CN101096370A - 缬氨酸恩替卡韦及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本项发明涉及缬氨酸恩替卡韦及其制备方法和其在医药领域的应用。本发明以恩替卡韦为原料，经酯化、还原两步反应得到缬氨酸恩替卡韦。缬氨酸恩替卡韦具有良好的水溶性，稳定性较好，有利于提高制剂的生物利用度。
Description
技术领域
本项发明涉及缬氨酸恩替卡韦及其制备方法和其在医药领域的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是肝炎病毒中在全世界引起的发病率和死亡率最为严重的一种。据世界卫生组织报道，全球超过20亿人已感染乙型肝炎病毒，其中约4亿人患有慢性乙型肝炎，30％的感染者会发展为进展性甚至致死性肝脏疾病，包括肝硬化和肝细胞癌。目前治疗乙型肝炎病毒感染的常用药有干扰素α、拉米夫定、阿德福韦，干扰素不良反应非常大，并且需要注射给药，病人依从性不佳，但其在临床应用过程中出现了耐药突变和停药后复发等新的问题，拉米夫定的耐药发生率每年以14％～32％的比例增加，4年的耐药发生率接近100％，耐阿德福韦的毒株出现较慢，约按每年2％的比例增加。临床研究显示，恩替卡韦对拉米夫定无效者也有效，恩替卡韦引起病毒变异仅发生在出现拉米夫定耐药变异病毒株病人，且变异率低。
恩替卡韦(enticavir)，化学名为：2-氨基-1，9-二氢-9-[(1S，3R，4S)-4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊烷]-6H-嘌呤-6-酮，其分子结构式如下：
恩替卡韦为环氧羟碳脱氧鸟苷，是一种能有效抑制乙肝病毒复制的脱氧鸟苷类似物，具有较强的抗HBV作用。体外试验中，恩替卡韦极低浓度即可抑制HBV的复制，而其细胞毒性则很低，有着十分优良的选择性治疗指数。
恩替卡韦水溶性差，生物利用度较低，本发明目的是提供一种水溶性好的且较稳定的恩替卡韦衍生物——单缬氨酸恩替卡韦。
本发明的另一目的是提供药学上可使用的可安全且有效地治疗乙肝病毒感染的含有缬氨酸恩替卡韦的胶囊剂、片剂、液体制剂及注射剂。
本发明的再一目的是提供缬氨酸恩替卡韦的制备方法及上述各缬氨酸恩替卡韦制剂的制备方法。
缬氨酸恩替卡韦是恩替卡韦的缬氨酸酯前药，吸收进入人体后，在肠道和肝脏细胞中被酯酶迅速水解游离出恩替卡韦和缬氨酸，口服生物利用度大大改善。
发明内容
一、缬氨酸恩替卡韦的制备
1、N-苄氧羰基-缬氨酸(Cbz-Va)的制备
将L-缬氨酸溶于20～25倍量的4mol/L的氢氧化钠溶液中，磁力搅拌下冰盐浴冷却，保持内温不高于10℃，向上述溶液中滴加40当量的苄氧基氯甲酯，加毕继续在冰水浴冷却下搅拌2h，然后室温搅拌6h，TLC检查原料消失。碱性反应混合物用氯仿提取以除去过量的苄氧基氯甲酯和其分解成的苄醇。水层于冰水浴冷却下用盐酸调节pH至2，用氯仿提取，水洗氯仿液，收取氯仿液，无水亚硫酸钠干燥，蒸干溶剂，即得。
2、恩替卡韦-L-缬氨酸酯的制备
取N-苄氧羰基-缬氨酸(Cbz-Va)和0.6当量的二环己基碳二亚胺(DCC)、0.125当量的4-二甲氨基吡啶混合于6～8倍量的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，所得溶液与氮气氛围下室温搅拌10min，然后加入1.2倍量的DMF和0.5当量的恩替卡韦，反应混合物室温下搅拌反应18h，倾入30倍量水中，用乙酸乙酯(10倍量)和甲苯(10倍量)的混合液提取，分出水层，有机层用饱和碳酸氢钠溶液16倍量洗涤，然后用6倍量水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，减压下浓缩溶剂，残余物用硅胶柱层析分离(0～5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱)，得化合物Em1、Em2、Em3。
3、缬氨酸恩替卡韦的制备
取上述酯化反应得到的化合物和0.3倍量的10％的Pd/C混合于25～30倍量甲醇中，室温下，与常压氢化5h，过滤反应混合物，用少量甲醇洗涤滤饼，滤液减压蒸除溶剂，残余物溶于甲醇中，硅胶柱层析分离纯化(0～5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱)，得到缬氨酸恩替卡韦。
二、抗乙肝病毒性能试验
1、体外抗乙肝病毒HBV-DNA的性能试验
病毒编码的HBV-DNA聚合酶是乙肝病毒DNA复制过程中所需的关键酶，也是抗病毒治疗的重要靶点。文献报道恩替卡韦抗HBV病毒的50％有效浓度(EC50)为3.7nmol/L，参照文献方法(Antimicrob Agents Chemother，1999，43(1)：190～193)，采用检测体外培养细胞上清液中HBV-DNA浓度，考察本品的体外抗病毒效能。
细胞培养：取转染了HBV全基因组，能分泌HBV-DNA颗粒的人肝母瘤细胞系，用DMEM培养液培养，培养液加10％肽牛血清，0.03％谷氨酰氨，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，200μg/ml G418，置37℃，5.00％二氧化碳培养箱中传代培养，每4天传代一次，取对数生长期细胞用于试验。
检测方法：采用荧光定量PCR法测定培养液上清液中HBV-DNA滴度，从而反映HBV-DNA的复制。
试验方法：试验分为三组，分别为
(1)恩替卡韦组：用含恩替卡韦浓度为4.5nmol/L的培养液培养；
(2)缬氨酸恩替卡韦组：用含缬氨酸恩替卡韦浓度为4.5nmol/L的培养液培养；
(3)空白对照组：用常规培养液培养。
培养72小时后，分别取培养液上清液，测定HBV-DNA滴度含量数(拷贝/m1)，结果如下：
| 组别 | HBV-DNA滴度含量数 |
| 恩替卡韦组 | 2.24×103拷贝/ml** |
| 缬氨酸恩替卡韦组 | 2.33×103拷贝/ml** |
| 空白对照组 | 8.17×107拷贝/ml## |
注：与空白对照组比较(*P＜0.05，**P＜0.01)；与恩替卡韦组比较(#P＜0.05，##＜0.01)
结果表明，恩替卡韦与缬氨酸恩替卡韦组对体外培养细胞的HBV-DNA病毒有极好的抑制作用，两者间无明显差异。
2、对鸭乙型肝炎模型的抗乙肝病毒作用
模型建立：取鸭静脉采血，经斑点分子杂交排除先天感染，随后经足静脉注射含DHBV3×108拷贝的鸭血清(100μl)，经斑点核酸杂交检测DHBV血症，以判断实验感染是否成功。
试验方法：接种病毒1周后，将鸭随机分为3组，分别为：
(1)恩替卡韦组：1mg/kg，口服给药，每天1次；
(2)缬氨酸恩替卡韦组：1mg/kg，口服给药，每天1次；
(3)空白对照组：口服给予生理盐水。
每周鸭颈静脉采血并分离血清，置-20℃保存。连续给药4周后，各组处死半数鸭，保留血清并取部分鸭肝脏保存于-70℃。余鸭停药观察2周，每周采血并分离血清，2周后处死鸭并取肝脏检测病毒。
采用斑点分子杂交和Southern印迹杂交检测治疗后感染鸭血清和肝脏匀浆中病毒(DHBVDNA、共价闭合环状病毒DNA(cccDNA))的动态变化，结果如下：
鸭血清中DHBV DNA检测结果
| 检测项目 | 时间(周) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 平均血清中DHBVDNA含量(pg/μl取对数值) | 恩替卡韦组 | 3.90±0.31 | 1.36±1.12** | 1.84±1.35** | 1.43±1.09** | 0.68±0.87** | 0.72±0.93** | 0.89±1.04** |
| 缬氨酸恩替卡韦组 | 3.93±0.29 | 1.32±1.24** | 1.76±1.46** | 1.36±1.20** | 0.69±0.91** | 0.80±1.01** | 0.88±1.11** | |
| 空白对照组 | 3.91±0.33 | 3.84±0.37 | 3.90±0.41 | 3.88±0.35 | 3.72±0.37 | 3.81±0.40 | 3.85±0.35 | |
| 肝组织中总DHBVDNA含量(pg/10μgliver DNA) | 恩替卡韦组 | 7800±398 | 3408±410** | 902±223** | 395±102** | 366±88** | 793±158** | 840±166** |
| 缬氨酸恩替卡韦组 | 7682±436 | 3680±450** | 883±245** | 387±89** | 394±93** | 803±147** | 839±158** | |
| 空白对照组 | 8012±503 | 7973±480 | 7812±511 | 8024±530 | 7912±466 | 8046±486 | 7954±551 | |
| 肝组织中总cccDNA含量(pg/10μg liver DNA) | 恩替卡韦组 | 135±36 | 58±21** | 34±17** | 19±12** | 16±14** | 27±13** | 42±15** |
| 缬氨酸恩替卡韦组 | 151±49 | 61±20** | 32±15** | 22±14** | 18±10** | 25±16** | 41±14** | |
| 空白对照组 | 144±42 | 138±51 | 149±40 | 152±39 | 147±38 | 154±53 | 147±47 |
注：与用药前DNA含量比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明，恩替卡韦组与缬氨酸恩替卡韦组血清中DHBV DNA、肝脏匀浆中DHBVDNA、cccDNA病毒水平均显著降低，与给药前有显著性差异(P＜0.01)，与空白对照组亦差异显著。
三、缬氨酸恩替卡韦的溶解性试验
室温下取缬氨酸恩替卡韦及恩替卡韦各适量，研细，分别精密称取1g，置具塞试管中，加水20ml，每隔5分钟强力振摇30秒，观察30分钟内的溶解情况，结果缬氨酸恩替卡韦迅速溶解，而30分钟后恩替卡韦仍有部分不溶，表明，缬氨酸恩替卡韦在水中溶解性能比恩替卡韦明显较好。
具体实施方式
实施实例一：缬氨酸恩替卡韦片的制备
缬氨酸恩替卡韦 2g
微晶纤维素 100g 淀粉 80g
羧甲基淀粉钠 13g 微粉硅胶 5g
制成 1000片
制法：将上述物料分别粉碎过100目筛，将缬氨酸恩替卡韦、微晶纤维素、淀粉充分混合后，加入适量的淀粉浆制成软材，12目筛制粒，55℃干燥4小时，16目筛整粒，外加入羧甲基淀粉钠和微粉硅胶混匀，压片，即得。
实施实例二：缬氨酸恩替卡韦胶囊的制备
缬氨酸恩替卡韦 2g
微晶纤维素 80g 甘露醇 120g
羧甲基淀粉钠 10g 硬脂酸镁 9g
制成 1000粒
制法：将上述物料分别粉碎过100目筛，将缬氨酸恩替卡韦、微晶纤维素、甘露醇、羧甲基淀粉钠充分混合后，加入适量的75％乙醇制成软材，12目筛制粒，55℃干燥4小时，16目筛整粒，加入硬脂酸镁，混匀，装胶囊，即得。
实施实例三：缬氨酸恩替卡韦口服液的制备
缬氨酸恩替卡韦 2g
麦芽糖醇 650g 对羟基苯甲酸甲酯 2g
柠檬香精 0.2g 拘橼酸 9.6g
拘掾酸钠 14.7g 水 加至1000ml
制成 1000ml
制法：取缬氨酸恩替卡韦溶于适量的水后，分别加入拘掾酸、拘掾酸钠、麦芽糖醇、对羟基苯甲酸甲酯、柠檬香精，搅拌使溶解，加水至1000ml，搅拌均匀，即得。
实施实例四：注射用缬氨酸恩替卡韦的制备
缬氨酸恩替卡韦 2g
甘露醇 10g 亚硫酸氢钠 0.2g
制成 1000支
制法：取缬氨酸恩替卡韦，加入适量水溶解后，分别加入甘露醇，亚硫酸氢钠，搅拌使溶解，加入0.05％的活性炭，80℃水浴搅拌40分钟，过滤除碳，用0.22μm滤膜过滤，加入注射用水至1000ml，分装成1000支，每支1ml，冻干，即得。
实施实例五、缬氨酸恩替卡韦滴丸的制备
缬氨酸恩替卡韦 2g
PEG4000 125g 硬脂酸聚烃氧40酯 23g
制成 1000粒
制法：取缬氨酸恩替卡韦、PEG4000、硬脂酸聚烃氧40酯混合均匀后，水浴加热，使完全熔融后，将此熔融液加入滴丸滴制机器物料漏斗中，80℃保温，挑选滴头，滴入至-5℃的二甲基硅油中，待成型后，过滤，分离，擦拭干净，即得。
实施实例六：缬氨酸恩替卡韦注射液的制备
缬氨酸恩替卡韦 2g 硫酸氢钠 0.2g
水 加至1000ml
制成 1000ml
制法：取缬氨酸恩替卡韦用适量水溶解后，加入亚硫酸氢钠，搅拌使溶解，加入0.05％活性炭，80℃水浴搅拌40分钟，过滤除碳，用0.22μm滤膜过滤，加入注射用水至1000ml，分装，每支1ml，即得。
实施实例七：缬氨酸恩替卡韦分散片的制备
缬氨酸恩替卡韦 2g
木糖醇 40g 微晶纤维素 42g
交联聚乙烯吡咯烷酮 12g 低取代羟丙基纤维素 6g
阿斯巴甜 3.6g 柠檬香精 1.2g
微粉硅胶 1g 75％乙醇 适量
制成 1000ml
制法：将上述物料分别粉碎过100目筛，将缬氨酸恩替卡韦、微晶纤维素、木糖醇、低取代羟丙基纤维素充分混合后，加入适量的75％乙醇制成软材，12目筛制粒，55℃干燥4小时，16目筛整粒，外加交联聚乙烯吡咯烷酮、阿斯巴甜、柠檬香精及微粉硅胶，混合均匀，压片，即得。
Claims (7)
1、一种恩替卡韦的缬氨酸酯，其特征在于可以是以下化合物中的一种或几种，其具有以下分子结构式
2、根据权利要求1所述的缬氨酸恩替卡韦还包括其结晶水合物，每分子缬氨酸恩替卡韦所含的结晶水个数为0.5～5个。
3、根据权利要求1或2所述的缬氨酸恩替卡韦的制备方法，其特征在于：以恩替卡韦为起始原料，通过L-缬氨酸保护、酯化、氢化三步反应合成目标化合物缬氨酸恩替卡韦。
4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：L-缬氨酸保护反应是向L-缬氨酸的氢氧化钠溶液中，加入苄氧基氯甲酯，L-缬氨酸与苄氧基氯甲酯的摩尔比为1∶10～60，优选1∶40，反应后用盐酸调节pH至1～3，优选pH＝2，氯仿萃取。
5、根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：酯化反应是将N-苄氧羰基-缬氨酸、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶混合于惰性溶剂中，氮气氛围下，边搅拌边加入适量的惰性溶剂和0.1～1当量的恩替卡韦，优选0.5当量，反应混合物室温下搅拌反应18h，倾入30倍量水中，用乙酸乙酯(10倍量)和甲苯(10倍量)的混合液提取，分出水层，有机层用饱和碳酸氢钠溶液16倍量洗涤，然后用6倍量水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，减压下浓缩溶剂，残余物用硅胶柱层析分离(0～5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱)，所用的惰性溶剂包括：DMF、二氯甲烷、四氢呋喃、DMSO。
6、根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：氢化反应是将上述酯化反应得到的化合物，0.1～0.5倍量的10％的Pd/C混合于25～30倍量甲醇中，室温下，与常压氢化5h，过滤反应混合物，用少量甲醇洗涤滤饼，滤液减压蒸除溶剂，残余物溶于甲醇中，硅胶柱层析分离纯化(0～5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱)。
7、根据权利要求1或2所述的缬氨酸恩替卡韦作为原料，用于制备药剂学上使用的片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、溶液剂、注射剂。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080102 |