感染区的填充修复材料；以及作为牙槽骨缺损填充修复材料及牙槽嵴增高材料、增宽材料等；还可用作为药物载体材料；
所述自固化磷酸钙微球作为医用骨缺损填充材料，其应用方法为：
(1)对于无明显出血的骨缺损部位，可根据缺损大小，选择适当粒径的自固化磷酸钙微球直接填满骨缺损处，然后缝合或用磷酸钙骨水泥封闭表面后缝合；
(2)对于有明显出血的骨缺损部位，先进行适当止血，然后将自固化磷酸钙微球与无毒、降解性良好的高分子粘结剂(如纤维蛋白胶、黄原胶和槐豆胶)调制成注射性较好的糊状物，再填充至骨缺损部位或通过无针头直通管状注射器推注至骨缺损部位，最后进行缝合处理；
(3)在微球制备的调和浆体过程中可以根据需要直接加入药物或生长因子成球，组成药物或生长因子释放系统，也可成球后通过液相吸附的形式载药，可同时实现骨缺损填充和药物控制释放治疗的双重功效。
自固化磷酸钙(又称磷酸钙骨水泥，英文缩写为“CPC”)具有自固化性和可任意塑型性，可以方便地在体温下或室温下根据临床需要制成不同的大小、不同形状的修复体(如微球)，而且能够在微球的制备过程中添加功能性成分，从而获得更好的骨缺损修复和治疗效果。本发明以自固化磷酸钙作为基体，以明胶和多糖胶作为成球粘结剂，采用反相乳液法制备一种新型的自固化磷酸钙微球。明胶是胶原的变性产物，是由18种氨基酸组成的长链多肽，有着良好的生物降解性和无毒性。明胶在常温干燥的条件下呈固胶态(干燥颗粒)，浸入水中吸水膨胀，变成凝胶态，随着温度的升高，在37～42℃变成流体，成为溶胶态，且这种转变是可逆的。多糖胶如变性淀粉或黄原胶等，一定温度下在水中分子链得到伸展，可以发生糊化，而形成具有粘结力的糊状物。自固化磷酸钙在成球和脱水养护过程除受明胶、多糖胶溶液的粘结作用外，还发生了磷酸钙颗粒向HA转化的溶解沉淀反应(即磷酸钙骨水泥的水化反应)。水化反应过程中，磷酸钙盐发生了溶解，并在颗粒间析出纳米HA晶体，随着水化过程的进行，HA晶体长大并相互交织桥连在一起，使磷酸钙盐颗粒之间开始形成三维网络骨架结构。用反相乳液法制备的自固化磷酸钙微球在脱水养护处理过程中，浆体中的液相减少，磷酸盐的浓度相应增大。由溶度积曲线图知道，在钙磷盐中HA的溶度积最小，所以HA晶体的析出、长大也会加速，此时浆体塑性流动由于水相粘度的增大，水化产物的增多和有机粘结剂的空间位阻作用而终止，产生了凝结现象。在原来由明胶/多糖胶溶液(有机粘结剂和水)所占据的空间附近形成很多凝胶孔，同时明胶和多糖胶由于失去水粘附在孔壁的表面，形成了有机/无机杂化体，提高了两相的结合强度。颗粒通过两种机制结合在一起，大大增强了微球的抗崩解能力，这种方法所制备的磷酸钙微球，无需通过烧结就具有良好的强度和抗崩解能力，同时作为药物载体，药物可以在微球的制备过程中同步载入，不但药物的装载量和包封率高，而且载药量可以得到精确的控制。本发明利用磷酸钙骨水泥的自固化特性和添加剂的粘结性，可以有效地避免烧结，可制备用于牙科和整形外科的粒径为0.25～2mm的自固化磷酸钙微球，这种微球同时具有良好的抗崩解性和可降解性，而且可以实现高载药量和精确载药的磷酸钙微球，迄今为止尚未见有报道。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次同时将明胶和多糖胶溶液作为调和液，调和磷酸钙骨水泥，所得到的磷酸钙骨水泥的凝结时间变化不大。明胶和多糖胶不改变原磷酸钙骨水泥的水化反应和自行固化特性，固化后水化产物的组成仍然为羟基磷灰石。
(2)本发明利用磷酸钙骨水泥的自固化特点制备磷酸钙微球，克服了无自固化能力又不经高温烧结制备的磷酸钙类微球在水溶液中较短时间便发生崩解的缺点，制备的自固化磷酸钙微球抗崩解性能显著增强，在水中振荡的至少6h内不发生崩解，而仅仅用高分子粘结成球不经高温烧结的普通非自固化磷酸钙微球在水中振荡最长39min便开始发生崩解。
(3)本发明所述的自固化磷酸钙微球的制备无需经过烧结处理，可实现制备过程中同步载入药物、生长因子或其它活性功能成分，克服了普通磷酸钙类微球经高温烧结后可降解性降低且无法同步载药的缺点，并可实现高载药率、高包封率和精确载药。
(4)本发明所述自固化磷酸钙微球的制备方法简单，具有更优良的生物医学性能，可取得更好的临床应用效果，应用前景更加广阔。
附图说明
图1是实施例1制备的自固化磷酸钙微球形貌的扫描电子显微镜照片。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
应用明胶和氧化淀粉作为粘结剂制备自固化磷酸钙微球的步骤包括：
(1)将明胶颗粒(国药集团化学试剂有限公司，F20071019，化学纯)以4g/100mL的比例加入至42℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待明胶颗粒完全溶解后，得到4％(w/v)的明胶溶液；
(2)将氧化淀粉颗粒(上海汇普工业化学品有限公司，化学纯)以0.2g/100mL的比例加入至39℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待氧化淀粉颗粒完全溶解后，得到0.2％(w/v)的氧化淀粉溶液；
(3)将步骤(1)得到的明胶溶液和步骤(2)得到的氧化淀粉溶液按等体积混合，得到明胶/氧化淀粉溶液，作为磷酸钙骨水泥调和液(其中明胶和氧化淀粉的浓度分别为：2％(w/v)和0.1％(w/v))。在调和液中按药物与磷酸钙粉体的质量比为5％的含量加入水溶性广谱抗菌素药物-硫酸庆大霉素，充分混合，得到含硫酸庆大霉素的磷酸钙骨水泥调和液；
(4)将步骤(3)得到的明胶/氧化淀粉溶液与无定形磷酸钙-磷酸氢钙(其中，无定形磷酸钙按Wang等(Control of crystallinity of hydrated products in acalcium phosphate bone cement，Xiupeng Wang，Jiandong Ye，Yingjun Wang，et al.Journal of Biomedical Materials Research，Part A，2007，81A：781-790)介绍的方法合成，磷酸氢钙为上海试四赫维化工有限公司生产的分析纯试剂，两者按质量比1∶1混合得到无定形磷酸钙-磷酸氢钙骨水泥)按液固比1.5mL/g充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再以150r/min的搅拌速度将自固化磷酸钙浆体搅拌分散到-10℃的大豆油中，搅拌30min后，得到含油小球粒，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球三次，初步得到湿微球；将湿微球置于37℃、相对湿度为97％的恒温恒湿箱中养护水化6d，干燥，得到自固化磷酸钙微球(下称CPC微球)。
CPC微球的形貌如图1所示。用激光粒度分析仪测得CPC微球的粒径范围为0.31～2.35mm；通过压汞法测得微球的孔隙率为41.3％；通过固定漏斗法测得微球的安息角为24.6°(按照Sunil K Jain等在文献(Calcium silicate basedmicrospheres of repaglinide for gastroretentive floating drug delivery：Preparationand in vitro characterization，Sunil K Jain，A M Awasthi，N K Jain，et al.Journal ofControlled Release 2005(107)：300-309)所介绍的方法测量.下同)；体外药物释放试验表明(分析方法见《中国药典》2000年版二部.化学工业出版社，附录ⅣA第866页)，CPC微球中硫酸庆大霉素的载药量为4.73％，包封率达到94.5％。
按上述4个制备步骤，将其中的明胶/氧化淀粉溶液分别替换成只含2.1％(w/v)的明胶溶液和只含2.1％(w/v)的氧化淀粉溶液，以相同的方法分别制备出只含明胶的CPC微球(含明胶2.1％(w/v))和只含氧化淀粉的CPC微球(含氧化淀粉2.1％(w/v)；用HA粉末(HA的制备方法按Guo等在文献“Fabrication ofnanostructured hydroxyapatite and analysis of human osteoblastic cellular response.Xingyuan Guo，Julie E Gough，Ping Xiao，et al.Journal of biomedical materialsresearch.Part A 2007，82(4)：1022-1032”中介绍的方法制备，下同)替代磷酸钙骨水泥粉末，并按照上述4个制备步骤和添加剂含量(调和液中明胶和氧化淀粉的浓度分别为：2％(w/v)和0.1％(w/v))，制备出相同添加剂含量的非自固化的HA微球。按下面所述的方法对比这4种微球的力学强度、抗崩解性和可降解性。
4种微球均具有一定的力学强度，用手指不能将微球捻碎。分别取8颗粒径相差不大的上述4种微球，并用万能力学试验机测微球的的平均破坏载荷，测试结果如表1所示：
表1微球抗压性能
选取粒径范围在1.47～1.88mm的4种微球，分别将其浸泡在装有去离子水的塑料瓶中，并将瓶子置于37℃，120r/min的摇床中振荡，并于一定时间间隔观察记录瓶中液体的浑浊情况，由此考察4种微球的体外抗崩解时间；将4种微球以1.5mg/mL的比例分别浸泡在PBS溶液(100mM phosphate buffer，150mM NaCl，广州市达晖生物技术有限公司，pH值7.2，下同)中振荡，条件为37℃，120r/min，每隔24h换新鲜PBS，考察4种微球的体外降解时间(参考王秀鹏等在(Control of crystallinity of hydrated products in a calcium phosphatebone cement，Xiupeng Wang，Jiandong Ye，Yingjun Wang，et al.Journal ofBiomedical Materials Research，Part A，2007，81A：781-790)中介绍的方法，下同)。体外抗崩解与体外降解测试结果如表2所示。
表2微球的抗崩解性和可降解性
实施例2
应用明胶和羧甲基淀粉作为粘结剂制备自固化磷酸钙微球的步骤包括：
(1)将明胶颗粒(国药集团化学试剂有限公司，F20071019，化学纯)以6g/100mL的比例加入至39℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待明胶颗粒完全溶解后，得到6％(w/v)的明胶溶液；
(2)将羧甲基淀粉颗粒(广州市金珠江化学有限公司，化学纯)以0.6g/100mL的比例加入至40℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待羧甲基淀粉颗粒完全溶解后，得到0.6％(w/v)的羧甲基淀粉溶液；
(3)将步骤(1)得到的明胶溶液和步骤(2)得到的羧甲基淀粉溶液按等体积混合，得到明胶/羧甲基淀粉溶液，作为磷酸钙骨水泥调和液(其中明胶和羧甲基淀粉的浓度分别为：3％(w/v)和0.3％(w/v))。在调和液中按药物与磷酸钙粉体的质量比为8％的含量加入水溶性广谱性抗肿瘤的药物表柔比星(Epirubicinhydrochloride，EPI)，充分溶解混合，得到含表柔比星的磷酸钙骨水泥调和液；
(4)将步骤(3)得到的明胶/羧甲基淀粉溶液与磷酸四钙-α-磷酸三钙(其中磷酸四钙由郑治等在文献“医用磷酸钙骨水泥的制备及性能的实验研究，郑治，向其军，刘咏等，生物医学工程学杂志，2006，23(5)：1048-1051)”中介绍的方法合成；α-磷酸三钙从阿拉丁试剂网购得，1040103，化学纯；将两者按摩尔比1∶1混合得到磷酸四钙-α-磷酸三钙骨水泥)按液固比1.8mL/g充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再以100r/min的搅拌速度将自固化磷酸钙浆体搅拌分散到2℃的大豆油中，搅拌10min后，得到含油小球粒，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球五次，初步得到湿微球；将湿微球置于25℃、相对湿度为95％的恒温恒湿箱中养护水化5d，干燥，得到CPC微球。
用激光粒度分析仪测得CPC微球的粒径范围为0.22～1.89mm；通过压汞法测得微球的孔隙率为51.3％；通过固定漏斗法测得微球的安息角为27.4°；体外药物释放试验表明(分析方法见“表柔比星壳聚糖微球联合微波消融治疗小鼠肝移植瘤术”，杨静，汪森明，曹漫明等，中国组织工程研究与临床康复，2010，14(8)：1382-1385)，CPC微球中表柔比星的载药量为7.91％，包封率达到91.2％。
按上述4个制备步骤，将其中的明胶/羧甲基淀粉溶液分别替换成只含3.3％(w/v)的明胶溶液和只含3.3％(w/v)的羧甲基淀粉溶液，以相同的方法分别制备出只含明胶的CPC微球(含明胶3.3％(w/v))和只含羧甲基淀粉的CPC微球(含羧甲基淀粉3.3％(w/v)；以HA粉末替代磷酸钙骨水泥粉末，并按照上述4个步骤和添加剂含量(调和液中明胶和羧甲基淀粉的浓度分别为：3％(w/v)和0.3％(w/v))，制备出相同添加剂含量的非自固化的HA微球。按下面所述的方法对比这4种微球的力学强度、抗崩解性和可降解性。
4种微球均具有一定的力学强度，用手指不能将微球捻碎，分别取5颗粒径相差不大的上述4种微球，并用万能力学试验机测微球的的平均破坏载荷，测试结果如表3所示：
表3微球抗压性能
选取粒径范围在1.23～1.78mm的4种微球，分别将其浸泡在装有去离子水的塑料瓶中，并将瓶子置于37℃，120r/min的摇床中振荡，并与一定时间间隔观察记录瓶中液体的浑浊情况，由此考察4种微球的体外抗崩解时间；将4种微球以1.5mg/ml的比例分别浸泡在PBS溶液(100mM phosphate buffer，150mMNaCl，广州市达晖生物技术有限公司，pH值7.2，下同)中振荡，条件为37℃，120r/min，每隔24h换新鲜PBS，考察4种微球的体外降解时间。体外抗崩解与体外降解测试结果如表4所示：
表4微球的抗崩解性和可降解性
实施例3
应用明胶和羟丙基淀粉作为粘结剂制备自固化磷酸钙微球的步骤包括：
(1)将明胶颗粒(国药集团化学试剂有限公司，F20071019，化学纯)以8g/100mL的比例加入至60℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待明胶颗粒完全溶解后，得到8％(w/v)的明胶溶液；
(2)将羟丙基淀粉颗粒(上海汇普工业化学品有限公司，化学纯)以1.2g/100mL的比例加入至40℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待羟丙基淀粉颗粒完全溶解后，得到1.2％(w/v)的羟丙基淀粉溶液；
(3)将步骤(1)得到的明胶溶液和步骤(2)得到的羟丙基淀粉溶液按等体积混合，得到明胶/羟丙基淀粉溶液，作为磷酸钙骨水泥调和液(其中明胶和羟丙基淀粉的浓度分别为：4％(w/v)和0.6％(w/v))。在调和液中按生长因子与磷酸钙粉体的质量比为0.05％的浓度加入骨形态发生蛋白(BMP)(rhBMP-2，北京百灵克生物科技有限公司)，充分溶解混合，得到含BMP的磷酸钙骨水泥调和液；
(4)将步骤(3)得到的明胶/羟丙基淀粉溶液与无定形磷酸钙-磷酸氢钙(其中无定形磷酸钙按Wang等“Control of crystallinity of hydrated products in a calciumphosphate bone cement，Xiupeng Wang，Jiandong Ye，Yingjun Wang，et al.Journal ofBiomedical Materials Research，Part A，2007，81A：781-790”介绍的方法合成，磷酸氢钙为上海试四赫维化工有限公司生产的分析纯试剂，两者按质量比1∶1混合得到无定形磷酸钙-磷酸氢钙骨水泥)按液固比2.0mL/g充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再以400r/min的搅拌速度将自固化磷酸钙浆体搅拌分散到-15℃的大豆油中，搅拌45min后，得到含油小球粒，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球五次，初步得到湿微球；将湿微球置于50℃、相对湿度为97％的恒温恒湿箱中养护水化2d，干燥，得到CPC微球。
用激光粒度分析仪测得CPC微球的粒径范围为0.12～1.65mm；通过压汞法测得微球的孔隙率为48.6％；通过固定漏斗法测得微球的安息角为22.3°；体外药物释放试验表明(分析方法按照文献(rh-BMP-2壳聚糖微球的制备及体外检测，黄鑫，孟国林，刘建等，中国矫形外科杂志，2009，17(15)：1172-1174所介绍的方法)，CPC微球中rh-BMP-2的载药量为0.04％，包封率为80％。
按上述4个制备步骤，将其中的明胶/羟丙基淀粉溶液分别替换成只含4.6％(w/v)的明胶溶液和只含4.6％(w/v)的羟丙基淀粉溶液，以相同的方法分别制备出只含明胶的CPC微球(含明胶4.6％(w/v))和只含羟丙基淀粉的CPC微球(含羟丙基淀粉4.6％(w/v)；以HA粉末替代磷酸钙骨水泥粉末，并按照步骤上述4个步骤和添加剂含量(调和液中明胶和羟丙基淀粉的浓度分别为：4％(w/v)和0.6％(w/v)，制备出相同添加剂含量的非自固化的HA微球。按下面所述的方法对比这4种微球的力学强度、抗崩解性和可降解性。
4种微球均具有一定的力学强度，用手指不能将微球捻碎，分别取5颗粒径相差不大的上述4种微球，并用万能力学试验机测微球的的平均破坏载荷，测试结果如表5所示：
表5微球抗压性能
选取粒径范围在1.17～1.65mm的4种微球，分别将其浸泡在装有去离子水的塑料瓶中，并将瓶子置于37℃，120r/min的摇床中振荡，并于一定时间间隔观察记录瓶中液体的浑浊情况，由此考察4种微球的体外抗崩解时间；将4种微球以1.5mg/ml的比例分别浸泡在PBS溶液(100mM phosphate buffer，150mMNaCl，广州市达晖生物技术有限公司，pH值7.2，下同)中振荡，条件为37℃，120r/min，每隔24h换新鲜PBS，考察4种微球的体外降解时间。体外抗崩解与体外降解测试结果如表6所示：
表6微球的抗崩解性和可降解性
实施例4
应用明胶和磷酸酯淀粉作为粘结剂制备自固化磷酸钙微球的步骤包括：
(1)将明胶颗粒(国药集团化学试剂有限公司，F20071019，化学纯)以10g/100mL的比例加入至48℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待明胶颗粒完全溶解后，得到10％(w/v)的明胶溶液；
(2)将磷酸酯淀粉颗粒(石家庄市富强精细化工有限公司，化学纯)以1.8g/00mL的比例加入至60℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待磷酸酯淀粉颗粒完全溶解后，得到1.8％(w/v)的磷酸酯淀粉溶液；
(3)将步骤(1)得到的明胶溶液和步骤(2)得到的磷酸酯淀粉溶液按等体积混合，得到明胶/磷酸酯淀粉溶液，作为磷酸钙骨水泥调和液(其中明胶和磷酸酯淀粉的浓度分别为：5％(w/v)和0.9％(w/v))；在调和液中按药物与磷酸钙粉体的质量比为5％的含量加入脂溶性抗生素药物红霉素，充分溶解混合，得到含红霉素的磷酸钙骨水泥调和液；
(4)将步骤(3)得到的明胶/磷酸酯淀粉溶液与磷酸四钙-β-磷酸三钙-磷酸二氢钙(其中磷酸四钙由郑治等在文献“医用磷酸钙骨水泥的制备及性能的实验研究，郑治，向其军，刘咏等，生物医学工程学杂志，2006，23(5)：1048-1051”中介绍的方法合成；β-磷酸三钙由王玥华等在文献“用磷酸八钙前驱体法制备β-磷酸三钙，王玥华，张云，尹光福等，航天医学与医学工程，2004，4”中介绍的方法合成；磷酸二氢钙由阿拉丁试剂网购得，7758-23-8，化学纯；将三者按摩尔比1∶1∶3.7混合得到磷酸四钙-β-磷酸三钙-磷酸二氢钙骨水泥)按液固比2.1mL/g充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再以300r/min的搅拌速度将自固化磷酸钙浆体搅拌分散到6℃的大豆油中，搅拌60min后，得到含油小球粒，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球四次，初步得到湿微球；将湿微球置于47℃、相对湿度为95％的恒温恒湿箱中养护水化7d，干燥，得到CPC微球。
用激光粒度分析仪测得CPC微球的粒径范围为0.25～2.28mm；通过压汞法测得微球的孔隙率为61.4％；通过固定漏斗法测得微球的安息角为26.1°；体外药物释放试验表明(分析方法按照文献“红霉素片释放度测定法”.傅燕芳，王金芳，李春平，西北药学杂志：2000，5：213介绍的方法)，微球中红霉素的载药量为3.58％，包封率为71.5％.
按上述4个制备步骤，将其中的明胶/磷酸酯淀粉溶液分别替换成只含5.9％(w/v)的明胶溶液和只含5.9％(w/v)的磷酸酯淀粉溶液，以相同的方法分别制备出只含明胶的CPC微球(含明胶5.9％(w/v))和只含磷酸酯淀粉的CPC微球(含磷酸酯淀粉5.9％(w/v)；以HA粉末替代磷酸钙骨水泥粉末，并按照步骤上述4个步骤和添加剂含量(调和液中明胶和磷酸酯淀粉的浓度分别为：5％(w/v)和0.9％(w/v)，制备出相同添加剂含量的非自固化的HA微球。按下面所述的方法对比这4种微球的力学强度、抗崩解性和可降解性。
4种微球均具有一定的力学强度，用手指不能将微球捻碎，分别取11颗粒径相差不大的上述4种微球，并用万能力学试验机测微球的的平均破坏载荷，测试结果如表7所示：
表7微球抗压性能
选取粒径范围在1.36～1.83mm的4种微球，分别将其浸泡在装有去离子水的塑料瓶中，并将瓶子置于37℃，120r/min的摇床中振荡，并于一定时间间隔观察记录瓶中液体的浑浊情况，由此考察4种微球的体外抗崩解时间；将4种微球以1.5mg/mL的比例分别浸泡在PBS溶液(100mM phosphate buffer，150mM NaCl，广州市达晖生物技术有限公司，pH值7.2，下同)中振荡，条件为37℃，120r/min，每隔24h换新鲜PBS，考察4种微球的体外降解时间。体外抗崩解与体外降解测试结果如表8所示：
表8微球的抗崩解性和可降解性
实施例5
应用明胶和醋酸酯淀粉作为粘结剂制备自固化磷酸钙微球的步骤包括：
(1)将明胶颗粒(国药集团化学试剂有限公司，F20071019，化学纯)以12g/100mL的比例加入至55℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待明胶颗粒完全溶解后，得到12％(w/v)的明胶溶液；
(2)将醋酸酯淀粉颗粒(石家庄市富强精细化工有限公司，化学纯)以2.8g/100mL的比例加入至60℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待醋酸酯淀粉颗粒完全溶解后，得到2.8％(w/v)的醋酸酯淀粉溶液；
(3)将步骤(1)得到的明胶溶液和步骤(2)得到的醋酸酯淀粉溶液按等体积混合，得到明胶/醋酸酯淀粉溶液，作为磷酸钙骨水泥调和液(其中明胶和醋酸酯淀粉的浓度分别为：6％(w/v)和1.4％(w/v))；
(4)将步骤(3)得到的明胶/醋酸酯淀粉溶液与磷酸氢钙-α-磷酸三钙-碳酸钙(磷酸氢钙为上海试四赫维化工有限公司生产的分析纯试剂；α-磷酸三钙从阿拉丁试剂网购得，1040103，化学纯；碳酸钙是由淄博盛华精细化工有限公司生产的；将三者按摩尔比1∶1∶0.8混合得到磷酸氢钙-α-磷酸三钙-碳酸钙骨水泥)按液固比2.2mL/g充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再以180r/min的搅拌速度将自固化磷酸钙浆体搅拌分散到4℃的大豆油中，搅拌90min后，得到含油小球粒，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球四次，初步得到湿微球；将湿微球置于50℃、相对湿度为100％的恒温恒湿箱中养护水化2d，干燥，得到CPC微球。
用激光粒度分析仪测得CPC微球的粒径范围为0.33～2.61mm；通过压汞法测得微球的孔隙率为63.4％；通过固定漏斗法测得微球的安息角为23.8°
按上述4个步骤，并将其中的明胶/醋酸酯淀粉溶液分别替换成只含7.4％(w/v)的明胶溶液和只含7.4％(w/v)的醋酸酯淀粉溶液，以相同的方法分别制备出只含明胶的CPC微球(含明胶7.4％(w/v))和只含醋酸酯淀粉的CPC微球(含醋酸酯淀粉7.4％(w/v)；以HA粉末替代磷酸钙骨水泥粉末，并按照步骤上述4个步骤和添加剂含量(调和液中明胶和醋酸酯淀粉的浓度分别为：6％(w/v)和1.4％(w/v)，制备出相同添加剂含量的非自固化的HA微球。按下面所述的方法对比这4种微球的力学强度、抗崩解性和可降解性。
4种微球均具有一定的力学强度，用手指不能将微球捻碎，分别取6颗粒径上述4种微球，用万能力学试验机测微球的的平均破坏载荷，测试结果如表9：
表9微球抗压性能
选取粒径范围在1.37～1.83mm的4种微球，分别将其浸泡在装有去离子水的塑料瓶中，并将瓶子置于37℃，120r/min的摇床中振荡，并于一定时间间隔观察记录瓶中液体的浑浊情况，由此考察4种微球的体外抗崩解时间；将4种微球以1.5mg/ml的比例分别浸泡在PBS溶液(100mM phosphate buffer，150mMNaCl，广州市达晖生物技术有限公司，pH值7.2，下同)中振荡，条件为37℃，120r/min，每隔24h换新鲜PBS，考察4种微球的体外降解时间。体外抗崩解与体外降解测试结果如表10所示：
表10微球的抗崩解性和可降解性
实施例6
应用明胶和魔芋胶作为粘结剂制备自固化磷酸钙微球的步骤包括：
(1)将明胶颗粒(国药集团化学试剂有限公司，F20071019，化学纯)以14g/100mL的比例加入至48℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待明胶颗粒完全溶解后，得到14％(w/v)的明胶溶液；
(2)将魔芋胶颗粒(上海汇普工业化学品有限公司，化学纯)以3.6g/100mL的比例加入至60℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待魔芋胶颗粒完全溶解后，得到3.6％(w/v)的魔芋胶溶液；
(3)将步骤(1)得到的明胶溶液和步骤(2)得到的魔芋胶溶液按等体积混合，得到明胶/魔芋胶溶液，作为磷酸钙骨水泥调和液(其中明胶和魔芋胶的浓度分别为：7％(w/v)和1.8％(w/v)；
(4)将步骤(3)得到的明胶/魔芋胶溶液与磷酸四钙-磷酸氢钙(其中磷酸四钙由郑治等在文献“医用磷酸钙骨水泥的制备及性能的实验研究，郑治，向其军，刘咏等，生物医学工程学杂志，2006，23(5)：1048-1051”中介绍的方法合成；磷酸氢钙为上海试四赫维化工有限公司生产的分析纯试剂，将两者按摩尔比2∶3混合得到磷酸四钙-磷酸氢钙骨水泥)按液固比2.4mL/g充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再以500r/min的搅拌速度将自固化磷酸钙浆体搅拌分散到0℃的大豆油中，搅拌10min后，得到含油小球粒，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球五次，初步得到湿微球；将湿微球置于50℃、相对湿度为98％的恒温恒湿箱中养护水化3d，干燥，得到CPC微球。
用激光粒度分析仪测得CPC微球的粒径范围为0.19～2.05mm；通过压汞法测得微球的孔隙率为61.8％；通过固定漏斗法测得微球的安息角为27.4°.
按上述4个制备步骤，将其中的明胶/魔芋胶溶液分别替换成只含8.8％(w/v)的明胶溶液和只含8.8％(w/v)的魔芋胶溶液，以相同的方法分别制备出只含明胶的CPC微球(含明胶8.8％(w/v))和只含魔芋胶的CPC微球(含魔芋胶8.8％(w/v)；以HA粉末替代磷酸钙骨水泥粉末，并按照步骤上述4个步骤和添加剂含量(调和液中明胶和魔芋胶的浓度分别为：7％(w/v)和1.8％(w/v)，制备出相同添加剂含量的非自固化的HA微球。按下面所述的方法对比这4种微球的力学强度、抗崩解性和可降解性。
4种微球均具有一定的力学强度，用手指不能将微球捻碎，分别取6颗粒径相差不大的上述4种微球，并用万能力学试验机测微球的的平均破坏载荷，测试结果如表11所示：
表11微球抗压性能
选取粒径范围在1.37～1.73mm的4种微球，分别将其浸泡在装有去离子水的塑料瓶中，并将瓶子置于37℃，120r/min的摇床中振荡，并于一定时间间隔观察记录瓶中液体的浑浊情况，由此考察4种微球的体外抗崩解时间；将4种微球以1.5mg/mL的比例分别浸泡在PBS溶液(100mM phosphate buffer，150mM NaCl，广州市达晖生物技术有限公司，pH值7.2，下同)中振荡，条件为37℃，120r/min，每隔24h换新鲜PBS，考察4种微球的体外降解时间。体外抗崩解与体外降解测试结果如表12所示：
表12微球的抗崩解性和可降解性
实施例7
应用明胶和黄原胶作为粘结剂制备自固化磷酸钙微球的步骤包括：
(1)将明胶颗粒(国药集团化学试剂有限公司，F20071019，化学纯)以16g/100mL的比例加入至46℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待明胶颗粒完全溶解后，得到16％(w/v)的明胶溶液；
(2)将黄原胶颗粒(上海汇普工业化学品有限公司，食品级)以4g/100mL的比例加入至75℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待黄原胶颗粒完全溶解后，得到4％(w/v)的磷酸酯淀粉溶液；
(3)将步骤(1)得到的明胶溶液和步骤(2)得到的黄原胶溶液按等体积混合，得到明胶/黄原胶溶液，作为磷酸钙骨水泥调和液(其中明胶和黄原胶的浓度分别为：8％(w/v)和2％(w/v))；
(4)将步骤(3)得到的明胶/黄原胶溶液与磷酸二氢钙-α-磷酸三钙-碳酸钙(其中磷酸二氢钙从阿拉丁试剂网购得，7758-23-8，化学纯；α-磷酸三钙从阿拉丁试剂网购得，1040103，化学纯；碳酸钙是由淄博盛华精细化工有限公司生产的；将三者按摩尔比1∶1∶0.8混合得到磷酸氢钙-α-磷酸三钙-碳酸钙骨水泥)按液固比2.6mL/g充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再以300r/min的搅拌速度将自固化磷酸钙浆体搅拌分散到8℃的大豆油中，搅拌30min后，得到含油小球粒，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球四次，初步得到湿微球；将湿微球置于37℃、相对湿度为97％的恒温恒湿箱中养护水化5d，干燥，得到CPC微球。
用激光粒度分析仪测得CPC微球的粒径范围为0.37～2.28mm；通过压汞法测得微球的孔隙率为65.4％；通过固定漏斗法测得微球的安息角为23.8°.
按上述4个制备步骤，将其中的明胶/黄原胶溶液分别替换成只含10％(w/v)的明胶溶液和只含10％(w/v)的黄原胶溶液，以相同的方法分别制备出只含明胶的CPC微球(含明胶10％(w/v))和只含黄原胶的CPC微球(含黄原胶10％(w/v)；以HA粉末替代磷酸钙骨水泥粉末，并按照步骤上述4个步骤和添加剂含量(调和液中明胶和黄原胶的浓度分别为：8％(w/v)和2％(w/v)，制备出相同添加剂含量的非自固化的HA微球。按下面所述的方法对比这4种微球的力学强度、抗崩解性和可降解性。
4种微球均具有一定的力学强度，用手指不能将微球捻碎，分别取7颗粒径相差不大的上述4种微球，并用万能力学试验机测微球的的平均破坏载荷，测试结果如表13所示：
表13微球抗压性能
选取粒径范围在1.43～1.76mm的4种微球，分别将其浸泡在装有去离子水的塑料瓶中，并将瓶子置于37℃，120r/min的摇床中振荡，并于一定时间间隔观察记录瓶中液体的浑浊情况，由此考察4种微球的体外抗崩解时间；将4种微球以1.5mg/ml的比例分别浸泡在PBS溶液(100mM phosphate buffer，150mMNaCl，广州市达晖生物技术有限公司，pH值7.2，下同)中振荡，条件为37℃，120r/min，每隔24h换新鲜PBS，考察4种微球的体外降解时间。体外抗崩解与体外降解测试结果如表14所示：
表14微球的抗崩解性和可降解性
实施例8
应用明胶和槐豆胶作为粘结剂制备自固化磷酸钙微球的步骤包括：
(1)将明胶颗粒(国药集团化学试剂有限公司，F20071019，化学纯)以18g/100mL的比例加入至58℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待明胶颗粒完全溶解后，得到18％(w/v)的明胶溶液；
(2)将槐豆胶颗粒(上海汇普工业化学品有限公司，食品级)以4.8g/100mL的比例加入至80℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待磷酸酯淀粉颗粒完全溶解后，得到4.8％(w/v)的槐豆胶溶液；
(3)将步骤(1)得到的明胶溶液和步骤(2)得到的槐豆胶溶液按等体积混合，得到明胶/槐豆胶溶液，作为磷酸钙骨水泥调和液(其中明胶和槐豆胶的浓度分别为：9％(w/v)和2.4％(w/v))；
(4)将步骤(3)得到的明胶/槐豆胶溶液与无定形磷酸钙-磷酸氢钙(其中无定形磷酸钙按Wang等“Control of crystallinity of hydrated products in a calciumphosphate bone cement，Xiupeng Wang，Jiandong Ye，Yingjun Wang，et al.Journal ofBiomedical Materials Research，Part A，2007，81A：781-790”介绍的方法合成，磷酸氢钙为上海试四赫维化工有限公司生产的分析纯试剂，两者按质量比1∶1混合得到无定形磷酸钙-磷酸氢钙骨水泥)按液固比2.8mL/g充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再以200r/min的搅拌速度将自固化磷酸钙浆体搅拌分散到4℃的大豆油中，搅拌20min后，得到含油小球粒，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球五次，初步得到湿微球；将湿微球置于50℃、相对湿度为100％的恒温恒湿箱中养护水化4d，干燥，得到CPC微球。
用激光粒度分析仪测得CPC微球的粒径范围为0.25～2.03mm；通过压汞法测得微球的孔隙率为58.3％；通过固定漏斗法测得微球的安息角为28.2°.
按上述4个制备步骤，将其中的明胶/槐豆胶溶液分别替换成只含11.4％(w/v)的明胶溶液和只含11.4％(w/v)的槐豆胶溶液，以相同的方法分别制备出只含明胶的CPC微球(含明胶11.4％(w/v))和只含槐豆胶的CPC微球(含槐豆胶11.4％(w/v)；以HA粉末替代磷酸钙骨水泥粉末，并按照步骤上述4个步骤和添加剂含量(调和液中明胶和槐豆胶的浓度分别为：9％(w/v)和2.4％(w/v)，制备出相同添加剂含量的非自固化的HA微球。按下面所述的方法对比这4种微球的力学强度、抗崩解性和可降解性。
4种微球均具有一定的力学强度，用手指不能将微球捻碎，分别取4颗粒径相差不大的上述4种微球，并用万能力学试验机测微球的的平均破坏载荷，测试结果如表15所示：
表15微球抗压性能
选取粒径范围在1.41～1.78mm的4种微球，分别将其浸泡在装有去离子水的塑料瓶中，并将瓶子置于37℃，120r/min的摇床中振荡，并于一定时间间隔观察记录瓶中液体的浑浊情况，由此考察4种微球的体外抗崩解时间；将4种微球以1.5mg/mL的比例分别浸泡在PBS溶液(100mM phosphate buffer，150mM NaCl，广州市达晖生物技术有限公司，pH值7.2，下同)中振荡，条件为37℃，120r/min，每隔24h换新鲜PBS，考察4种微球的体外降解时间。体外抗崩解与体外降解测试结果如表16所示：
表16微球的抗崩解性和可降解性
实施例9
应用明胶和瓜尔豆胶作为粘结剂制备自固化磷酸钙微球的步骤包括：
(1)将明胶颗粒(国药集团化学试剂有限公司，F20071019，化学纯)以20g/100mL的比例加入至58℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待明胶颗粒完全溶解后，得到20％(w/v)的明胶溶液；
(2)将瓜尔豆胶颗粒(上海汇普工业化学品有限公司，食品级)以10g/100mL的比例加入至42℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待瓜尔豆胶颗粒完全溶解后，得到10％(w/v)的瓜尔豆胶溶液；
(3)将步骤(1)得到的明胶溶液和步骤(2)得到的瓜尔豆胶溶液按等体积混合，得到明胶/瓜尔豆胶溶液，作为磷酸钙骨水泥调和液(其中明胶和瓜尔豆胶的浓度分别为：10％(w/v)和5％(w/v)；
(4)将步骤(3)得到的明胶/瓜尔豆胶溶液与磷酸四钙-磷酸氢钙(其中磷酸四钙由郑治等在文献“医用磷酸钙骨水泥的制备及性能的实验研究，郑治，向其军，刘咏等，生物医学工程学杂志，2006，23(5)：1048-1051”中介绍的方法合成；磷酸氢钙为上海试四赫维化工有限公司生产的分析纯试剂；将两者按摩尔比2∶3混合得到磷酸四钙-磷酸氢钙骨水泥)按液固比3.0mL/g充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再以300r/min的搅拌速度将自固化磷酸钙浆体搅拌分散到4℃的大豆油中，搅拌10min后，得到含油小球粒，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球四次，初步得到湿微球；将湿微球置于70℃、相对湿度为100％的恒温恒湿箱中养护水化3d，干燥，得到CPC微球。
用激光粒度分析仪测得CPC微球的粒径范围为0.48～2.39mm；通过压汞法测得微球的孔隙率为66.4％；通过固定漏斗法测得微球的安息角为25.2°.
按上述4个制备步骤，将其中的明胶/瓜尔豆胶溶液分别替换成只含15％(w/v)的明胶溶液和只含15％(w/v)的瓜尔豆胶溶液，以相同的方法分别制备出只含明胶的CPC微球(含明胶15％(w/v))和只含瓜尔豆胶的CPC微球(含瓜尔豆胶15％(w/v)；以HA粉末替代磷酸钙骨水泥粉末，并按照步骤上述4个步骤和添加剂含量(调和液中明胶和瓜尔豆胶的浓度分别为：10％(w/v)和5％(w/v)，制备出相同添加剂含量的非自固化的HA微球。按下面所述的方法对比这4种微球的力学强度、抗崩解性和可降解性。
4种微球均具有一定的力学强度，用手指不能将微球捻碎，分别取9颗粒径相差不大的上述4种微球，并用万能力学试验机测微球的的平均破坏载荷，测试结果如表17所示：
表17微球抗压性能
选取粒径范围在1.41～1.83mm的4种微球，分别将其浸泡在装有去离子水的塑料瓶中，并将瓶子置于37℃，120r/min的摇床中振荡，并于一定时间间隔观察记录瓶中液体的浑浊情况，由此考察4种微球的体外抗崩解时间；将4种微球以1.5mg/mL的比例分别浸泡在PBS溶液(100mM phosphate buffer，150mM NaCl，广州市达晖生物技术有限公司，pH值7.2，下同)中振荡，条件为37℃，120r/min，每隔24h换新鲜PBS，考察4种微球的体外降解时间。体外抗崩解与体外降解测试结果如表18所示：
表18微球的抗崩解性和可降解性
实施例10
应用明胶、黄原胶和可溶性壳聚糖作为粘结剂制备自固化磷酸钙微球的步骤包括：
(1)将明胶颗粒(国药集团化学试剂有限公司，F20071019，化学纯)以12g/100mL的比例加入至48℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待明胶颗粒完全溶解后，得到12％(w/v)的明胶溶液；
(2)将黄原胶颗粒(上海汇普工业化学品有限公司，食品级)以0.6g/100mL的比例加入至50℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待黄原胶颗粒完全溶解后，得到0.6％(w/v)的黄原胶溶液；将可溶性壳聚糖颗粒(上海优品生化有限公司，化学纯)以1.8g/100mL的比例加入至80℃的去离子水中进行充分溶胀，并用搅拌器进行搅拌，待可溶性壳聚糖颗粒完全溶解后，得到2.0％(w/v)的可溶性壳聚糖溶液；
(3)将步骤(1)得到的明胶溶液、步骤(2)得到的黄原胶溶液和可溶性壳聚糖混合溶液按等体积混合，得到明胶/黄原胶/可溶性壳聚糖溶液，作为磷酸钙骨水泥调和液(其中明胶、黄原胶、可溶性壳聚糖的浓度分别为：4％(w/v)、0.2％(w/v)和0.6％(w/v)；
(4)将步骤(3)得到的明胶/黄原胶/可溶性壳聚糖溶液与无定形磷酸钙-磷酸氢钙(其中无定形磷酸钙按Wang等“Control of crystallinity of hydrated productsin a calcium phosphate bone cement，Xiupeng Wang，Jiandong Ye，Yingjun Wang，et al.Journal of Biomedical Materials Research，PartA，2007，81A：781-790”介绍的方法合成，磷酸氢钙为上海试四赫维化工有限公司生产的分析纯试剂，两者按质量比1∶1混合得到无定形磷酸钙-磷酸氢钙骨水泥)按液固比2.0mL/g充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再以200r/min的搅拌速度将自固化磷酸钙浆体搅拌分散到10℃的大豆油中，搅拌20min后，得到含油小球粒，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球五次，初步得到湿微球；将湿微球置于50℃、相对湿度为100％的恒温恒湿箱中养护水化3d，干燥，得到CPC微球。
用激光粒度分析仪测得CPC微球的粒径范围为0.27～2.16mm；通过压汞法测得微球的孔隙率为59.7％；通过固定漏斗法测得微球的安息角为22.4°.
按上述4个制备步骤，将其中的明胶/黄原胶/可溶性壳聚糖溶液分别替换成只含4.8％(w/v)的明胶溶液和只含4.8％(w/v)的可溶性壳聚糖溶液，以相同的方法分别制备出只含明胶的CPC微球(含明胶4.8％(w/v))和只含可溶性壳聚糖的CPC微球(含可溶性壳聚糖4.8％(w/v)；以HA粉末替代磷酸钙骨水泥粉末，并按照步骤上述4个步骤和添加剂含量(调和液中明胶和可溶性壳聚糖的浓度分别为：4％(w/v)和0.6％(w/v)，制备出相同添加剂含量的非自固化的HA微球
4种微球均具有一定的力学强度，用手指不能将微球捻碎，分别取6颗粒径相差不大的上述4种微球，并用万能力学试验机测微球的的平均破坏载荷，测试结果如表19所示：
表19微球抗压性能
选取粒径范围在1.52～1.81mm的4种微球，分别将其浸泡在装有去离子水的塑料瓶中，将瓶子置于37℃，120r/min的摇床中振荡，并于一定时间间隔观察记录瓶中液体的浑浊情况，由此考察4种微球的体外抗崩解时间；将4种微球以1.5mg/ml的比例分别浸泡在PBS溶液(100mM phosphate buffer，150mMNaCl，广州市达晖生物技术有限公司，pH值7.2，下同)中振荡，条件为37℃，120r/min，每隔24h换新鲜PBS，考察4种微球的体外降解时间。体外抗崩解与体外降解测试结果如表20所示：
表20微球的抗崩解性和可降解性
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种自固化磷酸钙微球的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
（1）将明胶和去离子水混合，于39～60℃、搅拌，直至明胶完全溶解，得到明胶溶液；
（2）将多糖胶和去离子水混合，于39～80℃、搅拌，直至多糖胶完全溶解，得到多糖胶溶液；
（3）将步骤（1）得到的明胶溶液和步骤（2）得到的多糖胶溶液混合，得到明胶/多糖胶溶液，其中明胶和多糖胶的浓度分别为质量体积比2～10%和质量体积比0.1～5%；
（4）将步骤（3）得到的明胶/多糖胶溶液与磷酸钙骨水泥按液固比1.5～3.0 mL/g充分调和、搅拌，制得呈粘稠状的自固化磷酸钙浆体，再以100～500 r/min的搅拌速度将自固化磷酸钙浆体搅拌分散到﹣15～10 ℃的大豆油中，搅拌10～90 min后，滤除大豆油，并用丙酮和酒精反复洗涤微球，得到湿微球；将湿微球置于25～70 ℃、相对湿度为95%～100%的环境中养护水化2～7 d，干燥，得到自固化磷酸钙微球；
所述的多糖胶为变性淀粉、魔芋胶、黄原胶、槐豆胶、瓜尔豆胶或可溶性壳聚糖中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的变性淀粉为氧化淀粉、羧甲基淀粉、羟丙基淀粉、磷酸酯淀粉或醋酸酯淀粉中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的磷酸钙骨水泥为“磷酸四钙-磷酸氢钙”系统骨水泥、“磷酸二氢钙-α-磷酸三钙-碳酸钙”系统骨水泥、“磷酸四钙-α-磷酸三钙”系统骨水泥、“磷酸四钙-β-磷酸三钙-磷酸二氢钙”系统骨水泥、“无定形磷酸钙-磷酸氢钙”系统骨水泥或“磷酸氢钙-α-磷酸三钙-碳酸钙”系统骨水泥中的任一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的明胶和去离子水按4～20 g/100mL混合；
步骤（2）中所述的多糖胶和去离子水按0.2～10 g/100mL混合。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述洗涤的次数为至少三次。
6.一种自固化磷酸钙微球，由权利要求1～5任一项所述的制备方法得到。
7.权利要求6所述自固化磷酸钙微球的应用，其特征在于：所述自固化磷酸钙微球作为骨缺损或骨组织感染区的填充修复材料；作为牙槽嵴增高材料、增宽材料；以及作为药物载体材料。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述自固化磷酸钙微球作为医用骨缺损填充材料，应用方法为：
（1）对于无明显出血的骨缺损部位，根据缺损大小，选择适当粒径的自固化磷酸钙微球直接填满骨缺损处，然后缝合或用磷酸钙骨水泥封闭表面后缝合；
（2）对于有明显出血的骨缺损部位，先进行适当止血，然后将自固化磷酸钙微球与无毒、降解性良好的高分子粘结剂调制成注射性较好的糊状物，再填充至骨缺损部位或通过无针头直通管状注射器推注至骨缺损部位，最后进行缝合处理；
（3）在微球制备的调和浆体过程中根据需要直接加入药物或生长因子成球，组成药物或生长因子释放系统；或者成球后通过液相吸附的形式载药，同时实现骨缺损填充和药物控制释放治疗的双重功效。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述高分子粘结剂为纤维蛋白胶、黄原胶或槐豆胶中的任一种。
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