CN101123883A - 高纯度稻米蛋白浓缩物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从稻米底物产生稻米蛋白浓缩物的方法，该方法包括：在72℃或低于72℃的温度和约3.0至6.5的pH，用具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶和第二淀粉水解酶来酶促水解稻米底物，以获得溶解的淀粉组分和包括不溶性蛋白的残留物组分，和将溶解的淀粉组分与残余物分离，以获得稻米蛋白浓缩物。该稻米蛋白浓缩物可以用于动物饲料和人类食物制品。

Description

高纯度稻米蛋白浓缩物的制备方法

[001]本申请要求2004年2月23日提交的，题为高纯度稻米蛋白浓缩物的制备方法(A Method for the Preparation of a High-Purity Rice Protein Concentrate)的美国临时专利申请序列号60/547,153的优先权，该临时专利申请的内容整体并入本文作为参考。

技术领域

[002]本发明涉及稻米蛋白浓缩物，和其制备方法。该方法包括：在低于稻米底物中的蛋白质的变性温度和在该蛋白质的等电pH处或附近，酶促水解稻米底物，以获得包括溶解的颗粒淀粉水解物的组分和包括不溶性稻米蛋白的残余物，将溶解的淀粉水解物组分与包括不溶性稻米蛋白的残余物分离，以获得稻米蛋白浓缩物，特别是高纯度稻米蛋白浓缩物。

背景技术

[003]稻米是世界半数以上人口的主要的粮食。蛋白质(8％)和淀粉(80％)构成了稻米的两大主要成分。尽管稻米蛋白是有价值的食物成分，然而稻米在工业上的加工是为了获得它的淀粉和淀粉水解产物，稻米蛋白却主要用于动物饲料应用中。

[004]生产溶解的稻米淀粉水解产物以及从淀粉中分离稻米蛋白的方法是已知的。一般地，从稻米粉末中分离稻米蛋白如下进行：通过高温加热溶解稻米淀粉，然后用降解淀粉的淀粉酶水解(参见例如Hansen等，(1981)Food Technology 35：38-42；Chen等，(1984)J.Sci.Food Agric.35：1128-1135；和Shin等，(1997)Cereal Chem.74：437-441和Juliano B.O.(1984)IN STARCH：CHEMISTRY AND TECHNOLOGY，第二版Ed.R.L.Whistler等，Academic Press，New York，pp.507-528)。更具体地，Mitchell等，(美国专利4,744,922)公开了用传统的高温喷射蒸煮工艺产生稻米淀粉水解产物的方法。Slott等(美国专利3,912,590)公开了溶解稻米淀粉之后用热稳定α淀粉酶水解的方法。Euber等(美国专利4,990,344)报道了通过用热稳定α淀粉酶在提高的温度中溶解和水解稻米淀粉来制备稻米蛋白浓缩物，该稻米蛋白浓缩物具有减少的锰、铝和肌醇六磷酸水平和改进的可消化性，可用于婴幼食品。

[005]上面描述的方法是在高温中进行，通常在90℃的范围内。在这些颗粒淀粉的溶解温度中，稻米中的蛋白质会变性。据报道，稻米蛋白通常在75℃以上的温度中变性(Ju等，(2001)J.Food Sci.66：229-232)。蛋白质变性导致在食物制品中发挥作用的许多功能特性丧失。例如，在高温处理中产生的稻米蛋白浓缩物的营养值和可消化性低于乳蛋白-酪蛋白的营养值，酪蛋白被用作行业标准(Morita等，(1993)J.FoodSci.58：1393-1406和Chang等(1993)J.FoodSci.51：464-467)。因此，如上面提到的，工业上由高温蒸煮产生的稻米蛋白主要在动物饲料市场上出售。

[006]在不经淀粉溶解作用的情况下，将稻米蛋白与稻米淀粉分离开来具有许多缺点。该方法耗时的也是昂贵的，而且产品的产量低。此外，常常用于该方法的高碱、酸和表面活性剂化合物使得该方法未得人心，特别是如果该蛋白质打算用于食品应用的话。

[007]因为稻米蛋白是低过敏原性的(Helm等，(1996)Cereal Foods World41：839-843)，并且必需氨基酸诸如甲硫氨酸含量高(Tecson等，(1971)Cereal Chem.48：91-202)，稻米蛋白是有价值的。因此，通过开发某种方法来提高作为淀粉加工的副产品的稻米蛋白的质量和数量是值得期待的，在该方法中，从在淀粉加工中使用的稻米底物获得的稻米蛋白不被变性。该蛋白质然后可以用于各种应用，诸如用于人类食品用途。例如，在生产谷氨酸单钠的微生物发酵期间，使用了大量的稻米底物，这产生了大量的变性稻米蛋白副产品。仅仅在中国，估计需要大约2.6公吨的稻米底物来满足超过1.0×10⁶公吨的谷氨酸单钠年生产量。如果MSG的生产能产生高稻米蛋白浓缩物，而不是变性的蛋白质副产品，则有望获得巨大的益处。

[008]本发明提供了生产稻米蛋白浓缩物，特别是高纯度稻米蛋白浓缩物的方法，其是在淀粉加工期间获得的，其中所述加工不包括使含有淀粉和蛋白质的稻米底物经受高温处理，取而代之地是使稻米底物经受低于稻米底物蛋白的变性温度的温度。

[009]由本发明包括的方法产生的稻米蛋白浓缩物可以用于各种用途，包括用于人类食物制品和动物饲料中。因为总体上说稻米蛋白具有高水平的某些必需氨基酸和低的人类过敏原性，根据本发明包括的方法来获得稻米蛋白浓缩物具有额外的优点。

发明概述

[010]本发明的一个目的是提供由稻米底物制备高纯度稻米蛋白浓缩物的方法，该方法包括在低于包含在稻米底物中的稻米蛋白的变性温度下，在该稻米蛋白的等电pH处或附近，通过将稻米底物与两种淀粉水解酶接触，水解颗粒稻米淀粉，其中第一淀粉水解酶是颗粒淀粉水解(GSH)酶。

[011]在一个方面，本发明涉及从稻米底物产生稻米蛋白浓缩物的方法，该方法包括(a)在等于或低于包含在稻米底物中的稻米蛋白的变性温度的温度，在稻米蛋白的等电pH附近，将具有10至55％之间的干固体含量的稻米底物与两种淀粉水解酶的组合接触，以获得溶解的淀粉水解物，其中第一淀粉水解酶是颗粒淀粉水解(GSH)酶，和(b)分离溶解的淀粉水解产物，以获得稻米蛋白浓缩物。

[012]在该方面的一个实施方案中，变性温度在70℃或低于70℃，pH在约pH 3.0至pH 6.0之间。

[013]在第二个实施方案中，淀粉水解酶是α淀粉酶和葡糖淀粉酶。

[014]在第三个实施方案中，葡糖淀粉酶是颗粒淀粉水解酶(GSHE)，其来自灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)菌株(H-GSHE)或泡盛曲霉河内变种(Aspergillus awamori var.kawachi)菌株。

[015]在第四个实施方案中，α淀粉酶来自芽孢杆菌属(Bacillus)，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的菌株。

[016]在第五个实施方案中，GSHE是葡糖淀粉酶，其获自重组木霉属(Trichoderma)菌株，特别是里氏木霉(T.reesei)菌株，该菌株表达编码灰腐质霉GSHE的异源基因(rH-GSHE)或泡盛曲霉河内变种的基因(rA-GSHE)。

[017]在第六个实施方案中，由分离步骤获得的稻米蛋白浓缩物的蛋白含量(N×5.92)为约至少40％。在其他优选实施方案中，由分离步骤获得的稻米蛋白浓缩物的蛋白含量(N×5.92)为约至少60％。在其他实施方案中，稻米蛋白浓缩物是高纯度稻米蛋白浓缩物，其蛋白含量为至少约65％。

[018]在第七个实施方案中，本发明涉及根据本发明包含的方法获得的稻米蛋白浓缩物。

[019]在第二个方面，本发明涉及从稻米底物产生高纯度稻米蛋白浓缩物的方法，该方法包括(a)在低于包含在稻米底物中的稻米蛋白的变性温度的温度，在约3.0至6.0之间的pH，将稻米底物的浆体与两种淀粉水解酶温育足够的时间，以水解稻米底物中的颗粒淀粉的实质部分(substantial portion)，其中，其中一种淀粉水解酶是颗粒淀粉水解酶，和(b)将淀粉水解产物从温育的浆体中分离出来，以获得包括基本上不溶的稻米蛋白浓缩物的残留物。

[020]在该方面的一个实施方案中，该方法还包括(c)在低于包含在稻米底物中的稻米蛋白的变性温度的温度，将包括基本上不溶的稻米蛋白浓缩物的残余物与淀粉水解酶温育足够的时间，直到残余物基本上无所有的淀粉，以获得高纯度稻米蛋白浓缩物；和(d)分离该高纯度稻米蛋白浓缩物。

[021]在该方面的第二个实施方案中，温育温度为约70℃，在其他实施方案中，温育温度为约60℃。

[022]在第三个实施方案中，步骤a)中的第二淀粉水解酶是α淀粉酶。

[023]在第四个实施方案中，α淀粉酶来自芽孢杆菌属，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株。

[024]在第五个实施方案中，颗粒淀粉水解酶(GSHE)是来自灰腐质霉高温变种菌株的葡糖淀粉酶(H-GSHE)。

[025]在第六个实施方案中，GSHE是来自灰腐质霉高温变种菌株的GSHE，其表达在木霉属菌株，特别是里氏木霉菌株中(rH-GSHE)。

[026]在第七个实施方案中，温育步骤的pH在约4.0至6.0之间。

[027]在第八个实施方案中，其中一个温育步骤或两个温育步骤中的酶反应通过将pH降至低于约pH 4.0的值而终止。

[028]在第九个实施方案中，步骤(a)的温育进行约24小时。

[029]在第十个实施方案中，在温育步骤(a)中，90％以上的颗粒稻米淀粉被水解，在进一步的实施方案中，在温育步骤(c)中，90％以上的剩余淀粉被水解。

[030]在第十一个实施方案中，高纯度稻米蛋白浓缩物中的蛋白含量为至少65％。

[031]在第十二个实施方案中，稻米蛋白浓缩物被干燥，直到水分含量少于10％。

[032]在第三个方面，本发明涉及根据本文中描述的方法获得的高纯度稻米蛋白浓缩物，其中所述高纯度稻米蛋白浓缩物包括至少65％的蛋白质。

[033]在第四个方面，本发明涉及从稻米底物生产高纯度稻米蛋白浓缩物的方法，该方法包括(a)在约70℃至50℃之间的温度，在约3.0至6.0之间的pH中，将稻米底物的浆体与i)获自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶和ii)通过灰腐质霉高温变种GSHE在里氏木霉宿主中表达而获得的颗粒淀粉水解酶温育足够的时间，以水解稻米底物中至少90％的颗粒淀粉；(b)将淀粉水解产物与温育的浆体分离开来，以获得包括稻米蛋白浓缩物的残余物；(c)在70℃至50℃之间的温度和约3.0至6.0之间的pH，将包括稻米蛋白浓缩物的残余物与α淀粉酶和GSHE温育足够的时间，以水解残余物中至少80％的颗粒淀粉，从而获得包括高纯度稻米蛋白浓缩物的残余物，其蛋白含量为至少65％；和(d)回收该高纯度稻米蛋白浓缩物。

[034]在第五个方面，本发明涉及增加动物饲料的蛋白含量的方法，该方法包括在低于72℃的温度，将稻米底物与包括颗粒淀粉水解(GSH)酶在内的淀粉水解酶的组合接触足够的时间，以水解稻米底物中60％的淀粉；获得溶解的淀粉部分和包含不溶性蛋白的残余物；分离残余物以获得稻米蛋白浓缩物；并将稻米蛋白浓缩物加入到动物饲料中。

[035]在一个实施方案中，淀粉水解酶的组合包括GSH酶和α淀粉酶。在第二个实施方案中，该方法还包括，将包含不溶性蛋白的残余物与包含颗粒淀粉水解酶的淀粉水解酶接触，以获得包括可溶性淀粉和不溶性稻米蛋白的组分；分离不溶性稻米蛋白，以获得高纯度稻米蛋白浓缩物；和将高纯度稻米蛋白浓缩物加入到动物饲料中。

附图说明

[036]图1提供了编码天然的灰腐质霉高温变种颗粒淀粉水解酶(GSHE)的基因组DNA序列(SEQ ID NO：1)。推断的内含子用粗体和下划线表示。

[037]图2A提供了灰腐质霉高温变种GSHE的信号序列和成熟氨基酸序列(SEQID NO：2)。推断的信号序列用粗体和下划线表示。

[038]图2B提供了灰腐质霉高温变种GSHE的成熟氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。

[039]图3显示了pTrex3g_N13质粒，该质粒用于表达编码灰腐质霉GSHE的核酸，该质粒在真菌表达载体的侧翼含有Xba1位点，其中a)cbhI启动子是里氏木霉纤维二糖水解酶启动子，b)灰腐质霉gla1是编码SEQ ID NO：3的灰腐质霉GSHE的多核苷酸，c)amdS是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶标记基因，和d)cbhI终止子是里氏木霉纤维二糖水解酶终止子。

[040]图4提供了图3中的pTrex3g_N13质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)(10739bp)。

[041]图5提供了编码天然泡盛曲霉河内变种颗粒淀粉水解酶(A-GSHE)的基因组DNA序列(SEQ ID NO：5)。

[042]图6提供了泡盛曲霉河内变种GSHE的推断的信号序列(粗体和下划线表示)和成熟氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)。

[043]图7提供了在pH 5.5和60℃，作为时间函数的溶解的颗粒稻米淀粉的百分数(％)，分别使用下述酶：

a)α淀粉酶，G-Zyme G997，0.1 kg/MT G997)，(---◇---)；

b)表达于里氏木霉的灰腐质霉高温变种颗粒淀粉水解酶(rH-GSHE)，1.0 GSHE单位/g)；(---■---)和

c)两者的组合(---▲---)。

也参考实施例2，表2；实施例4，表4；和实施例5，表5。

发明详述

[044]在一些方面，本发明依靠用于遗传工程和分子生物学领域的常规技术和方法。下述文献中包含对可用于本发明的普通方法学的描述：Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(第二版，1989)；Kreigler，GENE TRANSFER AND EXPRESSION；A LABORATORY MANUAL(1990)和Ausubel等，Eds.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。

[045]本文中如无其它限定，在此应用的所有技术术语和科学术语具有被本发明所涉及领域的普通技术人员普遍理解的相同意义。Singleton，等，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第二版，John Wiley和Sons，New York(1994)，以及Hale和Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARYOF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明中应用的许多术语的一般性释义。虽然与此处描述相似或等价的任何方法和物质在本发明的实践或试验中是有用的，但此处描述了优选的方法和物质。

[046]本发明现将仅仅使用下面的定义和实施例，以参考的方式进行详细的描述。本文中参考的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有序列，特意并入本文作为参考。

[047]数值范围包括限定该范围的数。

[048]此处如无其它的说明，分别地，核酸的书写方向从左至右是5′至3′；氨基酸序列的书写方向从左至右是氨基至羧基端。

[049]此处提供的标题不是对本发明各个方面或实施方案的限制，可以参考说明书整体，对其进行理解。

A.定义

[050]术语“稻米(rice)”指归为水稻(Oryza sativa)种类的植物。

[051]术语“稻米底物(rice substrate)”包含所有形式的稻米(精制或未精制的)，诸如整粒谷物(whole grain)、碎粒谷物(broken grains)、稻米渣(rice grits)和稻米粉(riceflour)以及任何植物部分。

[052]如本文中所使用地，术语“淀粉(starch)”指由植物的复杂多糖碳水化合物组成的任何物质，由式为(C₆H₁₀O₅)_x的直链淀粉和支链淀粉组成，其中x可以是任何数。

[053]术语“颗粒淀粉(granular starch)”指未蒸煮过的(未加工的)淀粉，其未经历胶凝化作用。术语“胶凝化(gelatinization)”指淀粉分子溶解形成粘性悬浮液。

[054]术语“稻米蛋白浓缩物(rice protein concentrate)”指根据本发明的方法，从稻米底物分离出溶解的稻米淀粉水解物的实质部分后而得到的蛋白质组分，其中稻米蛋白浓缩物的蛋白含量大于约10％。

[055]术语“高纯度稻米蛋白浓缩物(high-purity rice protein concentrate)”指根据本发明的方法，从稻米底物分离溶解的稻米淀粉水解产物的实质部分而得到的蛋白质组分，其中高纯度稻米蛋白浓缩物的蛋白含量为至少约60％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、72％、75％、80％或更大。

[056]术语“蛋白质(protein)”指大分子量的聚合物，其由一个或多个多肽链组成，其单体是通过肽键连接起来的氨基酸。术语“蛋白质(protein)”和“多肽(polypeptide)”在本文中有时可以交换使用。本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。

[057]术语“变性温度(denaturation temperature)”指蛋白质因二级和三级结构的分解而失去它们的功能时的温度。一般而言，蛋白质从溶液中沉淀出来。

[058]术语“等电点(isoelectric point)”指蛋白质或许多蛋白质携带零净电荷时的溶液pH。

[059]术语“DE”或“葡萄糖当量(dextrose equivalent)”指测量总还原糖浓度的一个行业标准，基于干重量以D-葡萄糖进行计算。未水解的颗粒淀粉的DE基本上为0，D-葡萄糖的DE为100。

[060]术语“总糖含量(total sugar content)”指淀粉组合物中存在的总糖含量。

[061]术语“干固体含量(ds)”指浆体的总固体(以％表示)，基于干重量来计算。

[062]术语“浆(slurry)”指包括不溶性物的含水混合物。

[063]“白利(Brix)”指一种熟知的液体比重计标度，用于量度在给定温度下溶液的糖含量。白利标度测量的是每100克含水糖溶液中存在的蔗糖的克数(总的溶解固体含量)。白利测量值通常通过使用液体比重计或折光计来获得。

[064]术语“淀粉的水解(hydrolysis of starch)”指在加入水分子的情况下糖苷键的切割。

[065]短语“稻米底物中的淀粉的实质部分的水解(hydrolysis of a substantial portionof the starch of a rice substrate)”或“从稻米底物中分离溶解的稻米淀粉水解产物的实质部分(separation of a substantial portion of the solubilized rice starch hydrolysatefrom a rice substrate)”指稻米底物或残留物中至少80％的淀粉已被溶解和水解。

[066]术语“聚合度(degree of polymerization，DP)”是指，在给定的糖中脱水吡喃型葡萄糖单位的数量。DP1的实例是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，如麦芽糖和蔗糖。“DP4⁺”表示聚合度大于3的聚合物。

[067]术语“淀粉酶(amylases)”指催化淀粉水解的酶。

[068]术语“α-淀粉酶(E.C.分类3.2.1.1)”指催化α-1，4-糖苷键水解的酶。这些酶也已经被描述为在含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中实现1，4-α-D-糖苷键的外切或内切水解的那些酶。用于描述这些酶的另一个术语是糖原酶(glycogenase)。例证性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(α-1，4-glucan4-glucanohydrase glucanohydrolase)。

[069]术语“葡糖淀粉酶(glucoamylase)”在此指淀粉葡糖苷酶类别的酶(E.C.3.2.1.3，葡糖淀粉酶，α-1，4-D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些是外切作用的酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原末端释放葡糖残基。这些酶也水解α-1，6和α-1，3-键，尽管是以比α-1，4-键低得多的速率水解。

[070]如本文中所使用的，术语“颗粒淀粉水解酶(granular starch hydrolyzingenzyme)(GSHE)”或“具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶(an enzyme having granularstarch hydrolyzing(GSH)activity)”指具有水解粒状形式的淀粉的能力的酶。

[071]术语“重组子(recombinant)”当用于指例如细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或者通过改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者表明细胞是来源于如此而被修饰的细胞。因此，例如，重组的细胞表达在该细胞的天然(非重组的)形式中不存在的基因；或者表达天然基因，但这些天然基因以别的方式被异常表达、不足地表达或者根本不表达。

[072]术语“重组GSHE”、“重组表达的GSHE”和“重组产生的GSHE”指成熟GSHE蛋白质序列，其是在宿主细胞中由异源多核苷酸产生。符号“r”可以用于表示重组子。rGSHE的蛋白序列不包括信号序列。在一个实施方案中，在里氏木霉的菌株中表达的灰腐质霉高温变种GSHE，用“rH-GSHE”表示。

[073]术语“天然GSHE”和“nGSHE”指源自宿主生物的GSHE，其中编码GSHE的多核苷酸对于宿主生物是内源性。优选的天然GSHE来自灰腐质霉菌株或泡盛曲霉菌株。

[074]术语“糖基化(glycosylation)”指通过加入碳水化合物部分(moieties)对蛋白质进行的转录后修饰，其中碳水化合物是N-连接的或者O-连接的，由此产生糖蛋白。糖蛋白的N-连接碳水化合物部分通过糖苷键连接到天冬酰胺残基的β-酰胺氮上。通过丝氨酸或苏氨酸残基的羟基，O-连接碳水化合物通过糖苷键连接到蛋白质上。

[075]“信号序列(signal sequence)”指与蛋白质的N末端部分结合的氨基酸的序列，其有助于成熟形式的蛋白质分泌到细胞外。信号序列的定义是功能性定义。胞外蛋白质的成熟形式缺乏信号序列，其在分泌过程中被切割掉。

[076]“基因(gene)”指在产生多肽中所涉及的DNA片段，包括该编码区域之前的区域和之后的区域，以及在各编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

[077]术语“核酸(nucleic acid)”指DNA、RNA、单链或双链及其化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”在此处可以被交替使用。由于遗传密码是简并的，所以不止一种密码子可以被用于编码特定氨基酸，本发明包括多核苷酸，其编码特定的氨基酸序列。

[078]“载体(vector)”是指被设计用于将核酸引入到一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、序列盒及类似物。

[079]如本文中所使用地，“表达载体(expression vector)”指DNA构建物，其包括可操作地连接到适当的控制序列上的DNA序列，所述适当的控制序列能实现DNA在适当宿主中的表达。这样的控制序列可以包括启动子以实施转录、任选的操纵子序列以控制转录、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译终止的序列。

[080]“启动子(promoter)”是在结合RNA聚合酶以启动基因的转录中所涉及的调节序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。本发明中使用的优选启动子是里氏木霉cbh1，其是诱导型启动子。

[081]“在转录控制之下(under transcriptional control)”是本技术领域充分理解的一个术语，该术语表明，多核苷酸序列——通常是DNA序列——的转录依赖于其被可操作地连接到对转录的启动有贡献或者促进转录的元件上。

[082]“在翻译控制下(under translational control)”是本领域充分理解的术语，指在mRNA已经形成后发生的调节过程。

[083]如本文中所使用地，当描述蛋白质和编码它们的基因时，用于该基因的术语不用大写字母，并且是斜体字，例如编码灰腐质霉GSHE的基因可以表示为gla1。用于该蛋白质的术语通常不是斜体字，第一个字母是大写的，例如由gla1基因编码的蛋白质可以表示为Gla1。

[084]术语“可操作性连接(operably linked)”是指并列关系，其中元件以可允许它们在功能上相关的方式排列。例如，如果启动子控制编码序列的转录，那么启动子就是可操作地连接到该序列上。

[085]术语“选择性标记(selective marker)”指能在宿主中表达的基因，其可以使得含有被引入的核酸或载体的那些宿主的选择容易一些。选择性标记的实例包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)或赋予代谢优势例如营养优势给宿主细胞的基因。

[086]术语“来源(derived)”包含术语源自(originated from)、获自(obtained from)或可获自(obtainable from)，和分离自(isolated from)。

[087]“宿主菌株(host strain)”或“宿主细胞(host cell)”指包含编码本发明GSHE的多核苷酸的表达载体或DNA构建物的合适宿主。具体地，宿主菌株是丝状真菌细胞。在本发明优选的实施方案，“宿主细胞”不但指丝状真菌菌株特别是木霉属某种的细胞，也指由它们产生的原生质体。

[088]术语“丝状真菌(filamentous fungi)”包括所有丝状形式的真菌亚门(Eumycotina)(参见Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，New York：Wiley)。这些真菌的特征在于营养菌丝，具有由几丁质、纤维素和其它复合多糖组成的细胞壁。本发明的丝状真菌在形态学、生理学和遗传性上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝的延长，并且碳代谢是专性需氧的。在本发明中，丝状真菌亲本细胞可以是下述种的细胞，包括但不限于木霉属，例如里氏木霉(先前分类为长梗木霉(T.longibrachiatum)，目前也称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))，绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；青霉属某种(Penicillium sp.)；腐质霉属某种(Humicolasp.)，包括异常腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)；金孢菌某种(Chrysosporium sp.)，包括拉克淖金孢菌(C.lucknowense)；粘帚霉某种(Gliocladium sp.)；曲霉属某种，包括米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉、黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori)；镰孢菌属某种(Fusarium sp.)、脉孢菌属某种(Neurospora sp.)、肉座菌属某种(Hypocrea sp.)和裸孢壳属某种(Emericella sp.)。也可以参考Innis等，(1985)Sci.228：21-26。

[089]如本文中所使用的，术语“木霉”或“木霉属某种”指之前已被归入木霉属的任何真菌菌株或目前被归入木霉属的任何真菌菌株。

[090]术语“接触(contacting)”指将各酶充分近距离地靠近各稻米底物放置。本领域技术人员认识到，将酶的溶液和各稻米底物混合可以实现接触。

[091]术语“温育(incubating)”指在给定的条件下，将稻米底物和水解酶混合限定的一段时间。

[092]术语“酶促转化(enzymatic conversion)”指对稻米底物的修饰，以产生可溶的水解的颗粒稻米淀粉，优选产生葡萄糖。

[093]术语“浆(slurry)”指含有不溶性颗粒淀粉的含水混合物。有时，术语“浆”和“悬浮液”在本文中可以交换使用。

[094]术语“培养(culturing)”指在液体或固体培养基中，在合适的条件下，培育微生物细胞群。在一个实施方案中，培养指将颗粒淀粉底物通过发酵生物转化为葡萄糖糖浆或其他期望的最终产物(通常在容器或反应器中)。

[095]当指多核苷酸或蛋白质时，术语“异源的(heterologous)”或“外源的(exogenous)”是指在宿主细胞中不天然发生的多核苷酸或蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。这意味着，该术语包括由天然发生的基因、突变的基因和/或合成基因编码的蛋白质。谈及多核苷酸或蛋白质时，术语“同源的”或“内源的”，指在宿主细胞中天然发生的多核苷酸或蛋白质。

[096]如本文中所使用地，术语“回收的(recovered)”、“分离的(isolated)”和“分离的(separated)”指蛋白质、细胞、核酸或氨基酸，其与同其天然相关的至少一个成分是分离的。该术语也指将包括可溶性的淀粉水解产物的混合物与包括基本上不溶性的稻米蛋白的残留物分离开。

[097]如本文所应用，当用于描述细胞时，术语“转化的(transformed)”、“稳定转化的(stably transformed)”或者“转基因的(transgenic)”是指该细胞具有非天然的(异源的)核酸序列，其被整合到它的基因组中或者作为在多个世代中被维持的附加型质粒而存在。

[098]如本文所应用，术语“表达(expression)”是指根据基因的核酸序列产生多肽的过程。此过程既包括转录又包括翻译。

[099]在谈及将核酸序列插入到细胞中时，术语“引入(introduced)”是指“转染”或者“转化”或者“转导”，包括指将核酸序列导入到真核或原核细胞中，其中核酸序列可以被整合入到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，被转化为自主复制子，或者被短暂地表达(例如，转染的mRNA)。

[100]如本文中所使用地，术语“比活性(specific activity)”指酶的单位，定义为在特定条件下，每单位时间内通过酶制剂转化为产物的底物摩尔数。比活性表示为单位(U)/mg蛋白质。

[101]如本文中所使用地，“酶活性(enzyme activity)”指酶对其底物的作用。

[102]如本文中所使用地，术语“酶单位(enzyme unit)”指在最佳测定条件下，每分钟将1mg的底物转化为底物产物的酶数量。

[103]例如，在一个实施方案中，术语“颗粒淀粉水解酶单位(GSHE U)”定义为在例如50℃，pH 4.5的测定条件下，每分钟由颗粒淀粉产生1mg的葡萄糖所需要的酶的数量。

[104]例如，在一个实施方案中，术语α淀粉酶酶单位(AAU)定义为在pH 5.2和40℃的标准测定条件下，1分钟内水解1微摩尔的淀粉底物的α淀粉酶的量。

[105]在其他实施方案中，葡糖淀粉酶单位(GAU)定义为在60℃，pH 4.2的条件下，每小时由可溶性淀粉底物产生1 gm还原糖所需的酶量，所述还原糖以葡萄糖计算。

[106]“ATCC”指美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，位于Manassas，VA 20108(ATCC，www/atcc.org)。

[107]“NRRL”指Agricultural Research Service Culture Collection，National Center forAgricultural Utilization Research(先前称为USDA Northern Regional ResearchLaboratory)，Peoria，ILL。

[108]“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数，除非在上下文中明确另外指出。

[109]如本文中所使用地，术语“包含(comprising)”和它的同源词以它们的包含性的含义使用，也就是，相当于术语“包括(including)”和它对应的同源词。

B.优选实施方案

稻米底物：

[110]被用于本发明方法的稻米底物可以从任何来源获得。在一些优选实施方案中，稻米底物是稻米面粉，而在其他优选实施方案中，稻米底物是精米底物。尽管不想以任何方式限制本发明，一般而言，来自谷物的稻米面粉含有约6-10％的蛋白质(N×5.95)；约70-82％的糖类；约9-12％的水分；约0.4-1.5％的粗脂肪；约0.6至0.8％的灰分和约0.2至0.6％的纤维。

[111]谷物中发现的稻米蛋白质在水中具有有限的溶解性。发现这些蛋白质主要是不溶性的(碱溶性的)谷蛋白(约80-90％)；盐溶性的球蛋白(7-15％)；水溶性的白蛋白(9-10％)和醇溶性的醇溶谷蛋白(prolamin)(约2-5％)。参见Houston等，(1970)Cereal Chem.47：5；Perdon等，(1978)Phytochem.17：351；和Landers等，(1994)CerealChem 71：409-411。

[112]在本发明的一些实施方案中，将稻米底物磨成期望的颗粒尺寸，然后分散在水中，或者在加工期间进行湿磨。在本发明包括的方法的一些实施方案中，稻米底物，诸如稻米粉被制成浆(一般用水)，稻米底物将包含i)约10％至约55％的干固体(ds)；ii)约20％至约50％ds；iii)约25％至约45％ds；iv)约20％至约40％ds；v)约20％至约35％ds；和vi)以及约30％至35％ds。

酶：

颗粒淀粉水解酶--

[113]用于本发明包含的方法中的淀粉水解酶中的至少一种是颗粒淀粉水解酶(GSHEs)。一些颗粒淀粉水解酶具有葡糖淀粉酶活性，这些酶中的一些具有α淀粉酶活性(参见Tosi等，(1993)Can.J.Microbiol.39：846-855和Kanlayakrit等，(1987)J.Ferment.Technol.65：379-385)。合适的GSH酶可以是天然存在的，重组的和突变的GSH酶。天然存在的GSHEs已从真菌细胞诸如腐质霉属某种、曲霉属某种、毛霉属某种(Mucor sp.)和根霉属某种(Rhizopus sp.)中回收得到。米根霉GSHE已经描述于Ashikari等，(1986)Agric.Biol.Chem.50：957-964和USP 4,863,864中。灰腐质霉GSHE已经描述于Allison等，(1992)Curr.Genet.21：225-229和欧洲专利171218中。编码这种酶的基因也是本领域已知的，为gla1。泡盛曲霉河内变种GSHE已被Hayashida等，(1989)Agric.Biol.Chem 53：923-929描述。Aspergillusshirousami GSHE已被Shibuya等，(1990)Agric.Biol.Chem.54：1905-1914描述。

[114]在一些优选实施方案中，GSHE从真菌回收得到，这些真菌包括ATCC16453、NRRL 15219、NRRL 15220、NRRL 15221、NRRL 15222、NRRL 15223、NRRL 15224和NRRL 15225，以及它们经遗传改变的菌株。(EP 0 171218)。

[115]在一个实施方案中，GSHE可以源自灰腐质霉的菌株，特别是灰腐质霉高温变种的菌株(H-GSHE)(参见USP 4,618,579)。

[116]在一个实施方案中，GSHE可以源自泡盛曲霉的菌株，特别是泡盛曲霉河内变种的菌株(A-GSHE)(参见Hayashida等，(1989)Agric.Biol.Chem.53：923-929)。

[117]在一个实施方案中，用于本发明包括的方法中的GSHE与SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。在其他实施方案中，包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的GSHE或与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％序列同一性的GSHE，由与SEQ ID NO：1具有至少70％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％序列同一性的多核苷酸编码。

[118]在另一实施方案中，用于本发明包括的方法中的GSHE与SEQ ID NO：7中阐述的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。在其他实施方案中，包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列的GSHE或与SEQ ID NO：7的序列具有至少80％序列同一性的GSHE，由与SEQ ID NO：5具有至少70％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％序列同一性的多核苷酸编码。

[119]与另一序列具有一定的序列同一性百分数(例如80％、85％、90％或99％)的多核苷酸或多肽指，当被比对时，在比较两序列中，碱基或氨基酸残基相同的百分数。该比对和百分同源性或同一性可以用本领域已知的任何合适的软件程序测定，例如那些在Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，eds 1987Supplement 30，section 7.7.18)中描述的。优选的程序包括GCG Pileup程序、FASTA和BLAST。另一优选的比对程序是ALIGN Plus和TFASTA。

[120]在进一步的实施方案中，GSHE酶可以源自根霉属的菌株。诸如源自雪白根霉(R.niveus)的Koii菌株的酶(在商品名“CU CONC”下出售)，或在商品名GLUCZYME下出售的来自根霉属的酶。

α淀粉酶--

[121]在本发明包括的某些实施方案中，颗粒淀粉水解酶将与α淀粉酶组合。α淀粉酶是微生物酶，E.C.编号是E.C.3.2.1.1-3，特别是E.C.3.2.1.1。在一些实施方案中，α淀粉酶是热稳定性细菌α淀粉酶，在其他实施方案中，α淀粉酶是真菌α淀粉酶。合适的α淀粉酶可以是天然存在的以及重组和突变的α淀粉酶。在一些特别优选的实施方案中，α淀粉酶衍生自芽孢杆菌属的种。优选的芽孢杆菌属种包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)(USP 5,763,385；USP 5,824,532；USP 5,958,739；USP 6,008,026和USP 6,361,809)。特别优选的α淀粉酶来自芽孢杆菌属菌株，嗜热脂肪芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。也可以参考菌株ATCC 39709；ATCC 11945；ATCC 6598；ATCC 6634；ATCC 8480；ATCC 9945A和NCIB 8059。

[120]考虑用于本发明方法的商业上可获得的α淀粉酶包括SPEZYME AA；SPEZYME FRED；GZYME G997(Genencor International Inc.)和TERMAMYL120-L、LC、SC和SUPRA(Novozymes Biotech.)。

葡糖淀粉酶--

[122]葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)是从淀粉的非还原端除去连续的葡萄糖单元的酶。该酶可以水解淀粉，直链淀粉和支链淀粉的线性和分支糖苷键。尽管葡糖淀粉酶可以衍生自细菌、植物和真菌，本发明包括的优选的葡糖淀粉酶衍生自真菌菌株。合适的葡糖淀粉酶不但包括天然存在的葡糖淀粉酶，也包括重组和突变的葡糖淀粉酶。

[123]从曲霉属、根霉属、腐质霉属和毛霉属的真菌分泌的葡糖淀粉酶已从真菌菌株获得，真菌菌株包括黑曲霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、泡盛曲霉、雪白根霉、米根霉、米赫毛霉(Mucor miehe)、灰腐质霉、Aspergillus shirousami和Humicola(Thermomyces)laniginosa(参见Boel等(1984)EMBO J.3：1097-1 102；WO 92/00381；WO 00/04136；Chen等，(1996)Prot.Eng.9：499-505；Taylor等，(1978)CarbohydrateRes.61：301-308和Jensen等，(1988)Can.J.Microbiol.34：218-223)。

[124]商业上被使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶例如从黑曲霉产生(商品名OPTIDEX L-400，来自Genencor International Inc.)，或从根霉种产生(商品名CU.CONC.，来自Shin Nihon Chemicals，Japan和商品名GLUCZYME，来自AmanoPharmaceuticals，Japan)。

重组产生的GSHEs-

[125]在一些优选实施方案中，在本发明所包括的方法中使用的GHSE是重组表达的GSHE(rGSHE)，其获自丝状真菌菌株，该真菌菌株已被遗传工程改造，以表达异源多核苷酸，该异源多核苷酸编码源自宿主菌株以外来源的GSHE。

[126]在一些实施方案中，丝状真菌菌株是曲霉属某种、木霉属某种、镰孢菌属某种或青霉属某种的菌株。特别优选的真菌宿主包括构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、针尾曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉(A.japonicus)、里氏木霉、绿色木霉、尖镰孢菌(F.oxysporum)和茄腐镰孢菌(F.solani)。曲霉属菌株公开于Ward等，(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743和Goedegebuur等，(2002)Curr.Gene41：89-98中。在最优选的实施方案中，宿主是木霉属菌株，特别是里氏木霉菌株。里氏木霉的菌株是已知的，非限制性的例子包括ATCC号13631、ATCC号26921、ATCC号56764、ATCC号56765、ATCC号56767和NRRL 15709。在一些优选实施方案中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37公开于Sheir-Neiss等，(1984)Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53中。

[127]表达GSHE的宿主菌株可以以前已经通过遗传工程被改造。在一些实施方案中，真菌宿主的各种基因已进行失活。这些基因包括例如编码纤维素水解酶，诸如内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)的基因(例如cbh1、cbh2、egl1和egl3)。美国专利5,650,322公开了RL-P37的衍生菌株，该衍生菌株已剔除了cbh1基因和cbh2基因。

[128]在一些实施方案中，真菌宿主已进行遗传工程改造，以包含编码源自灰腐质霉的GSHE的多核苷酸。在一个实施方案中，该rGSHE与SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。在其他实施方案中，编码SEQ ID NO：3的GSHE的多核苷酸将与SEQ ID NO：1的序列具有至少70％的序列同一性。

[129]在其他实施方案中，真菌宿主已进行遗传工程改造，以表达编码源自泡盛曲霉河内变种的GSHE的多核苷酸。在一个实施方案中，该rGSHE与SEQ IDNO：7中阐述的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。在其他实施方案中，编码SEQID NO：7的GSHE的多核苷酸与SEQ ID NO：5的序列具有至少70％的序列同一性。

载体和真菌转化：

[130]根据本发明，编码GSHE的异源多核苷酸可以通过载体，特别是表达载体引入真菌宿主细胞中，所述表达载体包括可操作性地连接到GSHE编码序列上的调控序列。载体可以是任何载体，其当引入真菌宿主细胞时整合入宿主细胞基因组并被复制。可以参考Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(www.FGSC.net)中的一组载体。此外，合适的表达和/或整合载体的例子可以参见Sambrook等，(1989)supra；Ausubel(1987)supra；van den Hondel等(1991)，于Bennett和Lasure Eds.MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Presspp.396-428中和USP 5,874,276。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。

[131]在一些实施方案中，编码GSHE的核酸被可操作性地连接到合适的启动子，该启动子在真菌宿主细胞中显示出转录活性。启动子可以衍生自编码蛋白质的基因，或者与宿主细胞同源或者与宿主细胞是异源的。优选地，启动子是可以用于木霉属宿主中的，启动子的合适的非限制性例子包括cbh1、cbh2、egl1和egl2。在一个实施方案中，启动子是相对于宿主细胞为天然的启动子。例如，当里氏木霉是宿主细胞时，启动子是天然的里氏木霉启动子。在优选的实施方案中，启动子是里氏木霉cbh1，其是诱导型启动子，并保藏在GenBank中，编号为D86235。诱导型启动子是在环境或发育调控下具有活性的启动子。在另一实施方案中，启动子是相对于真菌宿主细胞为异源的启动子。有用的启动子的其他例子包括来自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子。(参见Nunberg等，(1984)Mol.CellBiol.4：2306-2315和Boel等，(1984)EMBO J.3：1581-1585)。此外，里氏木霉xln1基因和纤维二糖水解酶1基因的启动子也是有用的(EPA 137280A1)。

[132]在一些实施方案中，GSHE编码序列可操作性地连接到信号序列。编码信号序列的DNA优选是与待被表达的GSHE基因天然相关的信号序列。优选地，信号序列由编码GSHE的灰腐质霉或泡盛曲霉基因编码。更优选地，该信号序列与图2A和6A中描述的信号序列具有至少90％、至少95％、至少97％和至少99％的序列同一性。在另外的实施方案中，包括待被引入真菌宿主细胞的DNA构建物或载体的信号序列和启动子序列来自同样的来源。例如，在一些实施方案中，信号序列是cdh1信号序列，其可操作性地连接到cdh1启动子。

[133]在一些实施方案中，表达载体也包括终止序列。在一个实施方案中，终止子序列和启动子序列来自同样的来源。在另一实施方案中，终止子序列与宿主细胞同源。特别合适的终止子序列是源自木霉属菌株，特别是里氏木霉的cbh1。其他有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子(Nunberg等(1984)supra和Boel等，(1984)supra)。

[134]在一些实施方案中，表达载体包括选择性标记。优选的选择性标记的例子包括赋予抗微生物抗性的选择性标记(例如潮霉素和腐草霉素)。营养型选择性标记也可以用于本发明，包括那些在本领域已知的标记，如amdS、argB和pyr4。用于转化木霉属的载体系统的标记描述下述文献中：Finkelstein，第六章，BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI，Finkelstein等Eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992)，第六章，和Kinghom等(1992)APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI，BlackieAcademic and Professional，Chapman and Hall，London)。在优选的实施方案中，选择性标记是amdS基因，其编码乙酰胺酶，从而使得转化的细胞能够以乙酰胺作为氮源生长(参见Kelley等，(1985)EMBO J.4：475-479和Penttila等，(1987)Gene 61：155-164)。

[135]包含编码GSHE的多核苷酸的表达载体可以是能够在给定真菌宿主生物中自主复制或能够整合入宿主DNA的任何载体。在一些实施方案中，表达载体是质粒。在优选实施方案中，可以考虑两类表达载体，以获得基因的表达。

[136]第一类表达载体包括DNA序列，其中启动子、GHSE编码区域和终止子都来自待被表达的基因。在一些实施方案中，通过删除不想要的DNA序列(例如编码不需要的结构域的序列)，以使将要被表达的结构域处于它自己的转录和翻译调控序列的控制下，从而获得截短的基因。

[137]第二类表达载体是预先装配的，并含有高水平的转录所需要的序列和选择性标记。在一些实施方案中，GSHE基因的编码区域或其部分被插入到该多用途表达载体中，以便它处于表达构建物启动子和终止子序列的转录控制之下。在一些实施方案中，基因或其部分被插入到强cbh1启动子的下游。

[138]用于连接包括编码GSHE的多核苷酸的载体、启动子、终止子和其他序列的方法，以及将它们插入合适的载体的方法是本领域熟知的。一般地，通过在方便的限制性位点进行连接来实现连接。如果这样的位点不存在，则根据常规的实践，使用合成的寡核苷酸连接物。(参见Sambrook(1989)supra；Bennett和Lasure，MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press，San Diego(1991)pp70-76.)。此外，载体可以用已知的重组技术构建(例如Invitrogen Life Technologies，Gateway Technology)。

[139]当需要获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞时，可以使用已知的方法(参见美国专利5,246,853；美国专利5,475,101和WO 92/06209)。可以用下述方法使基因失活：完全或部分剔除，插入失活，或使得基因对其指定的作用丧失功能的任何其他方法(诸如阻止该基因表达功能性蛋白)。可以剔除木霉属某种或其他丝状真菌宿主中的任何基因，该基因已被克隆，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2。在一些实施方案中，通过用已知的方法将一种形式的待被失活的期望基因插入质粒，来实现基因的剔除。然后在合适的限制性酶位点切割剔除质粒，该限制性位点在期望的基因编码区域内部，该基因编码序列或其部分用选择性标记替换。待被剔除的基因位置的侧翼DNA序列(优选约0.5至2.0kb之间)保留在标记基因的每一边。合适的剔除质粒一般具有独特的限制性酶位点，以使得包含剔除的基因的片断——包括侧翼DNA序列和选择性标记基因——可以作为单个线性片段而被去除。

[140]将DNA构建物或载体引入宿主细胞的技术包括，诸如：转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染，包括脂转染介导的和DEAE-Dextrin介导的转染；用磷酸钙温育DNA沉淀；用DNA包覆的微射弹进行高速轰击；和原生质体融合。Ausubel等，(1987)，supra第九章，和Sambrook(1989)supra中教导了一般性的转化技术。更具体地，转化丝状真菌的方法描述在Campbell等，(1989)Curr.Genet.16：53-56中。具体地，为了能在木霉属中表达异源蛋白质，可以参考USP 6,022,725；USP6,268,328；Harkki等(1991)；Enzyme Microb.Technol.13：227-233；Harkki等，(1989)Bio Technol.7：596-603；EP 244,234；和EP 215,594。也可以参考Nevalainen等，“TheMolecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of BothHomologous and Heterologous Genes”，MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY，Eds.Leong和Berka，Marcel Dekker Inc.，NY(1992)pp.129-148。也可以参考Cao等，(2000)Sci.9：991-1001，以转化曲霉属菌株。

[141]优选地，可以用载体系统构建遗传上稳定的转化子，由此编码GSHE的核酸稳定整合入宿主菌株染色体。转化子然后可以用已知的技术纯化。

[142]在一个非限制性例子中，包含amdS标记的稳定转化子与不稳定的转化子不同，其不同在于它们在含有乙酰胺的固体培养基上更快的生长速率，以及形成具有平滑的而不是粗糙的轮廓的环状集落。另外，在一些情况下，稳定性的进一步测试通过在固体非选择性培养基(即缺乏乙酰胺)上培养转化子来进行，从该培养基收获孢子，并且确定随后将发芽并在含有乙酰胺的选择性培养基上生长的这些孢子的百分比。另外，本技术领域已知的其它方法可以用于选择转化子。

[143]在一个特定的实施方案中，用于转化的木霉属某种的制备涉及从真菌菌丝制备原生质体。(参见Campbell等人(1989)Curr.Genet.16：53-56)。在一些实施方案中，菌丝是从萌发的营养孢子获得的。用消化细胞壁的酶处理菌丝，从而产生原生质体。然后原生质体通过在悬浮培养基中存在的渗透稳定剂得到保护。这些稳定剂包括山梨糖醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁及其类似物。通常这些稳定剂的浓度在0.8M和1.2M之间变化。优选地在悬浮培养基中使用大约1.2M的山梨糖醇溶液。

[144]将DNA摄取到宿主木霉属某种菌株中是依赖于钙离子浓度。在摄取溶液中通常使用大约10mM和50mM之间的CaCl₂。在摄取溶液中除了需要钙离子，通常所包括的其它项目是缓冲体系，如TE缓冲液(10Mm Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS，pH 6.0缓冲液(吗啉代丙烷磺酸)和聚乙二醇(PEG)。据信，聚乙二醇发挥融合细胞膜的作用，从而允许培养基中的物质被传递到木霉属某种菌株的细胞质内，并且质粒DNA被转移到核中。该融合常常使得质粒DNA的多个拷贝温和地整合到宿主染色体中。

[145]通常在转化中使用含有木霉属某种原生质体或细胞的悬浮液，其已经以10⁵到10⁷/mL，优选地2×10⁶/mL的密度进行了可渗透性处理。将100μL体积的含有这些原生质体或细胞的适当溶液(例如1.2M山梨糖醇；50mM CaCl₂)与期望的DNA混合。通常将高浓度的PEG加入到摄取溶液中。0.1到1体积的25％PEG4000可以被加入到原生质体悬液中。然而，优选地将大约0.25体积加入到原生质体悬液中。添加剂如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾及其类似物也可以被加入到摄取溶液中，以便有助于转化。对于其它真菌宿主细胞，类似方法是可以获得的。例如参见美国专利6,022,725和6,268,328，其内容通过引用方式被并入。

[146]通常，混合物然后在大约0℃被温育10到30分钟。然后在混合物中再次加入PEG，以进一步增强期望基因或DNA序列的摄取。25％PEG 4000通常以转化混合物体积的5到15倍体积加入；然而，更大或更小的体积也可以是合适的。25％PEG 4000优选地是转化混合物体积的大约10倍。在加入PEG后，在加入山梨糖醇和CaCl₂溶液之前，在室温或在冰上温育转化混合物。原生质体悬液然后被进一步加入到融化的生长培养基等份中。该生长培养基仅仅允许转化子生长。本领域技术人员将充分意识到，类似的程序和方法可以用于转化宿主细胞以及在宿主细胞中异源表达其他酶，诸如淀粉水解酶。

细胞培养物：

[147]合适的宿主细胞通常在含有生理盐分和营养物的标准培养基中培养，如下述文献中所描述的：Pourquie，J等人，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OFCELLULOSE DEGRADATION，Aubert，J.P.等人编著，Academic Press，71-86页，1988，和Ilmen，M.等人，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306。也可以参考普通的商业上制备的培养基，如Yeast Malt Extract(YM)培养基，Luria Bertani(LB)培养基和Sabouraud Dextrose(SD)培养基。

[148]培养条件也是标准的，例如培养物在大约28℃，在适当的培养基中，在振荡培养器或发酵罐中培养，直到实现期望的GSHE表达水平。给定的丝状真菌的优选的培养条件可以在科学文献中发现，和/或从真菌的来源发现，如American TypeCulture Collection和Fungal Genetics Stock Center(www.FGSC.net)。

[149]在真菌生长已经建立后，将细胞暴露于可以有效地导致或允许淀粉水解酶尤其是本文所定义的GSHE表达的条件下。在GSHE编码序列处于诱导型启动子的控制下的情况下，诱导剂，例如糖、金属盐或抗生素，以可以有效地诱导GSHE表达的浓度加入到培养基中。

GSHF活性的鉴定：

[150]为了评价细胞系的淀粉水解酶表达，所述细胞系已用编码淀粉水解酶例如GSHE的异源多核苷酸转化，可以在蛋白质水平、RNA水平进行分析，或利用针对葡糖淀粉酶活性和/或产生的特定功能性生物分析。

[151]一般而言，用于分析GSHE表达的分析方法包括Northern印迹，点印迹(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)或原位杂交、使用适当标记的探针(基于核酸编码序列)和常规的Southern印迹和放射自显影。

[152]此外，淀粉水解酶的产生和/或表达可以直接在样品中测量，例如通过直接测量在培养基中的还原糖如葡萄糖的分析方法，通过测量葡糖淀粉酶活性、表达和/或产生的分析方法。例如，可以用于分析GSHE活性的底物包括颗粒淀粉底物。例如，葡萄糖浓度可以通过任何便利的方法来确定，如通过使用葡萄糖试剂盒No15-UV(Sigma Chemical Co.)，或设备如Technicon Autoanalyzer。也可以参考葡萄糖氧化酶试剂盒和葡萄糖己糖试剂盒，它们可从Instrumentation Lab.(Lexington，MA)商购。葡糖淀粉酶活性可以通过3，5-二硝基水杨酸(DNS)方法测定(参见Goto等人，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.58：49-54)。在非限制性例子中，rGSHE有能力在15％淀粉固体水悬液中水解颗粒淀粉，水解为至少90％、95％和97％wt葡萄糖的糖溶液，以干物质为基础进行计算。

[153]此外，蛋白质表达可以通过免疫学方法评价，如细胞的免疫组织化学染色、组织切片或组织培养基的免疫测定法，例如通过Western印迹或ELISA。这样的免疫测定法可以用于定性地和定量地评价淀粉水解酶的表达。这样的方法的细节对本技术领域技术人员是已知的，实践这样的方法的许多试剂可以商购获得。

[154]示范性的测定方法包括ELISA、竞争性免疫测定、放射性免疫测定、Western印迹、间接免疫荧光测定和类似方法。一般而言，商业上可以获得的抗体和/或试剂盒可以用于定量免疫测定GSHE的表达水平。

[155]在本发明的实施方案中，由重组木霉属宿主表达的GSHE为每升(g/L)培养基中大于1克蛋白质。在一些实施方案中，由重组木霉属宿主表达的GSHE的量为，每升培养基大于2克。在其他实施方案中，由重组木霉属宿主表达的GSHE的量为，每升培养基大于5克。在还有其他实施方案中，由重组木霉属宿主表达的GSHE的量为，每升培养基将大于10克。在一些例子中，表达的GSHE的量为，大于20g/L，大于25g/L，大于30g/L，大于50g/L培养基。

纯化淀粉水解酶的方法：

[156]一般而言，在细胞培养物中产生的淀粉水解酶(例如nGSHE或rGSHE)被分泌到培养基中，并且可以被纯化或分离，例如通过从细胞培养基中去除不需要的组分。在一些情况下，GSHE可以以细胞内形式产生，从而必须从细胞裂解物进行回收。在这样的情况下，从细胞中纯化该酶，其中它是使用本技术领域技术人员常规使用的技术产生。实例包括但不限于，亲和层析(Tibeurgh等人，(1984)FEBSLett.16：215)；离子交换层析方法(Goyal等人(1991)Biores.Technol.36：37；Fliess等人(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17：314；Bhikhabhai等人(1984)J.Appl.Biochem.6：336；和Ellouz等人(1987)Chromatography 396：307)，包括使用具有高分辨能力材料的离子交换(Medve等人(1998)J.Chromatography A808：153；疏水相互作用层析(Tomaz和Queiroz，(1999)J.Chromatography A 865：123；两相分离(Brumbauer等人(1999)Bioseparation 7：287)；乙醇沉淀；反相HPLC；硅或阳离子交换树脂上的层析，如DEAE；层析聚焦(chromatofocusing)；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；和胶凝过滤，使用例如Sephadex G-75。

工艺条件：

[157]将稻米底物，优选是浆状形式的，与淀粉水解酶接触或温育，以水解稻米底物中的颗粒淀粉。GSHE可以以无细胞提取物的形式提供(这样GSHE是从细胞培养基分离)，或以培养基形式提供(发酵肉汤)，其包括表达和分泌GSHE的真菌细胞。

[158]在一些实施方案中，GSHE可以加入到包括稻米底物的组合物中，加入量为约0.001至15.0 GSHE单位(U)/g浆ds，干固体调整到10-55％。在其他实施方案中，GSHE可以加入到包括稻米底物的组合物中，加入量为约0.01至10.0 GSHE单位(U)/g浆中淀粉干固体(ds)，干固体调整到10-55％。在一些实施方案中，以每克此溶液约0.01至5.0 GSHE U的量加入GSHE。在其他实施方案中，以每克此溶液约0.01至2.0 GSHE U的量加入GSHE。在一些实施方案中，以每克此溶液约0.01至1.5 GSHE U的量加入GSHE。也在其他实施方案中，以每克此溶液约0.05至1.5GSHE U的量，以及约0.1至1.0 GSHE U的量加入GSHE。

[159]在一些优选实施方案中，GSHE将具有葡糖淀粉酶活性，第二淀粉水解酶将是α淀粉酶。如本领域技术人员所理解地，用于本发明方法的α淀粉酶的量将取决于α淀粉酶的酶活性。一般地，将约0.001至5.0kg的α淀粉酶加入到一公吨(MT)稻米底物中。在一些实施方案中，将0.01至5.0kg的α淀粉酶加入到一公吨(MT)稻米底物中。尽管在一些实施方案中，α淀粉酶以每MT约0.05至4.0kg的量加入。在其他实施方案中，α淀粉酶以每MT约0.1至2.5kg的量加入，也以每MT约0.5至1.5kg的量加入。在进一步的实施方案中，可以采用其他数量。例如，通常将约0.01至1.5kg量的GZYME G997或SPEZYME FRED(Genencor InternationalInc.)加入到一公吨的淀粉中。在其他实施方案中，酶以每公吨淀粉约0.05至1.0kg；约0.1至0.6kg；约0.2至0.6kg；约0.4至0.6kg GZYME G997或SPEZYME FRED的量加入。

[160]在一些实施方案中，GSHE与α淀粉酶一起加入到稻米底物中，以基本上同时进行温育。然而，在其他实施方案中，依次加入GSHE和α淀粉酶，但是一般地，水解酶相互之间在约1至60分钟之内，相互之间在1至30分钟之内加入。

[161]在一些实施方案中，本发明方法中α淀粉酶单位与GSHE单位之比(α淀粉酶：GSHE)将在15∶1至1∶15范围内，在一些实施方案中，范围在10∶1至1∶10范围内。在其他实施方案中，比率在5∶1至1∶5范围内，在进一步的实施方案中，α淀粉酶：GSHE将是4∶1至1∶4。在优选实施方案中，比率为约2∶1至1∶4，在最优选的实施方案中，约2∶1至1∶2。

[162]在一些实施方案中，将包含稻米底物和水解酶的混合物在等于或低于包括在稻米底物中的蛋白质的变性温度的温度中温育。在一些实施方案中，该温度低于约72℃、70℃、68℃、65℃、63℃、60℃、58℃、55℃、50℃、45℃和40℃，但是不低于10℃。在其他实施方案中，该工艺在约70℃至50℃之间的温度进行。在进一步的实施方案中，该工艺在约70℃至55℃之间的温度进行，也在约65℃至55℃之间的温度进行。

[163]在一些实施方案中，包括稻米底物和淀粉水解酶的混合物在下述范围内的pH温育：在约pH 3.0至pH 6.5的范围内；在约pH 3.0至pH 6.0的范围内；在约pH 3.0至pH 5.5的范围内；在约pH 3.5至pH 5.0的范围内；在约pH 3.0至pH 4.0的范围内；在约pH 4.5至6.5的范围内；和在约pH 5.0至6.0的范围内。

[164]在一些实施方案中，包括稻米底物和淀粉水解酶(优选GSHE和α淀粉酶)的混合物在上述温度和pH中温育约2至100小时，约5至100小时，约10至100小时，约5至50小时，约10至50小时，和约10-24小时。

[165]在一些实施方案中，稻米底物中至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的干固体被转化为溶解的淀粉水解产物。在一些实施方案中，稻米底物中的干固体完全被溶解。优选地，可溶的淀粉水解产物是葡萄糖，最优选地，以总的溶解的干固体的百分数计，葡萄糖的产量为至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％和99.5％。

[166]在某些实施方案中，稻米底物中至少80％、85％和90％的颗粒淀粉在24小时内溶解并水解。在其他实施方案中，稻米底物中至少95％的颗粒淀粉在24小时内溶解并水解。在还有其他的实施方案中，稻米底物中至少98％的颗粒淀粉在24小时内溶解并水解。

[167]在一些实施方案中，包括稻米底物和淀粉水解酶(例如GSHE和α淀粉酶)的混合物在约5.0至6.0的pH温育足够的时间(例如，在2至96小时之间)。在一些实施方案中，温育的浆的pH将被降低至约3.0至4.0。如此降低pH将导致对稻米底物的酶反应的终止。

[168]足够的温育时间后，将含有溶解的稻米淀粉水解产物的组分从温育的浆中分离出来，留下残留物，其包含基本上不溶性的稻米蛋白浓缩物。本领域技术人员熟知进行分离的各种方法。一般而言，这些分离方法中的一些包括离心；常规过滤方法和膜分离方法。

[169]包含稻米蛋白浓缩物的残留物的蛋白含量(N×5.95)为大于10％、20％、30％、40％和50％。在一些实施方案中，稻米蛋白浓缩物的蛋白含量在约10％至60％的范围内；在约10％至50％的范围内；在约20％至45％的范围内；和在约30％至40％的范围内。

[170]在其他实施方案中，将获得高纯度稻米蛋白浓缩物。在一些实施方案中，通过第二个酶促水解步骤获得高纯度稻米蛋白浓缩物，因而，包括基本上不溶性的稻米蛋白浓缩物、且获自第一次酶促水解的残余物进一步温育一段时间，温育的温度和pH如上所述，以水解剩余的粒状或不溶性淀粉。在一些实施方案中，通过在约55℃至60℃的温度，将pH降低至低于温育时的pH的值，例如从pH 5.5降至pH 3.0-4.0的范围内，终止对在残余物中剩余的淀粉的酶水解作用。然后如上述描述地，将可溶性的稻米淀粉水解产物从残留物中分离出来，以获得高纯度稻米蛋白浓缩物。

[171]在该实施方案中，同样的淀粉水解酶可以如上面描述地那样使用。在优选的实施方案中，淀粉水解酶中的至少一种将是GSHE。在其他优选的实施方案中，GSHE可以与α淀粉酶联合使用；在其他优选的实施方案中，GSHE可以与葡糖淀粉酶联合使用。然而，无论是第一还是第二酶促水解过程都不限于仅仅使用这些酶。其他的酶可以用于该工艺，这些酶包括但是不限于纤维素酶、果胶酶、支链淀粉酶和β葡聚糖酶。

[172]高纯度稻米蛋白浓缩物的蛋白质含量(N×5.95)通常大于60％、63％、65％、68％、70％和75％。在一些实施方案中，高纯度稻米蛋白浓缩物的蛋白质含量为约65％或更大，以及约70％或更大。

[173]根据该工艺获得的稻米蛋白浓缩物或高纯度稻米蛋白浓缩物可以用常规的和熟知的技术干燥，例如真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥。在一些实施方案中，根据本发明获得的稻米蛋白浓缩物的水分含量将低于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％和2％。在一些实施方案中，获得的高纯度的蛋白质浓缩物将干燥到水分含量低于6％、5％、4％、3％和2％。在一些实施方案中，水分含量将在约2％至5％之间。

[174]相比通过使用常规高温处理的淀粉加工方法获得的蛋白质组分，根据本文的方法获得的蛋白质浓缩物和高纯度蛋白质浓缩物具有改善的特性。在一些实施方案中，蛋白质浓缩物和高纯度蛋白质浓缩物包含这样的蛋白质，其相比从在淀粉加工中使用的现有工艺获得的蛋白质残留物的蛋白质溶解性，在碱性pH水平，特别是在10.0的pH水平具有更大的溶解性。在一些实施方案中，在pH 10的溶解度为至少20％、至少40％和至少50％。在进一步的实施方案中，蛋白质浓缩物和高纯度蛋白质浓缩物包含这样的蛋白质，其相比从在淀粉加工中使用的现有工艺获得的蛋白质残留物的蛋白质溶解性，在酸性pH水平，特别是在2.0的pH水平具有更大的溶解性。在一些实施方案中，在pH 2.0的溶解度为至少15％、至少20％、至少25％和至少30％。

[175]在其他的实施方案中，根据本发明获得的蛋白质浓缩物和高纯度蛋白质浓缩物将具有这样的氨基酸组成，其中，相比从在淀粉加工中使用的现有方法获得的残留物中的蛋白质组分的氨基酸分布型，某些氨基酸的百分数增加。例如，在一些实施方案中，在根据本发明获得的蛋白质浓缩物中谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、精氨酸、天冬氨酸或丙氨酸的数量较大。

实验

[176]提供下列实施例，目的是证明和进一步阐述本发明的一些优选实施方案和优选方面，不是为了构成对其范围的限制。事实上，应该认为这些教导可用于进一步优化本文中描述的工艺系统。

[177]在随后的公开和实验部分中，使用下面的缩写：H-GSHE(天然灰腐质霉高温变种GSHE)；rH-GSHE(表达在里氏木霉中的灰腐质霉高温变种GSHE)；wt％(重量百分比)；℃(摄氏度)；rpm(每分钟的转数)；H₂O(水)；dH₂O和Di(去离子水)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；μm(微米)；M(摩尔每升)；mM(毫摩尔每升)；μM(微摩尔每升)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；MT(公吨)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；邻苯二甲酸盐缓冲液(邻苯二甲酸钠，水中，20mM，pH 5.0)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；w/v(重量与体积之比)；v/v(体积与体积之比)；Genencor(Genencor International，Inc.，Palo Alto，CA)；Shin Nihon(Shin Nihon，Japan)；HPLC(高压液相色谱方法)；ds(干固体含量)。

一般方法：

[178]稻米底物——白稻米粉，Elephant Brand，购自Thai Better Foods，Co.，Ltd.Bangpong，Thailand。

[179]总蛋白分析——使用Kjeldhal方法测定稻米粉末和稻米蛋白质制备物的总氮含量(参见Methods 22B608，American Association of Cereal Chemists(AACC)1983，St Paul，MN)。对总氮使用5.95的mortification因子，计算蛋白质含量(％)(JulianoB.O.(1985)Rice：Chemistry and Technology；AACC，St.Paul MN)。

[180]总淀粉含量的测定——通过酶-酶淀粉液化和糖化方法，测定总淀粉含量。在典型的分析中，将两克(g)干样品放入100ml Kohlraucsh瓶中，并加入45ml的MOPS缓冲液pH 7.0。充分搅拌浆体30min。加入1.0ml SPEZYME FRED(用H₂O以1∶50稀释)，并加热到沸腾3-5min。将瓶置于维持在121℃的高压灭菌器中15min。高压灭菌后，将瓶置于维持在95℃的水浴中，加入1.0ml的1∶50稀释的SPEZYME FRED，并温育45min。将pH调整到pH 4.2，温度降到60℃，然后将20ml醋酸盐缓冲液pH 4.2加入到混合物中。通过加入1.0ml的1∶100稀释的OPTIDEX L-400(Genencor International，Inc.)进行糖化，并在60℃再继续温育18小时。通过在95℃加热10min终止酶反应。通过使用葡萄糖作为标准进行HPLC分析，测定总糖组成。从在室温未经酶促处理的样品的水提取物中获得的可溶性淀粉水解产物从该总糖中扣除。

[181]寡糖分析——寡糖反应产物的组成通过配备有HPLC柱(Rezex 8 u8％H，Monosaccharides)的HPLC(Beckman System Gold 32 Karat Fullerton，California，USA)来测定，温度维持在50℃，并安装有折射率(RI)检测仪(ERC-7515A，RI Detector，来自The Anspec Company，Inc.)。稀硫酸(0.01N)被用作移动相，流速为0.6ml/分钟。将20微升的4.0％溶液注射到柱上。依靠糖的分子量进行柱分离。例如DP1指单糖，诸如葡萄糖；DP2指二糖，诸如麦芽糖；DP3指三糖，诸如麦芽三糖；DP4⁺指聚合度(DP)为4或大于4的寡糖。

[182]固体的相对溶解——传统低温喷射蒸煮工艺被用来溶解稻米淀粉(参见美国专利3,912,590)。清澈的上清液被用来测量Brix(ABBE Refractometer，AmericanOptical Corporation，Scientific Instrument Division，Buffalo，New York)。在低温喷射工艺下，从30％稻米粉浆体(300克稻米粉，在700g dH₂O中)获得的溶解淀粉的Brix取为100％溶解，并被用于计算不同处理条件下的淀粉的相对溶解百分比。

[183]在典型的低温喷射蒸煮试验中，在塑料烧杯中将700g蒸馏水加入到300g白稻米粉中，以制备30％ds的稻米粉浆。搅拌浆体，用6.0N H₂SO₄将pH调整到6.0。加入来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶(G-zyme G997)(Genencor InternationalInc.)，加入剂量为0.8kg/MT(w/w dss)。用泵使浆体通过105℃的加热圈5min，并保持在部分浸没于95℃水浴的闭口Eflenmeyer瓶中2小时。使用塑料移液管将2ml的液化物(liquefact)转移入离心管，在8000rpm离心3分钟。上清液的Brix值为27。

[184]假设利用G-Zyme G997的稻米淀粉的溶解为100％，Brix值27代表参照Brix，并在随后的实施例中被用来计算稻米淀粉的相对溶解。

RS＝(Brix/参照Brix)×100％

[185]其中，RS＝相对溶解；Brix＝试验(Expt)Brix，参照Brix＝在100％溶解时的Brix。

实施例

[186]本发明在下面的实施例中得到进一步详细的描述，这些实施例绝不是为了限制本发明的范围。

实施例1

[187]灰腐质霉高温变种GSHE在里氏木霉中的表达(rH-GSHE)

[188]克隆灰腐质霉高温变种GSHE基因——

[189]从冷冻的嗜热小柱孢霉(Scytalidium thermophilium)(ATCC 16453，无性型，灰腐质霉高温变种)菌丝体提取基因组DNA(SEQ ID NO：1)。冷冻的菌丝体在咖啡磨具中用干冰研磨，通过EasyDNA方案(Invitrogen)提取DNA。将过量的氯仿/酚/异戊醇提取剂加入到该标准方案中。基于NCBI数据库登记号M89475，设计PCR引物。正向引物含有用于定向克隆入pENTR/D载体(Invitrogen)的基序。

[190]RSH003f引物的序列是

[191]CAACATGCATACCTTCTCCAAGCTCCTC(SEQ ID NO：8)，RSH004r引物的序列是TTAACGCCACGAATCATTCA CCGTC(SEQ ID NO：9)。

[192]根据Invitrogen Gateway系统方案，将PCR产物克隆到pENTR/D中。然后将载体转化到化学感受态Top 10大肠杆菌(Stratagene)中，卡那霉素选择。来自几个克隆的质粒DNA被限制性消化，以确认正确尺寸的插入物。随后从几个克隆对gla1插入物进行测序(Sequetech，Mountain View，CA)。来自一个克隆的质粒DNA，pENTR/D_N13，被加入到带有pTrex3g/amdS目的载体DNA的LR克隆酶反应(Invitrogen Gateway系统)中。在LR克隆酶反应中，通过重组，目的载体的CmR和ccdB基因被来自pENTR/D载体的灰腐质霉gla1代替。

[193]该重组在目的载体的cbh1启动子和终止子之间定向插入gla1。48bp和50bp的重组位点序列分别保持在gla1的上游和下游。将等份的LR克隆酶反应转化到化学感受态Top 10大肠杆菌中，过夜培养，用羧苄青霉素选择。将来自几个克隆的质粒DNA进行限制性消化，以确认正确的插入物大小。用Xba1消化来自克隆的质粒DNA，pTrex3g_N13(参见图3和4)，以释放包含cbh1启动子：gla1：cbh1和终止子：amdS的表达盒子。该6.6kb盒子通过琼脂糖提取进行纯化，并转化到源自可公开获得的菌株QM6a的里氏木霉菌株中，正如下面进一步描述的。

[194]通过Sequetech，Mountain View，CA对表达盒测序，GSHE的DNA示于图1(SEQ ID NO：1)中，多肽序列示于图2(SEQ ID NO：2和3)中。

里氏木霉的转化——

[195]将平板上约二分之一拭样(或1-2cm²)的形成孢子的菌丝体(在PDA平板上在30℃生长5天)接种到置于250ml的、带有4个挡板的摇瓶中的50mM YEG(5g/L酵母提取物加上20g/L葡萄糖)肉汤中，37℃在200rpm培养16-20小时。通过将液体体积转移到50ml锥形管中并于2500rpm旋转离心10分钟，回收菌丝体。吸走上清液。将菌丝体沉淀物转移到250ml的、0.22微米CA Corning过滤瓶中，CA Corning过滤瓶中含有40ml的β-葡聚糖酶溶液，30℃、200rpm温育2小时，以产生用于转化的原生质体。

[196]通过用无菌滤布(miracloth)进行过滤，原生质体被收获到50ml锥形管中。通过以2000rpm旋转离心5分钟将它们沉淀，并抽吸掉液体。用50ml的1.2M山梨糖醇将原生质体沉淀物洗涤一次，旋转沉淀下来，抽吸掉液体，用25ml的山梨糖醇/CaCl₂洗涤。对原生质体计数，然后以2000rpm 5分钟沉淀，倒尽上清液，将原生质体沉淀物重悬在足够量的山梨糖醇/CaCl₂中，以获得每毫升含1.25×10⁸个原生质体的原生质体浓度，从而产生原生质体溶液。

[197]将最多20μg的表达载体DNA(体积不超过20μl)的等份物放置到15ml锥形管中，将管子置于冰上。然后在每份转化等份物中加入200μl的原生质体，以及50μl PEG溶液。轻轻地混合管子，冰上温育20分钟。将PEG溶液(2ml)加入到转化等份物管子中，室温下将这些管子温育5分钟。加入山梨糖醇/CaCl₂溶液(4ml)至管子中，得到的总体积为6.2ml。将转化混合物分为3个等份，每份含有大约2ml。通过将这三份等份物中的每一份加入到含有融化的顶层琼脂的三个管子中(通过维持在50℃而保持融化状态)，产生表层混合物(overlay mixture)，并将该表层混合物倾倒到转化平板上。然后将转化平板在30℃温育4至7天。

[198]实施转化，用amdS进行选择。乙酰胺/山梨醇板和表层(overlays)被用于转化。对于选择平板，使用同样的平板，但是无山梨醇。通过将分离的菌落转移到含有乙酰胺的新鲜选择性培养基中来纯化转化子。

参考实施例，如下制备下述溶液。

1)40ml β-D-葡聚糖酶溶液在1.2M山梨醇中制备，包括600mg β-D-葡聚糖酶和400mg MgSO₄·7H₂O。(InterSpex Products Inc.San Mateo，CA)。

2)200ml PEG混合物，含有50g PEG 4000(BDH Laboratory Supplies Poole，England)和1.47g CaCl₂·2H₂O，在dH₂O中制备。

3)山梨醇/CaCl₂，含有1.2M山梨醇和50mM CaCl₂。

4)乙酰胺/山梨醇琼脂：

第I部分——0.6g乙酰胺(Aldrich，99％升华)、1.68g CsCl、20g葡萄糖、20g KH₂PO₄、0.6g MgSO₄·7H₂O、0.6g CaCl₂·2H₂O、1ml 1000×盐(见下面)，调整到pH 5.5，用dH₂O补足体积(300ml)，过滤并灭菌。

第II部分——20g Noble琼脂和218g山梨醇，用dH₂O补足体积(700ml)，高压灭菌。

将第II部分加入到第I部分，至终体积为1L。

5)1000x盐——将FeSO₄·7H₂O，1.6g MnSO₄·H₂O，1.4g ZnSO₄·7H₂O，1gCoCl₂·6H₂O混合，用dH₂O将体积补足到1L。将溶液过滤并灭菌。

用灰腐质霉高温变种葡糖淀粉酶基因转化的里氏木霉的发酵——

[199]一般地，遵照如Foreman等人所描述的发酵方案(Foreman等人(2003)J.Biol.Chem 278：31988-31997)。更具体地，对每一菌株进行双份发酵。用1.5ml冷冻的孢子悬液接种含有5％葡萄糖的0.8L的Vogels基本培养基(Davis等人(1997)Methods in Enzymology 17A，第79-143页；和Davis，Rowland，NEUROSPORA，CONTRIBUTIONS OF A MODEL ORAGNISM，Oxford University Press，(2000))。48小时后，将每一培养物转移到14LBiolafitte发酵罐中的6.2L的相同培养基中。发酵罐在25℃、750 RPM和每分钟8个标准升的空气流中运行。在初始葡萄糖消耗完毕后1小时，开始进行25％(w/w)的乳糖供给，以碳限制方式供给，以防止乳糖累积。用葡萄糖氧化酶测定试剂盒或者葡萄糖己糖激酶测定试剂盒(Instrumentation Laboratory Co.，Lexington，MA)分别监控葡萄糖和乳糖的浓度，其中β-半乳糖苷酶被加入以裂解乳糖。以规律的时间间隔获得样品，以便监控发酵进程。收集的样品用Internal Equipment Company(Needham Heights，MA)的临床离心机在50ml离心管中以3/4速率旋转离心。

[200]样品上清液在4-12％的BIS-TRIS SDS-PAGE凝胶上跑胶，在还原条件下采用MOPS(吗啉代丙烷磺酸)SDS跑胶缓冲液和LDS样品缓冲液进行。在不同的时间阶段，观察68kD rGSHE条带(数据未显示)。

转化的里氏木霉克隆的GSHE活性分析——

[201]酶活性——测定GSHE活性，即在0.1 M醋酸盐缓冲液，pH 4.5中，50℃，将5ml的10％粒状玉米淀粉与等份的酶制备物温育期间，每分钟(min)释放的还原糖(测为葡萄糖等价物)的毫克(mg)数。

[202]来自灰腐质霉高温变种的天然GSHE(nGSHE)和从里氏木霉产生的重组灰腐质霉高温变种rGSHE，是通过标准技术纯化的，其中采用使用了苯基-琼脂糖的疏水相互作用色谱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，随后采用使用了SP-琼脂糖的离子交换色谱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。由里氏木霉克隆最初表达的重组GSHE包括两个蛋白峰组分，以大约相等的浓度存在。这些峰被标记为rGSHE1和rGSHE2。这两个峰值在质量上相差1500D，且相差0.3个pH单位，正如通过基质辅助激光解吸附和电离方法(MALDI-TOF)测量的，这是在voyageur质谱仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)和等电聚焦凝胶(SERVAElectrophoresis，GmbH，Heidelberg，Germany)上根据制造商的指导进行的。rGSHE1和rGSHE2具有相同的比活性，如通过生淀粉水解分析和蛋白质测定测量的，所述测定使用了MicroBCA蛋白分析试剂盒(Pierce，Rockland，IL)和百分溶液消光系数(A280 0.1％＝1.963)。在一段时间后，在初始的rGSHE表达后的大约72小时时进行测量，只有一种形式的rGSHE被呈现(rGSHE3)。参考表1。

表1

GSHE的来源	比活性GSHE单位/mg	％总碳水化合物(total carbohydrate)
			天然GSHE	9.0	1.12
rGSHE1/rGSHE2	8.0/8.0	2.70
			rGSHE3	8.0	0.57

[203]GSHEs的％碳水化合物(CHO)是通过使用4N三氟乙酸在100℃酸水解5小时来确定的，使用对羟苯甲酸酰肼，依据释放的还原糖进行测量。当最初被表达时，rGSHE1和rGSHE2的糖基化是总碳水化合物的2.70％。然而，在72小时后，在培养基中发现的rGSHE3的糖基化水平是0.57％总CHO。天然GSHE的糖基化水平是1.12％。

[204]根据本实施例获得的rGSHE被用作下面实施例中的重组GSHE的来源，并称为rH-GSHE。

[205]泡盛曲霉河内变种GSHE在里氏木霉中表达——

[206]编码图6中描述的成熟氨基酸序列的泡盛曲霉河内变种GSHE基因被克隆和转化，按照与上述相同的方式转化入里氏木霉。

[207]简言之，根据上面描述的方法从泡盛曲霉河内变种菌株的冷冻菌丝体提取基因组DNA。依据泡盛曲霉河内变种葡糖淀粉酶(GAI)的公开序列，设计引物序列(Hayashida等(1989)Agric.Biol.Chem.53：923-929)。使用下面的引物：

[208]RSH10f引物的序列为：CACCATGTCGTTCCGATCTCTTCTC(SEQ ID NO.10)

[209]其包括Gateway(Invitrogen)定向克隆基序CACC，RSH11 r引物的序列为：CTACCGCCAGGTGTCGGTCAC(SEQ ID NO.11)。

[210]DNA序列提供在图5(SEQ ID NO：5)中。按照上述方法构建载体和转化里氏木霉。通过Sequetech Corp.(Mountain View，CA)对A-GSHE插入片段进行测序。按照上面针对rH-GSHE表达的描述，测定rA-GSHE的表达。测得表达水平为大于2g/L。

实施例2

[211]利用α淀粉酶对颗粒稻米淀粉的溶解

[212]在1000ml不锈钢容器中，将350g dH₂O加入到150g白稻米粉中，以制备30％ds稻米粉浆。搅拌浆体，用6N H₂SO₄将pH调整到5.5。将不锈钢搅拌器放入容器中，并将玻璃盖放在顶部。在将酶加入到容器之前，将容器放在70℃水浴中15分钟。比较嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶(G-zyme G997，来自GenencorInternational，Inc)和地衣芽孢杆菌的α淀粉酶(SPEZYME FRED，来自GenencorInternational，Inc)溶解颗粒稻米淀粉的能力，它们以0.8kg/MT(w/w dss)的剂量加入。加入酶之后，于70℃在搅拌下温育悬液2小时，然后60℃温育48小时。用塑料移液管，在预先确定的时间间隔，从每一容器取2ml样品，并转移到离心管中。样品在8000rpm离心3分钟。从离心管取出上清液，将几滴置于LeciaAR200数字手持折射计(digital hand held refractometer)的样品孔中。记录Brix值，计算相对溶解度(RS)。结果如表2所示，这表明，嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶(G-zymeG997)在溶解颗粒稻米淀粉方面比地衣芽孢杆菌的α淀粉酶(SPEZYME FRED)更为有效。

表2

[213]在pH 5.5，60℃，α淀粉酶对颗粒稻米淀粉溶解的影响

酶          相对溶解度(％)

	2hrs	6hfs	12hrs	24hrs	36hrs	48hrs
							G-zyme G997	20	31	40	48	53	59
Spezyme Fred	25	27	33	41	44	46

实施例3

[214]G-zyme G997浓度对颗粒稻米淀粉溶解的影响

[215]在1000ml不锈钢容器中，将蒸馏水(350g)加入到150g白稻米粉中，以制备30％ds稻米粉悬浮液。搅拌悬浮液，用6N H₂SO₄将pH调整到5.5。将不锈钢搅拌器放入容器中，并将玻璃盖放在顶部。将含有悬浮液的不锈钢容器置于60℃水浴中15分钟，之后加入α淀粉酶。制备三个容器的上述悬浮液。以0.1、0.25和0.5kg/MT稻米粉(ds)的剂量，将G-zyme G997加入到每一容器中。加入酶之后，伴随着搅拌，在60℃温育悬浮液24小时。用塑料移液管，在预先确定的时间间隔，从每一容器取2ml样品，并转移到离心管中。样品在8000rpm离心3分钟。然后从离心管小心取出几滴上清液，并测量Brix。记录Brix值，计算相对溶解度(RS)。结果如表3所示，表明，当G-zyme G997的剂量增加到0.25kg/MT稻米粉(ds)以上时，颗粒稻米淀粉的相对溶解度没有明显的差异。

表3

[216]在pH 5.5和60℃，G-Zyme G997浓度对颗粒稻米淀粉溶解的影响

G-Zyme G997          相对溶解度(％)

(kg/MT稻米粉)	2hr	6hr	17hr	23hr
					0.10	25	37	51	54
0.25	31	43	55	59
					0.50	35	47	58	60

[217]实施例4——rH-GSHE浓度对颗粒稻米淀粉溶解的影响

[218]以在30％含水浆体中的每克稻米粉不同浓度的GSHE U，将上面实施例1中描述的颗粒淀粉水解酶(rH-GSHE)加入，将pH调整到pH 5.5。浆体在60℃温育，在不同的时间点取样品。将样品按上述方法离心，清澈的上清液用于测定Brix。

表4

[219]在pH 5.5和60℃，rH-GSHE浓度对颗粒稻米淀粉(30％，ds)溶解的影响

相对溶解度(％)

GSHE单位淀粉ds	3hr	6hr	9hr	13hr	24hr
						0.1	11.1	13.3	15.6	20.0	25.9
0.5	14.1	17.0	18.5	22.6	28.1
						1.0	17.0	21.9	23.7	30.0	35.2

实施例5

在0.1kg/MT稻米粉(ds)和G-zyme G997存在下，rH-GSHE对颗粒稻米淀粉溶解的影响

[220]在1000ml不锈钢容器中，将蒸馏水(350g)加入到150g白稻米粉中，以制备30％ds稻米粉悬浮液。搅拌悬浮液，用6N H₂SO₄将pH调整到5.5。将不锈钢搅拌器放入容器中，并将玻璃盖放在容器顶部。将含有悬浮液的不锈钢容器置于60℃水浴中15分钟，之后加入酶。

[221]按照上述方法，制备两个容器的悬浮液。以0.1kg/MT稻米粉(ds)的剂量，将G-zyme G997加入到每一容器中；以0和1.0 GSHE单位/g稻米粉ds的剂量，加入rH-GSHE。加入酶之后，伴随着搅拌，在60℃温育悬浮液24小时。用塑料移液管，在预先确定的时间间隔，从每一容器取2ml样品，并转移到离心管中。带有样品的管在8000rpm离心3分钟。从离心管小心地取出几滴上清液，并测量Brix。记录Brix值，计算相对溶解度(RS)。将另外0.5ml上清液转移到配备有螺帽的试管中。给试管戴上螺帽，并置于沸水浴中15分钟，以使得酶失活。用蒸馏水稀释上清液，以便Brix约为3。充分混合每一管，将2ml的内容物通过0.45μm过滤器进行过滤，收集到自动进样瓶(autosampler vial)中。使用HPLC分析上清液中的糖分布型。

[222]结果如表5和6所示，表明在0.1kg/MT dss G-Zyme G997存在下，仅仅24小时之后，rH-GSHE显著增加颗粒稻米淀粉的溶解至90％以上。也参考图7，比较单独的G-Zyme G997、单独的rH-GSHE、rH-GSHE和G-Zyme-G997组合随时间推移的％溶解淀粉。观察到，使用rH-GSHE和G-Zyme-G997组合时，20小时之后，超过90％的颗粒淀粉被溶解，与之相比，当G-Zyme G997单独使用时，约50％溶解，当rH-GSHE单独使用时，约28％溶解。此外，仅仅在24小时之后，rH-GSHE和G-Zyme G997便能够产生具有96％以上的葡萄糖的糖浆。然而，单独的G-Zyme G997既不能溶解超过90％的颗粒稻米淀粉，也不能产生高葡萄糖糖浆。

表5

在pH 5.5和60℃，在0.1kg/MT ds G-Zyme G997存在下，rH-GSHE对颗粒稻米淀粉溶解的影响

处理          相对溶解度(％)

GSHU/g ds	2hr	4hr	6hr	9hr	12hr	24hr
							无rH-GSHE	26	35	39	47	51	55
有rH-GSHE	53	68	75	86	90	93

表6

在pH 5.5和60℃，在0.1kg/MT ds G-Zyme G997存在下，rH-GSHE对溶解的稻米淀粉水解产物的糖分布型的影响，温育24hr

酶	DP1	DP2	DP3	DP4+
					G-Zyme G997	55.7	25.4	11.6	7.1
G-Zyme G997+rH-GSHE	96.4	3.0	0.1	0.1

实施例6

在rH-GSHE和G-zyme G997存在下，pH对颗粒稻米淀粉溶解的影响

[223]在1000ml不锈钢容器中，将蒸馏水(350g)加入到150g白稻米粉(Elephantbrand，Thai Better Foods，Co.Ltd.，Bangpong，Thailand)中，以制备30％ds稻米粉悬浮液。制备四个容器的上述这样的悬浮液。用6N H₂SO₄和/或1N NaOH，将pH调整到pH 4.5、5.0、5.5和6.0。将不锈钢搅拌器放入到每一容器中，并将玻璃盖放在每一容器顶部作为盖子。将不锈钢容器置于60℃水浴中15分钟，之后加入酶。

[224]以0.5 GSHE单位/g稻米粉的剂量，将rH-GSHE加入到每一容器中；以0.1kg/MT稻米粉的剂量比，加入G-zyme G997。加入酶之后，伴随着搅拌，在60℃温育悬浮液24小时。用塑料移液管，在预先确定的时间间隔，从每一容器取2ml样品，并然后转移到离心管中。将样品在8000rpm离心3分钟。从离心管小心地取出几滴上清液，并测量Brix。记录Brix值，计算相对溶解度(RS)，如表7所示。结果显示，在60℃，pH 5.0至6.0之间，颗粒稻米淀粉的溶解没有明显的差异，但是在pH 4.5，溶解速率明显较低。

表7

在0.5 GSHE单位/g ds rH-GSHE和0.1kg/MT稻米粉ds G-Zyme G997存在下，在60℃，pH对颗粒稻米淀粉溶解的影响。

pH处理          相对溶解度(％)

	1hr	2hr	4hr	6hr	9hr	12hr	24hr
								4.5	30	40	52	59	62	67	76
5.0	32	46	58	66	72	76	85
								5.5	33	46	59	67	73	78	86
6.0	33	47	58	66	73	76	87

实施例7

在rH-GSHE和G-zyme G997存在下，在pH 5.5，温度对颗粒稻米淀粉溶解的影响

[225]在1000ml不锈钢容器中，将蒸馏水(350g)加入到150g白稻米粉(Elephantbrand，Thai Better Foods，Co.Ltd.，Bangpong，Thailand)中，以制备30％ds稻米粉悬浮液。搅拌悬浮液，并用6N H₂SO₄将pH调整到pH 5.5。制备四个容器的上述这样的悬浮液。将不锈钢搅拌器放入到每一容器中，并将玻璃盖放在每一容器顶部作为盖子。将不锈钢容器置于55℃、60℃、65℃和70℃水浴中15分钟，之后加入酶。

[226]以1.0 GSHE单位/g稻米粉ds的剂量，将rH-GSHE加入到每一容器中；以0.1kg/MT稻米粉ds的剂量比，加入G-zyme G997。加入酶之后，伴随着搅拌，温育悬浮液24小时。用塑料移液管，在预先确定的时间间隔，从每一容器取2ml样品，并然后转移到离心管中。将样品在8000rpm离心3分钟。从离心管小心地取出几滴上清液，并测量Brix。记录Brix值，计算相对溶解度，如表8所示。结果表明，在pH 5.5时，60℃是最佳温度。

表8

在1.0 GSHE单位/g ds rH-GSHE和0.1kg/MT稻米粉ds G-Zyme G997存在下，在pH 5.5，温度对颗粒稻米淀粉溶解的影响

温度          相对溶解度(％)

℃	2hr	4dr	6dr	9dr	12dr	24dr
							55	50	64	71	78	81	91
60	57	71	78	83	88	96
							65	56	61	65	67	68	71
70	54	57	61	6	64	67

实施例8

在pH 5.5和60℃，在0.1kg G Zyme G997/MT稻米粉ds存在下，rH-GSHE浓度对颗粒稻米淀粉溶解的影响

[227]在1000ml不锈钢容器中，将蒸馏水(350g)加入到150g白稻米粉(Elepdantbrand，Tdai Better Foods，Co.Ltd.，Bangpong，Thailand)中，以制备30％ds稻米粉悬浮液。搅拌悬浮液，并用6N H₂SO₄，将pH调整到pH 5.5。将不锈钢搅拌器放入到容器中，并将玻璃盖放在容器顶部作为盖子。以这样的方式，制备六个容器，并置于60℃水浴中15分钟，之后加入酶。

[228]以0.1kg/MT稻米粉，ds的剂量率，将G-zyme G997加入到每一容器中；以0、0.5、1.0、1.5、2.0或3.0 GSHE单位/g稻米粉ds的剂量，加入rH-GSHE。加入酶之后，伴随着搅拌，在60℃温育悬浮液24小时。用塑料移液管，在预先确定的时间间隔，从每一容器取2ml样品，然后转移到离心管中。将样品在8000rpm离心3分钟。从离心管小心地取出几滴上清液，并测量Brix。记录Brix值，计算相对溶解度(RS)，如表9所示。结果证实了在60℃的温度时稻米淀粉溶解度超过90％的工艺，其产生了大于95％的葡萄糖产量。当rH-GSHE的剂量增加到1.5 GSHE单位/g ds以上时，％RS没有明显的差异。用0.1kg G Zyme G997 MT/稻米粉，ds和1.5 GSHE单位的H-GSHE/g稻米粉，ds，可以获得超过90％的颗粒稻米淀粉水解。

表9

在与稻米粉和G ZYME G997温育期间，rH-GSHE浓度对溶解和水解的影响

rH-GSHE浓度	％RS			％可溶性糖(24hrs)
									3.5hrs	15hrs	24hrs	DP1	DP2	DP3	DP4+
0	31	55	59	45.5	24.5	15.3	15.1
								0.5	58	81	88	96.1	3.2	0.2	0.3
1.0	64	87	91	96.4	3.0	0.1	0.1
								1.5	73	93	93	96.4	3.3	0.1	0.1
2.0	76	95	97	95.7	3.9	0.2	0.1
								3.0	80	97	100	95.2	4.4	0.2	0.2

实施例9

在pH 5.5和60℃，在0.5 GSHE单位/g稻米粉，ds存在下，G-Zyme G997浓度对颗粒稻米淀粉溶解的影响

[229]在1000ml不锈钢容器中，将蒸馏水(350g)加入到150g白稻米粉(Elephantbrand，Thai Better Foods，Co.Ltd.，Bangpong，Thailand)中，以制备30％ds稻米粉悬浮液。搅拌悬浮液，并用6N H₂SO₄，将pH调整到pH 5.5。将不锈钢搅拌器放入到容器中，并将玻璃盖放在容器顶部作为盖子。以这样的方式，制备四个容器，并置于60℃水浴中15分钟，之后加入酶。

[230]以0.5 GSHE单位/g稻米粉，ds的剂量率，将rH-GSHE加入到每一容器中；以0.1、0.25、0.5和1.0kg/MT稻米粉ds的剂量，加入变化数量的G-zyme G997。加入酶之后，伴随着搅拌，在60℃温育悬浮液24小时。用塑料移液管，在预先确定的时间间隔，从每一容器取2ml样品，然后转移到离心管中。将样品在8000rpm离心3分钟。从离心管小心地取出几滴上清液，并测量Brix。记录Brix值，计算相对溶解度(RS)，如表10所示。

[231]结果表明，在0.5 H-GSHE存在下，增加G-Zyme G997的剂量，对颗粒稻米淀粉的RS具有正效应，用0.5 G-Zyme G997 MT/稻米粉，ds，可以获得颗粒稻米淀粉超过90％的RS。

表10

用rH-GSHE(0.5 GSHE单位/g稻米粉，ds)时，G-ZYME G997浓度(Conc)对颗粒稻米粉溶解的影响

G-Zyme G997(kg/MT稻米粉，ds)	％相对溶解度(RS)
							2hrs	6hrs	17hrs	23hrs	25hrs
0.10	43	64	83	87	88
						0.25	45	67	84	87	87
0.5	58	74	86	90	91
						1.0	58	74	87	90	94

实施例10

在用G-Zyme G997和不同浓度的rH-GSHE温育期间，稻米粉浓度对颗粒稻米淀粉溶解和水解的影响

[232]在不同的瓶中，制备稻米粉浆体，分别含有a)105g，于395g DH₂O中；b)142.5g，于357.5g DH₂O中；和c)178.5g，于321.5g DH₂O中。使用6N H₂SO₄，将浆的pH调整到pH 5.5。以0.2kg/MT稻米粉，加入G-Zyme G997。向每一瓶，加入不同浓度的rH-GSHE。将瓶保持在维持于60℃的水浴中，在温育期间持续搅拌混合物，以获得均匀混合。在不同的时间间隔，取出样品，离心，并用于测量Brix，如上所述。将样品进行HPLC分析。结果示出于表11中，表明，在高达25％的浓度，将稻米粉浆与α淀粉酶和H-GSHE温育，导致颗粒稻米淀粉完全溶解，并产生大于96％葡萄糖产量的葡萄糖。

表11

Rf(W/W)	IT(hr)	G997(kg/MT)	H-GSHEGSHEU/g	SS％	DP1	DP2	DP3	DP4+
									22	1216	0.20.20.20.20.2	0.50.751.00.50.75	80.794.897.490.698.4	88.196.997.389.696.8	9.02.52.47.92.7	1.20.601.00.1	1.70.40.41.40.4

	2025	0.20.20.20.20.20.20.2	1.00.50.751.00.50.751.0	1009199.599.196.6100100	97.090.896.696.791.996.696.5	2.67.22.92.96.53.03.1	0.10.80.10.10.70.10.1	0.41.10.40.40.90.40.3
									25.7	12162025	0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2	0.50.751.00.50.751.00.50.751.00.50.751.0	80.285.7898485.292.387.287.894.68990.498.1	95.296.396.595.496.096.195.695.795.795.495.695.3	3.83.02.93.73.33.33.83.63.83.83.94.2	0.30.10.10.20.10.10.20.10.10.20.20.2	0.70.50.40.60.50.50.50.50.40.50.40.4
35.7	12162025	0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2	0.50.751.00.50.751.00.50.751.00.50.751.0	65.669.575.270.772.779.473.775.781.376.477.783.7	92.994.595.593.795.995.493.994.795.194.094.594.7	5.54.33.55.14.33.84.94.54.14.94.64.5	0.60.30.10.40.20.20.30.20.20.30.20.2	0.90.70.60.80.60.50.70.50.50.60.50.5

Rf＝稻米粉；IT＝温育时间；ss＝溶解的淀粉

实施例11-稻米蛋白浓缩物和高纯度稻米蛋白浓缩物的蛋白质含量的评价

[233]在1000ml不锈钢容器中，将蒸馏水(700g)加入到300g白稻米粉(Elephantbrand，Thai Better Foods，Co.Ltd.，Bangpong，Thailand)中，以制备30％ds稻米粉浆。用6N H₂SO₄，将浆的pH调整到pH 5.5。将浆体置于60℃的水浴中，持续搅拌，以获得均匀混合，之后加入酶。rH-GSHE以1.0 GSHE单位/g稻米粉，ds的剂量率加入，G-Zyme G997以0.1kg/MT稻米粉ds的剂量加入。加入酶之后，伴随着搅拌，将悬浮液在60℃温育24小时(直到99％以上的颗粒稻米被溶解)。

[234]在稻米蛋白质溶解度最低时的pH(pH 3.0-5.5)溶解稻米淀粉，有助于不溶性稻米蛋白与溶解的稻米淀粉分离。在稻米淀粉的水解完成之后，使用Buchner漏斗，将温育的浆体在Whatman No.1滤纸上过滤，获得湿饼。将小部分的湿饼用dH₂O洗涤若干次，并在60℃干燥(一次处理)。剩余的湿饼在300g dH₂O中再次制成浆，并在60℃用G-Zyme G997(0.1kg/MT稻米粉)和rH-GSHE(1.0 GSHE单位/g稻米粉)再温育12小时。在60℃，使用6N H₂SO₄将浆的pH调整到pH 3.5，以终止酶反应。使用Buchner漏斗，用Whatman滤纸过滤，分离不溶性的稻米蛋白。饼用dH₂O洗涤，以除去任何溶解的淀粉。在60℃干燥稻米蛋白浓缩物，直到水分含量降到小于5.0％(双次处理)。

[235]测定稻米蛋白质的近似组成，并在表12中给出。如下获得来自高温喷射蒸煮工艺的蛋白质浓缩物：将SPEZYME FRED(Genencor International Inc.)(0.1kg/MT稻米粉)加入到30％的稻米底物含水浆体中，pH 5.5。使浆体通过维持在105℃的喷射蒸煮器(保持8min)，然后迅速转移(flash)到大气压。在95℃，再继续液化90min。液化淀粉的pH调整到pH 4.2，温度降到60℃。以0.4kg/MT稻米底物加入OPTIMAX 4060 VHP(葡糖淀粉酶和支链淀粉酶的混合物，获自GenencorInternational Inc.)，并温育48小时，至少洗涤2次。按照所述方法，通过离心分离溶解物，以获得包括不溶性蛋白质残留物的饼。将蛋白质残留物用dH₂O洗涤，并在60℃干燥。

[236]结果证明，本发明的方法通过水解颗粒稻米淀粉从稻米底物分离得到高纯度稻米蛋白浓缩物。

表12

通过水解颗粒稻米淀粉获得的稻米蛋白质的组成

制备物	％蛋白质(N×5.95)	％水分
			稻米粉	8.0	10
由高温喷射蒸煮工艺获得的蛋白质组分*	60.0
			蛋白质浓缩物(一次处理)	43.0

高纯度蛋白质浓缩物(双次处理)

70.0

3.9

实施例12

稻米蛋白浓缩物的水溶性评价

[237]根据上面实施例11获得稻米蛋白浓缩物。此外，按照在实施例11给出的描述，在传统的高温中，制备蛋白质组分。获得蛋白质浓缩物和蛋白质组分的悬浮液，适当的话，用NaOH或H₂SO₄调整pH，以获得2.0、4.0、6.0、8.0和10.0的pH水平。在室温下持续搅拌悬浮液，每隔15分钟，将样品调整到它们各自的起始pH。按照上面的描述，通过离心分离溶解的蛋白质，清澈的溶液被用于测定总氮(N)。按照N×5.95计算蛋白质含量(％P)。

表13

处理pH	％溶解的蛋白质传统工艺	％溶解的蛋白质本发明工艺
			2.0	3.2	33.0
4.0	2.6	18.0
			6.0	3.1	2.5
8.0	5.3	5.0
			10.0	6.5	59.6

实施例13-

蛋白酶处理对稻米蛋白浓缩物溶解和水解的影响

[238]在典型的研究中，在50℃和pH 2.0，将根据本发明的方法获得的2.0％稻米蛋白浓缩物和根据上述传统方法获得的2.0％稻米蛋白质组分，与酸性真菌蛋白酶(单位/g蛋白质)温育。在温育期间，样品的pH每隔15分钟进行一次调整。在60min、120min、240min、360min和720min取出样品，加入等体积的10％三氯醋酸(TCA)溶液，以沉淀未水解的蛋白质。样品在5℃冷却，然后过滤。分析清澈的滤液，以获得总氮(数据未显示)。

[239]在进一步的研究中，在55℃和pH 7.0，将根据本发明的方法获得的2.0％稻米蛋白悬浮液和根据上述传统方法获得的2.0％稻米蛋白质组分，与Proteinase T和PROTEX 6L(Genencor)温育，以模拟人低位消化系统。在温育期间，样品的pH每15分钟进行一次调整。在不同的时间间隔取样品，通过加入10％TCA沉淀未水解的蛋白质。样品在5℃冷却，然后过滤。分析清澈的滤液，以获得总氮(数据未显示)。

实施例14-高纯度稻米蛋白浓缩物的氨基酸组成

[240]将如上面实施例11中描述的高纯度稻米蛋白浓缩物(双次处理)的氨基酸组成(％)与按照实施例11中描述的高温传统工艺获得的蛋白质组分的氨基酸组成进行比较，参见表14。将高纯度蛋白质浓缩物和蛋白质组分的氨基酸组成与酪蛋白的氨基酸组成(％)进行比较。酪蛋白的数值从Shih等，(2000)JAOCS 77：885-889和Morita等(1993)J.FoodSci.58：1393-1396获得。

表14

氨基酸	滞留时间(min)	AA数量(g/100g)LT	AA数量(g/100g)HT	酪蛋白
					Asp	1.226	6.251	4.81	9.17
Glu	1.383	13.611	9.921	18.8
					Ser	3.534	3.67	2.905	7.99
His	4.518	1.107	0.774	2.25
					Gly	4.606	3.069	2.358	4.99
Thr	4.954	2.841	2.143	4.59
					Ala	6.18	4.259	3.093	4.99
Arg	6.405	5.927	4.359	3.23
					Tyr	7.831	3.846	2.568	3.51
Cys	9.164	0.837	0.825	-
					Val	9.635	4.647	2.7	5.77
Met	9.856	2.292	1.647	2.10
					Phe	11.258	4.418	3.199	3.46
IIe	11.496	3.535	1.943	3.54
					Leu	12.132	6.595	4.678	6.41
Lys	12.855	2.491	1.832	8.48
					Pro	16.456	3.549	2.591	12.40
总氮(g/100g)		72.943	52.315

LT＝低温，双次处理，如实施例11所述。

HT＝高温，传统处理，如实施例11所述。

Claims (22)

1.由稻米底物生产稻米蛋白浓缩物的方法，包括：a)在72℃或低于72℃的温度，在约3.0至6.5的pH中，用i)具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶和ii)第二淀粉水解酶酶促水解稻米底物足够的时间，水解所述稻米底物中的淀粉的实质部分，以获得溶解的淀粉组分和包括不溶性蛋白的残留物组分；和b)将所述溶解的淀粉组分与所述残留物分离，获得稻米蛋白浓缩物。

2.根据权利要求1的方法，其中所述具有GSH活性的酶是葡糖淀粉酶。

3.根据权利要求2的方法，其中所述葡糖淀粉酶源自腐质霉属(Humicola)、根霉属(Rhizopus)或曲霉属(Aspergillus)的菌株。

4.根据权利要求1的方法，其中所述第二淀粉水解酶是α-淀粉酶。

5.根据权利要求4的方法，其中所述α淀粉酶源自细菌来源。

6.根据权利要求1的方法，其中所述具有GSH活性的酶获自GSH酶在木霉属菌株或曲霉属菌株中的异源表达。

7.根据权利要求1的方法，还包括纯化所述稻米蛋白浓缩物的步骤。

8.根据权利要求1的方法，还包括干燥所述稻米蛋白浓缩物的步骤。

9.根据权利要求1的方法，其中所述稻米蛋白浓缩物的蛋白质含量为至少约20％。

10.根据权利要求1的方法，其中所述稻米底物被制成浆，并具有在10％至55％之间的干固体含量。

11.根据权利要求1的方法，其中温度在70℃至55℃之间。

12.根据权利要求1的方法，还包括步骤c)：在约3.0至6.5的pH，70℃至55℃范围内的温度，用具有GSH活性的酶和淀粉水解酶酶促水解步骤b)中获得的稻米蛋白浓缩物，以获得包括溶解的淀粉和不溶性的稻米蛋白的组分，和步骤d)：分离所述组分，以获得高纯度的稻米蛋白浓缩物。

13.根据权利要求12的方法，还包括干燥步骤d)中获得的所述高纯度的稻米蛋白浓缩物。

14.根据权利要求12的方法，其中步骤c)的淀粉水解酶是α淀粉酶。

15.根据权利要求12的方法，其中所述高纯度的稻米蛋白浓缩物的蛋白质含量为至少约60％。

16.稻米蛋白浓缩物，其根据权利要求1或权利要求12的方法获得。

17.动物饲料制品，包括根据权利要求1或权利要求12的方法获得的稻米蛋白浓缩物。

18.人用食物制品，包括根据权利要求1或权利要求12的方法获得的稻米蛋白浓缩物。

19.增加动物饲料中的蛋白质含量的方法，包括：a)在低于72℃的温度，将稻米底物与包括淀粉水解酶和颗粒淀粉水解(GSH)酶的酶组合接触足够的时间，以水解所述稻米底物中60％的淀粉，b)获得溶解的淀粉组分和残余物，所述残余物包括可溶性蛋白质，c)分离所述残余物以获得稻米蛋白浓缩物，和d)将所述稻米蛋白浓缩物添加入动物饲料中。

20.根据权利要求19的方法，其中所述淀粉水解酶是α淀粉酶。

21.根据权利要求19的方法，还包括步骤：将在步骤d)中获得的所述残余物与GSH酶以及可选的淀粉水解酶接触，以获得包括溶解的淀粉的组分和包括不溶性稻米蛋白质的残余物，分离所述残余物以获得高纯度稻米蛋白浓缩物，将所述高纯度稻米蛋白浓缩物加入到动物饲料中。

22.动物饲料，包括根据权利要求21的方法获得的高纯度稻米蛋白浓缩物。

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